mNGS在区分感染性和恶性胸腔积液中的应用的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术mngs在区分感染性和恶性胸腔积液中的应用技术领域1.本发明涉及分子生物医学技术领域，特别是涉及mngs在区分感染性和恶性胸腔积液中的应用。背景技术：2.胸腔积液最常见的原因有恶性肿瘤和感染性疾病，感染性疾病常见病原包含结核和其他细菌，病毒和真菌。恶性肿瘤性胸腔积液的诊断常采用病理学细胞检测，但其敏感性不高，约40％-60％；或是利用二代测序判断其染色体的不稳定、重要基因突变等来诊断。结核性胸腔积液诊断方法有培养、抗酸染色、x-pert、t-spot，但各有局限性。培养的时间较长约2-8周，且敏感性较低约30％；抗酸染色时间短，但其敏感性较低仅约28％，且不能有效区别结核和非结核分枝杆菌；xpert mtb/rif(xpert)由世卫组织科学技术咨询委员会批准，集成了半巢式实时结核分枝杆菌特异性dna扩增及利福平耐药相关rpob突变检测，而其敏感性也不高约40％，因此需要不断增加新型的检测手段来辅助诊断结核性胸腔积液。3.近年来mngs进行病原诊断逐渐被应用到临床中，尤其在非典型病原体诊断有很大的优势。在终末期肝病患者胸腹感染诊断中，mngs检测患者胸腹水阳性率为42.5％，显著高于常规培养法(21.9％)。虽有mngs辅助诊断感染性胸膜炎和结核性胸膜炎的相关研究发表，但暂无mngs检测大样本量感染性(尤其是结核性)胸腔积液的研究报道。4.在各种体液中，发现恶性肿瘤主要是基于细胞学分析作为金标准测试。有文章研究利用染色体不稳定性，确定癌症和作为一种形式的无创产前检查，使染色体cnvs检测成为诊断恶性肿瘤的新方法。5.但是，临床对患者进行mngs以鉴别病原体，对于潜在恶性肿瘤但无传染性病原的患者，mngs可能产生阴性结果，或是mngs通过分析人源序列cnv初步判断可能阴性结果，进而导致误诊漏诊等情况的发生。技术实现要素：6.本发明所要解决的技术问题是：对于临床患者的胸腔积液样本进行mngs检测时，不能有效地对感染性样本或者恶性肿瘤样本进行区分。7.本发明提供了mngs技术在区分感染性胸腔积液和恶性胸腔积液中的应用。通过对胸膛积液中进行分析含较高比例的人源序列,通过宏基因组过滤掉的人源序列进行cnv检测，实现了对感染性样本或者恶性肿瘤样本进行区分。8.技术方案是：9.一种胸腔积液样本分类方法，所述的分类方法用于区分感染性胸腔积液和恶性胸腔积液，包括如下步骤：10.s1、提取胸腔积液中的核酸：采用dna提取试剂盒对胸腔积液中的dna进行提取；11.s2、文库构建及上机测序：对提取得到的dna进行文库构建，进行mngs测序；12.s3、cnv分析：对下机测序数据进行质控后，获得人源序列，将基因组分为多个窗口，并计算出各个窗口中的reads的zscore值；13.s4、病原体分析：将下机测序数据中未对比于人基因组上的数据与病原体数据库进行对比，进行病原微生物的鉴定；14.s5、机器模型构建：将cnv分析中获得的zscore值作为模型的输入特征，构建感染性胸腔积液和恶性胸腔积液的分类器模型，并对待测样本进行分类。15.所述的步骤s3中，还需要将下机数据reads不能覆盖的、且在全部样品中占比大于10-30％的窗口过滤去除。16.所述的步骤s5中，分类器模型是广义线性模型(generalize linear model，glm)。17.所述的步骤s5中，构建模型时采用交叉验证法。18.所述的步骤s3中，窗口大小是0.5-1.5mb。19.一种计算机可读取介质，其记载有能够运行上述的胸腔积液样本分类方法的计算机程序。20.一种胸腔积液样本分类装置，包括：21.核酸提取模块，用于采用dna提取试剂盒对胸腔积液中的dna进行提取；22.文库构建模块，用于对核酸提取模块中获得的dna进行测序文库的构建；23.测序模块，用于对文库进行ngs测序；24.cnv分析模块，用于对下机测序数据进行质控后，获得人源序列，将基因组分为多个窗口，并计算出各个窗口中的reads的zscore值；25.病原体分析模块，用于将下机测序数据中未对比于人基因组上的数据与病原体数据库进行对比，进行病原微生物的鉴定；26.分类模块，用于将cnv分析中获得的zscore值作为模型的输入特征，构建感染性胸腔积液和恶性胸腔积液的分类器模型，并对待测样本进行分类。27.有益效果28.本发明的用于区分感染性胸腔积液和恶性胸腔积液的方法，通过对胸腔积液进行mngs测序，cnv-glm模型进行区分，该模型的敏感性为54.1％，特异性为80.8％，auc为0.851。能够为早期判断肿瘤提供参考依据，可进行早期鉴别诊断和疗效评估，具有很好的临床应用价值。附图说明29.图1为mngs用于胸腔积液样本感染性和恶性预测的工作流程示意图30.图2为mngs-cnv分析的诊断性能具体实施方式31.为了便于更好地理解本发明，下面将结合相关附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了对本发明作进一步解释，不对其内容进行限定。32.实施例133.1.临床样本的收集和信息分析34.样本获得北京胸科医院制度审查委员会批准，并在病人知情同意书签字情况下，按照北京胸科医院病理科收集胸腔积液的方法获得。总共纳入139例患者，依据临床确诊为结核性胸腔积液患者(tpe)82例，恶性肿瘤胸腔积液(mpe)36例，其他病原感染(oipe)21例。样本被均分为六份，每次将一份样本作为测试集，其余为训练集。采用交叉验证法对模型进行训练，取每次平均值作为模型性能参数。35.本发明中的所指的感染性胸腔积液，是指结核性胸腔积液患者和其他病原感染患者。36.2.mngs筛查cnv的性能37.按照mngs的工作流程图1对样本进行检测。从患者的胸腔积液样本中提取出核酸，并进行质控。对质控合格后的核酸加上测序接头，完成文库构建后进行质控。质控合格的文库在illumina平台测序仪上进行测序，其reads数均为20m。待数据下机后，采用bwa软件与hg19版人源基因组数据库进行比对，获得人源序列的reads数。未比对到人源基因组数据库的序列与病原数据库进行比对，进行病原微生物的鉴定。38.随机选取25例非恶性胸腔积液的样本作为人类基因组拷贝数基线标准，在基因组序列上滑动窗口，设置窗口大小为1mb长度，将基因组序列分为3053个窗口，这些窗口中的拷贝数特征作为后续的建模输入特征。39.基于cnv算法对测序数据进行处理，得到cnv图谱，该算法说明为：分别计算每个窗口中的read count，对read count进行均一化，计算样本的平均测序深度，进行gc矫正后重定位到二倍体状态，计算log2 ratio值，基于健康样本池和pca进行降噪，从待测样本中(剩余的感染性胸腔积液和恶性胸腔积液样本)剥离噪音和真实cnv信号，基于降噪后log2 ratio计算每个窗口中的测序深度的zscore值。40.每个窗口的zscore值，其公式为：41.z＝(x-μ)/σ；42.x为单个外显子的log2 ratio值，μ为基线样本的log2 ratio均值，σ为基线样本的标准差。43.由于每个样本测序reads数仅为20m，3053个窗口并不能完全覆盖到，因此我们进一步进行筛选，标准为如果某一个窗口仅仅在不到20％样本中出现过，则该窗口即被剔除，保留剩余的窗口，并计算每个窗口的zscore值，最终剩余2662个cnv特征(每个窗口的zscore值)被纳入。mngs筛查恶性肿瘤患者cnv发现染色体中存在了大量的gains and losses(图2a)。44.3.cnv-glm分类器构建45.使用拷贝数数据(cnv)筛选恶性和非恶性组的特征值，运用梯度提升机(gradient boosting machine，gbm)的算法结合cnv特征值构建分类器模型，进一步评估mngs检测cnv进行恶性肿瘤诊断预测，利用loocv评估预测能力。分类器算法中的输入特征是上述筛选得到的2662个cnv特征，输出值是恶性和非恶性组的分类标签。46.使用r包h2o中h2o.gbm函数建模时，采用了6折留一交叉验证法，模型参数通过6次计算结果取平均值确定。使用r包proc中roc函数计算auc值、敏感性以及特异性，最后绘制roc曲线。47.与临床病理诊断相比，mngs-cnv建模具有51.4％的敏感性，80.8％的特异性和71.7％的准确性(图2的b-c)，基于受试者工作特征(roc)曲线的曲线下面积(auc)为0.851(图2的d)。48.另外，我们还采用了广义线性模型(generalize linear model，glm)和随机森林(random forest，rf)算法结合cnv特征值，使用r包h2o中h2o.glm函数以及h2o.randomforest函数进行同样的分类器模型构建，采用的是5倍交叉验证，并对两个模型的性能进行分析。glm模型具有88.6％的敏感性，70.5％的特异性和77.3％的准确性，而rf模型具有62.8％的敏感性，83.3％的特异性和68.5％的准确性。本专利中采用的gbm模型表现出更好的分类特性。









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