可成为淀粉样蛋白球体(ASPD)的替代物的β淀粉样蛋白(Aβ)的交联体、以及ASPD的分析的制作方法

测量装置的制造及其应用技术可成为淀粉样蛋白球体(aspd)的替代物的β淀粉样蛋白(aβ)的交联体、以及aspd的分析技术领域1.本公开涉及β淀粉样蛋白(aβ)的交联体、可成为淀粉样蛋白球体(aspd)的替代物的aβ交联体(交联的aβ)、以及aspd的分析。背景技术：2.淀粉样蛋白球体(amylospheroids(aspd))是β淀粉样蛋白(aβ)约30个集合而成的直径为约10～15nm的球状的aβ集合体，其是被认为在引起阿尔茨海默病的神经细胞死亡的方面发挥重要作用的结构体。3.aspd作为显示强的神经毒性的体外(in vitro)合成的aβ集合体(即合成aspd)而被分离出(非专利文献1)。制作了针对该合成aspd特异性抗体(专利文献1和2)，使用该抗体从阿尔茨海默病的人患者的脑中实际分离出在生物体内形成的aspd(即天然aspd)(非专利文献1)。4.天然aspd及合成aspd同样地选择性地诱发成熟神经细胞发生细胞死亡。发现该神经细胞死亡中的aspd的靶是对神经的生存和功能发挥极为重要的作用的突触蛋白“na+、k+-atpase泵的α3亚单元(以下称为nakα3)”，已清楚nakα3的功能因aspd的结合而降低，神经细胞过度兴奋而发生神经细胞死亡(专利文献3、非专利文献2)。5.阿尔茨海默病中与临床症状最相关的是神经细胞脱落。已清楚可见神经细胞脱落的阿尔茨海默病患者的大脑皮质中的天然aspd量与阿尔茨海默病的重症度相关地增加，并且几乎未见神经细胞脱落的阿尔茨海默病患者的小脑中的天然aspd量仅微量存在(非专利文献3)。因此，认为淀粉样蛋白球体在阿尔茨海默病发病的不可逆阶段中发挥重要的作用。此外，从路易体痴呆患者的脑中也检测到天然aspd(非专利文献3)，认为对于路易体痴呆而言，aspd也在其发病中发挥重要的作用。6.被认为与天然aspd等价的合成aspd可以通过缓慢搅拌含有aβ的液体来制造(非专利文献1、专利文献4)。7.另外，被认为与天然aspd等价的细胞分泌型aspd样结构体例如可以从表达特定的app蛋白的cho细胞分泌，可以从该cho细胞的培养上清液得到(专利文献5)。8.现有技术文献9.专利文献10.专利文献1：wo2006/01664411.专利文献2：wo2009/05766412.专利文献3：wo2013/09980613.专利文献4：wo2013/09461414.专利文献5：wo2017/17964615.非专利文献16.非专利文献1：hoshi et al.,spherical aggregates ofβ-amyloid(amylospheroid)show high neurotoxicity and activate tau protein kinase i/glycogen synthase kinase-3β,pnas may 27,2003vol.100no.11 6370-637517.非专利文献2：ohnishi et al.,na,k-atpaseα3is a death target of alzheimer patient amyloid-βassembly,pnas august 11,2015vol.112no.32e4465-e447418.非专利文献3：noguchi et al.,isolation and characterization of patient-derived,toxic,high mass amyloid beta-protein(abeta)assembly from alzheimer disease brains,j biol chem.2009nov 20；284(47)：32895-905技术实现要素：19.发明所要解决的课题20.如上所述，淀粉样蛋白球体(aspd)在阿尔茨海默病或路易体痴呆中发挥重要的作用。对于aspd参与的疾病的预防、诊断、治疗等而言，对对象(患者)的生物试样中的aspd进行分析的必要性提高。21.另外，在开发出以aspd为靶的治疗药时，为了其伴随诊断而需要aspd的分析。22.在对物质进行分析(包括测定)的情况下，通常需要标准物质(标准品)。标准物质例如用于制作校准或标准曲线。天然aspd、合成aspd以及细胞分泌型aspd样结构体可以作为aspd分析的标准物质使用。23.另一方面，作为诊断试剂盒的标准物质，期望能够稳定制造、保管稳定性优异且制造成本低。天然aspd、合成aspd以及细胞分泌型aspd样结构体作为用于分析aspd的试剂盒的标准物质，从制造的容易性、保管稳定性、制造成本等观点出发，存在问题。24.因此，本公开在一个方式中，提供可成为aspd的替代物的物质、或者在aspd的分析中可成为aspd的标准物质的物质。25.另外，本公开在另一方式中，提供一种能够对生物试样、例如血液、脑脊髓液中的aspd进行分析的方法。26.用于解决课题的手段27.本公开在一个方式中涉及一种对aspd特异性抗体与aspd发生竞争的物质，其是aβ通过交联剂交联而成的物质，所述交联剂是间隔臂长度为以上且以下的交联剂、或作为间隔臂具有1个以上且13个以下的氧亚乙基(-ch2ch2o-)和/或氧亚丙基(-ch2ch2ch2o-)的交联剂。28.本公开在另一方式中涉及一种aβ的交联体，其是aβ通过间隔臂长度为以上且以下的交联剂、或作为间隔臂具有1个以上且13个以下的氧亚乙基和/或氧亚丙基的交联剂交联而成的。29.本公开在另一方式中涉及一种aspd的分析方法，其包含下述工序：30.(1)使有可能含有aspd的生物体来源的试样与结合于不溶性载体的、能够与aspd结合的抗体(第一抗体)接触，在含有aspd的情况下使aspd与第一抗体结合的工序，以及31.(2)使抗aspd单克隆抗体(第二抗体)与在工序(1)中已结合于第一抗体的aspd反应的工序；32.其中，第一抗体为人源化抗aspd单克隆抗体huasd2、或单克隆抗体ban50a，第二抗体为抗aspd单克隆抗体masd3或其标记化抗体。33.发明效果34.根据本公开，在一个方式中，能够提供可成为aspd的替代物的物质、或者在aspd的分析中可成为aspd的标准物质的物质。35.另外，根据本公开，在另一方式中，能够提供一种能够对生物试样、例如血液、脑脊髓液中的aspd进行分析的方法。附图说明36.图1是对aβ交联体1～3进行sdspage而得到的结果的一例。37.图2是说明aspd的cleia的一个实施方式[抗aspd多克隆抗体/masd3]的概略图。[0038]图3是表示通过aspd和aβ交联体1～3对aspd在cleia中的反应性进行比较而得到的结果的图表的一例。[0039]图4是表示通过aβ交联体1、aspd及aβ1-16二聚体对市售的aβ低聚物elisa及aspd在cleia中的反应性进行比较而得到的结果的图表的一例。[0040]图5是确认aβ交联体1的免疫原性而得到的结果的一例，是表示用aβ交联体1免疫后的兔的血清与经固相化的合成aspd反应的结果。[0041]图6是对添加有aspd的人csf的稀释样品(稀释率为1倍、1/2、1/4、及1/8)的aspd的通过cleia得到的测定值进行作图而得到的结果的图表的一例。[0042]图7是对添加有aspd的人血浆的稀释样品(稀释率为1倍、1/2、1/4、1/8及1/16)的aspd的通过cleia得到的测定值进行作图而得到的结果的图表的一例。[0043]图8是说明aspd的cleia的一个实施方式[huasd2/masd3]的概略图。[0044]图9是通过aspd的cleia[huasd2/masd3]对独立的4个含aspd样品进行测定而得到的结果的图表的一例。[0045]图10是说明aspd的cleia的一个实施方式[huasd2/生物素化masd3]的概略图。[0046]图11是通过aspd的cleia[huasd2/生物素化masd3]对含aspd样品进行测定而得到的结果的图表的一例。[0047]图12是通过aspd的cleia[huasd2/生物素化masd3]系统和[ban50/生物素化ban50]系统对aspd和map16进行检测而得到的结果的图表的一例。[0048]图13是通过用各种[第一抗体/第二抗体]的组合对人血浆样品(稀释率为1/4)与缓冲液样品的结果进行比较而得到的结果的一例。[0049]图14是对诊断为阿尔茨海默病(ad)的患者的血浆样品10例和健康人的血浆样品10例进行aspd的cleia[huasd2/生物素化masd3]而得到的结果的一例。具体实施方式[0050]本公开在一个方式中基于如下见解：通过特定的交联剂交联而成的aβ的交联体对aspd特异性抗体显示出与aspd同样的反应性。[0051]本公开在另一方式中基于如下见解：通过特定的抗体的组合，能够高效地对生物试样内的aspd进行分析。[0052]在本公开中，在仅记为aspd的情况下，可以包括天然aspd、合成aspd和细胞分泌型aspd样结构体。[0053]作为aspd特异性抗体，在一个或多个实施方式中，可举出wo2006/016644及wo2009/057664中公开的多克隆抗aspd抗体及单克隆抗aspd抗体，在进一步的一个或多个实施方式中，可举出兔多克隆抗aspd抗体(rpasd1、rpasd2及rpasd3)、小鼠单克隆抗aspd抗体(masd1、masd2及masd3)、仓鼠单克隆抗aspd抗体(haasd1、haasd2、haasd3、haasd4及haasd5)、以及人源化单克隆抗aspd抗体(huasd2)等。[0054][β淀粉样蛋白][0055]aβ是由相当于淀粉样蛋白前体蛋白(app)的一部分的序列构成的蛋白，是具有在生物体内由β选择酶和γ选择酶从app切出的肽的序列的蛋白。[0056]在本公开中，仅记为aβ时，可以是指aβ38(aβ1-38)、aβ39(aβ1-39)、aβ40(aβ1-40)、aβ41(aβ1-41)、aβ42(aβ1-42)、aβ43(aβ1-43)、或它们的全部或一部分。[0057]在本公开中，仅记为aβ时，可以包括人aβ和非人哺乳类aβ。[0058]作为人app，在一个或多个实施方式中，可举出happ770、happ751及happ695等剪接突突变体。happ770(ncbi登录号np_000475(version np#000475.1gi：4502167)，但并不限定于此。[0059]人aβ的n末端的氨基酸(aβ的第1个氨基酸)相当于happ770的第672个氨基酸d(天冬氨酸)。[0060]在本公开中，仅记为aβ时，可以包括野生型和突变型的aβ。[0061]作为突变型aβ，在一个或多个实施方式中，可举出具有从突变型app切出的肽的序列的突变型aβ。作为突变型app，可举出与家族性阿尔茨海默病连锁的突变，例如可举出swedish突变、leuven突变、icelandic突变、london突变、iranian突变、austrian突变、german突变、french突变、florida突变、iberian突变、australian突变、belgian突变、flemish突变、icelandic突变、british突变、tottori突变、italian突变、arctic突变、osaka突变、iowa突变、dutch突变等。作为其他突变，可以包括向修饰氨基酸、非天然氨基酸、d-氨基酸等的突变。作为修饰氨基酸，在一个或多个实施方式中，可举出氨基修饰、羧基修饰、硫醇基修饰、羟基修饰、糖化修饰、peg化修饰等。[0062][aβ交联体][0063]本公开在一个方式中，涉及aβ通过特定的交联体交联而成的aβ交联体。关于aβ，如上所述。[0064]本公开的aβ交联体中使用的交联剂在一个或多个实施方式中，是间隔臂长度为以下且以下的交联剂。间隔臂长度是指交联剂的分子跨度(键合分子间的距离)。交联体的间隔臂长度记载于市售的交联体的目录或产品说明书中，只要是本领域技术人员，即可适当选择而获得。[0065]作为间隔臂长度，在一个或多个实施方式中，从使与aspd特异性抗体的反应性接近aspd的观点出发，为以上，优选为以上，优选为以上，更优选为以上，更优选为以上，更优选为以上，进一步优选为以上，进一步优选为以上，进一步优选为以上，进一步优选为以上，进一步优选为以上，进一步优选为以上。[0066]作为间隔臂长度，在一个或多个实施方式中，从同样的观点出发，为以下，优选为以下，更优选为以下，进一步优选为以下，进一步优选为以下，进一步优选为以下，进一步优选为以下，进一步优选为以下。[0067]本公开的aβ交联体中使用的交联剂在一个或多个实施方式中，是作为间隔臂具有1个以上且13个以下的氧亚乙基(-ch2ch2o-、eo基)和/或氧亚丙基(-ch2ch2ch2o-、po基)的交联剂。间隔臂是指交联剂的反应性末端间的骨架或基团。[0068]作为间隔臂中的eo基和po基的总数，在一个或多个实施方式中，从使与aspd特异性抗体的反应性接近aspd的观点出发，为1个以上，优选为2个以上，更优选为3个以上，进一步优选为4个以上。[0069]作为间隔臂中的eo基和po基的总数，在一个或多个实施方式中，从同样的观点出发，为13个以下、优选为10个以下、更优选为9个以下、进一步优选为8个以下、进一步优选为7个以下、进一步优选为6个以下。[0070]本公开的aβ交联体中使用的交联剂的交联靶在一个或多个实施方式中，可举出氨基、巯基、羧基、非选择等。[0071]本公开的aβ交联体中使用的交联剂的反应末端在一个或多个实施方式中，从使与aspd特异性抗体的反应性接近aspd的观点出发，优选为使氨基间交联的反应末端，可举出nhs酯或酰亚胺酯。[0072]本公开的aβ交联体中使用的交联剂可以具有开裂性，也可以不具有开裂性。从稳定性的观点出发，优选不具有开裂性。[0073]本公开的aβ交联体中使用的交联剂在一个或多个实施方式中，从使与aspd特异性抗体的反应性接近aspd的观点出发，优选乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(egs、间隔臂长度为)、磺基egs(间隔臂长度为)、双(琥珀酰亚胺基)五(乙二醇)(bs(peg)5、间隔臂长度为)、双(琥珀酰亚胺基)九(乙二醇)(bs(peg)9、间隔臂长度为)，更优选bs(peg)5和bs(peg)9，进一步优选bs(peg)5。[0074]本公开的aβ交联体中使用的aβ从使与aspd特异性抗体的反应性接近aspd的观点出发，可举出aβ38、aβ39、aβ40、aβ41或aβ42，优选aβ40或aβ42，更优选aβ42。[0075]本公开的aβ交联体的分子量在一个或多个实施方式中，以通过10-20％sdspage分析的分子量计，超过100kda或超过114kda。[0076]本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，aspd的细胞毒性、即选择性地诱发功能上成熟的神经细胞发生细胞死亡的特性可以与aspd为同等，或者可以与aspd相比为弱毒性，或者可以不具有细胞毒性，或者也可以与aspd相比毒性更高。本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，可以与aspd相比为弱毒性，或者也可以不具有细胞毒性。[0077]本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，与除aspd以外的aβ集合体的反应性相比，与aspd特异性抗体的反应性接近aspd的反应性，更优选为与aspd同等的反应性。[0078]本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，是对aspd特异性抗体与aspd发生竞争的物质。[0079]本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，从与aspd特异性抗体的反应性的观点出发，可以成为aspd的替代物。[0080]本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，可以成为aspd分析或其试剂盒的标准物质。[0081]在本公开中，aspd的分析在一个或多个实施方式中，可以包括aspd的检测、测定、定量、以及利用它们的筛选。[0082]作为将本公开的aβ交联体作为标准物质使用的aspd分析，在一个或多个实施方式中，可举出利用了使用aspd特异性抗体的免疫测定法的分析，更具体而言，可举出使用aspd特异性抗体的酶免疫测定法、化学发光-酶免疫测定法，更具体而言，可举出使用aspd特异性抗体的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)、化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay，cleia)等。[0083]在一个或多个实施方式中，本公开的aβ交联体可以用于制作aspd分析中的标准曲线。在其他的一个或多个实施方式中，本公开的aβ交联体可以在aspd分析中用作阳性对照。[0084]本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，可以成为伴随aspd的蓄积的疾病的诊断中的aspd分析的标准物质。作为伴随aspd的蓄积的疾病，在一个或多个实施方式中，可举出阿尔兹海默症、及路易体痴呆等。[0085]本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，可以成为以aspd为靶的治疗药的伴随诊断中的aspd分析或其试剂盒的标准物质。本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，可以成为以aspd为靶的治疗药的伴随诊断药的一个成分。[0086]因此，本公开在另一方式中，涉及含有本公开的aβ交联体作为标准物质的aspd分析试剂盒。本方式的aspd分析试剂盒在一个或多个实施方式中，包含使用aspd特异性抗体的免疫测定法中所需的试剂。作为上述试剂，在一个或多个实施方式中，可举出aspd特异性抗体。[0087]本方式的aspd分析试剂盒在一个或多个实施方式中，是用于伴随aspd的蓄积的疾病的诊断的aspd分析试剂盒、用于以aspd为靶的治疗药的伴随诊断的aspd分析试剂盒、或以aspd为靶的治疗药的伴随诊断药。[0088]作为以aspd为靶的治疗药，在一个或多个实施方式中，可举出用于预防、改善和/或治疗伴随aspd的蓄积的疾病的药物组合物。[0089]本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，具有免疫原性，可诱导产生针对本公开的aβ交联体的抗体。[0090]另外，本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，具有免疫原性，可诱导产生针对aspd的抗体。[0091]因此，本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，从能够诱导针对aspd的抗体的观点出发，可以成为aspd的替代物。[0092]已公开了将aspd作为针对伴随aspd的蓄积的疾病的主动疫苗使用(例如wo2017/179646)。[0093]本公开的aβ交联体可以成为aspd的替代物，因此本公开的aβ交联体也可以用作主动疫苗，并且可以用于疫苗的制造。[0094]因此，本公开在一个方式中，涉及将本公开的aβ交联体作为有效成分的药物组合物。作为本公开的药物组合物的一个或多个实施方式，可举出含有本公开的aβ交联体的疫苗。本公开的药物组合物和疫苗可以含有药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。[0095]本公开的药物组合物和疫苗在一个或多个实施方式中，可以用于预防、改善和/或治疗伴随aspd的蓄积的疾病。本公开的药物组合物和疫苗在一个或多个实施方式中，可以用于预防、改善和/或治疗阿尔茨海默病和/或路易体痴呆。[0096]本公开的药物组合物和疫苗在一个或多个实施方式中，可以给药至可能患有伴随aspd的蓄积的疾病的对象、可能已患病的对象、或者患病的对象。本公开的药物组合物在一个或多个实施方式中，可以给药至可能患有阿尔茨海默病和/或路易体痴呆的对象、可能已患病的对象、或患病的对象。作为该对象，可举出哺乳类、人、除人以外的哺乳类。[0097]对于用本公开的药物组合物和疫苗使对象获得针对aspd、伴随aspd的蓄积的疾病、或阿尔茨海默病和/或路易体痴呆的免疫的一个或多个实施方式进行说明。本公开的药物组合物和疫苗的给药方法在一个或多个实施方式中，可包括向肌肉内、腹腔内、皮内或皮下注射、或向口腔、消化道、呼吸道、泌尿生殖道经粘膜给药。作为本公开的药物组合物和疫苗中的aβ交联体的给药量，可举出在不会对给药对象造成显著的副作用的情况下诱发免疫防御响应的量。本公开的药物组合物和疫苗的给药量在一个或多个实施方式中，可以预见以0.01μg～10mg、0.1μg～1000μg、1μg～100μg、5μg～50μg或5μg～25μg的范围含有细胞分泌型aspd样结构体的量。也可以在初始给药之后，隔着充分的间隔进行1次或数次的加强给药。[0098]因此，本公开在一个方式中，涉及一种预防、改善和/或治疗伴随aspd的蓄积的疾病(例如阿尔茨海默病和/或路易体痴呆)的方法，其包含将本公开的aβ交联体或本公开的药物组合物或疫苗给药至对象的工序。[0099]本公开在另一方式中，涉及一种使对象获得针对aspd本身的免疫的方法，其包含将本公开的aβ交联体或本公开的药物组合物或疫苗给药至对象的工序。[0100]本公开在又一方式中，涉及一种使对象获得针对伴随aspd的蓄积的疾病的免疫的方法，其包含将本公开的aβ交联体或本公开的药物组合物或疫苗给药至对象的工序。[0101]另外，本公开在一个方式中，涉及一种药物组合物或疫苗的制造方法，其包含将本公开的aβ交联体与赋形剂和/或佐剂组合的工序。[0102]本公开在另一方式中，涉及一种药物组合物或疫苗的制造方法，所述药物组合物具有本公开的aβ交联体作为有效成分，所述疫苗具有本公开的aβ交联体，所述制造方法包含通过后述的制造方法制造本公开的aβ交联体的工序。[0103][aβ交联体的制造方法][0104]本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，可以通过在aβ溶解于水性溶剂而成的aβ水溶液中添加交联剂进行交联反应而得到。[0105]aβ可以通过肽合成来制备，也可以通过重组技术来生产。[0106]所添加的交联剂的量在一个或多个实施方式中，相对于aβ以摩尔换算，为10倍以上、20倍以上、或30倍以上。所添加的交联剂的量在一个或多个实施方式中，以摩尔换算，为200倍以下、100倍以下、或75倍以下。[0107]交联反应后的交联体还可以供于超滤。可以在保持液或过滤残渣的回收液中得到本公开的aβ交联体。[0108]作为超滤过滤器的分子量临界值(mwco)，在一个或多个实施方式中，可举出30kda、50kda、或100kda。[0109]本公开的aβ交联体在一个或多个实施方式中，可以通过实施例记载的方法制造。[0110]因此，本公开可涉及以下的实施方式；[0111][a1]一种aβ交联体，其中，aβ通过间隔臂长度为以上且以下的交联剂交联。[0112][a2]一种aβ交联体，其中，aβ通过作为间隔臂具有1个以上且13个以下的eo基和/或po基的交联剂交联。[0113][a3]根据[a1]或[a2]所述的aβ交联体，其中，aβ为aβ38、aβ39、aβ40、aβ41、aβ42、或aβ43。[0114][a4]根据[a1]～[a3]中任一项所述的aβ交联体，其中，交联剂为具有使氨基间交联的反应末端的交联剂。[0115][a5]根据[a1]～[a4]中任一项所述的aβ交联体，其中，通过10-20％sdspage分析的分子量超过100kda。[0116][a6]根据[a1]～[a5]中任一项所述的aβ交联体，其为对aspd特异性抗体与aspd发生竞争的物质。[0117][a7]根据[a1]～[a6]中任一项所述的aβ交联体，其为aspd分析的标准物质。[0118][a8]根据[a1]～[a7]中任一项所述的aβ交联体，其为伴随aspd的蓄积的疾病的诊断中的aspd分析的标准物质。[0119][a9]根据[a1]～[a8]中任一项所述的aβ交联体，其为以aspd为靶的治疗药的伴随诊断中的aspd分析的标准物质。[0120][a10]根据[a1]～[a9]中任一项所述的aβ交联体，其为以aspd为靶的治疗药的伴随诊断药的一个成分。[0121][b1][a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体作为对aspd特异性抗体与aspd发生竞争的物质的用途。[0122][b2][a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体作为针对aspd特异性抗体的aspd的替代物的用途。[0123][b3][a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体作为aspd分析的标准物质的用途。[0124][b4][a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体在伴随aspd的蓄积的疾病的诊断中的用途。[0125][b5]根据[b4]所述的用途，其中，所述诊断是以aspd为靶的治疗药的伴随诊断。[0126][b6][a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体作为伴随aspd的蓄积的疾病的诊断中的aspd分析的标准物质的用途。[0127][b7]根据[b6]所述的aβ交联体的用途，其中，伴随aspd的蓄积的疾病为阿尔茨海默病和/或路易体痴呆。[0128][b8][a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体作为以aspd为靶的治疗药的伴随诊断中的aspd分析的标准物质的用途。[0129][b9][a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体作为以aspd为靶的治疗药的伴随诊断药的一个成分的用途。[0130][c1]一种aspd分析试剂盒，其包含[a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体作为标准物质。[0131][c2]根据[c1]所述的aspd分析试剂盒，其进一步包含aspd特异性抗体。[0132][c3]根据[c1]或[c2]所述的aspd分析试剂盒，其用于伴随aspd的蓄积的疾病的诊断。[0133][c4]根据[c3]所述的aspd分析试剂盒，其中，伴随aspd的蓄积的疾病为阿尔茨海默病和/或路易体痴呆。[0134][c5]根据[c1]～[c4]中任一项所述的aspd分析试剂盒，其用于以aspd为靶的治疗药的伴随诊断。[0135][c6]一种以aspd为靶的治疗药的伴随诊断药，其含有[a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体作为标准物质，。[0136][c7]一种aspd分析方法，其包含使用[a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体作为标准物质的工序。[0137][c8]根据[c7]所述的aspd分析方法，其包含使用aspd特异性抗体进行免疫分析。[0138][c9]根据[c7]或[c8]所述的aspd分析方法，其用于伴随aspd的蓄积的疾病的诊断。[0139][c10]根据[c9]所述的aspd分析方法，其中，伴随aspd的蓄积的疾病为阿尔茨海默病和/或路易体痴呆。[0140][c11]根据[c7]～[c10]中任一项所述的aspd分析方法，其用于以aspd为靶的治疗药的伴随诊断。[0141][c12]一种以aspd为靶的治疗药的伴随诊断方法，其包含进行[c7]～[c11]中任一项所述的aspd分析方法的工序。[0142][c13]根据[c12]所述的诊断方法，其中，以aspd为靶的治疗药是用于预防、改善和/或治疗伴随aspd的蓄积的疾病的药物组合物。[0143][c14]根据[c13]所述的诊断方法，其中，伴随aspd的蓄积的疾病为阿尔茨海默病和/或路易体痴呆。[0144][d1]一种药物组合物，其含有[a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体作为有效成分。[0145][d2]一种疫苗，其含有[a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体。[0146][d3][a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体作为主动疫苗的用途。[0147][d4][a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体在疫苗制造中的用途。[0148][d5]根据[d2]所述的疫苗或[d3]或[d4]所述的用途，其中，疫苗是针对伴随aspd的蓄积的疾病的疫苗。[0149][d6]一种预防、改善和/或治疗伴随aspd的蓄积的疾病的的方法，其包含将[a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体、[d1]所述的药物组合物、或[d2]所述的疫苗给药至对象的工序。[0150][d7]根据[d6]所述的方法，其中，伴随aspd的蓄积的疾病为阿尔茨海默病和/或路易体痴呆。[0151][d8]一种使对象获得针对aspd的免疫的方法，其包含将[a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体、[d1]所述的药物组合物、或[d2]所述的疫苗给药至对象的工序。[0152][d9]一种使对象获得针对伴随aspd的蓄积的疾病的免疫的方法，其包含将[a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体、[d1]所述的药物组合物、或[d2]所述的疫苗给药至对象的工序。[0153][d10]根据[d9]所述的方法，其中，伴随aspd的蓄积的疾病为阿尔茨海默病和/或路易体痴呆。[0154][d11]一种药物组合物或疫苗的制造方法，其包含将[a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体与药学上可接受的赋形剂组合的工序。[0155][aspd的分析方法][0156]本公开在一个方式中，涉及一种aspd的分析方法(以下也称为“本公开的aspd分析方法”)，其包含下述工序(1)和(2)。[0157](1)使有可能含有aspd的生物体来源的试样与结合于不溶性载体的、能够与aspd结合的抗体(第一抗体)接触，在含有aspd的情况下使aspd与第一抗体结合的工序。[0158](2)使抗aspd单克隆抗体(第二抗体)与在工序(1)中已结合于第一抗体的aspd反应的工序。[0159]在此，第一抗体为人源化抗aspd单克隆抗体huasd2或单克隆抗体ban50a，[0160]第二抗体为小鼠单克隆抗aspd抗体masd3或其标记化抗体。[0161]本公开的aspd分析方法是利用免疫测定法的原理的方法，在一个或多个实施方式中，其是elisa等酶免疫测定法、cleia等化学发光酶免疫测定法。[0162]作为结合于不溶性载体的第一抗体，在一个或多个实施方式中，从提高将血液、血浆成分、脑脊髓液或它们的稀释液作为试样的情况下的检测灵敏度的观点出发，优选为huasd2或ban50a。[0163]huasd2记载于wo2009/057664中，是具有序列表的序列号1中记载的氨基酸序列的重链可变区域和序列表的序列号2中记载的氨基酸序列的轻链可变区域的人源化单克隆抗aspd抗体。[0164]序列号1：evqlvesggglvkpggslrlscaasgftfsdyfmswvrqapgkglewvggieiksyfyatyyfgsvkgrftisrddskntlylqmnslktedtavyycttnrevggldnwgqgtlvtvss[0165]序列号2：qsvltqpsslsaspgasasltctlrsgisvggkniywyqqkpgsppqyllkyssysnkqlgpgvpsrfsgskdasanagillisglqsedeadyycsihesnayvfgggtkltvlgr[0166]huasd2例如可以通过将asd2rhapg1d200(专利生物保藏中心保藏编号：ferm bp-11040)asd2rlapln100(专利生物保藏中心保藏编号：ferm bp-11041)共转染至公知的动物细胞并使其表达而得到。[0167]另外，在一个或多个实施方式中，本公开中的huasd2可以用具有序列表的序列号3中记载的氨基酸序列的重链可变区域和序列表的序列号4中记载的氨基酸序列的轻链可变区域的抗aspd抗体代替。[0168]序列号3：evqlvesggglvkpggslrlscaasgftfsdyfmswvrqapgkglewvxgieiksyfyatyyfgsvkgrftisrddskntxylqmnslktedtavyyctxnrevggldnwgqgtlvtvss[0169]序列号4：qxvltqpxslsaspgasasltctlrsgisvggkniywyqqkpgsppqxxlxyssysnkqlgpgvpsrfsgskdxsanaxillisglqsedeadyycsihesnayvfgggtkltvlg[0170](在序列号3中，第49位的x为g或a，第81位的x为l或v，第100位的x为t或r，在序列号4中，第2位的x为s或a，第8位的x为s或a，第48位的x为y或f，第49位的x为l或f，第51位的x为k或f或r，第74位的x为a或t，第79位的x为g或a。)[0171]在本公开中，ban50a是国际公开wo94-17197号小册子中记载的特异性地识别aβ的n末端区域的公知的单克隆抗体。ban50a可以使用市售品，或者可以使用专利生物保藏中心杂交瘤ban50(保藏编号ferm bp4163)通过公知的方法来制造。[0172]第二抗体在一个或多个实施方式中，从提高检测灵敏度的观点出发，可举出masd3的标记化抗体。作为标记化，在一个或多个实施方式中，可举出生物素化。[0173]作为本公开的aspd分析方法中的不溶性载体，在一个或多个实施方式中，可举出珠粒、多孔平板等固相物。[0174]作为有可能含有aspd的生物体来源的试样，作为一个或多个实施方式，可举出血液、血浆、和脑脊髓液、以及它们的稀释物。[0175]本公开的aspd分析方法在一个或多个实施方式中，可以包含在工序(1)之前制备生物体来源的试样的工序(0)。该试样制备工序(0)在一个或多个实施方式中，包含将血液、血浆和脑脊髓液等生物试样稀释到适当的溶剂或缓冲液中。另外，该试样制备工序(0)在一个或多个实施方式中，所述溶剂或缓冲液可以在不妨碍分析的范围内含有表面活性剂或其他药剂。[0176]本公开的aspd分析方法在一个或多个实施方式中，可以进一步包含下述的工序(3)。[0177](3)使连接有报告基因的抗小鼠抗体与工序(2)中已结合于aspd的第二抗体反应的工序、或使连接有报告基因的所述标记的结合伴侣与工序(2)中已结合于aspd的第二抗体的标记反应的工序。[0178]作为报告基因，在一个或多个实施方式中，可举出利用化学发光或生物发光的物质、荧光蛋白等，从提高检测灵敏度的观点出发，优选利用化学发光或生物发光的物质。[0179]作为利用化学发光或生物发光的物质，在一个或多个实施方式中，可举出生物发光酶或其突变体等酶。[0180]作为上述酶，在一个或多个实施方式中，可举出hrp(辣根过氧化物酶)和碱性磷酸酶等。[0181]作为所述结合伴侣，在一个或多个实施方式中，在标记为生物素的情况下，可举出链霉亲和素等。[0182]发光的测定在一个或多个实施方式中，可以通过发光光度计或多功能酶标仪进行。[0183]本公开的aspd分析方法在一个或多个实施方式中，可以将本公开的aβ交联体用作标准物质。[0184]因此，本公开可涉及以下的实施方式；[0185][e1]一种aspd的分析方法，其包含下述的工序(1)和(2)。[0186]工序(1)：使有可能含有aspd的生物体来源的试样与结合于不溶性载体的、能够与aspd结合的抗体(第一抗体)接触，在含有aspd的情况下使aspd与第一抗体结合的工序。[0187]工序(2)：使抗aspd单克隆抗体(第二抗体)与在工序(1)中已结合于第一抗体的aspd反应的工序。[0188]在此，第一抗体为人源化抗aspd单克隆抗体huasd2或单克隆抗体ban50a，[0189]第二抗体为小鼠单克隆抗aspd抗体masd3或其标记化抗体。[0190][e2]根据[e1]所述的分析方法，其为利用免疫测定法的原理的方法。[0191][e3]根据[e2]所述的分析方法，其中，利用免疫测定法的原理的方法为elisa或cleia。[0192][e4]根据[e1]～[e3]中任一项所述的分析方法，其中，生物体来源的试样为血液、血浆成分、脑脊髓液或它们的稀释液。[0193][e5]根据[e1]～[e4]中任一项所述的分析方法，其包含在工序(1)之前制备生物体来源的试样的工序(0)。[0194][e6]根据[e5]所述的分析方法，其中，试样制备工序(0)包含将选自血液、血浆和脑脊髓液的生物试样稀释到溶剂或缓冲液中的工序。[0195][e7]根据[e1]～[e6]中任一项所述的分析方法，其进一步包含下述的工序(3)。[0196]工序(3)：使连接有报告基因的抗小鼠抗体与工序(2)中已结合于aspd的第二抗体反应的工序、或使连接有报告基因的所述标记的结合伴侣与工序(2)中已结合于aspd的第二抗体的标记反应的工序。[0197][e8]根据[e1]～[e7]中任一项所述的分析方法，其中，作为aspd的标准物质使用后述[1]所述的物质。[0198][e9]根据[e1]～[e7]中任一项所述的分析方法，其中，包含将[a1]～[a10]中任一项所述的aβ交联体作为标准物质使用的工序。[0199][e10]根据[e1]～[e9]中任一项所述的分析方法，其用于伴随aspd的蓄积的疾病的诊断。[0200][e11]根据[e10]所述的分析方法，其中，伴随aspd的蓄积的疾病为阿尔茨海默病和/或路易体痴呆。[0201][e12]根据[e1]～[e11]中任一项所述的分析方法，其用于以aspd为靶的治疗药的伴随诊断。[0202][e13]一种伴随aspd的蓄积的疾病的诊断方法，其包含进行[e1]～[e12]中的任一项所述的分析方法的工序。[0203][e14]根据[e13]所述的诊断方法，其中，伴随aspd的蓄积的疾病为阿尔茨海默病和/或路易体痴呆。[0204][e15]一种以aspd为靶的治疗药的伴随诊断方法，其包含进行[e1]～[e12]中任一项所述的分析方法的工序。[0205][e16]根据[e15]所述的诊断方法，其中，以aspd为靶的治疗药为用于预防、改善和/或治疗伴随aspd的蓄积的疾病的药物组合物。[0206][e17]根据[e16]所述的诊断方法，其中，伴随aspd的蓄积的疾病为阿尔茨海默病和/或路易体痴呆。[0207][f1]一种aspd分析试剂盒，其包含人源化抗aspd单克隆抗体huasd2或单克隆抗体ban50a(第一抗体)、和小鼠单克隆抗aspd抗体masd3或其标记化抗体(第二抗体)。[0208][f2]根据[f1]所述的aspd分析试剂盒，其进一步包含[a1]～[a10]中任一项所述[0233]aβ交联体3：aβ42，交联剂为dfdnb[0234]所使用的交联剂如下。[0235]bs(peg)5：双(琥珀酰亚胺基)五(乙二醇)[0236](间隔臂长度：)[0237]bs(peg)9：双(琥珀酰亚胺基)九(乙二醇)[0238](间隔臂长度：)[0239]dfdnb：1,5-二氟-2,4-二硝基苯[0240](间隔臂长度：)[0241][化学式1][0242][0243]aβ交联体的方案(protocol)[0244]将aβ42 0.56mg用120μl dmso溶解(1mm)[0245]↓[0246]将10μl添加到90μl pbs(-)后，在25℃下静置15分钟(以aβ计，为100μm，相当于0.046667mg)[0247]↓[0248]添加50倍摩尔的交联试剂bs(peg)5、bs(peg)9、或dfdnb后，在25℃静置30分钟[0249]↓[0250]添加tris-hcl ph为8.0(终浓度为50mm)，在25℃静置30分钟[0251]↓[0252]用mwco50k的超滤过滤器进行过滤处理，得到高分子级分。[0253]pbs(-)300μl清洗×3[0254]用50μl的pbs(-)回收膜残渣[0255]↓[0256]通过bca法进行浓度测定[0257]2.aβ交联体的sdspage[0258]使用所得到的aβ交联体1～3进行sdspage(10-20％凝胶)，确认到交联。将其结果的一例示于图1。[0259]如图1所示，可见aβ交联体1～3分别高分子化，分子量为100kda以上。[0260]3.aβ交联体的aspd cleia反应性[0261]确认到所得到的aβ交联体1～3的aspd cleia反应性。[0262]所使用的aspd cleia是图2所示的系统，其是使用固定化于固相的抗aspd多克隆抗体(第一抗体)、检测侧的小鼠抗aspd单克隆抗体masd3(第二抗体)、及抗小鼠igg-hrp的系统。masd3是wo2006/016644及wo2009/057664中记载的单克隆抗体，杂交瘤被保藏于专利生物保藏中心(保藏编号为ferm bp-10394)。hrp表示辣根过氧化物酶。[0263]将以aβ交联体1～3为受检物的aspd cleia[抗aspd多克隆抗体/masd3]的反应性与以aspd为受检物时比较的结果的一例示于图3。[0264]如图3所示，aβ交联体1和2与aβ交联体3相比，与aspd的反应性更接近。其中，aβ交联体1显示出与aspd同等的反应性。[0265]aβ交联体的反应性比较(续)[0266]接着，使用市售的aβ低聚物测定试剂盒比较aβ交联体的反应性，该试剂盒使用特异性识别aβ的n末端的单克隆抗体82e1。[0267]作为受检物，使用了aβ交联体1、aspd、及aβ1-16二聚物。[0268]另外，比较了aspd cleia[抗aspd多克隆抗体/masd3]中的aβ交联体1、aspd、及aβ1-16二聚物的反应性。[0269]将其结果的一例示于图4。[0270]如图4所示，与aspd cleia同样地，在市售的aβ低聚物测定试剂盒中，aβ交联体1也显示出与aspd同等的反应性。[0271]使用82e1的市售的aβ低聚物测定试剂盒时，aβ交联体1和aspd与aβ1-16二聚物相比反应性显著地弱。[0272]相反，在aspd cleia中，aβ1-16二聚物的反应性与aβ交联体1和aspd相比反应性显著地弱。[0273]另外，可见aspd cleia对aβ交联体1和aspd具有特性高的检测灵敏度。[0274]4.aβ交联体的免疫原性[0275]与弗氏佐剂(fca，初次)、不完全弗氏佐剂(fia，5次)的佐剂一起用aβ交联体1对兔(新西兰白色)进行免疫(100μg/次)6次，然后进行全部采血，进行血清中的抗体与aβ交联体1和合成aspd的反应性的评价。将其结果的一例示于图5。[0276]在图5中，“pre血清”表示免疫前的血清与aβ交联体1固相化平板的反应性，“固相化aβ交联体”表示所得到的血清与aβ交联体1固相化平板的反应性，“固相化合成aspd”表示所得到的血清与合成aspd固相化平板的反应性，“对照”表示所得到的血清与f12蛋白固相化平板的反应性，“空白”表示所得到的血清与空白平板的反应性。[0277]由图5的结果显示，aβ交联体1具有免疫原性，能够诱导与aspd反应的抗体。[0278]5.脑脊髓液(csf)中的aspd的测定[0279]用aspd cleia系统[抗aspd多克隆抗体/masd3]进行人csf检样中的aspd的测定。具体而言，按照以下的流程进行。[0280](1)向csf中添加已知浓度aspd，用检样稀释液进行稀释(稀释1～16倍)。[0281](2)一次反应：以100μl/孔添加到固定化有兔抗aspd多克隆抗体的多孔平板中，在25℃静置60分钟。[0282]清洗×3[0283](3)二次反应：以100μl/孔添加masd3(1μg/ml)，在25℃静置60分钟。[0284]清洗×3[0285](4)三次反应：以100μl/孔添加抗小鼠igg-hrp(1/20000)，在25℃静置60分钟。[0286]清洗×3[0287](5)测定：以100μl/孔添加hrp的化学发光底物(商品名：supersignal pico、thermofisher公司制)，用酶标仪(商品名：infinite m200pro、tecan公司制)测定发光。[0288]测定用的标准品使用了aβ凝聚体1或细胞分泌型aspd样结构体(wo2017/179646)。[0289]检样稀释液使用了3％bsa的pbs(-)0.05％防腐剂(商品名：proclin、sigma-aldrich公司制)。[0290]清洗液使用了pbs(-)0.05％tween20。[0291]将向人csf(年龄84/caucasian/m)中添加已知浓度aspd(高浓度h：108pm、中浓度m：54pm、低浓度l：27.5pm、无n：0pm)、4倍稀释进行定量而得到的结果示于下述表1。[0292][表1][0293]表1：向人csf中添加的aspd的回收率(稀释倍率×4)[0294][0295]如表1所示，有大致100％的回收率。另外，在使用了人csf(年龄66/caucasian/m)和人csf(年龄69/caucasian/m)的情况下也得到了同样的结果。[0296]接着，将在人csf中aspd达到峰值的样品用检样稀释液稀释为2倍、4倍、8倍，测定稀释率为1倍、1/2、1/4和1/8的样品，将其结果示于图6。[0297]如图6所示，对稀释样品的结果作图，其结果得到了稀释直线性。[0298]6.人血浆中的aspd的测定[0299]通过aspd cleia[抗aspd多克隆抗体/masd3]进行人血浆检样中的aspd的测定。具体而言，按照以下的流程进行。[0300](1)向人血浆中添加已知浓度aspd，用检样稀释液进行稀释(稀释1～16倍)。[0301](2)一次反应：以100μl/孔添加到固定化有兔抗aspd多克隆抗体的多孔平板中，在25℃振荡60分钟。[0302]清洗×3[0303](3)二次反应：以100μl/孔添加masd3(1μg/ml)，在25℃振荡60分钟。[0304]清洗×3[0305](4)三次反应：以100μl/孔添加抗小鼠igg-hrp(1/20000)，在25℃振荡60分钟。[0306]清洗×3[0307](5)测定：以100μl/孔添加hrp的化学发光底物(商品名：supersignal pico、thermofisher公司制)，用酶标仪(商品名：infinite m200pro、tecan公司制)测定发光。[0308]测定用的标准品使用了aβ凝聚体1或细胞分泌型aspd样结构体(wo2017/179646)。[0309]检样稀释液使用了3％bsa的pbs(-)0.05％防腐剂(商品名：proclin、sigma-aldrich公司制)。[0310]清洗液使用了pbs(-)0.05％tween20。[0311]将向人血浆(年龄29/caucasian/f)中添加已知浓度aspd、用3％bsa pbs(-)稀释4倍进行定量而得到的结果的一例示于下述表2。[0312][表2][0313]表2：向人血浆中添加的aspd的回收率(稀释倍率×4)[0314][0315]如表2所示，即使代替人csf使用人血浆也能够测定aspd。但是，回收率为一半左右。考虑是血浆成分的影响。[0316]接着，将在人血浆中aspd达到峰值的样品用检样稀释液稀释为2倍、4倍、8倍、16倍，测定稀释率为1倍、1/2、1/4、1/8、及1/16的样品，将其结果示于图7。[0317]如图7所示，对稀释样品的结果作图，其结果得到了稀释直线性。但是，与缓冲液相比，斜率为1/2。考虑是血浆成分的影响。[0318]需要说明的是，对人血浆试样中的回收率的影响在使试样的稀释率为1/16时可以消除。[0319]7.aspd cleia[huasd2/masd3][0320]作为固定化于固相的抗体，使用人源化抗aspd单克隆抗体huasd2，通过使用了小鼠抗aspd单克隆抗体masd3和抗小鼠igg-hrp的aspd cleia测定aspd(图8)。[0321]huasd2记载于wo2009/057664中。[0322]将其结果的一例示于图9。如图9所示，实施4次独立的aspd测定，其结果得到大致相同的发光值。[0323]8.aspd cleia[huasd2/生物素化masd3][0324]为了提高aspd的检测灵敏度，构建了使用将masd3抗体生物素化并结合了链霉亲和素(sa)的hrp的系统(图10)。[0325]通过huasd2/生物素化masd3系统测定aspd，其结果与huasd2/masd3的系统相比检测灵敏度提高(图11)。[0326]另外，huasd2/生物素化masd3系统对aspd的特性高，几乎没有检测到结合有16个分子的aβ1-10分子的多抗原肽(map16，富士胶片和光纯药公司制)(图12)。另一方面，通过作为对照的ban50/生物素化ban50系统(高分子淀粉样蛋白β低聚物elisa试剂盒，富士胶片和光纯药公司制)进行测定，其结果该系统灵敏度良好地检测出map16，且几乎没有检测到aspd(图12)。[0327]9.能够降低血浆影响的抗体的组合[0328]从固定化的第一抗体和检测侧的第二抗体的组合中发现了能够降低血浆的影响的组合。[0329]用下述的[第一抗体/第二抗体]的组合构建aspd ceila的系统，测定血浆试样中的aspd。[0330]作为[第一抗体/第二抗体]的组合，采用了[huasd2/生物素化masd3]、[masd3/生物素化masd3]、[82e1/生物素化masd3]、[ban50a/生物素化masd3]、及[6e10/生物素化masd3]。作为样品，准备含有aspd的稀释率为1/4的血浆样品，与缓冲液样品进行比较。[0331]将其结果的一例示于图13。[0332]如图13所示，确认了在[ban50a/生物素化masd3]的组合的情况下，能够最有效地避免血浆成分的影响。[0333]10.使用了ad患者的血液试样的测定[0334]对于诊断为阿尔茨海默病(ad)的患者的血浆样品10例(○)和健康人的血浆样品10例(△)，用[huasd2/生物素化masd3]的组合进行aspd cleia。其结果，对于ad患者的4例检测到aspd。将其结果示于图14。[0335]根据以上的这些结果，显示了能够通过aspd cleia来测定血液中的aspd。









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