由横纹肌溶解诱发的肾损伤的抑制的制作方法 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及由横纹肌溶解诱发的肾损伤的抑制。具体而言，涉及由横纹肌溶解诱发的肾损伤的抑制剂，其包含西司他丁或其药学上允许的盐。另外，本发明还涉及肾组织摄入肌红蛋白的抑制剂。背景技术：2.已知当由于横纹肌溶解而游离肌红蛋白大量释放至血中时，该肌红蛋白被运输至肾脏，对肾脏组织造成损伤，导致肾损伤。3.目前认为肾损伤机制之一是，被摄入肾小管上皮细胞的肌红蛋白通过血红素所含的铁而产生活性氧种，其造成了细胞的损伤。进而，已知从肌红蛋白游离的血红素会被释放到血中、尿中，认为游离血红素也会引起近端肾小管损伤。4.据说，从来自横纹肌溶解的肌红蛋白、血红素、铁引起近端肾小管损伤开始，受损而脱落的细胞成分变成管型并梗阻肾小管，引发急性肾衰竭。5.来自横纹肌溶解的肌红蛋白及血红素所诱发的肾损伤以急性肾损伤(aki：acute kidney injury)形式发病。aki多数情况下为一过性的可逆的，但是也有加重并严重影响预后的情况，而且已知还存在从aki转变为慢性肾病的情况。另外，在随着某些医疗处置而引发aki的情况下，aki还可能会妨碍原本的治疗。6.因此，需要抑制由横纹肌溶解诱发的肾损伤的手段。7.据报道作为肝脏中产生的蛋白的α1-微球蛋白(α1m)、血红素结合蛋白(hx)可与游离血红素结合并预防活性氧的产生(非专利文献1)。另外，还报道了以减轻血红素的毒性为目标的、重组血红素结合蛋白的应用(专利文献1)。但是，根据非专利文献1，血红素-α1m复合体被肾组织过量摄入时可能导致肾损伤。8.有报道指出，西司他丁能够通过在巨蛋白受体上拮抗与近端肾小管细胞中表达的巨蛋白(megalin)结合的药剂来抑制一些药剂所致的肾损伤(非专利文献2、专利文献2)。9.现有技术文献10.专利文献11.专利文献1:日本特表2017-531643号公报12.专利文献2:wo2019/20877713.非专利文献14.非专利文献1:zagar等、2016年、american journal of physiology-renal physiology、第311卷、第640-651页15.非专利文献2:hori等、journal of the american society of nephrology、2017年、第28卷、第1783-1791页技术实现要素：16.发明要解决的问题17.在本发明的一个方面，本发明的课题是提供用于抑制由横纹肌溶解诱发的肾损伤的新手段。18.在本发明的另一个侧面，本发明的课题是提供用于抑制肾组织摄入肌红蛋白的新手段。19.用于解决问题的方案20.本发明人们为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，西司他丁(cilastatin：(z)-7-[[(r)-2-氨基-2-羧基乙基]硫代]-2-[[[(s)-2,2-二甲基环丙基]羰基]氨基]-2-庚烯酸)(cilastatin:(z)-7-[[(r)-2-amino-2-carboxyethyl]thio]-2-[[[(s)-2,2-dimethylcyclo propyl]carbonyl]amino]-2-heptenoic acid)对于上述课题的完成有效。[0021]本发明包括以下方式，但是不限于这些。[0022]1.一种由横纹肌溶解诱发的肾损伤的抑制剂，其包含西司他丁或其药学上允许的盐作为有效成分。[0023]2.根据1所述的抑制剂，其为注射剂的形态。[0024]3.一种肾组织摄入肌红蛋白的抑制剂，其包含西司他丁或其药学上允许的盐作为有效成分。[0025]发明的效果[0026]本发明能够抑制由横纹肌溶解诱发的肾损伤。[0027]一般认为，通过横纹肌溶解而游离的肌红蛋白借助巨蛋白而被摄入肾组织，引起肾损伤。本发明人确认，西司他丁抑制巨蛋白与肌红蛋白的结合，抑制肾组织摄入肌红蛋白。可认为，本发明通过这样的机理而抑制肾损伤。[0028]另外，本发明人确认，可结合从肌红蛋白游离的血红素的α1m和hx与巨蛋白进行结合、及西司他丁抑制α1m及hx与巨蛋白的结合。因此，血红素借助巨蛋白而被摄入细胞内、引起肾损伤，但是，确认了西司他丁抑制α1m或hx与巨蛋白的结合。因此认为，西司他丁能够抑制肾组织摄入血红素。并且认为，本发明不仅能够抑制通过横纹肌溶解而游离的肌红蛋白所致的损伤，而且还能够抑制血红素所致的损伤。[0029]本发明在安全性和价格方面也有优势。首先，西司他丁与抗生素亚胺培南的组合剂已经广泛地在全世界安全使用了很多年。这证明了西司他丁的安全性。另外，上述组合剂(包括主剂)在日本的药价(基于说明书的标准单剂量单价)为1741日元。[0030]需要说明的是，本说明书中对肾损伤使用的“抑制”这一术语是指完全不表现出症状、使该症状减轻等。另外，上述“减轻”包括：降低上述症状的表现程度、使已经产生的症状减弱、及使已经产生的症状完全消失。本说明书中，将完全不表现出疾病症状或疾病症状的表现程度降低称为“预防”。另外，将用于“抑制”的药物称为“抑制剂”。[0031]关于“抑制”的这些说明，在适宜修正基础上也适用于摄入的“抑制”。附图说明[0032]图1以血钾的测定值示出横纹肌溶解模型小鼠中由西司他丁带来的肾损伤抑制效果。[0033]图2-1示出使用石英晶体微天平法(qcm法)的巨蛋白在固相化肌红蛋白、hx的石英传感器上的结合性及西司他丁的抑制效果。[0034]图2-2示出使用qcm法的α1m在固相化巨蛋白的石英传感器上的结合性及西司他丁的抑制效果。[0035]图3示出西司他丁给药组及对照组的尿蛋白(α1m)浓度的比较。[0036]图4示出使用肾特异性巨蛋白ko小鼠及对照小鼠的横纹肌溶解模型中肾组织的血红素源铁的摄入量的比较图像(利用普鲁士蓝进行组织染色)。[0037]图5示出横纹肌溶解模型小鼠中西司他丁的肌红蛋白摄入抑制效果(利用抗肌红蛋白抗体进行免疫染色)。[0038]图6示出使用肾特异性巨蛋白ko小鼠及对照小鼠的横纹肌溶解模型小鼠中的肾组织损伤程度(利用抗肾损伤分子-1(kim-1抗体)进行免疫染色)。具体实施方式[0039](由横纹肌溶解诱发的肾损伤)[0040]本发明的一个方式为由横纹肌溶解诱发的肾损伤的抑制剂。[0041]横纹肌溶解是指由于创伤性或非创伤性的原因而产生的骨骼肌细胞的溶解、坏死。随着溶解而流出到血液中的肌红蛋白等肌细胞成分除了会引起急性肾衰竭以外，还会引发各种并发症。[0042]横纹肌溶解的原因包括创伤性的原因，例如剧烈运动后、中暑、癫痫发作、挫伤综合征、烧伤、电击休克、长时间心肺复苏、重复除颤、栓塞、胫骨前肌综合征、镰刀状红细胞贫血等；非创伤性的原因，例如由降脂药、抗生素、镇静剂等引起的药物性肌肉损伤。[0043]当背景中存在上述原因且存在肌力下降、疲劳感、肌肉疼痛等自觉症状时，可能发生了横纹肌溶解。[0044]本发明的抑制剂可以在诊断为横纹肌溶解或疑似横纹肌溶解时开具处方。例如，通过临床检查等确认高肌红蛋白血症、高钾血症、高肌酐激酶(ck)血症、或凝血异常；或者确认到特征性尿所见、即由肌红蛋白导致的暗褐色尿时，可以诊断或怀疑横纹肌溶解症。[0045]进而，在认为发生了由横纹肌溶解导致的肾损伤时，特别是对于肾功能下降的对象等，可以预防性地开具处方。[0046]另外，作为在临床现场所设想的、抑制由横纹肌溶解诱发的肾损伤的例子，是作为临床检查的血清肌酐上升、肾过滤功能下降(gfr、egfr)、血尿素氮上升、血尿酸上升、或血/尿的离子浓度异常的抑制，此外为被称为肾损伤标记物的kim-1、n-乙酰基-β-d-氨基葡萄糖苷酶(nag)、α1m、β2微球蛋白(β2m)、肝型脂肪酸结合蛋白(l型脂肪酸结合蛋白：l-fabp)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(n-gal)、白蛋白(alb)、iv型胶原蛋白、巨蛋白或足萼糖蛋白(podocalyxin)的尿中浓度异常的抑制。[0047]另外，从临床症状的观点出发的肾损伤抑制的例子为浮肿、高血压、尿毒症症状(恶心·呕吐、意识障碍等)或黄疸的抑制；抑制血尿、肌红蛋白尿、或蛋白尿的出现；或者，抑制尿量的减少，从病理学观点出发的肾损伤抑制的例子为肾小管上皮损伤、管型形成、肾小管梗阻、间质细胞浸润/浮肿/纤维化、肾小球损伤、或血管损伤的抑制。[0048]该肾损伤可能通过巨蛋白而诱发。巨蛋白在生物体内的主要表达部位为肾脏近端肾小管上皮细胞(主要是管腔侧膜)，因此本发明对于抑制近端肾小管上皮细胞损伤、由其衍生的肾损伤(即，作为抑制剂)有用。[0049]由横纹肌溶解诱发的肾损伤包括肾病、肾损伤、肾炎、肾衰竭、肾脏病、急性肾病、急性肾损伤、急性肾炎、急性肾衰竭、急性肾脏病、慢性肾病、慢性肾损伤、慢性肾炎、慢性肾衰竭、慢性肾脏病、肾小管(性)肾病、肾小管(性)肾损伤、肾小管(性)肾炎、肾小管(性)肾衰竭、肾小管(性)肾脏病、肾小管间质(性)肾病、肾小管间质(性)肾损伤、肾小管间质(性)肾炎、肾小管间质(性)肾衰竭、肾小管间质(性)肾脏病、梗阻性肾病、梗阻性肾损伤、梗阻性肾炎、梗阻性肾衰竭、梗阻性肾脏病、急性肾炎综合征、快速进行性肾炎综合征、慢性肾炎综合征、肾病综合征、肾血管痉挛、急性肾小管坏死。[0050](西司他丁)[0051]本发明中，使用西司他丁或其药学上允许的盐。[0052]西司他丁为(z)-7-[[(r)-2-氨基-2-羧基乙基]硫代]-2-[[[(s)-2,2-二甲基环丙基]羰基]氨基]-2-庚烯酸)。进行确认性记载，当西司他丁生成水合物时，使用水合物的情况也包括在本发明的范围内。[0053]西司他丁的药学上允许的盐的例子可列举出碱金属盐、例如锂盐、钠盐、钾盐；碱土金属盐、例如镁盐、钙盐；锌盐、铝盐；有机胺盐、例如胆碱盐、乙醇胺盐、三甲胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、二苄胺盐、苯乙基苄胺盐、普鲁卡因盐、吗啉盐、吡啶盐、哌啶盐、哌嗪盐、n-乙基哌啶盐；铵盐；碱性氨基酸盐、例如赖氨酸盐、精氨酸盐；等。特别优选的盐是西司他丁钠。进行确认性记载，药学上允许的盐的范围还包括水合盐。[0054]西司他丁或其药学上允许的盐例如可以使用市售品，或可以通过其本身公知的方法或依据公知的方法的方法来制造/获得。[0055]西司他丁与巨蛋白的胞外域结合。西司他丁或其药学上允许的盐能够抑制肌红蛋白和血红素与巨蛋白的直接或间接结合及向细胞内的摄入。[0056]本发明的抑制剂以足以抑制由横纹肌溶解诱发的肾损伤的量来含有西司他丁或其药学上允许的盐。肾损伤的情况下，针对成人的西司他丁或其盐的每1天的给药量的例子为0.01～100mg或0.1～10mg。可以以给药量处于这样的范围的方式将该抑制剂以1次或分成多次来给药。另外，也可以使用隔天给予、隔两天给予等间歇给药。[0057](肾组织摄入肌红蛋白的抑制剂)[0058]本发明的一个方式中，涉及肾组织摄入肌红蛋白的抑制剂，其包含西司他丁或其药学上允许的盐作为有效成分。[0059]肌红蛋白是存在于包括人在内的脊椎动物的肌肉中的蛋白，包含1个被称为珠蛋白的多肽部分和1个作为辅基的血红素部分。肌红蛋白具有结合氧分子的性质，发挥着向肌肉供给氧的作用。[0060]与本发明相关地，本发明人们发现西司他丁抑制肌红蛋白与巨蛋白的结合。认为该抑制效果导致了由横纹肌溶解诱发的肾损伤的抑制。[0061]本发明的抑制剂以有效量含有西司他丁或其药学上允许的盐。该有效量可以参考关于本发明的肾损伤的抑制剂的上述给药量等来确定。[0062](肾组织摄入血红素的抑制剂)[0063]本发明的一个方式中，涉及肾组织摄入血红素的抑制剂，其包含西司他丁或其药学上允许的盐作为有效成分。[0064]血红素是构成肌红蛋白的部分结构，可由于肌红蛋白分解而释放到生物体内。[0065]血红素与α1m或hx结合，但是本发明人确认α1m及hx与巨蛋白结合及它们与巨蛋白的结合可被西司他丁抑制。可认为，该抑制效果导致了由横纹肌溶解诱发的肾损伤的抑制。[0066]本发明的抑制剂以有效量含有西司他丁或其药学上允许的盐。该有效量可以参考关于本发明的肾损伤的抑制剂的上述给药量等来确定。[0067](剂型)[0068]本发明的抑制剂的形态没有特别限定，可以制成散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、咀嚼剂等固体制剂、溶液剂、糖浆剂等液体制剂、注射剂、或喷雾剂等形态。优选的形态为注射剂。[0069](其它成分)[0070]本发明的抑制剂还可以根据制剂上的需要包含药学上允许的载体。作为载体，例如可列举出赋形剂、溶剂。本发明的抑制剂中任选包含的进一步的成分的例子是结合剂、ph调节剂、崩解剂、螯合剂、助溶剂、悬浮剂、乳化剂、等渗剂、稳定化剂、无痛化剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、矫味矫臭剂、着色剂。[0071]作为赋形剂，可列举出乳糖、葡萄糖、d-甘露糖醇等糖类；淀粉类；结晶纤维素等纤维素类等有机系赋形剂；磷酸二钙、碳酸钙、高岭土等无机系赋形剂等。作为溶剂，可列举出纯化水、生理盐水等。作为结合剂，可列举出α化淀粉、明胶、阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、d-甘露糖醇、海藻糖、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等。作为ph调节剂，可列举出盐酸、氢氧化钠等。作为崩解剂，可列举出低取代度羟丙基纤维素、经化学修饰的纤维素、淀粉类、藻酸等。作为螯合剂，可列举出依地酸二钠钙水合物、依地酸钙钠水合物等。作为助溶剂，可列举出聚乙二醇、丙二醇、海藻糖、苯甲酸苄酯、乙醇、碳酸钠、柠檬酸钠、水杨酸钠、乙酸钠等。作为悬浮剂或乳化剂，可列举出十二烷基硫酸钠、阿拉伯胶、明胶、卵磷脂、单硬脂酸甘油酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠等纤维素类；聚山梨醇酯类；聚氧亚乙基氢化蓖麻油等。作为等渗剂，可列举出氯化钠、氯化钾、糖类、甘油、尿素等。作为稳定化剂，可列举出聚乙二醇、硫酸葡聚糖钠、其它氨基酸类等。作为无痛化剂，可列举出葡萄糖、葡萄糖酸钙、盐酸普鲁卡因等。作为防腐剂，可列举出对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。作为抗氧化剂，可列举出亚硫酸盐、抗坏血酸等。[0072]优选方式中，本发明的抑制剂不含亚胺培南。[0073](方法及应用)[0074]本发明的抑制剂的另一方面为西司他丁或其药学上允许的盐在抑制由横纹肌溶解诱发的肾损伤、抑制肾组织摄入肌红蛋白、或抑制肾组织摄入血红素中的应用。[0075]另外，本发明的抑制剂的另一方面为用于抑制由横纹肌溶解诱发的肾损伤、抑制肾组织摄入肌红蛋白、或抑制肾组织摄入血红素的方法，其包括对有需求的对象给予有效量的西司他丁或其药学上允许的盐的步骤。[0076]西司他丁或其药学上允许的盐的有效量可以基于关于本发明的抑制剂的上述给药量等而确定。[0077]优选方式中，本发明的方法及应用不包括给予亚胺培南。[0078]另外，本说明书中，对各种抑制有需求的对象优选为哺乳动物，例如人；小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、仓鼠、猴、绵羊、马、牛、猪、驴、狗、猫等家畜；或其它实验动物，特别优选人。[0079](数值范围)[0080]为了清楚而进行记载，本说明书中由下限值和上限值表示的数值范围、例如“1.0～2.0g”包括这些的下限值和上限值。[0081]实施例[0082]以下基于实施例对本发明进行说明，但本发明不限定于这些实施例。[0083](试验例1)西司他丁对由横纹肌溶解诱发的肾损伤的抑制[0084]通过因肾功能下降而升高的血清钾测定，来验证横纹肌溶解模型小鼠中发生的肾损伤能否通过西司他丁给药来抑制。[0085]方法[0086]对于c57bl/6(雄性10-12周龄)，制备50％volume/volume glycerol(50％体积/体积甘油)(富士胶片和光纯药株式会社)/pbs5ml/kg，将该溶液肌肉注射到右后肢，由此制作横纹肌溶解肾病模型。将接受给药的动物分为2组(每组6只)，腹腔内给药a)西司他丁(sigma-aldrich inc.)400mg/kg(稀释到生理盐水100μl中)或b)作为对照的生理盐水100μl。[0087]在甘油给药24小时后，从下腔静脉采集血液，以800g离心30分钟，分离、回收血清。[0088]血清于-80℃下保存至分析，血清中钾的测定委托oriental yeast co.,ltd.进行。[0089]结果[0090]血清中钾的评价结果是西司他丁(cs)给药组的值低于对照组(图1)。可知通过给药西司他丁能够抑制由横纹肌溶解诱导的肾损伤。[0091]本发明人考虑如下。因横纹肌溶解而产生的肌红蛋白通过巨蛋白而被摄入肾组织，引发肾损伤。另外，从肌红蛋白游离的血红素与α1m或hx结合而形成复合体，该复合体通过巨蛋白而被摄入肾组织，引发肾损伤。并且，确认西司他丁抑制肌红蛋白或其复合体与巨蛋白的结合、抑制肾损伤。接下来的试验例中确认了西司他丁的这种作用机制。[0092](试验例2)作用机制的确认(1)[0093]各配体与巨蛋白的直接结合性以及西司他丁的结合抑制[0094]参考专利文献2中记载的方法，使用石英晶体微天平法(qcm法)来验证巨蛋白与各配体(肌红蛋白、α1m、hx)的结合特异性、以及西司他丁抑制结合的可能性。[0095]方法-1[0096]关于作为验证对象的配体，使用肌红蛋白(lifespan biosciences inc.、rat hemoglobin native protein、ls-g11201)、hx(sino biological inc.、rat hemopexin/hpx protein(his tag 81025-r08h))。[0097]使用immobilization kit for affinix(注册商标、initium inc.制)，将按照上述试剂盒的推荐方案利用上述试剂盒附带的缓冲液a制备成0.1mg/ml的各配体溶液或作为对照的牛血清白蛋白(bsa：calbiochem公司、albumin、bovine serum、fractionv、fatty acid-free、cat#126575)溶液载置于设置在保持件上的石英传感器，将配体或白蛋白固定化(固相化)于石英上。[0098]将固定化有各配体或bsa的石英传感器设置于测定设备affinix(注册商标)q8(initium inc.制)，在确认频率达到稳定后，按照orlando等的方法注入从sprague-dawley大鼠(sd大鼠)肾脏纯化而得的巨蛋白的0.1mg/ml溶液8μl，经时测定频率。[0099]更详细而言，使巨蛋白溶液与放在装有200μl缓冲液的水面的各配体固定化石英传感器反应，测定频率。[0100]另外，预先向缓冲液中注入1mg的西司他丁，将固定化有各配体的石英传感器设置于测定设备中，在确认频率达到稳定后，注入巨蛋白溶液，经时地测定频率，由此分析西司他丁对各配体与巨蛋白的结合的拮抗作用。[0101]对于对照，也进行了同样的实验。[0102]方法-2[0103]基于方法-1而制作固定化有大鼠纯化巨蛋白或bsa的石英传感器。将该石英传感器设置于测定装置，设定预先向缓冲液中注入1mg/200μl的西司他丁的条件和不注入的条件。在确认频率达到稳定后，向腔室内注入α1m(lifespan biosciences，inc.、rat ambp protein(recombinant 6his、n-terminus)(aa20-202)、ls-g11794)溶液8μl，经时测定频率。[0104]结果-1[0105]向固相化肌红蛋白、hx的石英传感器添加巨蛋白时，石英的信号大幅下降，且其反应可被西司他丁抑制(图2-1)。可知：肌红蛋白、hx与巨蛋白直接结合，西司他丁抑制该结合。[0106]结果-2[0107]向固相化巨蛋白的石英传感器添加α1m时，石英的信号大幅下降，且其反应可被西司他丁抑制(图2-2)。可知：与肌红蛋白、hx同样地，α1m与巨蛋白直接结合，西司他丁抑制该结合。[0108](试验例3)作用机制的确认(2)[0109]各配体向肾组织中的摄入与巨蛋白、西司他丁的关系[0110]该试验例验证了肾组织摄入各配体(α1m和hx)借助了巨蛋白、及其受西司他丁抑制。[0111]方法[0112]对小鼠给予西司他丁，观测由此带来的尿中各配体的浓度变化。[0113]首先，对5只小鼠(雄性12周龄c57bl/6)腹腔内给予西司他丁钠(sigma-aldrich japan k.k.,、c5743)400mg/kg(稀释到生理盐水100μl中，西司他丁给药组)后，放入代谢笼3小时中收集尿，将5只的尿合并。另外，对于另外5只小鼠的组，给予生理盐水100μl(对照组)，实施与上述同样的实验。[0114]从得到的尿样品中，通过电泳(sds-聚丙烯酰胺凝胶)分离蛋白质，进行还原烷基化(使用二硫苏糖醇、碘乙酰胺)、胰蛋白酶消化，提取所得到的肽，得到固体。[0115]向得到的固体中加入15μl的0.3％甲酸(fa)，振荡5分钟，然后超声处理1分钟，再振荡5分钟。轻微振荡(spin down)，上样到孔径0.45μm的膜滤器(ultra free-mc、hv、0.45μm、millipore)中，以10000rpm进行5分钟离心处理，将通过过滤器的样品供于lcms分析。[0116]利用lcms的分析[0117](lc的系统)[0118]eksigent(注册商标)exspert nano lc 400、exsigent tm exspert chiplc(注册商标)[0119](柱)[0120]捕集柱：nano chiplc捕集柱200μm×0.5mm chromxp c18-cl 3μm(804-00006、sciex)[0121]分析柱：nano chiplc column 75μm×15cm chromxp c18-cl 3μm3μm(804-00001、sciex)[0122]柱温度30℃[0123](样品导入)[0124]注入量：3μl[0125]将样品保持于捕集柱后，按照后述调整流动相的梯度，导入分析柱。[0126](流动相)[0127]a溶剂：0.1％三氟乙酸水溶液[0128]b溶剂：在乙腈中含0.1％三氟乙酸的溶液[0129]流速：合计300nl/分钟[0130]梯度条件：将向用a溶剂98％、b溶剂2％平衡化的分析柱导入样品时设为0分钟，将b溶剂比例在30分钟内线性升高到32％而分离洗脱测定对象物。之后用5分钟使b溶剂比例升高到90％，之后的5分钟保持90％的b溶剂比例，冲洗柱，用0.1分钟使该比例回到2％，维持初始状态的2％的b溶剂比例直至60分钟为止，对柱进行平衡化。[0131](质谱仪)[0132]以正离子模式使用ab sciex triple tof 5600+。[0133](tof-ms条件)[0134]质量范围：400-1250da[0135](数据分析)[0136]将lcms的数据与序列数据库对照，确认存在多种蛋白质。在此基础上，对于在西司他丁给药组和对照组这两组中确认到的蛋白质，计算相当于西司他丁给药组/对照组的峰强度比的spc/l比(spectral abundance factor：saf，谱丰度因子)，将spc/l比为2.0以上者判断为更多地存在于西司他丁给药组的尿中的蛋白质，将该蛋白质列出。[0137]分析方法参考了ohara等、2018年、plos one、第13卷1、e0204160中记载的方法。将分析方法示于以下。[0138]lcms/ms的数据获取/分析软件使用了analyst(注册商标)tf1.6(ab sciex)，将得到的原始数据变换为峰列表文件(mgf文件格式)，使用matrix science公司的mascot daemon、mascot server 2.2.1进行ms/ms离子检索(mis检索)。序列数据库使用uniprot、swiss-prot。显著性阈值设为0.05(错误发现率小于5％)，将超过鉴定基准的肽为2个以上的蛋白作为鉴定蛋白而列出。[0139]为了覆盖lcms中的分析再现性问题，对于每一个样品用lcms2次获取原始数据，将2次运行得到的峰列表文件合并，用mascot进行分析(ohara等、2018年、plos one、第13卷1、e0204160)。[0140]对于通过两组间的比较均鉴定出的蛋白质，使用作为无标签比较半定量分析法的谱图计数法(spectral count method)，该方法利用了表达量多则鉴定出的肽片段多、ms/ms数也多的原理。即，对于在西司他丁给药组、对照组这两组中鉴定出的蛋白质，计算西司他丁给药组/对照组的spc/l比(spectral abundance factor：saf)，将spc/l比为2.0以上的蛋白质作为在西司他丁给药组的尿中较多的蛋白质而列出。[0141](使用抗α1m抗体的利用wb的尿分析)[0142]对于上述所得到的西司他丁给药组及对照组的尿，使用4～15％的梯度凝胶(bio-rad laboratories，inc.)实施还原条件下的sds-聚丙烯酰胺电泳，将展开物转印到聚偏氟乙烯(pvdf)膜上。将该膜用含有5％脱脂乳的缓冲液封闭后，与作为一抗的抗α1m抗体(lifespan biosciences inc.)1μg/ml在室温下反应2小时。与作为二抗的辣根过氧化物酶(hrp)标记多克隆山羊抗兔免疫球蛋白(dako公司)0.25μg/ml在室温下反应1小时。之后用免疫印迹用化学发光底物(supersignaltm west femto maximum sensitivity substrate、thermo scientific(注册商标))检测条带。[0143]结果[0144]将在西司他丁给药组、对照组这两组所鉴定出的蛋白质中的、西司他丁给药组/对照组的spc/l比为2.0以上者作为与对照组相比在西司他丁给药组中尿浓度高的蛋白质，鉴定出63种。认为这些蛋白质的尿中排泄量的变化受西司他丁的巨蛋白拮抗作用影响。并且，其中包括有报道指出为血红素粘结剂的α1m和hx。作为参考，图3示出西司他丁给药组和对照组的尿α1m的免疫印迹图像。[0145]因此，有报道指出α1m为巨蛋白的配体(christensen等、2002年、molecular cell biology、第3卷、第258-268页)，但是本研究显示，不仅α1m，hx也可能是巨蛋白的配体。另外，可以确认，西司他丁抑制了它们向肾组织中的摄入。[0146]需要说明的是，在西司他丁给药组和对照组中，作为尿中浓度无变化且有报道指出为巨蛋白配体的蛋白，包括白蛋白、甲状腺素转运蛋白、簇集素(clusterin)、维生素d结合蛋白等。本研究表明，即使为巨蛋白的配体，也存在结合不被西司他丁拮抗的情况。[0147]对于本试验中spc/l比为2.0以上的蛋白及spc/l比小于2.0的蛋白中已有报道指出为巨蛋白的配体、或通过发明人的研究明确了为巨蛋白的配体的例子，将其测定数值示于以下。[0148][表1][0149]spc/l比为2.0以上的蛋白[0150]蛋白名称spc/l比α1m3.67hx2.33钴胺传递蛋白-22.33[0151][表2][0152]spc/l比低于2.0的蛋白[0153]蛋白名称spc/l比白蛋白1.10甲状腺素转运蛋白1.00簇集素0.73维生素d结合蛋白0.80[0154](试验例4)作用机制的确认(3)[0155]肾组织摄取血红素源铁的巨蛋白依赖性[0156]使用由肾特异性巨蛋白敲除(ko)小鼠制作的横纹肌溶解模型，验证了肾组织中摄入血红素源铁是否依赖巨蛋白。[0157]方法[0158]使用肾特异性巨蛋白ko小鼠(ndrg1-creert2、megalin lox/lox)、及作为对照的对照小鼠(megalin(lox/lox)；cre(-))(均为雄性12周龄)。制备50％volume/volume glycerol(富士胶片和光纯药株式会社)/pbs5ml/kg，将该溶液肌肉注射到右后肢，由此制作横纹肌溶解肾病模型。[0159]在给予甘油溶液24小时后，对于右肾的包含肾蒂的部分以3mm厚度进行切片，用包含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液固定。将固定试样用切片机(rem-710；yamato kohki industrial co.、ltd.)以4μm厚度薄切，进行普鲁士蓝染色(*)，在显微镜下观察。[0160]*3价的铁与蛋白质形成复合体而存在于生物体内。通过用酸将其分解，从而可促进接下来的与亚铁氰化钾的反应。3价的铁离子(fe3+)与亚铁氰化钾结合，形成靛蓝色的亚铁氰化铁(普鲁士蓝)。[0161]结果[0162]关于横纹肌溶解肾病模型小鼠的肾脏中的铁摄入，对照小鼠中大部分在近端肾小管s1、s2段(segment1、2)观察到，在巨蛋白ko小鼠中没有摄入，仅在管腔内以圆柱形态观察到(图4)。由于肾脏中的铁摄入依赖于巨蛋白，因此可知通过横纹肌溶解而产生的肌红蛋白或血红素依赖于巨蛋白而被肾脏摄入。[0163](试验例5)作用机制的确认(4)[0164]西司他丁对肾组织摄入肌红蛋白的抑制[0165]使用横纹肌溶解模型小鼠验证了给予西司他丁能否抑制肾组织摄入肌红蛋白。[0166]方法[0167]基于试验例1，对c57bl/6(雄性10-12周龄)给予50％甘油，由此制作横纹肌溶解模型小鼠。[0168]在给予甘油24小时后，将右肾的包含肾蒂的部分以3mm厚度切片，用包含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液进行固定。将固定试样用切片机(rem-710、yamato kohki industrial co.，ltd.)以4μm厚切片，用抗肌红蛋白抗体(abcam ab77232)进行免疫染色(500倍稀释)，在显微镜下观察。[0169]结果[0170]可以确认，横纹肌溶解模型小鼠的肾组织中的肌红蛋白摄入量因给药西司他丁而减少(图5)。因此，可知可以用西司他丁来抑制肾摄入肌红蛋白。[0171](试验例6)作用机制的确认(5)[0172]肾组织中的损伤标记物kim-1的巨蛋白依赖性[0173]使用基于肾特异性巨蛋白ko小鼠的横纹肌溶解肾病模型，来验证肾组织中的损伤标记物kim-1的表达是否依赖于巨蛋白。[0174]方法[0175]使用肾特异性巨蛋白ko小鼠(ndrg1-creert2、megalin lox/lox)、及作为对照的其对照小鼠(megalin(lox/lox)；cre(-))(均为雄性12周龄)。制备50％volume/volume glycerol(富士胶片和光纯药株式会社)/pbs 5ml/kg，将该溶液肌肉注射于右后肢，由此制作横纹肌溶解肾病模型。[0176]在给予甘油溶液24小时后，将右肾的包含肾蒂的部分以3mm厚度切片，用包含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液进行固定。将固定试样用切片机(rem-710、yamato kohki industrial co.，ltd.)以4μm厚切片，用抗kim-1抗体(山羊抗小鼠kim-1抗体(af1817；r&d systems))进行免疫染色(700倍稀释)，在显微镜下观察。[0177]结果[0178]关于横纹肌溶解肾病模型小鼠的肾脏组织中的kim-1表达，可以确认：对照小鼠中大部分在近端肾小管s1、s2段观察到，巨蛋白ko小鼠中未观察到(图6)。由于肾组织中的kim-1表达依赖于巨蛋白，因此可知肾组织中的损伤发生依赖于巨蛋白。[0179]产业上的可利用性[0180]本发明能够提供由横纹肌溶解诱发的肾损伤的抑制剂、或肾组织摄入肌红蛋白或血红素的抑制剂。









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