用于提供具有增强功能的免疫细胞的方法与流程

有机化合物处理,合成应用技术用于提供具有增强功能的免疫细胞的方法1.相关申请的交叉引用2.本技术要求于2019年11月20日提交的美国临时申请号62/938,022的优先权，其内容整体并入本文。技术领域3.本公开内容涉及用于产生具有增强功能的免疫细胞的方法。更具体地，本文公开了一种用于增强免疫细胞功能的方法，其包括修饰免疫细胞以抑制选自rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2的至少一种基因的功能。本文还公开了一种方法，其包括修饰能够分化成免疫细胞的干细胞或祖细胞以抑制选自rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2的至少一种基因的功能。本文还公开了通过本发明方法制备的免疫细胞或干细胞，以及免疫细胞在治疗性治疗中的用途。4.通过引用并入序列表5.ascii文本文件中的序列表，命名为37830wo_nd201903_序列表.txt，大小为10kb，创建于2020年11月3日，通过引用并入本文。技术背景6.表达嵌合抗原受体的t细胞(car-t细胞)已经显示出在疾病(例如急性淋巴细胞白血病(all)和非霍奇金淋巴瘤(nhl))中杀伤肿瘤细胞方面非常有效。靶向b细胞抗原cd19的获批产品通过将car基因构建体引入患者来源(“自体”)的t细胞产生(kershaw等,gene-engineered t cells for cancer therapy,nat rev cancer,2013,13(8):525-41)。另外的自体产品正在开发中，其靶向其他血液系统恶性肿瘤(例如多发性骨髓瘤)的其他血细胞标志物，例如b细胞成熟抗原(bcma)(sadelain等,therapeutic t cell engineering,nature,2017,545(7655):423-431)。7.虽然在基于血液的癌症中使用car-t细胞的临床结果令人印象深刻，但是在治疗实体瘤中未出现类似的结果。在实体瘤中相对缺乏功效有多种原因，包括限制进入肿瘤部位、肿瘤微环境的免疫抑制性质以及缺乏实体瘤特异性靶抗原。另外，施用的car-t细胞缺乏持久性和“耗尽”是一直观察到的限制(newick等,car t cell therapy for solid tumors,annu rev med,2017,68:139-152)。8.抑制性受体(如ctla-4、pd-1或lag-3)可以减弱car-t细胞的活化并且加速t细胞耗尽。在pd-1被基因组编辑破坏之后，期望t细胞的抗肿瘤活性提高(liu等,crispr-cas9-mediated multiplex gene editing in car-tcells,cell res,2017,27(1):154-157)。然而，在t细胞上pd-1的消融也可以增加对耗尽的易感性，降低寿命并且无法提高抗肿瘤作用(odorizzi等,genetic absence of pd-1promotes accumulation of terminally differentiated exhausted cd8+t cells,j exp med,2015,212(7):1125-37)。出于这些原因，需要逐案评价t细胞中的基因编辑是否增强抗肿瘤活性。9.crispr/cas9是细菌免疫系统的重要组分，其允许细菌记住和破坏噬菌体。在哺乳动物细胞中，crispr/cas9可以用于基因编辑，如其他基因编辑技术，例如talen和zfn。crispr系统含有两种主要组分，cas9核酸酶和指导rna。具体地，设计的指导rna与cas9核酸酶形成复合物，将cas9-grna核糖核蛋白(rnp)复合物指导到人基因组中用户定义的切割位点。rnp切割导致基因组中的双链dna断裂，双链dna断裂通过被称为非同源末端连接(nhej)的容易出错的过程被修复。在nhej途径中，核苷酸缺失或插入(“indel”)导致基因破坏或敲除(addgene,crispr 101:a desktop resource(第2版)，2017)。指导rna的在靶效率和脱靶作用决定了crispr/cas9基因靶向应用的特异性和安全性。因此，专门设计的指导rna在基因破坏的成功中起至关重要的作用。10.最近的研究使用crispr对免疫调节剂进行全基因组功能丧失筛选，并且发现负调节剂(如tce2、socs1、rasa和cblb)的消融显著增加体外t细胞细胞毒性(shifrut等,genome-wide crispr screens in primary human tcells reveal key regulators of immune function.cell,2018,175(7):1958-1971,e15)。然而，短期体外细胞毒性在基因抑制或缺失对体内功能或寿命的影响方面提供有限的指导。基因抑制可以对免疫细胞(包括t细胞、nk细胞、nkt细胞等)的功能(包括其活性或寿命)产生的潜在影响需要在体外和体内更广泛地进行评估。11.虽然增强的免疫细胞是对抗癌症的潜在武器，但是在数值上生成、扩增和表征免疫细胞产物存在挑战。免疫细胞可以从多能干细胞(psc)生成。因此，多能干细胞技术是一项非常有前途的技术，因为在理论上多能干细胞提供了无限的、可再生的细胞来源。直接从干细胞(例如诱导多能干细胞(ipsc))有效地无限供应免疫细胞(其具有增强的能力，还包括能够响应多种病原体和癌症的广泛的靶标识别系统(tcr/car/细胞毒性受体))的能力代表了一个重大的商业机会。因此，了解特定目标基因的抑制对ipsc活力、自我更新、增殖能力和分化成免疫细胞的能力的影响也很重要。技术实现要素：12.本文已经证明了，数种基因的抑制增强体内细胞毒性细胞的持久性和抗肿瘤活性。13.在一方面，本文提供了一种用于增强免疫细胞功能的方法。所述方法包括修饰所述免疫细胞以抑制选自rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2的至少一种基因(即，一种或更多种基因)的功能。14.在另一方面，本文提供了一种用于修饰能够分化成免疫细胞的干细胞的方法。所述方法包括修饰所述干细胞以抑制选自rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2的至少一种基因的功能。在一些实施方案中，经修饰的干细胞进一步分化成免疫细胞，其中在所述免疫细胞中所述至少一种基因的功能被抑制。15.在一些实施方案中，基因功能的抑制通过降低mrna的水平或功能，任选地通过小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)或反义核酸来实现。16.在一些实施方案中，基因功能的抑制通过降低由基因编码的蛋白质的水平或活性，任选地通过使用抗体或小分子来实现。17.在一些实施方案中，基因功能的抑制通过基因编辑系统来实现。在一些实施方案中，所述基因编辑系统选自crispr/cas、talen和zfn。在一些实施方案中，所述基因编辑系统是包含指导rna-核酸酶复合物的crispr/cas系统。在一些实施方案中，所述指导rna靶向选自seq id no：2至seq id no：16的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述crispr/cas系统利用选自以下的指导rna依赖性核酸酶：cpf1、cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也被称为csn1和csx12)、cas100、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3和csf4。18.在一些实施方案中，所述免疫细胞选自t细胞(包括细胞，例如nkt细胞)或nk细胞。19.在一些实施方案中，通过本文公开的方法产生的经修饰的细胞，例如经修饰的免疫细胞或经修饰的干细胞，还包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸。20.在一些实施方案中，通过本文公开的方法产生的经修饰的免疫细胞识别一种或更多种靶抗原。在一些实施方案中，所述靶抗原选自tag-72、cd19、cd20、cd24、cd30、cd47、叶酸受体α(frα)和bcma。21.在另一方面，本文提供了通过本文公开的方法产生的免疫细胞。22.在另一方面，本文提供了通过本文公开的方法产生的经修饰的干细胞。23.在一方面，本文提供了经修饰的免疫细胞，其中相对于未经修饰的免疫细胞，在经修饰的免疫细胞中至少一种基因的功能被抑制，其中所述至少一种(即，一种或更多种)基因选自rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2。在一些实施方案中，在经修饰的免疫细胞中所述rc3h1基因被抑制。在一些实施方案中，在经修饰的免疫细胞中所述rc3h2基因被抑制。在一些实施方案中，在经修饰的免疫细胞中所述a2ar基因被抑制。在一些实施方案中，在经修饰的免疫细胞中所述fas基因被抑制。在一些实施方案中，在经修饰的免疫细胞中所述tgfbr1基因被抑制。在一些实施方案中，在经修饰的免疫细胞中所述tgfbr2基因被抑制。在一些实施方案中，选自rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2的多种基因被抑制。24.在一些实施方案中，在经修饰的免疫细胞中基因功能的抑制是由从所述基因转录的mrna的水平或功能、或由所述基因编码的蛋白质的水平或活性的降低引起的。25.在一些实施方案中，基因功能的抑制是由所述基因的核酸序列的修饰引起。26.在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞选自t细胞(包括细胞，例如nkt细胞)或nk细胞。27.在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞表达嵌合抗原受体(car)。28.在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞识别一种或更多种靶抗原。在一些实施方案中，所述靶抗原选自tag-72、cd19、cd20、cd24、cd30、cd47、叶酸受体α(frα)和bcma。29.在另一方面，本文提供了经修饰的干细胞，其能够分化成免疫细胞，其包含至少一种基因的核酸序列的修饰，其中所述修饰抑制所述至少一种基因的功能，并且其中所述至少一种基因选自rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2。30.在一些实施方案中，在经修饰的干细胞中所述rc3h1基因被抑制。在一些实施方案中，在经修饰的干细胞中所述rc3h2基因被抑制。在一些实施方案中，在经修饰的干细胞中所述a2ar基因被抑制。在一些实施方案中，在经修饰的干细胞中所述fas基因被抑制。在一些实施方案中，在经修饰的干细胞中所述tgfbr1基因被抑制。在一些实施方案中，在经修饰的干细胞中所述tgfbr2基因被抑制。在一些实施方案中，选自rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2的多种基因被抑制。31.在一些实施方案中，所述经修饰的干细胞是诱导的多能干细胞。32.在一些实施方案中，经修饰的干细胞包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸。33.在另一方面，本文提供了用于增强免疫细胞功能的组合物，其包含能够编辑靶基因序列的指导rna-核酸酶复合物，其中所述指导rna靶向选自seq id no：2至seq id no：16的核苷酸序列。34.在一些实施方案中，所述核酸酶包含选自以下的至少一种蛋白质：cpf1、cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也被称为csn1和csx12)、cas100、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3和csf4。35.在另一方面，提供了一种用于在受试者中治疗病症的方法，其包括向所述受试者施用本文公开的经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述病症是癌症、感染、自身免疫病、器官纤维化或子宫内膜异位症。附图说明36.本专利或申请文件包含至少一幅以彩色绘制的图。专利局将根据请求和支付必要的费用提供本专利或专利申请公开的彩色附图副本。37.图1a-1b评价经修饰的免疫细胞的抗肿瘤活性的示例性策略。(a)执行用于评价car-t细胞的策略(其包括crispr敲除免疫调节基因)的示意图，示出了在实施例中使用的原代t细胞中慢病毒car转导、基因靶向和功能分析的代表性时间线。(b)生成经修饰的nk-92细胞的代表性时间线，其中crispr敲除免疫调节基因，然后在nk-92细胞中进行慢病毒car转导和功能分析。38.图2a-2b人原代t细胞的慢病毒转导以生成tag-72car-t细胞。(a)该研究中使用的tag-72特异性car构建体的示意图。(b)在人原代t细胞中car的转导效率。在用慢病毒载体转导后10天检查表达。每个点图中嵌入的值代表car+事件的频率，作为活的单个细胞的百分比。(示出了来自一个供体的t细胞的代表性数据)。39.图3在crispr/cas9 rnp转染之后tag-72car-t细胞的生长曲线(示出了来自一个供体的t细胞的代表性数据)。nt：未经转导的t细胞；tag-72car：用tag-72car转导的t细胞；tag-72car/pd-1ko t：用tag-72car和靶向pd-1的crispr/cas9 rnp转导的t细胞；tag-72car/a2ar ko t：用tag-72car和靶向a2ar的crispr/cas9 rnp转导的t细胞；tag-72car/fas ko t：用tag-72car和靶向fas的crispr/cas9 rnp转导的t细胞；tag-72car/rc3h1 ko t：用tag-72car和靶向rc3h1的crispr/cas9 rnp转导的t细胞；tag-72car/rc3h2 ko t：用tag-72car和靶向rc3h2的crispr/cas9 rnp转导的t细胞；tag-72car/tgfbr1 ko t：用tag-72car和用将显性阴性突变引入tgfbr1中的crispr/cas9 rnp转导的t细胞；tag-72car/tgfbr2 ko t：用tag-72car和用将显性阴性突变引入tgfbr2中的crispr/cas9 rnp转导的t细胞。40.图4a-4d指导rna形成的rnp的转染将插入和缺失(indel)引入car-t细胞中特定基因的开放阅读框中。通过crispr编辑(ice)测定评估indel的频率。(a)来自经rc3h2 grna转染的car-t细胞(“经编辑的样品”)的sanger测序轨迹显示，与未经转染的car-t细胞(“对照样品”)相比，切割位点下游的碱基的不均匀混合(seq id no：17示出来自经编辑的样品的281至346bp；seq id no：18示出来自对照样品的281至346bp)。对照样品的黑色下划线区域代表指导序列，水平红色虚线下划线区域是相关的pam(原间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif))位点。两条轨迹上的垂直黑色虚线代表切割位点。(b)来自经rc3h2 rnp转染的car-t细胞的基因组dna中每个经编辑的序列的贡献的相对百分比(归一化)。从上到下的序列分别在seq id no：19、20、21、22、23、24、25和26中示出。(c)经rc3h2 rnp转染的car-t细胞的整个经编辑的群中indel大小的分布。框外indel百分比是表示移码或长度超过21bp的indel的比例。通过pearson相关系数计算的r2值表示indel百分比的置信度。(d)经rnp转染的car-t细胞的ice测定结果的总结。rnp复合物是由该研究中使用的代表性指导rna(pd-1，seq id no：1；rc3h1，seq id no：2；rc3h2，seq id no：4；a2ar，seq id no：7；fas，seq id no：9；tgfbr1，seq id no：11；tgfbr2，seq id no：14)形成的；示出了来自一个供体的t细胞的代表性数据。41.图5a-5h基因敲除tag-72car-t细胞介导tag-72hi表达靶细胞(ovcar-3细胞系)的有效细胞杀伤(图5a、5c、5e和5g)，但是不介导tag-72-neg/低癌症靶细胞(mes-ov细胞系)(图5b、5d、5f和5h)。在以1:1的效应物与靶标之比添加car-t细胞之前，允许靶细胞附着在板上过夜。在杀伤测定中包括未经转导的t细胞(nt)作为对照。在20小时内监测细胞阻抗(平均值±sd，表示为归一化细胞指数(nci))。还在整个过程中监测在正常生长条件下的靶细胞增殖(“仅靶细胞”)。(示出了以技术一式三份进行的来自一个供体的t细胞的代表性数据)。car-t(图5a-5h)：tag-72car-t细胞；pd-1(图5a-5b)：pd-1敲除tag-72car-t细胞；rc3h1(图5c和5d)：rc3h1敲除tag-72car-t细胞；rc3h2(图5c和5d)：rc3h2敲除tag-72car-t细胞；a2ar(图5e和5f)：a2ar敲除tag-72car-t细胞；fas(图5e和5f)：fas敲除tag-72car-t细胞；tgfbr1(图5g和5h)：tgfbr1显性阴性tag-72car-t细胞；tgfbr2(图5g和5h)：tgfbr2显性阴性tag-72car-t细胞。42.图6在nod scid gamma(nsg)小鼠异种移植模型中ovcar-3卵巢肿瘤的肿瘤生长曲线。每组四只nsg小鼠皮下施用1x107 ovcar-3肿瘤细胞(tag-72阳性)。当肿瘤生长到约150-200mm3时，每隔5天通过静脉注射过继转移两个剂量的5x106t细胞。数值和误差条代表平均肿瘤大小(mm3±sem)。nt：未经转导的t细胞；tag-72car-t：用tag-72car转导的t细胞；tag-72car/pd-1ko t：pd-1基因敲除tag-72car-t细胞；平均值±sem；示出了来自一个供体的t细胞的代表性数据。43.图7在ovcar-3卵巢肿瘤nsg小鼠异种移植模型中rc3h1和/或rc3h2基因敲除car-t细胞的抗肿瘤活性。每组四只nsg小鼠皮下施用1x107 ovcar-3肿瘤细胞(tag-72阳性)。当肿瘤生长到约150-200mm3时，每隔5天通过静脉注射过继转移两个剂量的5x106t细胞。数值和误差条代表平均肿瘤大小(mm3±sem)。nt：未经转导的t细胞；tag-72car-t：用tag-72car转导的t细胞；tag-72car/rc3h1 ko t：rc3h1基因敲除tag-72car-t细胞；tag-72car/rc3h2 ko t：rc3h2基因敲除tag-72car-t细胞；tag-72car/rc3h1,2ko t：rc3h1和rc3h2双基因敲除tag-72car-t细胞。**p《0.01，采用greisser-greenhouse校正的混合效果分析和dunnett多重比较单因素方差检验，将所有组平均值与tag-72car-t对照组比较。示出了来自一个供体的t细胞的代表性数据。44.图8在ovcar-3卵巢肿瘤nsg小鼠异种移植模型中a2ar和fas基因敲除car-t细胞的抗肿瘤活性。每组四只nsg小鼠皮下施用1x107 ovcar-3肿瘤细胞(tag-72阳性)。当肿瘤生长到约150-200mm3时，每隔5天通过静脉注射过继转移两个剂量的5x106t细胞。数值和误差条代表平均肿瘤大小(mm3±sem)。nt：未经转导的t细胞；tag-72car-t：用tag-72car转导的t细胞；tag-72car/a2ar ko t：a2ar基因敲除tag-72car-t细胞；tag-72car/fas ko t：fas基因敲除tag-72car-t细胞。*p《0.05，**p《0.01，#p《0.001，双向方差分析，然后dunnett多重比较检验，将所有组平均值与car-t对照组比较。示出了来自一个供体的t细胞的代表性数据。45.图9在ovcar-3卵巢肿瘤nsg小鼠异种移植模型中tgfbr1和tgfbr2显性阴性基因突变car-t细胞的抗肿瘤活性。每组四只nsg小鼠皮下施用1x107 ovcar-3肿瘤细胞(tag-72阳性)。当肿瘤生长到约150-200mm3时，每隔5天通过静脉注射过继转移两个剂量的5x106t细胞。数值和误差条代表平均肿瘤大小(mm3±sem)。nt：未转导的t细胞，tag-72car-t：用tag-72car转导的t细胞，tag-72car/tgfbr1 ko t：tgfbr1显性阴性基因敲除tag-72car-t细胞，tag-72car/tgfbr2 ko t：tgfbr2显性阴性基因敲除tag-72car-t细胞。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，双向方差分析，然后dunnett多重比较检验，将所有组平均值与car-t对照组比较。示出了来自一个供体的t细胞的代表性数据。46.图10在raji淋巴瘤肿瘤nsg小鼠异种移植模型中具有rc3h1和/或rc3h2基因敲除的cd19 car-t细胞的抗肿瘤活性。每组四只nsg小鼠皮下施用raji肿瘤细胞(cd19阳性)。肿瘤接种后3天，通过静脉注射用单个剂量的5x106 car-t细胞处理小鼠。(a)监测肿瘤大小23天。数值和误差条代表平均肿瘤大小(mm3±sem)。进行采用holm-sidak校正的多重t检验，以比较rc3h1和/或rc3h2基因敲除cd19 car-t细胞组与未经转染的cd19car-t细胞。(*p《0.005；**p《0.001)(b)使用对数秩(mantel-cox)检验分析kaplan-meier生存曲线。nt：未经转导的t细胞；cd19 car：cd19 car-t细胞；cd19 car/rc3h1 ko：rc3h1基因敲除cd19 car-t细胞；cd19car/rc3h2 ko：rc3h2基因敲除cd19 car-t细胞；cd19 car/rc3h1,2ko：rc3h1和rc3h2双基因敲除cd19 car-t细胞。示出了来自一个供体的t细胞的代表性数据。47.图11在持续活化暴露之后，在有或没有rc3h1和/或rc3h2基因ko的cd19 car-t细胞上活化标志物的表达。图示出了在抗原暴露7天之后在car+细胞上活化标志物cd25和cd69的表达。cd19 car-t细胞由单个健康供体生成。结果代表技术重复的平均值±sd。48.图12在单敲除和双敲除t细胞中rc3h1和rc3h2基因的crispr敲除分析。将rc3h1和rc3h2指导rna形成的rnp转染到人活化t细胞中以生成rc3h1或rc3h2单ko t细胞(rc3h1 ko t细胞或rc3h2 ko t细胞)，或rc3h1和rc3h2双ko t细胞(rc3h1,2ko t细胞)。使用ice分析分析敲除效率。框外indel百分比是表示移码或长度超过21bp的indel的比例。49.图13rc3h1和/或rc3h2 ko对没有car的t细胞(cd8+、cd4+)功能的影响。在dynabeadstm人t-活化剂cd3/cd28珠(thermofisher，马萨诸塞州，美国)(db)的存在下以1:1的珠与细胞之比将t细胞±rc3h1和/或rc3h2 ko在t细胞扩增培养基中保持至少92h。在测定中使用效应细胞之前，通过磁性除去珠。将效应细胞以1:1的效靶比(e:t)添加到靶癌细胞(在该实例中，ovcar-3)。监测nci超过20h。在所有条件下都观察到靶细胞消除(观察到nci降低)。重要地，在持续的cd3/cd28介导的活化之后，具有基因缺失的rc3h1和/或rc3h2基因的细胞能够在体外更有效地消除靶细胞。结果代表生物学和测定内一式三份的平均值+sem。50.图14在单敲除和双敲除nk-92细胞中rc3h1和rc3h2基因的crispr敲除分析。将rc3h1和rc3h2指导rna形成的rnp转染到nk-92细胞中，以生成rc3h1或rc3h2单ko nk-92细胞(rc3h1 ko nk-92细胞或rc3h2ko nk-92)，或rc3h1和rc3h2双ko nk-92细胞(rc3h1,2ko nk-92)。使用ice分析分析敲除效率。框外indel百分比是表示移码或长度超过21bp的indel的比例。通过pearson相关系数计算的r2值表示indel百分比的置信度。51.图15rc3h1和/或rc3h2 ko对nk-92细胞(有和没有tag-72car)功能的影响。使用实时细胞监测系统评估nk细胞系nk-92±rc3h1 ko(绿色)或rc3h2 ko(紫色)或rc3h1,2ko(橙色)±tag-72car体外消除癌细胞的能力。(a)使用crispr/cas9在nk-92细胞系中缺失rc3h1和/或rc3h2基因。将所得的rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92效应细胞以1:1的e:t比添加到靶癌细胞(mes-ov(左图)或ovcar-3(右图)中。监测nci超过40h.在所有条件下都观察到靶细胞消除(与单独的靶细胞(蓝色)相比，观察到nci降低)。结果代表技术三次重复的平均值±sem。(b)对nk-92细胞进行进一步的基因操作以引入tag-72car。在转染之后进行慢病毒转导。在培养约72h之后通过流式细胞术评估转导效率，其中每个点图中嵌入的值代表car+细胞的比例作为活的单细胞的频率。将所得的tag-72car/rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92细胞使用荧光活化细胞分选分离，并且如前所述的，评估其体外功能。(c)监测nci超过40h。结果代表平均值±sem，n＝1-3。52.图16生成crispr基因敲除诱导多能干细胞(ipsc)作为用于过继细胞疗法的细胞来源。从ipsc中获取基因敲除免疫细胞的工作流程。将ipsc转染以敲除目标基因。然后对这些细胞进行测序以表征和验证敲除，然后分化成cd34+细胞和免疫细胞。53.图17a-17b在ipsc(rc3h1,2ko ipsc)中的rc3h1和rc3h2双ko不影响多能性。其特征在于(a)形态(比例条＝200μm)，其中存在未分化细胞，以及(b)ipsc标志物tra-1-60、tra-1-81和ssea-4的流式细胞术分析。死细胞、碎片和双联体被排除，因此直方图示出了来自未经转染的ipsc或rc3h1,2ko ipsc样品的培养物中的所有活细胞。超过99％的所有活细胞表达所有ipsc标志物。54.图18a-18c rc3h1和rc3h2指导rna形成的rnp的转染将插入和缺失(indel)引入ipsc中特定基因的开放阅读框中。来自经rc3h1和rc3h2grna共转染的ipsc(“经编辑的样品”)的sanger测序轨迹显示，与未经转染的ipsc(“对照样品”)相比，rc3h1基因(a)和rc3h2基因(b)切割位点下游的碱基的不均匀混合(在a中，seq id no：27示出来自经编辑的样品的184至249bp，seq id no：28示出来自对照样品的183至248bp；在b中，seq id no：29示出来自经编辑的样品的270至336bp，seq id no：30示出来自对照样品的272至337bp)。对照样品的黑色下划线区域代表指导序列，水平红色虚线下划线区域是相关的pam位点。两条轨迹上的垂直黑色虚线代表切割位点。(c)经rc3h1和rc3h2 grna共转染ipsc的crispr敲除分析。使用ice分析评估rc3h1和rc3h2基因的敲除效率。框外indel百分比是表示移码或长度超过21bp的indel的比例。通过pearson相关系数计算的r2值表示indel百分比的置信度。55.图19ipsc中的rc3h1和rc3h2双ko不阻止向icd34+细胞分化。通过流式细胞术分析未经染色的细胞和用针对cd34+的抗体染色的细胞。死细胞、碎片和双联体被排除，因此直方图示出了来自未经转染的ipsc或rc3h1,2ko ipsc样品的培养物中的所有活cd34+细胞。rc3h1和rch32基因二者的缺失不能阻止ipsc发育成icd34细胞亚群。56.图20含有rc3h1和rc3h2双ko的ipsc能够向具有nkg2d和nkp46的nk细胞毒性受体应理解为“至少一个/种”，而不应理解为排除“两个/种或更多个/种”。65.如本文所用，“核酸构建体”通常是指人工或重组构建或制备的核酸分子，并且也可互换地被称为核酸载体。例如，可以使核酸构建体包括目标核苷酸序列，期望该目标核苷酸序列在细胞中转录，并且在一些情况下，产生具有期望功能的rna分子(例如反义rna、sirna、mirna或grna)，以及在另一些情况下，产生翻译成目标蛋白质(例如cas蛋白)的mrna。核酸构建体中的目标核苷酸序列可以可操作地连接至5'调节区(例如，启动子例如异源启动子)和/或3'调节区(例如，3'非翻译区(utr)例如异源3'utr)。核酸构建体可以是环状(例如质粒)或线性形式，可以是整合核酸(即，能够整合到宿主细胞的染色体中，例如，病毒载体例如慢病毒载体)或可以保持游离(例如，质粒)。66.一般描述67.本文公开了通过抑制一种或更多种所选基因的功能来提供具有增强功能的免疫细胞的方法。例如，本文已经证明，使用crispr/cas9基因编辑技术消融一种或更多种所选基因增强了体内细胞毒性淋巴细胞的持久性和抗肿瘤活性。因此，通过抑制免疫细胞或能够分化成免疫细胞的干细胞中一种或更多种所选基因的功能来提供方法。本文还公开了通过本发明方法制备的免疫细胞或干细胞，以及免疫细胞在治疗性治疗中的用途。68.免疫细胞69.如本文所用，“免疫细胞”应理解为包括哺乳动物免疫系统的细胞(例如淋巴细胞(t细胞、b细胞、nk细胞和nkt细胞)、嗜中性粒细胞和单核细胞(包括巨噬细胞和树突细胞))以及源自哺乳动物免疫系统的细胞的细胞系。免疫细胞可以从哺乳动物受试者中分离，从源自哺乳动物受试者的免疫细胞的细胞系培养物中收集，或通过从干细胞中分化产生。70.本公开内容旨在提供具有增强功能的免疫细胞。“增强的功能”意指作为本文公开的修饰或操作的结果而提供的免疫细胞，与对照免疫细胞(即，没有修饰或操作的免疫细胞)相比，表现出增强的活性(例如细胞毒性)、增殖、存活、持久性和/或浸润。免疫细胞的细胞毒性是指免疫细胞杀伤靶细胞的能力，通常通过基于受体的机制。71.在一些实施方案中，免疫细胞是细胞毒性免疫细胞，例如细胞毒性淋巴细胞。72.在一些实施方案中，免疫细胞是t细胞。在一些实施方案中，t细胞是nkt细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是nk细胞。73.提及“t细胞”应理解为提及包含t细胞受体的任何细胞。在这方面，t细胞受体可以包含α、β、γ或δ链中的任一种或更多种。如本领域技术人员将理解的，nkt细胞也表达t细胞受体，并且因此也可以根据本发明生成靶抗原特异性nkt细胞。本发明不旨在限制于任何特定的t细胞亚类，尽管在一个实施方案中，受试者t细胞表达α/βtcr二聚体。在一些实施方案中，所述t细胞是cd4+辅助t细胞、cd8+杀伤t细胞或nkt细胞。在不将本发明限制于任一种理论或作用方式的情况下，cd8+t细胞也被称为细胞毒性细胞。作为适应性免疫系统的主要部分，cd8+t细胞扫描细胞内环境，以主要靶向和破坏受感染的细胞。源自细胞内内容物的小肽片段被加工并且运输到细胞表面，其中它们在mhc i类分子的背景下呈递。然而，除了对病毒感染作出反应外，cd8+t细胞还通过监测和清除受损或异常细胞(包括癌症)来提供另外的免疫监视。mhc i呈递肽的cd8+t细胞识别通常导致释放细胞毒性颗粒或淋巴因子，或通过fas/fasl相互作用活化细胞凋亡途径以破坏主题细胞。另一方面，cd4+t细胞通常在mhc ii类的背景下识别由抗原呈递细胞呈递的肽，导致释放旨在调节b细胞和/或cd8+t细胞免疫反应的细胞因子。在各种免疫反应中也观察到具有细胞毒活性的cd4+t细胞。此外，cd4+car-t细胞显示出在体外与cd8+car-t细胞相当的细胞毒性，并且甚至对于更长久的抗肿瘤活性，在体内优于cd8+car-t细胞(参见例如，wang等,jci insight.2018；3(10):e99048；yang等,sci transl med.2017nov22；9(417),eaag1209)。74.自然杀伤t细胞(也被称为nkt或t/nk细胞)是表达半不变t细胞受体(tcrα-β)和通常与自然杀伤细胞相关的表面抗原的特化t细胞群。nkt细胞上的tcr是独特的，因为它通常识别由mhc i样分子cd1d呈递的糖脂抗原。大多数nkt细胞表达不变tcrα链和少数tcrβ链之一。i型nkt细胞上存在的tcr通常识别抗原α-半乳糖苷神经酰胺(α-galcer)。在该组中，已经鉴定出可区分的亚群，包括cd4+cd8-细胞、cd4-cd8+细胞和cd4-cd8-细胞。ii型nkt细胞(或非不变nkt细胞)表达更广泛的tcrα链并且不识别α-galcer抗原。nkt细胞产生具有多种通常相反作用(例如促进炎症或诱导免疫抑制(包括耐受性))的细胞因子。因此，它们可以有助于抗菌和抗病毒免疫反应，促进与肿瘤相关的免疫监视，以及抑制或促进自身免疫病的发展。与自然杀伤细胞一样，nkt细胞也可以诱导穿孔素、fas和tnf相关的细胞毒性。因此，提及t细胞应理解为包括提及nkt细胞。75.自然杀伤(nk)细胞是一种类型的细胞毒性淋巴细胞，其形成先天免疫系统的一部分。nk细胞提供对感染病毒的细胞的快速反应，在感染后约3天起作用，并且对肿瘤形成也产生反应。通常，免疫细胞(例如t细胞)检测受感染或转化细胞表面上存在的主要组织相容性复合物(mhc)，触发细胞因子释放并且导致靶细胞裂解或凋亡。然而，nk细胞具有在不存在抗体或mhc的情况下识别应激细胞的能力，允许更快的免疫反应。该作用尤其重要，因为缺少mhc i标志物的有害细胞无法被其他免疫细胞(例如t细胞)检测和破坏。与nkt细胞相比，nk细胞不表达tcr或cd3，但是它们通常表达表面标志物cd16(fcγriii)和cd56。76.在一些实施方案中，要根据本发明方法修饰或操作的免疫细胞可以从哺乳动物受试者分离，包括例如血液(全血、血清或血浆)、骨髓、胸腺、淋巴结。77.在一些实施方案中，要根据本发明方法修饰或操作的免疫细胞可以从源自哺乳动物受试者的免疫细胞的细胞系培养物(例如t细胞系)收集。78.在一些实施方案中，要根据本发明方法修饰或操作的免疫细胞可以从干细胞或其他祖细胞(例如从干细胞培养和分化的细胞)中分化。用于将干细胞分化成免疫细胞，特别是分化成t细胞或nk细胞的方法是本领域已知的(li等,human ipsc-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity,cell stem cell,2018,23(2):181-192e5；themeli等,generation of tumor-targeted human t lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy,nat biotechnol,2013,31(10):928-33；maeda等,regeneration of cd8alphabeta t cells from t-cell-derived ipsc imparts potent tumor antigen-specific cytotoxicity,cancer res,2016,76(23):6839-6850)。79.干细胞80.如本文所用，“源细胞”是指将通过重编程或分化转化成“衍生细胞”的细胞。适用于本文公开的方法的源细胞的实例包括干细胞。“衍生细胞”的实例包括免疫细胞，例如t细胞、nkt细胞和nk细胞。81.术语“干细胞”应理解为是指能够自我更新并且表现出在给定其特定表型的情况下向多个谱系方向发展的潜力的细胞，并且从而形成新的有机体或再生有机体的组织或细胞群。根据本发明利用的干细胞是多能的(pluripotent)和多效的(multipotent)并且能够沿两个或更多个谱系分化，并且包括但不限于胚胎干细胞(esc)、成体干细胞、脐带干细胞、造血干细胞(hsc)、祖细胞、前体细胞、多能细胞、多效细胞或去分化体细胞(例如诱导多能干细胞)。“多能”意指主题干细胞可以分化形成，尤其是三种胚层中任一种的细胞，这些胚层是外胚层、内胚层和中胚层。82.在一些实施方案中，源细胞也表达至少一种纯合主要hla基因型。在一些实施方案中，源细胞表达至少一种纯合hla基因型，该基因型是主要移植抗原并且优选地由显著比例的群体表达，例如至少5％、至少10％、至少15％、至少17％、至少20％或更多的群体。当纯合hla基因型对应于显性mhc i或mhc ii hla类型(在组织排斥方面)时，在治疗方案的背景下使用此种细胞导致在接受本发明细胞的更广泛群体中显著减少的组织排斥问题。在另一些实施方案中，源细胞关于多于一种hla抗原，例如两种、三种或更多种hla抗原可以是纯合的。目标hla抗原可以选自例如hla a1、b8、c7、dr17、dq2，或hla a2、b44、c5、dr4、dq8，或hla a3、b7、c7、dr15、dq6。83.在一些实施方案中，源细胞关于抑制基因是纯合的。84.在一些实施方案中，源细胞已经在本文鉴定的一种或更多种基因中进行遗传修饰，使得在从经遗传修饰的源细胞分化的衍生细胞中经修饰的基因的功能被抑制。85.在一些实施方案中，源细胞也已经被遗传修饰以包含编码car的核酸(即，嵌合抗原受体)。可以通过本领域已知的方法将编码car的核酸引入源细胞中。86.在一些实施方案中，源细胞是干细胞。在一些实施方案中，源细胞是诱导多能干细胞(ipsc)。87.在一些实施方案中，能够分化成免疫细胞的祖细胞用于被修饰；例如，从多能干细胞(例如ipsc)培养的细胞，在培养中已经历一些向免疫细胞的分化，但是尚未完全分化成免疫细胞。88.ipsc89.ipsc通常直接从体细胞生成。ipsc原则上可以从任何有核细胞诱导，包括例如来自血液的单核细胞和皮肤细胞。在一些实施方案中，ipsc可以由完全分化的t细胞生成；或者从前体t细胞(例如胸腺细胞，这些前体t细胞已经开始甚至完成它们的tcr的重排并且表现出目标抗原特异性)生成。在另一个实施方案中，用一种或更多种编码针对目标抗原决定簇(例如，肿瘤抗原决定簇)的tcr(例如重排的tcr基因)的核酸分子转染ipsc。在一个实施方案中，ipsc源自表达重排的tcr，优选重排的αβtcr的细胞。在另一个实施方案中，所述细胞表达重排的γδtcr。适用于生成本发明的ipsc的细胞的实例包括但不限于cd4+t细胞、cd8+t细胞、nkt细胞、胸腺细胞或其他形式的前体t细胞。90.在另一个实施方案中，ipsc源自另一种类型的免疫细胞，例如nk细胞。91.用于从成熟或分化细胞(例如t细胞或前体t细胞)生成ipsc的方法是本领域技术人员已知的(themeli,kloss等2013，li,hermanson等2018)。92.在一些实施方案中，源细胞是诱导多能干细胞(ipsc)。93.在一些实施方案中，源细胞从脐带血pbmc(外周血单核细胞)生成。94.在一些实施方案中，主题源细胞是与多能干细胞相比更向免疫细胞分化的细胞。95.通过本文公开的方法生成的衍生免疫细胞包括能够分化成免疫细胞的造血谱系细胞和特定类型的免疫细胞。衍生免疫细胞的实例是he、pre-hsc、hsc、多能祖细胞、常见淋巴祖细胞、早期胸腺祖细胞、pre-t细胞祖细胞、pre-nk祖细胞、t祖细胞、nk祖细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞(例如t细胞、nk-t细胞和nk细胞)。96.本公开内容涉及提供具有增强功能的免疫细胞或通过分化产生的衍生免疫细胞。“增强的功能”意指作为本文公开的修饰或操作的结果提供的免疫细胞，与对照免疫细胞(即，没有修饰或操作的免疫细胞)相比，表现出增强的活性(例如细胞毒性)、增殖、存活、持久性和/或浸润。免疫细胞的细胞毒性是指免疫细胞杀伤靶细胞的能力，通常通过基于受体的机制。97.要抑制的基因98.根据本公开内容，本文鉴定的一种或更多种基因的功能的抑制可以增强免疫细胞的功能。99.如本文所用，“基因功能的抑制”意指由基因编码的蛋白质的水平和/或活性最终降低或消除。因此，基因的功能可以由于对基因的基因组dna序列的操作或修饰(例如，导致基因的破坏)，由于抑制mrna(例如，降低mrna的水平或功能，例如通过抑制转录或翻译)，或由于抑制蛋白质(例如，通过降低蛋白质的水平或活性)而被抑制。在一些实施方案中，当将在经修饰的细胞中由基因编码的蛋白质的水平和/或活性与在未经修饰的细胞中蛋白质的水平和/或活性比较时，抑制程度为至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。100.在一些实施方案中，要抑制其功能的基因选自rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2。在一些实施方案中，抑制针对选自rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2的单基因；例如，是rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1或tgfbr2的单基因。在一些实施方案中，抑制针对选自rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2的单基因，与至少另一种基因的抑制组合。在一些实施方案中，抑制针对选自rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2的基因中的两种或更多种，例如rc3h1和rc3h2基因、tgfbr1和tgfbr2基因、tgfbr1和rc3h2基因；并且任选地与至少另一种基因的抑制组合。101.如下所述，rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2的基因组的成员是本领域已知的涉及免疫细胞功能。然而，本领域不知道单独或组合地抑制这些基因的功能是否产生不利后果。特别地，预期完全除去这些基因的功能(例如，通过基因编辑)可能对重要的细胞功能产生不利影响，从而导致细胞活力或复制能力降低。此外，预期在干细胞(例如，ipsc)中除去这些基因的功能对细胞功能产生不利影响，例如活力、自我更新、多能性、分化成特定细胞类型(例如免疫细胞)的能力和使这些细胞类型起作用。本领域技术人员将认识到，保持这些关键细胞功能是本发明的关键特征。102.rc3h1、rc3h2103.rc3h1也被称为rc3h1、roquin-1、环指和ccch型结构域1、环指和含有ccch型锌指结构域的蛋白1、环指和c3h锌指蛋白1、环指和ccch型锌指结构域1、roq1、rnf198或环指蛋白198。104.rc3h2也被称为roquin-2、roquin2、环指和ccch型结构域2、环指和含有ccch型锌指结构域的蛋白2、环指和ccch型锌指结构域2、mnab、roq2、rnf164或环指蛋白164。105.蛋白质的roquin家族包括roquin1(由rc3h1编码)和roquin2(由rc3h2编码)，其是在先天和适应性免疫系统中起重要作用的rna结合蛋白(athanasopoulos,v.,r.r.ramiscal和c.g.vinuesa,roquin signalling pathways in innate and adaptive immunity.eur j immunol,2016,46(5):第1082-90页)。小鼠(sanroque小鼠)中的rc3h1突变导致t细胞中icos表达增加，这在小鼠中引起狼疮样自身免疫综合征(yu,d.等,roquin represses autoimmunity by limiting inducible t-cell co-stimulator messenger rna.nature,2007,450(7167):第299-303页)。尽管在小鼠中单独的rc3h1或rc3h2敲除不产生自身抗体并且缺乏自身免疫，但是rc3h1和rc3h2双敲除小鼠显示出与sanroque小鼠相似的免疫生理表型。迄今为止，没有发现人携带引起rc3h1或rc3h2突变的疾病(athanasopoulos,v.,r.r.ramiscal和c.g.vinuesa,roquin signalling pathways in innate and adaptive immunity.eur jimmunol,2016,46(5):第1082-90页)。rc3h1和rc3h2基因在人t细胞中的作用，尤其是其在细胞毒性细胞中的功能，在本公开内容之前是未知的。106.根据本公开内容，rc3h1和rc3h2基因之一或两者的功能的抑制增强了免疫细胞的功能。107.a2ar108.a2ar也被称为adora2a、腺苷a2a受体、腺苷受体a2a、adora2、腺苷受体亚型a2a或rdc8。109.通过肿瘤细胞生成的细胞外腺苷是一种关键的免疫抑制代谢物，其通过腺苷2a受体(a2ar)限制细胞毒性淋巴细胞的活化并且抑制抗肿瘤免疫反应。110.根据本公开内容，a2ar基因的功能的抑制(例如通过基因编辑(例如通过基于特别设计的指导rna的crispr/cas9介导的))增强免疫细胞的功能。111.fas112.fas也被称为fas细胞表面死亡受体、apt1、cd95、fas1、apo-1、fastm、alps1a或tnfrsf6。113.fas受体(也被称为cd95和apo-1)诱导细胞毒性t细胞的细胞凋亡和终末分化。fas与其配体fasl的接合可能抑制car-t细胞的抗肿瘤活性。114.根据本公开内容，fas基因的功能的抑制(例如通过基因编辑(例如通过crispr/cas9介导的))增强免疫细胞的功能。115.tgfbr1和tgfbr2116.tgfbrl也被称为tgfrbri、tgfb受体1、tgf-β受体1、aat5、alk5、essl、ldsl、msse、skr4、tbri、alk-5、lds1a、lds2a、tbr-1、tgfr-1、acvrlk4、tβr-i、转化生长因子β受体1或转化生长因子β受体i。117.tgfbr2也被称为tgfbrii、aat3、faa3、lds2、mfs2、riic、lds1b、lds2b、taad2、tbrii、tbr-ii、tgfr-2、tgfβ-rii、转化生长因子β受体2或转化生长因子β受体ii。118.tgf-β发挥全身免疫抑制作用，并且抑制宿主免疫监视，被认为是肿瘤中免疫抑制微环境的主要因素之一。119.根据本公开内容，tgfbrl和/或tgfbr2基因的功能的抑制(例如通过基因编辑(例如通过基于特别设计的指导rna的crispr/cas9介导的))增强免疫细胞的功能。120.根据本公开内容，选自rc3h1、rc3h2、a2ar、fas、tgfbr1和tgfbr2的基因中的至少一种的功能的抑制，与至少另一种基因的抑制组合，增强免疫细胞的功能。121.抑制基因的功能122.基因功能的抑制可以通过多种方法来实现，例如通过基因编辑(通过例如rna干扰或反义寡核苷酸抑制翻译)，或通过使用化合物(例如直接拮抗蛋白质产物的小分子或抗体)。123.通过基因编辑抑制124.在一些实施方案中，基因功能的抑制通过使用修饰基因的基因组序列的基因编辑系统来实现。125.基因编辑系统通常包括与核酸酶偶联的dna结合蛋白或dna结合核酸。dna结合蛋白或dna结合核酸与基因的靶向区域特异性结合或杂交，并且核酸酶在基因的靶向区域中产生一个或更多个双链断裂和/或一个或更多个单链断裂。靶向区域可以是基因的编码区，例如在外显子中，靠近编码区的n末端部分(例如，在第一或第二外显子中)。双链或单链断裂可以通过细胞修复过程进行修复，例如通过非同源末端连接(nhej)或同源定向修复(hdr)。在一些情况下，修复过程引入插入、缺失、错义突变或移码突变(包括例如双等位基因移码突变)，导致基因的破坏和基因功能的抑制。126.基因编辑系统的实例包括包含dna结合蛋白和核酸酶(例如锌指核酸酶(zfn)或tal效应核酸酶(talen))的融合物，或rna指导的核酸酶，例如成簇规律间隔短回文核酸(crispr)-cas系统。127.zfp和talen128.在一些实施方案中，基因功能的抑制通过利用基因编辑系统来实现，该基因编辑系统包括与核酸内切酶融合dna结合蛋白，例如一种或更多种锌指蛋白(zfp)或转录活化因子样蛋白(tal)。实例包括zfn、tale和talen。129.zfp和tal的dna结合结构域可以被“工程化”以与目标靶dna序列结合。例如，可以修饰天然存在的锌指或tale蛋白的识别螺旋区的一个或更多个氨基酸，以直接与预定的dna序列结合。合理设计的标准在例如美国专利6,140,081、美国专利6,453,242、美国专利6,534,261、wo 98/53058、wo 98/53059、wo 98/53060、wo 02/016536、wo 03/016496和美国专利公开号20110301073a1中被描述。130.在一些实施方案中，dna结合蛋白包含锌指蛋白(zfp)或zfp的一个或更多个锌指结构域。zfp或其结构域通过一个或更多个“锌指”(结合结构域内的氨基酸区域，其结构通过锌离子的配位而稳定)以序列特异性方式与dna结合。天然存在的zfp的序列特异性可以通过在锌指识别螺旋上的某些位置处进行氨基酸取代来改变。另外，许多工程化的基因特异性锌指是可商购获得的(参见，例如，用于锌指构建的compozr平台，由sangamo biosciences(richmond，加利福尼亚州，美国)与sigma-aldrich(st.louis，密苏里州，美国)合作开发)。因此，在一些实施方案中，zfp被工程化以与在本文中鉴定为要抑制的基因内的靶序列结合。典型的靶序列包含外显子、编码序列n末端区域附近的区域(例如，第一外显子、第二外显子)和5'调节区(启动子或增强子区域)。zfp与核酸内切酶或dna切割结构域融合以形成锌指核酸酶(zfn)。dna切割结构域的实例包括iis型限制酶的dna切割结构域。131.在一些实施方案中，通过转染包含编码zfn的核酸序列的核酸构建体将zfn引入细胞(例如免疫细胞或干细胞)中。然后在该细胞中zfn从构建体中表达并且导致靶基因的编辑和破坏。在一些实施方案中，zfn以其蛋白质形式被引入细胞中。132.在一些实施方案中，dna结合蛋白包含天然存在的或工程化的转录活化因子样蛋白(tal)dna结合域，例如在转录活化因子样蛋白效应子(tale)蛋白中。参见，例如us 20110301073 a1，通过引用并入本文。tale dna结合结构域是包含一个或更多个tale重复序列的多肽，每个重复序列的长度为33-35个氨基酸并且包含1或2个dna结合残基。已经确定tal重复序列的12和13位处的hd(组胺-天冬氨酸)序列导致与胞嘧啶(c)结合，ng(天冬酰胺-甘氨酸)与t结合，ni(天冬酰胺-异亮氨酸)与a结合，以及nn(天冬酰胺-天冬酰胺)与g或a结合。参见，例如us 20110301073 a1。在一些实施方案中，tale可以被设计成具有对本文中鉴定为要抑制的基因内的目标靶dna序列具有特异性的tal重复序列阵列。定制设计的tale阵列也可通过cellectis bioresearch(巴黎，法国)、transposagen biopharmaceuticals(列克星敦，肯塔基州，美国)和life technologies(格兰德岛，纽约州，美国)商购获得。在一些实施方案中，tal dna结合结构域与核酸内切酶融合以形成tale-核酸酶(talen)，其在本文中鉴定为要抑制的基因内的靶位点处切割核苷酸序列。133.在一些实施方案中，通过转染包含编码talen的核酸序列的核酸构建体(例如，质粒、mrna或慢病毒载体)将talen引入细胞中。然后在该细胞中talen从构建体中表达并且导致靶基因的编辑和破坏。在一些实施方案中，将talen以其蛋白质形式引入细胞中。134.crispr/cas135.在一些实施方案中，基因功能的抑制通过利用用于基因编辑的crispr(用于“成簇规律间隔短回文重复”)/cas(用于“crispr相关核酸酶”)系统来实现。crispr/cas是本领域众所周知的，其中试剂和方案易于获得(mali等,2013,science,339(6121),823-826；hsu等,2014,cell,157.6:1262-1278；jiang等,2013,nature biotechnology,31,233-239；anzalone等,nature(2019)doi:10.1038/s41586-019-1711-4；komor等,nature 533:420–424,2016；gaudelli等,nature 551:464-471(2017))。示例性crispr-cas基因编辑协议在jennifer doudna和prashant mali,2016,"crispr-cas:a laboratory manual"(cshl press,isbn:978-1-621821-30-4)和ran等2013,nature protocols,8(11):2281-2308中被描述。136.crispr/cas系统通常包含两种组分：(1)rna依赖性dna核酸酶，本文中也被称为crispr核酸内切酶或cas蛋白，例如cas9、cas12或其他替代核酸酶；(2)非编码短“指导rna”，其包含含有crrna(“crispr rna”)和tracrrna(“反式活化crrna”)的双rna或单链全长指导rna，并且包含将核酸酶指导到基因组中的靶位点的靶向序列。指导rna(grna)将核酸酶指导到靶位点，其中核酸酶在靶位点的dna中生成双链断裂(dsb)。然后通过两种一般修复途径之一修复所得dsb：非同源末端连接(nhej)途径和同源定向修复(hdr)途径。nhej修复途径是最活跃的修复机制，能够快速修复dsb，但是经常导致dsb位点处的小核苷酸插入或缺失(indel)，导致移码突变以敲除功能基因。hdr途径效率较低，但是具有高保真度。当crispr核酸内切酶提供有断裂区域同源的dna模板时，使用同源dna模板通过hdr修复双链断裂。hdr途径允许将大的基因插入片段与rnp一起插入细胞中。137.包含靶向目标基因中的靶位点的序列的grna序列的设计或选择已经在本领域中被描述。靶位点可以包括调节区序列(例如启动子和增强子)，或编码区内的序列(例如外显子，例如5'端附近的外显子，或编码蛋白质特定结构域或区域的外显子)。在一些实施方案中，基于其紧邻pam序列5'的位置来选择靶位点，例如通常ngg或nag。138.指导序列被设计为包括与靶序列(靶位点处的核苷酸序列)具有互补性的靶向序列。不一定需要完全互补性，只要有足够的互补性以引起指导序列与靶序列之间的特异性杂交并且促进在靶位点处形成crispr复合物即可。在一些实施方案中，grna的靶向序列与靶序列之间的互补性程度为至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高(例如，100％或完全互补).139.在一些实施方案中，指导序列的长度为至少15个核苷酸，例如,,15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列的长度不超过75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25或20个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列的靶向序列部分的长度为约20个核苷酸。具有靶标互补性的较短区域(《20个核苷酸)的截短grna已经被描述为有效提高靶标特异性(参见，例如fu等,nature biotechnol.,32(3):279-284,2014)。因此，在一些实施方案中，指导rna的靶向序列的长度为17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，指导rna的靶向序列与靶位点处的核苷酸序列完全互补。在其中指导rna的靶向序列与靶位点处的核苷酸序列不完全互补的一些实施方案中，靠近基因组中pam序列的靶向序列部分(也被称为种子区域)与靶位点处的核苷酸序列完全互补。换言之，指导序列(即非种子区)的核苷酸5'的一些变化是允许的。例如，指导序列可以被设计为包含长度至少为17个核苷酸(例如长度为17、18、19或20个核苷酸)的靶向部分，具有与靶序列中的至少17个核苷酸完全互补的至少17个核苷酸的种子区域。140.表1中提供了特定基因中的靶序列的实例。在一些实施方案中，指导序列包含17-20个核苷酸的靶向序列，其中种子区域中的至少17个核苷酸(靶向序列的3'部分)与靶序列中的至少17个核苷酸完全互补，例如与靶序列3'端的17个核苷酸完全互补。141.表1142.[0143][0144]用于crispr基因组编辑的grna数据库是可公开获得的，其提供了人基因组或小鼠基因组的组成型基因外显子中的示例性sgrna靶序列(参见，例如由genscript和麻省理工学院提供的grna数据库；还参见sanjana等(2014)nat.methods,11:783-4)。在一些实施方案中，grna序列是或包含与非靶基因具有最小脱靶结合的序列。[0145]适用于在本文中使用的cas蛋白或crispr核酸内切酶的实例包括cpfl(zetsche等,cell(2015)163(3):759-771)、cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也被称为csn1和csx12)、cas100、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3或csf4或者其功能衍生物(即，天然存在的crispr核酸内切酶的突变形式或衍生物，例如其片段，其基本上保留天然存在形式的rna依赖性核酸内切酶活性)。参见，例如us20180245091a1和us20190247517a1。在一些实施方案中，cas蛋白是cas9，例如来自化脓性链球菌(s.pyogenes)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)或肺炎链球菌(s.pneumoniae)的cas9。在一些实施方案中，cas蛋白是来自化脓性链球菌的cas9蛋白，其具有在swissprot数据库中以登录号q99zw2提供的氨基酸序列。[0146]在一些实施方案中，基因功能的抑制通过crispr介导的基因编辑来实现，其包括将编码cas核酸酶的第一核酸和编码对本文中鉴定为要抑制的基因中的靶序列具有特异性的指导rna(grna)的第二核酸引入细胞(例如免疫细胞或干细胞)中。这两种核酸可以包含在一个核酸构建体(或载体)中，或提供在不同的构建体(或载体)上，以实现cas蛋白和grna在细胞中的表达。cas核酸酶和grna在细胞中的表达指导在靶序列处形成crispr复合物，这导致dna切割。[0147]在一些实施方案中，基因功能的抑制通过crispr介导的基因编辑来实现，其包括将grna和cas核酸酶的组合或复合物引入细胞中。在一些实施方案中，cas蛋白/grna组合或复合物可以通过以下方法递送到细胞中：例如电穿孔、基因枪、磷酸钙转染、细胞压缩或挤压、脂质体、纳米颗粒、显微注射、裸dna质粒转移、蛋白质转导结构域介导的转导或病毒介导(包括整合病毒载体(例如逆转录病毒和慢病毒)以及非整合病毒载体(例如腺病毒、aav、hsv、牛痘))。[0148]无论使用何种特定基因编辑方法，为了确认基因序列已经被修饰并且基因功能已经被抑制，可以进行多种测定，包括例如通过凭借southern和northern印迹、包括rt-pcr的pcr或核酸测序检查dna或mrna，或通过凭借例如免疫学方式(elisa和蛋白质印迹)检测特定蛋白质或肽的存在或活性。[0149]在一些实施方案中，rc3h1、rc3h2、a2ar和fas基因中的至少一种的功能通过通过crispr/cas9系统将indel引入这些基因中的至少一种的早期外显子中而被抑制，这导致这些基因中的至少一种的移码突变，使得不从经编辑的基因中翻译功能性蛋白质。在一些实施方案中，rc3h1、rc3h2、a2ar和fas基因中的两种或更多种的功能通过使用crispr/cas9将indel引入这些基因中的两种或更多种的早期外显子中而被抑制，导致这些基因中的两种或更多种的移码突变，使得不从经编辑的基因中翻译功能性蛋白质。在一些实施方案中，rc3h1、rc3h2、a2ar和fas基因中的两种或更多种包含与另一种基因组合的rc3h2，例如rc3h2和rc3h1。[0150]在一些实施方案中，tgfbrl和tgfbr2基因中的至少一种的功能通过通过crispr/cas9系统将indel引入外显子和用于这些基因中至少一种的细胞内信号转导结构域的起始氨基酸残基的密码子上游而被抑制，导致除去细胞内信号转导结构域的移码突变，这是一种显性阴性突变。在一些实施方案中，tgfbrl和tgfbr2基因两者的功能通过使用crispr/cas9将indel引入外显子和用于这些基因中至少一种的细胞内信号转导结构域的起始氨基酸残基的密码子上游而被抑制，导致除去细胞内信号转导结构域的移码突变，这是一种显性阴性突变。[0151]通过使用切口酶(即，cas9切口酶)和高保真酶，还可以在没有双链断裂或供体dna的情况下使用crispr/cas系统。参见，例如anzalone,a等,nature(2019)doi:10.1038/s41586-019-1711-4；komor等,nature 533:420–424,2016；gaudelli等,nature 551:464-471(2017)。[0152]通过降低或消除mrna的水平或功能来抑制[0153]在一些实施方案中，基因功能的抑制通过降低或消除从该基因转录的mrna的水平或功能(即抑制mrna)来实现。与通过基因编辑系统的抑制不同，mrna的抑制是暂时的。[0154]在一些实施方案中，mrna的抑制可以通过使用例如反义核酸、核酶、小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、mirna(微rna)或其前体，或可以在细胞中转录以产生反义rna、sirna、shrna、mirna或其前体的核酸构建体来实现。[0155]反义-反义技术是众所周知的方法。反义rna是与内源性mrna的全长或部分互补并且通过与内源性mrna形成双链体来阻断从内源性mrna的翻译的rna分子。反义rna可以合成地制备并且引入目标细胞(例如免疫细胞)中，或在目标细胞中通过从外源引入的核酸构建体转录制备，以实现对目标基因表达的抑制。反义rna不必与来自目标基因的全长mrna互补。然而，反义rna的长度应该足以与靶mrna形成双链体并且阻断基于靶mrna的翻译。通常，反义rna的长度为至少15个核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、35、40、50、75、100、200、300、400、500个核苷酸或更多。在一些实施方案中，反义rna的长度不超过500、400、300、200、100、75或50个核苷酸。反义分子也可以是dna、dna类似物和rna类似物。[0156]核酶-核酶(即，催化性rna)可以被设计为与靶rna特异性配对并且在特定位置切割磷酸二酯骨架，从而使靶rna功能性失活。参见，例如美国专利号6,423,885、美国专利号5,254,678和perriman等,pnas 92(13):6175-6179(1995)。核酶可以合成地制备并且引入目标细胞(例如免疫细胞)中，或在目标细胞中通过从外源导入的核酸构建体转录制备。[0157]rnai(rna干扰)-通过rnai抑制基因表达或翻译是本领域已知的，并且可以利用rna分子(例如sirna(“小干扰rna”)、shrna(“短发夹rna”)和mirna(“微rna”))来实现。已知sirna和shrna参与rna干扰途径并且干扰特定基因的表达。sirna是小的(通常长度为20-25个核苷酸)双链rna，并且可以被设计为包含与靶mrna(即，从目标基因转录的mrna)或靶mrna的一部分同源或互补的序列。shrna被核糖核酸酶dicer切割以产生sirna。鉴于靶基因的序列，sirna或shrna可以合成地设计和制备并且引入目标细胞(例如免疫细胞)中，或在目标细胞(例如免疫细胞)中从外源引入的编码此种rna的核酸构建体制备。mirna也是从由非蛋白质编码基因转录的长前体加工的小rna分子(通常约21-22个核苷酸)，并且通过与靶mrna的不精确碱基配对中断翻译。mirna或其前体(pri-mirna或pre-mirna)可以合成地制备并且引入目标细胞(例如免疫细胞)，或在目标细胞(例如免疫细胞)中从外源引入的编码mirna或其前体的核酸构建体制备。[0158]在一些实施方案中，mrna的抑制可以使用经修饰形式的crispr/cas系统来实现，其中为酶失活核酸酶的cas分子与靶向目标基因的grna组合使用。靶位点可以在基因的5'调节区(例如，启动子或增强子区)。在一些实施方案中，cas分子是酶失活的cas9分子，其包含消除或显著降低dna切割活性的突变，例如点突变(参见，例如wo2015/161276)。在一些实施方案中，酶失活的cas9分子直接或间接地与转录阻遏蛋白融合。[0159]通过其他方式抑制[0160]本发明包括本领域已知的用于抑制基因功能，包括用于降低由该基因编码的蛋白质的水平或活性的其他方法，例如通过将直接抑制由该基因编码的蛋白质的活性的化合物(例如小分子、抗体等)引入细胞(例如免疫细胞)中。[0161]car[0162]在一些实施方案中，被修饰以抑制一种或更多种所选基因的细胞(例如免疫细胞或干细胞)也被修饰以含有编码嵌合抗原受体(或“car”)的核酸。[0163]在一些实施方案中，可以在细胞被修饰以抑制所选基因的功能之前、同时或之后将编码car的核酸引入细胞中。在其中抑制是瞬时的(例如，通过反义rna或rnai)的实施方案中，优选地在细胞被修饰以实现抑制之前将编码car的核酸引入细胞中。在其中抑制是永久的(例如，通过基因编辑)的实施方案中，可以在细胞被修饰以实现抑制之前、同时或之后将编码car的核酸引入细胞中。在一些实施方案中，编码car的核酸被设计为允许在引入dsb之后通过hdr插入基因编辑的靶位点，即，通过敲入或插入编码car的核酸破坏该基因。[0164]在一些实施方案中，car基因可以通过多种技术引入细胞中，包括慢病毒或逆转录病毒载体、转座子系统、crispr-cas9或talen介导的基因敲入。[0165]术语“嵌合抗原受体”(“car”，也被称为“人工t细胞受体”、“嵌合t细胞受体”和“嵌合免疫受体”)应理解为是指将抗原识别部分移植到免疫细胞上的工程化受体。一般而言，car是由对靶抗原具有特异性的抗原识别部分、跨膜结构域和在免疫细胞上天然表达的受体的细胞内/细胞质信号传导结构域组成，彼此可操作地连接。“可操作地连接”意指各个结构域彼此连接，使得在抗原识别部分与靶抗原结合后，通过细胞内信号传导结构域诱导信号以活化表达car的细胞(例如，t细胞或nk细胞)并且使其效应功能被活化。[0166]car的抗原识别部分是受体的细胞外部分，其识别并且结合靶抗原的表位。抗原识别部分通常是但不限于scfv。[0167]car的细胞内结构域可以包括免疫细胞的天然存在受体的初级细胞质信号传导序列和/或免疫细胞的天然存在受体的次级或共刺激序列。初级细胞质信号传导序列的实例包括源自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3 epsilon、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。在一些实施方案中，car的细胞内信号传导结构域包含cd3-ζ的细胞质信号传导序列。在一些实施方案中，car的细胞内信号传导结构域可以包含与共刺激分子的共刺激信号传导序列组合的cd3-ζ的细胞质信号传导序列。合适的共刺激分子的实例包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、tim3、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3等。在一些实施方案中，car的细胞质结构域被设计为包含cd3-ζ的信号传导结构域和cd28的信号传导结构域。[0168]car的跨膜结构域通常是典型的疏水性α螺旋，其跨越膜并且可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜结构域可以源自天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，跨膜区可以源自t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154，或源自免疫球蛋白例如igg4。可替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下它主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。[0169]术语“靶抗原”应理解为是指由细胞表达的任何蛋白质或非蛋白质分子，其是试图被表达受体的免疫细胞(例如t细胞或nk细胞)靶向的。靶抗原可以是“自身”分子(在患者机体中表达的分子)或非自身分子(例如，来自受感染的微生物)。本文所指的靶抗原不限于天然能够引发t或b细胞免疫反应的分子；相反，“靶抗原”是指试图被靶向的任何蛋白质或非蛋白质分子。在一些实施方案中，靶抗原在细胞表面上表达。应理解，靶抗原可以仅由靶细胞表达，或它可以由非靶细胞表达。在一些实施方案中，靶抗原是非自身分子或仅由试图被靶向的细胞表达或由试图被靶向的细胞以显著高于正常细胞的水平表达的分子。靶抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原(例如mart-1/melana(mart-i)、gp100(pmel 17)、酪氨酸酶、trp-1、trp-2)和肿瘤特异性多谱系抗原(例如，mage-1、mage-3、bage、gage-1、gage-2、pl5)；过表达的糖蛋白，例如muc1和muc16；过表达的胚胎抗原，例如cea；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，例如p53、ras、her-2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原；例如bcr-abl、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar；和病毒抗原，例如爱泼斯坦-巴尔病毒抗原ebva和人乳头瘤病毒(hpv)抗原e6和e7。其他肿瘤相关抗原包括叶酸受体α(frα)、egfr、cd47、cd24、tsp-180、mage-4、mage-5、mage-6、rage、ny-eso、pl 85erbb2、pl80erbb-3、cmet、nm-23hl、psa、ca19-9、cam 17.1、numa、k-ras、β-联蛋白、cdk4、mum-1、p 15、p 16、43-9f、5t4、791tgp72、α-胎蛋白、β-hcg、bca225、btaa、ca125、ca 15-3ca27.29bcaa、ca 195、ca 242、ca-50、cam43、cd68p1、co-029、fgf-5、g250、ga733epcam、htgp-175、m344、ma-50、mg7-ag、nb/70k、ny-co-1、rcas 1、sdccag16、ta-90mac-2结合蛋白亲环蛋白c相关蛋白、taal6、tag-72、tlp、tps、psma、间皮素或bcma。[0170]在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤相关抗原，特别是蛋白质、糖蛋白或非蛋白质肿瘤相关抗原。[0171]在一些实施方案中，靶抗原选自cd47、叶酸受体α(frα)和bcma。[0172]在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤相关抗原，例如肿瘤相关抗原tag-72。[0173]在另一些实施方案中，靶抗原是表面蛋白，例如cd24，并且在另一个实施方案中，可用于肿瘤靶向的表面蛋白，例如cd19或cd20。[0174]经修饰的细胞的药物组合物和治疗用途[0175]在另一方面，本文提供了组合物，其包含通过本文公开的方法产生的细胞，即其中一种或更多种所选基因的功能已经被抑制的经修饰的细胞。[0176]在一些实施方案中，本文提供了药物组合物，其包含本文产生的细胞和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括溶剂、分散介质、等渗剂等。载体的实例包括油、水、盐溶液、凝胶、脂质、脂质体、树脂、多孔基质、防腐剂等，或者其组合。在一些实施方案中，药物组合物被制备和配制用于向患者施用，例如用于过继细胞疗法，通常以单位剂量可注射形式(溶液、混悬液、乳剂)。在一些实施方案中，药物组合物可以采用定时释放、延迟释放和持续释放的递送系统。[0177]在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量的细胞，例如治疗有效量或预防有效量。在一些实施方案中，药物组合物包含本文公开的经修饰的细胞，其量为约1百万至约1000亿个细胞，例如至少1、5、10、25、50、100、200、300、400或500个百万个细胞，至多约10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000亿个细胞。[0178]在一些实施方案中，药物组合物还包含另一种活性剂或药物，例如化疗剂。[0179]在另一方面，本文提供了本文公开的经修饰的细胞的方法和用途，例如过继细胞疗法中的治疗方法和用途。[0180]在一些实施方案中，方法包括向患有疾病或病症或者有发展疾病或病症风险的受试者施用本文公开的经修饰的细胞或包含本文公开的经修饰的细胞的组合物。[0181]在一些实施方案中，疾病或病症是肿瘤病症(即癌症)、微生物或寄生虫感染(例如hiv、std、hcv、hbv、cmv、covid-19或抗生素抗性细菌)、自身免疫病(例如类风湿性关节炎(ra)、i型糖尿病、系统性红斑狼疮(sle)、炎症性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘)、器官纤维化(例如心脏、肺、肝等)或子宫内膜异位症。[0182]在一些实施方案中，肿瘤病症包括中枢神经系统肿瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、儿科肿瘤、头和颈癌(例如鳞状细胞癌)、乳腺癌和前列腺癌、肺癌(小细胞和非小细胞肺癌)、肾癌(例如肾细胞腺癌)、食道胃癌、肝细胞癌、胰胆管肿瘤(例如腺癌和胰岛细胞肿瘤)、结直肠癌、宫颈癌和肛门癌、子宫癌和其他生殖道癌、泌尿道癌(例如，输尿管和膀胱)、生殖细胞肿瘤(例如睾丸生殖细胞肿瘤或卵巢生殖细胞肿瘤)、卵巢癌(例如卵巢上皮癌)、未知原发性癌、人免疫缺陷相关恶性肿瘤(例如卡波西肉瘤)、淋巴瘤、白血病、恶性黑色素瘤、肉瘤、内分泌肿瘤(例如甲状腺)、间皮瘤和其他胸膜或腹膜肿瘤、神经内分泌肿瘤和类癌瘤。[0183]在一些实施方案中，本发明方法导致病症的治疗，即病症或者病症的任一种或更多种症状的减轻或改善，例如通过在治疗癌症的上下文中抑制肿瘤生长和/或转移或通过在治疗病毒感染的上下文中减少病毒载量和/或传播。术语“治疗”不一定意味着完全恢复。在一些实施方案中，本发明方法导致病症的预防，即预防、降低发展风险或延迟病症的发作。类似地，“预防”不一定意指受试者最终不得该病症。[0184]在一些实施方案中，向其施用细胞或组合物的受试者(例如患者)是哺乳动物，通常灵长类动物，例如人。[0185]在一些实施方案中，细胞或包含细胞的组合物是肠胃外施用的。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。[0186]经修饰的细胞或包含经修饰的细胞的组合物的期望剂量可以通过组合物的单次施用、多次施用或连续输注施用来递送。治疗或预防功效可以通过对经治疗的受试者的定期评估来监测。[0187]在一些实施方案中，过继细胞疗法通过自体转移进行。免疫细胞(例如t细胞)从要接受细胞疗法的受试者中或从源自此种受试者的样品中分离和/或以其他方式制备。在一些实施方案中，免疫细胞(例如t细胞或nk细胞)从受试者中分离，根据本文公开的方法进行修饰(以抑制一种或更多种基因的功能)并且然后向同一受试者施用。[0188]在一些实施方案中，过继性细胞疗法通过同种异体转移进行，其中细胞从不同于要接受细胞疗法的受试者(受体受试者)的供体受试者中分离和/或以其他方式制备。在一些实施方案中，供体和受体受试者表达相同的hla类或超型。实施例[0189]在以下实施例中，已经说明但不限于，为了增强用于肿瘤治疗的car-t细胞、t细胞、nk细胞和衍生细胞(例如ink细胞)的功能，采用crispr/cas9基因编辑技术来消除这些免疫细胞的阴性免疫调节剂。在含有car的t细胞的情况下，在活化之后首先通过慢病毒car载体转导细胞，然后将具有专门设计的指导rna的cas9核酸酶复合物转染到car-t细胞中以消融免疫调节基因(图1a)。在含有car的nk-92细胞的情况下，首先用具有专门设计的指导rna的cas9核酸酶复合物转染细胞以消融免疫调节基因，然后使用慢病毒car载体转导(图1b)。通过基于基因组dna测序的定量检查基因编辑效率。然后在细胞的体外扩增期间监测细胞毒性和扩增速率。为了评价体内持久性，将car-细胞(在以下实施例中为car-t细胞)过继转移到小鼠异种移植肿瘤模型中(图1a-1b)。[0190]实施例1–第二代tag-72car-t细胞的生成[0191]tag-72是已确定的腺癌肿瘤标志物，并且也是某些实体瘤中car-t细胞的靶标。第二代tag-72car-t细胞如wo2017/088012中所述的生成，通过引用并入本文。tag-72car表达盒包含作为信号肽的κ前导序列、作为肿瘤抗原结合部分的抗tag-72scfv、来自人cd8的铰链区和跨膜区以及4-1bb和cd3ζ的细胞质活化信号传导结构域。p2a是指导蛋白水解切割的信号序列，其释放egfp作为car表达的荧光报告蛋白(图2a)。因此，在慢病毒转导之后，可以使用gfp流式细胞术检测t细胞中的car转导效率和表达水平(图2b)。[0192]人t细胞分离和培养[0193]从健康人供体自新鲜全血或从澳大利亚红十字血液服务中心获得的血沉棕黄层(不合格/丢弃的材料不适合临床目的)分离原代人t细胞。所有患者和健康供体都提供知情同意书。按照制造商的说明书，通过ficoll-paque(ge healthcare，伊利诺伊州，美国)离心使用leucoseptm管(greiner，克雷姆斯明斯特，奥地利)分离外周血单核细胞(pbmc)。在使用前将pbmc冷冻保存。为了用于转导和转染，将pbmc解冻并且使用人t-活化剂cd3/cd28珠(thermofisher，马萨诸塞州，美国)分离并活化t细胞。细胞和珠在室温下以1:3的比例孵育1小时，同时持续温和混合。然后通过将细胞珠悬浮液放置于磁体上1-2分钟除去未结合的细胞。除去上清液并且将细胞珠混合物在t细胞培养基：具有5％人ab血清(sigma-aldrich，密苏里州，美国)和100u/ml il-2的texmacs培养基(miltenyi biotech，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)中在37℃5％co2下孵育约65小时。通过混合20-50x解离细胞-珠复合物收集t细胞，立即放置于磁体上1-2分钟并且收集含有细胞的上清液。在musetm细胞计数器(merck-millipore，马萨诸塞州，美国)上对分离的t细胞悬浮液进行计数并且准备用于转染。[0194]慢病毒转导[0195]使用慢病毒car载体来转导活化的人cd3+t细胞，如wo2017/088012中所述，通过引用并入本文。为了产生慢病毒car-t细胞，将活化的人cd3+/cd28+t细胞在(takara bio inc)包被的板中与慢病毒颗粒一起孵育48小时。[0196]car表达的流式细胞术。[0197]为了检测在经慢病毒转导的car-t细胞中car构建体的表达，在分析仪10(miltenyi biotec，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)上进行流式细胞术分析。分析gfp表达。使用碘化丙啶溶液(miltenyi biotec)或viobility 405/520染料来区分活细胞与死细胞。[0198]实施例2-使用crispr生成经基因编辑的tag-72car-t细胞[0199]为了生成crispr基因敲除(ko)car-t细胞，在第5天慢病毒tag-72car转导后48小时分别将由代表性指导rna(pd1 ko，seq id no:1；rc3h1 ko，seq id no:2；rc3h2 ko，seq id no:4；a2ar ko，seq id no:7；fas ko，seq id no:9；tgbfbr1 ko，seq id no:11；tgfbr2 ko，seq id no:14)转染到t细胞中(图1a至3)。尽管发生了电穿孔诱导的细胞死亡，但是使用本文公开的协议(图3)可以回收和扩增经rnp转染rnp的car-t细胞以及未经转染的car-t细胞。在rnp转染后4天，提取car-t细胞的基因组dna用于基因编辑的定量分析。使用ice(inference of crispr edits)测定分析基因编辑效率(hsiau等,inference of crispr edits from sanger trace data.biorxiv,2018,10.1101/251082(251082))。本文示出了rc3h2基因编辑效率分析作为ice测定的代表性结果(图4a至4c)。rc3h2 grna(seq id no：4)显示出将indel(总indel频率＝92％)引入rc3h2基因的早期外显子的高活性。另外，它导致开放阅读框的高频率移码(框外indel频率＝91％)，从而破坏功能性rc3h2蛋白的翻译(图4b和4c)。在该研究中，对于所有经crispr基因编辑的car-t细胞，实现了非常高的基因编辑效率(总indel百分比＝89％至96％)和高效的基因敲除结果(框外indel频率＝61％至91％)(图4d)。综上所述，这些结果表明，研究中使用的grna经验证具有高活性在以不干扰car-t细胞体外扩增的情况下破坏car-t细胞中相应基因的表达。[0200]car-t细胞的crispr基因编辑[0201]在慢病毒tag-72car转导后2天，通过dpbs洗涤t细胞用于cas9 rnp转染。使crrna和tracrrna(synthego或idt)退火以形成全长指导rna。在转染前通过在室温下以1:2的比例将cas9蛋白与全长grna一起孵育10至20分钟来制备cas9 rnp。为了转染cas9 rnp，用106个t细胞/注射。在car-t细胞输注后监测肿瘤体积、体重和临床评分。根据动物伦理批准，剔除肿瘤大小为800mm3至1000mm3、体重显著减轻或临床评分差的小鼠。在该卵巢癌肿瘤模型中，第二代tag-72car-t细胞处理初始减小了肿瘤的大小，但是在car-t细胞施用后约30天观察到肿瘤复发(图6)。根据实施例1和2中所述的方法生成经基因编辑的tag-72car-t细胞，并且在相同模型中评估体内功效。pd-1基因敲除tag-72car-t细胞没有提高tag-72car-t细胞的抗肿瘤活性或持久性(图6)。然而，rc3h1和/或rc3h2基因的敲除导致tag-72car-t疗法的抗肿瘤活性和持久性显著提高。此外，在这些组中rc3h1和rc3h2双基因敲除tag-72car-t细胞(tag-72car/rc3h1,2ko t细胞)显示出最好的抗肿瘤活性和持久性，如在监测期间在tag-72car/rc3h1,2kot细胞处理的小鼠中完全防止了肿瘤复发所证明的(图7)。a2ar和fas基因敲除还提高了tag-72car-t疗法的抗肿瘤功效和持久性，这在nsg小鼠异种移植模型中延迟了肿瘤复发(图8)。由crispr指导的tgfβ受体1和2的显性阴性突变也增强了tag-72car-t细胞的持久性，如在car-t处理后60天对肿瘤体积的更持久控制所证明的(图9)。[0211]实施例5–使用crispr生成经rc3h1和/或rc3h2基因编辑的cd19car-t细胞和体内功能[0212]cd19 car-t细胞疗法是第一个成功的批准用于b细胞恶性肿瘤的car-t治疗(porter等,n engl j med,2011.365(8):第725-33页)。为了验证通过crispr基因敲除增强的car-t细胞的抗肿瘤活性不限于ovcar-3肿瘤模型、tag-72抗原或tag-72car-t细胞，还生成了具有rc3h1和/或rc3h2基因敲除的cd19 car-t细胞用于体内功能评价。如前所述的，构建cd19 scfv-4-1bb-cd3ζcar表达盒(porter等,n engl j med,2011.365(8):第725-33页；milone等,mol ther,2009.17(8):第1453-64页；还参见wo2017088012)。如实施例1中所述的，制备cd19 scfv-4-1bb-cd3ζcar慢病毒载体并且转导到人活化的t细胞中以生成cd19 car-t细胞，然后通过由如实施例2中所述的rc3h1 grna(seq id no：2)和/或rc3h2 grna(seq id no：4)形成的rnp复合物转染，以生成crispr rc3h1和/或rc3h2基因敲除cd19 car-t细胞。[0213]cd19 car-t细胞体内细胞毒性测定[0214]在伯基特淋巴瘤异种移植模型中评估t细胞的体内功效。对于该模型，将5x105 cd19阳性raji淋巴瘤细胞皮下注射到6至10周龄的nsg小鼠的肋腹。在肿瘤接种后3天，每只小鼠静脉内注射单剂量的5x106 car-t细胞。在cd19 car-t细胞输注之后监测肿瘤体积、体重和临床评分。根据动物伦理批准，剔除肿瘤大小为800mm3至1000mm3、体重显著减轻或临床评分差的小鼠。在该淋巴瘤肿瘤模型中，与cd19 car-t细胞处理相比，cd19car/rc3h1,2kot细胞处理显著延迟了小鼠的肿瘤生长并且提高了荷瘤小鼠的中位生存期(图10a-10b)。该结果表明，rc3h1和rc3h2基因的敲除提高了cd19 car-t细胞的体内抗肿瘤活性，与使用tag-72car-t细胞所观察到的相似。[0215]实施例6-在持续活化暴露后cd19 car/rc3h1和/或rc3h2 ko t细胞的活化标志物[0216]如实施例5中所述的，生成rc3h1和/或rc3h2基因敲除cd19 car-t细胞。[0217]评估cd19 cart细胞+rc3h1和/或rc3h2 ko在抗原暴露后活化标志物的差异(图11)。对工程化的cd19过表达细胞系ovcar-3(cd19)进行照射(30gy)并且以80,000个细胞/ml/孔的24孔组织培养板接种。在第0天将等分试样的1x106 car-t细胞(有和没有rc3h1和/或rc3h2 ko)添加到每个孔中；随后在7天的时间内将这些car-t细胞每天转移到未接触过的经照射的ovcar-3(cd19)细胞单层中。在持续接触抗原7天之后，通过离心洗涤效应细胞一次，并且评估活化标志物cd69和cd25的表达。这些标志物分别与早期和晚期活化相关，其中表达与tcr连接有关。为了检测在car-t细胞上这些活化标志物的表达，使用分析仪10进行流式细胞术分析。通过检测共表达的gfp间接检测car表达。使用标准协议对cd69和cd25进行细胞表面染色，其中将细胞与荧光缀合抗体在4℃下一起孵育15分钟，进行避光保护。在分析前使用facs缓冲液将细胞洗涤两次。使用碘化丙啶溶液来区分活细胞和死细胞。使用flowlogictm软件(miltenyi biotec)进行数据分析。[0218]在持续抗原暴露之后，缺乏一种或两种基因的cd19 car/rc3h1和/或rc3h2 kot细胞显示出更高频率的car+/cd25+/cd69+表达细胞的证据。虽然增加没有统计学意义，但是这在所有三种ko t细胞中是一致的，表明与未经转染的cd19 car-t细胞相比，活化增加(图11)。[0219]实施例7–使用crispr生成rc3h1和/或rc3h2 ko t细胞和体外功能[0220]为了证明用于生成基因敲除免疫细胞的方法不限于car-t细胞，还在正常t细胞中进行等效的crispr基因敲除。[0221]为了生成crispr t细胞，如实施例1中所述的，使用cd3/cd28珠分离并活化人t细胞。如实施例2中所述的，在活化和体外扩增后3天，通过由rc3h1 grna(seq id no：2)和/或rc3h2 grna(seq id no：4)形成的rnp复合物转染活化的人t细胞。[0222]如实施例2中所述的，通过ice测定分析经转染的t细胞的crispr indel频率和基因敲除效率。ice测定结果表明这些指导rna还显示出高活性以在活化的人t细胞中引入indel(包括框外indel)(图12)。[0223]通过延长的t细胞活化进行体外杀伤(图13)[0224]为了确定ko的作用是否限于car-t细胞，通过其tcr和cd28共辅助分子多克隆地活化正常t细胞(图13)。在αcd3/αcd28珠的存在下将rc3h1和/或rc3h2 ko t细胞以1:1的珠与细胞之比保持至少92小时。约每24小时进行细胞计数，其中相应地添加新鲜的珠。在持续活化之后，在20小时监测期间，与未经转染(nt)的t细胞相比，rc3h1和/或rc3h2 ko t细胞显示出改善的体外功能。虽然差异没有统计学意义，但是三种ko t细胞中的每一种都比未经转染的t细胞更有效地杀伤靶肿瘤细胞，表明ko t细胞的延长活化可能不导致杀伤功能“耗尽”。[0225]实施例8–使用crispr生成rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92细胞(有和没有car)[0226]为了证明用于生成基因敲除免疫细胞的方法不仅限于t细胞，还在nk-92细胞中进行等效的crispr基因敲除(图1b)。nk-92是对癌症靶标具有高细胞毒性的自然杀伤(nk)细胞系。可以通过基因修饰(包括car表达)提高nk-92功能(klingemann等,front immunol,2016.7:第91页)。将nk-92细胞系在具有200u/ml il-2和胎牛血清的rpmi-1640培养基中保持并扩增。[0227]为了生成rc3h1和rc3h2基因敲除nk-92细胞(分别地rc3h1 ko nk-92细胞和rc3h2 ko nk-92细胞)，如实施例2中所述的，使用由rc3h1grna(seq id no：2)和/或rc3h2 grna(seq id no：4)形成的rnp复合物转染nk-92细胞。如实施例2中所述的，还通过ice测定分析经转染的nk-92细胞的crispr indel频率和基因敲除效率。ice测定结果表明这些指导rna还可以在nk-92细胞中以高频率引入indel(包括框外indel)(图14)。[0228]为了生成tag-72car/rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92细胞，如实施例1中所述的，使用tag-72car慢病毒载体转导rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92细胞。[0229]实施例9-rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92和tag-72car/rc3h ko nk-92细胞的体外功能[0230]如实施例8中所述的，使用慢病毒tag-72car载体来转导所得rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92细胞。在补充有10％fbs和100u/ml il-2的l-谷氨酰胺的rpmi-1640中生成rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92±car细胞并常规地保持在培养物中。在培养至少3天之后，通过流式细胞术评估转导效率。另外，体外评价rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92±car细胞消除癌细胞的能力。[0231]使用实时细胞监测系统确定rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92细胞的体外杀伤效率。将靶细胞(10,000个靶细胞/100ul)(例如卵巢癌细胞系mes-ov或ovcar-3)重悬于有(ovcar-3)或没有(mes-ov)牛胰岛素的补充有10％-20％fbs的培养基(例如mccoy's 5a或rpmi-1640基础培养基)中，并且分配到rtca板中。将靶细胞在37℃、5％co2下保持至少5小时以允许细胞附着。在靶细胞附着之后，以1:1的e:t比添加rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92效应细胞。平行地，将未经转染的nk-92细胞与靶细胞共培养，以证明nk-92细胞在体外的背景功能性。将所有共培养物在最佳生长条件下保持至少40小时。在整个过程中监测细胞阻抗。[0232]为了比较rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92细胞裂解肿瘤细胞的能力，将肿瘤细胞与rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92细胞或未经转染的nk-92细胞一起孵育，然后通过监测体外细胞毒性。当与mes-ov细胞共培养时，所有nk-92细胞(图15a，左图)都显示出出抑制细胞作用。当与未经转染的nk-92对照相比时，使用rc3h2 ko nk-92细胞和rc3h1,2ko nk-92细胞提高了该作用，证明了体外功能的增强。另外，当与ovcar-3细胞共培养时，所有nk-92细胞(图15a，右图)都显示出细胞毒性作用，如通过nci降低所证明的。与未经转染的nk-92细胞条件相比，使用rc2h2ko nk-92细胞和rc2h1/2ko nk-92细胞分别提高了该作用，证明了体外功能的增强。[0233]使用tag-72car nk-92细胞进行类似的测定。为了确认将tag-72car nk-92细胞转导到rc3h1和/或rc3h2 ko nk-92细胞中，进行流动分析(如实施例1中所述的)，其中gfp用作整合和表达car的替代物(图15b)。数值代表car(gfp)％，表示为活细胞的百分比，其中亲本门中不包括碎片和双联体。[0234]为了比较rc3h1和/或rc3h2基因敲除tag-72car-nk-92细胞裂解肿瘤细胞的能力，将癌细胞系(在这种情况下ovcar-3)与tag-72car nk-92细胞+rc3h1和/或rc3h2 ko共培养，并且通过监测体外细胞毒性。当与ovcar-3细胞共培养时，所有具有tag-72car的nk-92细胞(图15c)都具有细胞毒性作用，如通过nci的平稳或降低所证明的。在共培养40小时内，使用tag-72car/rc3h1 ko nk-92细胞、tag-72car/rc3h2 ko nk-92细胞和tag-72car/rc3h1,2ko nk-92细胞，该作用显著更大，证明了体外功能的增强。[0235]实施例10–使用crispr生成基因ko ipsc[0236]干细胞(例如诱导多能干细胞(ipsc))可以无限期地自我更新并且分化成各种细胞类型，包括造血干细胞(hsc)和免疫细胞。免疫细胞(如t细胞和nk细胞)先前已经从ipsc生成用于癌症治疗(themeli等,nat biotechnol,2013.31(10):第928-33页；li等,cell stem cell,2018.23(2):第181-192e5页)。按照类似的方法，crispr基因敲除t或nk细胞可以源自ipsc(图16)。为了生成crispr rc3h1和rc3h2基因双敲除(rc3h1,2ko ipsc)和a2ar基因敲除ipsc(a2ar ko ipsc)，使用lonza 4d nucleofector系统将由代表性grna(rc3h1，seq id no：2；rc3h2，seq id no:4；a2ar，eq id no:7)形成的rnp复合物转染到ipsc中。首先，使用在pbs中的层粘连蛋白-521(stemcell technologies)包被12孔板，并且在37℃下孵育2小时。在转染之前将ipsc与含有revitacelltm补充物(life technologies)的mtesr plustm培养基(stemcell technologies)一起预孵育2小时。通过将全长grna与lonza p3缓冲液和cas-9组合制备rnp。然后将rnp混合物在室温下孵育10-20分钟。在预孵育之后，使用(life technologies)提取ipsc作为单细胞，每个反应获得1x 106个细胞用于电穿孔。为了生成基因敲除ipsc，将在lonza p3缓冲液中的细胞和rnp混合物合并到pcr管中，然后负载到lonza 4d nucleofector中用于电穿孔。此后，将具有clonertm培养基(stemcell technologies)的mtesr plustm添加到反应中并且在室温下孵育10分钟。在孵育之后，将细胞添加到在具有clonertm培养基的mtesr plustm中的laminin-521预包被的板中。使用mtesr plustm进行每天培养基更换72小时，在达到约80％汇合后(电穿孔后6-7天)将细胞传代。在转染之后，将具有多能干细胞样形态的rc3h1,2ko ipsc和a2ar ko ipsc集落保持在培养物中(图17a和21a)。[0237]将未经转染和经转染的ipsc在mtesr plustm中在层粘连蛋白-521上培养，并且使用明场显微镜以10倍成像。通过提起细胞并且收集作为单细胞。然后按照制造商的建议，使用靶向tra-1-60(miltenyi biotec)、tra-1-81(stemcell technologies)和ssea-4(miltenyi biotec)的抗体对它们进行染色。tra-1-60、tra-1-81和ssea-4是在多能干细胞上表达的表面受体，并且是表征ipsc的经过考虑的常见做法(baghbaderani等2015,stem cell reports)。通过流式细胞仪(miltenyi biotec)分析细胞，以及未经染色的样品和适当的同种型对照。死细胞(通过pi染色)、碎片和双联体被排除；使用flowlogictm生成直方图(图17a-17b，rc3h1,2ko并且图21a-21b，a2ar ko)。有或没有ko的ipsc显示出几乎相同的tra-1-60、tra-1-81和ssea-4多能性标志物，所有标志物以》95％共表达(图17b和21b)。ipsc形态(图17a和21a)没有视觉差异，表明rc3h1和rc3h2双ko或a2ar ko对ipsc保持和多能性没有负面影响。[0238]如实施例2中所述的，通过ice测定分析经转染的ipsc的crisprindel频率和基因敲除效率。ice测定结果表明在ipsc中grna以高频率产生indel(包括框外indel)(图18a-18c，rc3h1,2ko和图22a-22c，a2ar ko)。[0239]总之，我们的数据证明了使用已知方法，本文所述的经基因编辑的ipsc可以分化成cd34+/he/hsc，然后分化成免疫细胞(例如nk、nkt或t细胞)，用于随后的癌症治疗。[0240]实施例11-rc3h1和rc3h2 ko(rc3h1,2ko)ipsc分化成ink细胞(经编辑的ink细胞)。[0241]icd34+细胞[0242]受体cd34在he和hsc上表达，其是形成平台以产生免疫细胞的干细胞来源。ipsc向cd34+细胞的分化是能够产生ipsc衍生免疫细胞的先决条件和必要条件(sturgeon等nature biotechnology,2014第32(6)卷第554-561页，knorr等stem cells translational medicine vol 2(4)第274-283页，zeng等,stem cell reports,2017第9(6)卷第1796-1812页)。将cd34+表达表征为ipsc与免疫细胞之间的中间细胞类型被认为是常见的做法，并且是证明在ipsc中包含基因-ko不在初始发育期间破坏任何潜在的分化途径的关键步骤。[0243]按照制造商的说明书，使用stemdifftm血细胞生成试剂盒(stemcell technologies)将未经转染和经转染的ipsc(含有rc3h1，2ko)分化成icd34+细胞。按照制造商的建议，使用靶向cd34的抗体(miltenyi biotec)分离细胞并对其进行染色。通过流式细胞仪(miltenyi biotec)使用未经染色的样品和适当的同种型对照分析细胞。死细胞(通过pi染色)、碎片和双联体被排除；使用flowlogictm进行数据分析。[0244]包含rc3h1,2ko或没有包含rc3h1,2ko的ipsc(图19)都分化成icd34+细胞。这些数据证明了从rc3h1,2ko ipsc成功产生icd34+细胞，并且表明通过所有中间表型从ipsc转化成含有cd34表达细胞的细胞群所需的关键发育途径保持完整。[0245]ink细胞[0246]含有rc3h1,2ko的ipsc能够分化成ink免疫细胞。[0247]将基因敲除icd34+(源自rc3h1,2ko ipsc)进一步分化成由细胞因子组合(包括il-15、flt3和il-7)驱动的ink细胞。ink细胞可以使用公开的方法(例如美国专利9,260,696b2(kaufman,knorr)、li等(stem cell,23(2018)181-197)中所述的方法)或使用可商购的培养系统stemspantm nk细胞生成试剂盒(stem cell technologies)制备。[0248]按照制造商的建议，使用靶向cd56(miltenyi biotec)、nkp46(miltenyi biotec)和nkg2d(miltenyi biotec)的抗体分离分化的细胞并对其进行染色。通过macsquanttm流式细胞仪(miltenyi biotec)使用未经染色的样品和适当的同种型对照分析分化的细胞。死细胞(通过pi染色)、碎片和双联体被排除，使用flowlogictm进行数据分析(图20)。nk功能受体(nkp46和nkg2d)的表达支持icd56+细胞具有nk特异性细胞毒性功能。[0249]实施例12-a2ar ko ipsc分化成ink细胞(经编辑的ink细胞)。[0250]icd34+细胞[0251]按照制造商的说明书，使用stemdifftm血细胞生成试剂盒(stemcell technologies)将未经转染和经转染的ipsc(含有rc3h1，2ko)分化成icd34+细胞。按照制造商的建议，使用靶向cd34的抗体(miltenyi biotec)分离细胞并对其进行染色。通过流式细胞仪(miltenyi biotec)使用未经染色的样品和适当的同种型对照分析细胞。死细胞(通过pi染色)、碎片和双联体被排除；使用flowlogictm进行数据分析。[0252]包含a2ar ko或没有包含a2ar ko的ipsc(图23)都分化成icd34+细胞。这些数据证明了从a2ar ko ipsc成功产生icd34+细胞，并且表明通过所有中间表型从ipsc转化成含有cd34表达细胞的细胞群所需的关键发育途径保持完整。[0253]ink细胞[0254]含有a2ar ko的ipsc能够分化成ink免疫细胞。[0255]将未经转染的icd34(源自未经转染的ipsc)和基因敲除icd34+(源自基因敲除ipsc)进一步分化成由细胞因子组合(包括il-15、flt3和il-7)驱动的ink细胞。ink细胞可以使用公开的方法(例如美国专利9,260,696b2(kaufman,knorr)、li等(stem cell,23(2018)181-197)中所述的方法)或使用可商购的培养系统stemspantm nk细胞生成试剂盒(stem cell technologies)制备。[0256]通过流式细胞术评估分化细胞的nk细胞标志物的表达。死细胞、碎片和双联体被排除，使得图24中呈现的cd56+直方图示出了从未经转染或经转染的ipsc样品生成的培养物中的所有活细胞。呈现未经染色的样品以显示每种抗体对每种相应受体的明显阳性染色。适当的同种型对照的阴性。nk功能受体(nkp46、nkp30、nkp44和nkg2d)的表达证实了icd56+细胞是具有细胞毒性功能的ink细胞。[0257]实施例13-经编辑的ink细胞的功能[0258]生成a2ar ko ipsc(实施例10)并且分化成经编辑的ink细胞(实施例12)。然后在20-40天后收集ink细胞并且用于随后的功能测定。[0259]使用实时细胞监测系统在体外评估ink细胞杀伤癌细胞的能力。将靶细胞(10,000/100ul)(例如卵巢癌细胞系ovcar-3)重悬于补充有10％-20％fbs和牛胰岛素的培养基(例如，rpmi-1640和l-谷氨酰胺基础培养基)中，并且分配到rtca板。将靶细胞在37℃、5％co2下保持至少5小时以允许细胞附着。在靶细胞附着之后，以1:1的e:t比添加ink效应细胞。平行地，将ipsc衍生的ink细胞与靶细胞共培养以证明未经转染的ink细胞在体外的背景功能性。将所有共培养物在最佳生长条件下保持至少10小时。在整个过程中，监测细胞阻抗并且在本文中作为nci呈现，其中归一化发生在添加效应细胞的时间。使用以下等式计算在5小时和10小时共培养之后ink+a2ar ko效应细胞(测试)相对于单独的靶细胞(对照)的细胞毒性百分比(细胞毒性％)：[0260]((归一化细胞指数对照–归一化细胞指数测试)/归一化细胞指数对照)x 100[0261]为了比较a2ar ko ipsc衍生的ink细胞(a2ar ko ink细胞)裂解肿瘤细胞的能力，将肿瘤细胞系与a2ar ko ink细胞或nt ink细胞一起孵育，并且通过监测体外细胞毒性。当与ovcar-3靶细胞共培养时nt ink细胞显示出细胞毒性作用(图25a)。与未经转染的对照相比，使用a2ar ko ink细胞提高了该作用，证明了体外功能的增强。此外，在a2ar ko ink中共培养5小时(图25b，左图)和共培养10小时(图25b，右图)之后的细胞毒性都显示出更高的细胞毒性。总之，这些数据表明，与未经转染的对照细胞相比，不仅在t细胞中还在ink细胞中，a2ar ko可以增强抗肿瘤活性。[0262]在整个本说明书中引用了各种出版物，包括专利、专利申请、公开的专利申请、登录号、技术文章和学术文章。这些引用的出版物中的每一个都通过引用以其整体并且出于所有目的并入本文件中。









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