一种寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物及其合成方法与流程 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于基因编码化合物库构建领域，具体涉及一种寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物及其合成方法。背景技术：2.目前，在医药研究中先导化合物的探索不断进入一个未知的领域。因此，找到合适的化学物质与现有的化合物进行结合并进行筛选越来越困难。传统高通量筛选存在化合物库数量有限、时间较长、成本高等缺点。这就限制了先导化合物发现的时效性(a.a.shelat,r.k.guy,nat.chem.biol.2007,3,442.)。brenner和lerner于1992年提出的可以使用基因编码化合物库技术(delt)来进行生物活性筛选的方法。它结合了分子生物学技术，在分子水平上给每个化合物加上一个dna标签，通过组合化学的合成方法可在较短的时间内产生多达亿级的化合物库，直接将这种dna逐个标记的化合物混合物进行生物活性筛选(s.brenner；r.a.lerner.proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1992,89,5381-5383.)。采用极少量的dna编码化合物库与靶标蛋白进行生物筛选，然后通过pcr技术进行复制扩增并对扩增dna序列进行测序、解码，找到对应的具体化合物。该技术不仅突破了传统高通量生物筛选的高成本与化合物化学空间上的瓶颈，实现了筛选的化合物化学结构空间及数量上的飞跃，而且可以同时在多种生物筛选条件下简洁、高效地进行先导化合物的筛选，成为越来越受欢迎的先导化合物的发现方法。3.为了能够成功地筛选到与生物标靶蛋白有亲和力的小分子化合物，构建化学结构上的多样性是delt能够成功筛选的重要保障。但由于dna化学结构的特殊性，它只能在一定的条件下(温度、ph、离子浓度、溶剂等)才能稳定，同时用于基因编码化合物库构建的化学反应还需要较高的产率，因此能够在基因编码化合物库上运用的化学反应的种类十分有限(r.j.fair,r.t.walsh,c.d.hupp.bioorg.med.chem.lett.,2021,51,128-339.)。只有在基因编码化合物库上能够成功应用的化学反应的种类越多，条件越丰富，在进行基因编码化合物库的设计和合成时选择才越多，得到的化合物库的多样性才会越丰富。然而，能够在del合成上能够成功应用的有机化学反应仍然十分有限，因此开发出更多能适用于基因编码化合物库的合成方法也是delt领域的重要工作之一(r.m.franzini,c.randolph.j med.chem.,2016,59,6629-6644；p.dickson,t.kodadek.org.biomol.chem.,2019,17,4676-4688；k.s.chines,a.brunschweiger.tetrahedron.lett.2020,61,151889；p.r.fitzgerald,b.m.paegel.chem.rev.2021,121,7155-7177；y.shi,y.r.wu,w.n.zhang,et al.rsc adv.,2021,11,2359-2376.)。4.硫代磷酸酯类化合物具有重要的生物活性，广泛应用于药物和农药类化合物的骨架结构中，因此，对于硫代磷酸酯类化合物的高效合成研究具有重要的科学意义和应用价值。在生物医学方面，硫代磷酸酯类化合物可以用来合成碘化二乙氧膦酰硫胆碱(ache抑制剂)，其可以用来治疗慢性青光眼；还进一步合成用于治疗癌症的氨磷汀，可以显著降低对患者身体各部分的神经毒性作用。在1994年在日本上市的治疗各种类型的高血压药也可以用来合成，例如抗高血压药盐酸依福地平。[0005][0006]传统化学中已报道过多种可有效合成硫代磷酸酯类小分子化合物的方法。例如，1968年，murdock等人报道了亚磷酸三乙酯与硫酚在溴代氯仿中反应制备芳香基取代的硫代磷酸酯，但是该方法不适用于普通的硫醇，并且该方法在小分子上需要无水无氧的条件，条件苛刻，不适用于在dna构建硫代磷酸酯类化合物。2013年kaboudi等发现了在铜作为催化剂下亚磷酸酯化合物于硫醇化合物可以通过脱氢形成硫代磷酸酯类小分子化合物。但该条件仅适用于苯硫酚类化合物，官能团兼容性比较差。另外，song等人报道了一种没有过渡金属催化，氧气气氛、乙腈做溶剂的条件下，由硫醇和磷酸二烷基酯得到硫代磷酸盐的方法，但dna上的反应一般在离心管中进行，很难充分保证氧气氛围，因此该方法也不适用于在dna构建硫代磷酸酯类化合物。(a)l.l.murdock,t.l.hopkins.synthesis of o,o-dialkyl s-aryl phosphorothiolates[j].org.chem.1968,33(2),907-908；b)q.an,j.shen.n.butt.et al.cheminform abstract:asymmetric domino double michael addition of nitroolefins and aldehyde esters with trans-perthydroindolic acid as an organocatalyst[j].synthesis.2013,45(12),1612-1623；c)s.song,y.q.zhang.et al.cs2co3-catalyzed aerobic oxidative cross-dehydrogenative coupling of thiols with phosphonates and arenes[j].angew.chem.int.ed.2017,56,2487-2491.)[0007]目前还未见在dna上构建硫代磷酸酯类基因编码化合物方法的报道。dna化学与普通化学反应存在差别，许多普通的小分子化学反应条件苛刻，容易引起dna变性、破坏dna化学结构，使得它们不能应用于基因编码化合物库构建。因此，开发出一种对dna损伤小、转化率高的合成on-dna硫代磷酸酯类化合物的方法具有重要意义。技术实现要素：[0008]本发明的目的在于提供一种寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物的合成方法。[0009]本发明提供了一种寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物，它具有式i所示结构：[0010][0011]其中，l1、l2为连接单元；[0012]r1、r2分别独立选自c1～12烷基、苯基或苄基。[0013]进一步地，上述l1为：[0014]和/或，所述l2为取代或未取代的：c1～6亚烷基或5～6元芳基或杂芳基；[0015]其中，所述取代的取代基个数为1～3个，所述取代基分别独立选自卤素、c1～5烷基、c1～5酰胺基、氨基或被保护的氨基。[0016]更进一步地，上述l2为取代或未取代的：c1～3亚烷基、苯基或吡啶基；[0017]其中，所述取代的取代基个数为1个，所述取代基是氟、甲基、乙酰氨基或fmoc保护的氨基。[0018]进一步地，上述r1、r2分别独立选自c1～5烷基、苯基或苄基，优选的，r1、r2分别独立选自甲基、乙基、苯基或苄基。[0019]更进一步地，上述化合物是下列化合物之一：[0020][0021]本发明还提供了一种寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物的合成方法，它是以式iii所示的寡聚核酸-硫醇类化合物和式ii所示的磷酸酯类化合物为原料，在催化剂的作用下于溶剂中反应，得到式i所示的寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物；反应式如下：[0022][0023]其中，l1、l2为连接单元；[0024]r1、r2分别独立选自c1～12烷基、苯基或苄基。[0025]进一步地，上述式iii所示的寡聚核酸-硫醇类化合物、式ii所示的磷酸酯类化合物和催化剂的摩尔比例为：1:(1～500):(1～1000)，优选为1:(50～250):(200～600)；[0026]和/或所述反应的温度为0～90℃；优选为4～50℃；[0027]和/或所述反应的时间为1～24小时；优选为2～20小时；[0028]和/或所述催化剂为叔丁醇钠、叔丁醇钾、碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸锂、氢氧化锂、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铯、硼酸钠、硼酸钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、醋酸钠、氟化钠、氟化钾、氟化铯、三乙胺、正丁胺、异丁胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶、三乙烯二胺、n,n-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、n,n,n',n'-四甲基乙二胺、1,1,3,3-四甲基胍、n,n-二环己基甲胺、二环己胺、四氢吡咯、无机盐缓冲溶液、有机碱缓冲溶液中的一种或多种的混合；在一个优选的实施方案中，所述催化剂为三乙烯二胺、三乙胺、n,n-二异丙基乙胺中的一种或多种的混合；在一个更优选的实施方案中，所述催化剂为n,n-二异丙基乙胺；[0029]和/或所述溶剂为水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环己醇、2-氟乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、1,4-二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚，乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、n-甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯中的任意一种或几种的混合；优选地，所述反应的溶剂是水和二甲基亚砜的混合。[0030]更进一步地，上述式iii所示的寡聚核酸-硫醇类化合物、式ii所示的磷酸酯类化合物和碱的摩尔比例为1：200：400；[0031]和/或所述反应的温度为25℃；[0032]和/或所述反应的时间为12小时；[0033]和/或所述催化剂是n,n-二异丙基乙胺。[0034]进一步地，上述l1为：[0035]和/或，所述l2为取代或未取代的：c1～6亚烷基或5～6元芳基或杂芳基；[0036]其中，所述取代的取代基个数为1～3个，所述取代基分别独立选自卤素、c1～5烷基、c1～5酰胺基、氨基或被保护的氨基。[0037]更进一步地，上述l2为取代或未取代的：c1～3亚烷基、苯基或吡啶基；[0038]其中，所述取代的取代基个数为1个，所述取代基是氟、甲基、乙酰氨基或fmoc保护的氨基。[0039]进一步地，上述r1、r2分别独立选自c1～5烷基、苯基或苄基，优选的，r1、r2分别独立选自甲基、乙基、苯基或苄基。[0040]更进一步地，上述式i化合物为下列化合物之一：[0041][0042]本发明还提供了上述的合成方法在构建基因编码化合物库中的用途。[0043]本发明的有益效果：本发明提供了一种在dna上合成寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物的方法，在特定的催化剂作用下，特定的溶剂体系中，特定温度下反应特定时间，成功制得寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物。该方法对dna损伤小，普适性好，操作简单，条件温和，能高收率地制得寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物，为扩大和丰富delt化合物库提供重要基础。[0044]本发明结构式中的“dna”为单链或双链的寡聚核苷酸链。[0045]本发明碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀ca～b烷基表示任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。例如，c1～6烷基是指包含1～6个碳原子的直链或支链的烷基。[0046]本发明“环烃基”指饱和或不饱和的纯碳环(构成环骨架的原子均为c)或杂环(杂环即纯碳环中的部分碳原子被杂原子如o、n、s替代进而形成的稳定环结构(例如一个环上的一个亚甲基-ch2-被的c被o替代，即形成稳定结构的-o-，或被n替代形成稳定结构的-nh-；或被s替代形成稳定结构的-so2-等))失去1或2个氢原子形成的基团。[0047]本发明“有机溶剂”包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环己醇、2-氟乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、1,4-二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚，乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、n-甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜(dmso)、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯。[0048]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。[0049]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明[0050]图1为寡聚核酸-nhfmoc原料(s2)的液相色谱质谱图。[0051]图2为寡聚核酸-nh2原料(s3)的液相色谱质谱图。[0052]图3为寡聚核酸-cooh原料(s4)的液相色谱质谱图。[0053]图4为寡聚核酸-硫醇类化合物原料s5-1的液相色谱质谱图。[0054]图5为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-2的液相色谱质谱图。[0055]图6为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-3的液相色谱质谱图。[0056]图7为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-4的液相色谱质谱图。[0057]图8为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-5的液相色谱质谱图。[0058]图9为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-6的液相色谱质谱图。[0059]图10为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-7的液相色谱质谱图。[0060]图11为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-8的液相色谱质谱图。[0061]图12为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-9的液相色谱质谱图。[0062]图13为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-10的液相色谱质谱图。[0063]图14为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-11的液相色谱质谱图。[0064]图15为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-12的液相色谱质谱图。[0065]图16为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-13的液相色谱质谱图。[0066]图17为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-14的液相色谱质谱图。[0067]图18为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物s5-15的液相色谱质谱图。[0068]图19为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p1的液相色谱质谱图。[0069]图20为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p2的液相色谱质谱图。[0070]图21为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p3的液相色谱质谱图。[0071]图22为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p4的液相色谱质谱图。[0072]图23为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p5的液相色谱质谱图。[0073]图24为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p6的液相色谱质谱图。[0074]图25为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p7的液相色谱质谱图。[0075]图26为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p8的液相色谱质谱图。[0076]图27为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p9的液相色谱质谱图。[0077]图28为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p10的液相色谱质谱图。[0078]图29为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p11的液相色谱质谱图。[0079]图30为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p12的液相色谱质谱图。[0080]图31为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p13的液相色谱质谱图。[0081]图32为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p14的液相色谱质谱图。[0082]图33为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p15的液相色谱质谱图。[0083]图34为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p16的液相色谱质谱图。[0084]图35为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p17的液相色谱质谱图。[0085]图36为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p18的液相色谱质谱图。[0086]图37为本发明寡聚核酸-α-羟基膦酸类化合物p9与taga连接后的产物taga-p9的液相色谱质谱图。[0087]图38为各寡聚核酸-硫醇类化合物(s5-1～s5-15)的结构图。[0088]图39为本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物(p1～p18)的结构图。具体实施方式[0089]本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。本发明说明书中所有的“当量”指摩尔当量。[0090]1、寡聚核酸-nh2原料(s3)的合成[0091]1.1按照以下反应式合成寡聚核酸-nhfmoc原料(s2)：[0092][0093]将100纳摩尔hp(s1，hp的结构如图1所示，为市售产品)溶于去离子水配制成1毫摩尔/升的溶液(100微升，1当量)。将40当量的起始头片段化合物(市售产品)的dmso溶液(20微升，200毫摩尔/升)、250当量ph＝9.5的四硼酸钠(na2b4o7)缓冲液(100微升，250毫摩尔/升)、40当量的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmt-mm)水溶液(20微升，200毫摩尔/升)混合，将该混合物用涡旋振荡器充分混匀。再将上述混合物加入到hp的溶液中，混合均匀后于4℃下反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5摩尔/升氯化钠溶液。然后，继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应液置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液。余下沉淀用去离子水溶解后得到dna-nhfmoc的溶液。利用液相色谱质谱联用仪检测dna-nhfmoc(s2)的谱图如图1所示，其分子量为5406。[0094]1.2按照以下反应式合成寡聚核酸-nh2原料(s3)：[0095][0096]将100纳摩尔dna-nhfmoc(s2)溶于去离子水配制成1毫摩尔/升(100微升，1当量)，向其中加入56微升10％的哌啶水溶液，将两者混合均匀后于室温下反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5摩尔/升氯化钠溶液。然后，继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液。余下沉淀用去离子水溶解后得到寡聚核酸-nh2(s3，简写为dna-nh2)的溶液。利用液相色谱质谱联用仪检测dna-nh2(s3)的谱图如图2所示，其分子量为5184。[0097]2、寡聚核酸-cooh原料(s4)的合成[0098]2.1按照以下反应式合成寡聚核酸-cooh原料(s4)：[0099][0100]将100纳摩尔hp(s1，hp的结构如图1所示，为市售产品)溶于去离子水配制成1毫摩尔/升的溶液(100微升，100纳摩尔，1当量)。将40当量的起始头片段化合物(市售产品)的dmso溶液(浓度：200毫摩尔/升)、250当量ph＝9.5的四硼酸钠(na2b4o7)缓冲液(浓度：250毫摩尔/升)、40当量的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmt-mm)水溶液(浓度：200毫摩尔/升)混合，将该混合物用涡旋振荡器充分混匀。再将上述混合物加入到hp的溶液中，混合均匀后于4℃下反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5摩尔/升氯化钠溶液。然后，继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应液置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液。余下沉淀用去离子水溶解后得到dna-cooh的溶液。利用液相色谱质谱联用仪检测dna-cooh(s4)的谱图如图3所示，其分子量为5229。[0101]3、寡聚核酸-硫醇化合物原料(s5-1)的合成encoded combinatorial libraries,neri d.acs comb.sci.2016,18,8,438–443.)。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5摩尔/升氯化钠溶液，然后加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下4℃离心半小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解后得到寡聚核苷酸-二硫化物水溶液。将100纳摩尔寡聚核苷酸-二硫化物溶于去离子水配制成1毫摩尔/升浓度的溶液(100微升，1当量)，向其中加入ph＝8.0的3-环己胺基丙磺酸(caps)缓冲液(100微升，100毫摩尔/升)，100当量dl-1,4-二硫苏糖醇(dtt，50微升，200毫摩尔/升乙腈溶液)，混合均匀后25℃反应0.5小时(参考文献：kaori sakurai；thomas m.snyder；and david r.liu*；dna-templated functional group transformations enable sequence-programmed synthesis using small-molecule reagents,j.am.chem.soc.2005,127,1660-1661)。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5摩尔/升氯化钠溶液和总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下4℃离心半小时，倒掉上清液，沉淀即为寡聚核苷酸-硫醇化合物(s5-6)。余下沉淀用去离子水溶解后得到寡聚核苷酸-硫醇化合物(s5-6)水溶液，该溶液直接用于下一步反应。利用液相色谱质谱联用仪检测寡聚核苷酸-硫醇化合物s5-6的谱图如图10所示，其分子量为5286，转化率为86％。以实施例1与实施例2为方法合成的其他寡聚核酸-硫醇类化合物原料(s5-2-s5-15，)，检测结果见图5-图18，s5-1-s5-15，的结构图见图38。[0107]原料hp(s1)的代表结构为：[0108][0109]但需要特别说明的是，本发明方法不仅限于本发明上述特定的s1结构的dna链，可以是其它经人工修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸单体聚合得到的单链或双链的脱氧核糖核苷酸链，链的长度没有限制。[0110]实施例1、以寡聚核酸-硫醇类化合物原料(s5-1)合成寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物(p1)[0111][0112]于10纳摩尔寡聚核酸-硫醇类化合物(s5-1，1毫摩尔/升，1当量，10微升)的水溶液中加入400当量n,n-二异丙基乙胺(20微升，200毫摩尔/升二甲基亚砜溶液)，以及200当量亚磷酸二乙酯(市售产品，200毫摩尔/升乙腈溶液，10微升)。将该混合物用涡旋振荡充分混匀后25℃反应12小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5摩尔/升氯化钠溶液及3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将其置于-80℃的冰箱中冷冻2小时，然后高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，15分钟)，倒掉上清液，余下沉淀为产物on-dna硫代磷酸酯类化合物(p1)，通过液相色谱质谱联用仪进行检测，检测结果见图19，分子量为5396，转化率为69％。以实施例3为方法合成的其他on-dna硫代磷酸酯类代表化合物(p2-p18)，检测结果见图20-图36。化合物p1-p18的结构图见图39。[0113]以下通过实验例证明本发明的有益效果。[0114]实验例1、本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物合成条件筛选[0115]参照实施例1的合成寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p10的方法，区别仅在于根据表1控制以下参数：催化剂、亚磷酸二乙酯当量、与水的共溶剂、反应时间。[0116][0117]计算不同参数下所得寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p10的转化率。结果见表1。根据实验结果可以看出，在#9的反应条件下，所得产物p10的收率最高。[0118]表1 不同条件下合成寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物p10的转化率[0119][0120][0121]实验例2、本发明寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物中寡聚核酸的完整性验证实验[0122][0123]on-dna硫代磷酸酯类化合物p9与oligo a(短链的寡聚核苷酸，两条链的分子量分别为4064、5884)链接：将1纳摩尔p9溶于去离子水配制成1毫摩尔/升浓度的溶液(1微升，1当量)，向其中加入1.2当量的oligo a(1毫摩尔/升的水溶液，1.2微升)、1微升10×t4 dna链接缓冲溶液以及0.5微升t4 dna链接酶。然后将上述溶液混合均匀，室温反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5摩尔/升氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液。余下沉淀用去离子水溶解后通过液相色谱质谱检测确认产物oligo a-p9的分子量，分子量为15367，质谱检测结果见图37。[0124]lcms分析结果表明，on-dna硫代磷酸酯类化合物p9与oligo a能够成功偶联。这说明按照本技术书中描述的合成方法得到的on-dna硫代磷酸酯类化合物的dna链完整性好。再通过lcms质谱能够精确地显示其分子量，进一步证实本发明中的反应方法对dna基本结构和活性基本不会造成损伤。[0125]综上，本发明提供了一种在dna上合成寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物的方法，在特定的碱、原料当量和特定溶剂的体系中反应特定时间，成功制得寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物。该方法对dna损伤小，普适性好，操作简单，条件温和，能高转化率地制得寡聚核酸-硫代磷酸酯类化合物，为扩大和丰富delt化合物库提供了一种新的方法。









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