基于共轭聚合物的纳米粒子及其应用 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明属于有机合成及医药技术领域，具体涉及一种基于共轭聚合物的纳米粒子及其在制备用于光热和co协同治疗肿瘤的药物或光热试剂上的应用。背景技术：2.光热疗法(ptt)通常是指光热试剂(pta)吸收激光照射的能量并将其转化为热量，引起癌细胞蛋白质变性、引起dna的损伤，将其注入体内并主动或被动靶向在肿瘤处聚集，选择性地杀死癌细胞。研究表明，肿瘤细胞比正常细胞对温度敏感，而激光可以穿透皮肤和组织，最大限度地减少对周围健康组织的损害，从而实现对于深层肿瘤组织有效的热杀伤。光热疗法在癌症治疗中的良好效果，使其临床应用的可能性越来越受到人们的关注。但是单一的光热治疗依然有待进一步提高。3.近年来，为此激发了组合疗法的研究，组合疗法整合了不同疗法之间的加成、协同和互补相互作用。其中基于气体分子的治疗方法是一种很有前途的治疗方法，从伤口、炎症、心血管疾病到癌症。更具体地说，在肿瘤的气体治疗中，气体分子如一氧化氮(no)、硫化氢(h2s)、一氧化碳(co)、二氧化碳(co2)和氢(h2)，在高浓度下可以杀死癌细胞。这些气体可以逆转癌细胞中的瓦伯格效应，从而抑制它们的生存，而不会对正常细胞产生不利影响。此外，它们的超低分子量允许分子扩散到肿瘤间质并通过生物膜，而且不需要任何主动的运输机制。4.作为气体传送分子中的一员，co分子可以通过增强线粒体生物合成和加剧癌细胞的氧化应激来增强癌细胞对化疗的敏感性。高浓度的co能够诱导癌细胞凋亡。然而，由于co与血红蛋白的高度结合特性，co在肿瘤中的有效递送和按需释放以达到高治疗浓度是限制其临床应用的两大障碍。此外，肿瘤微环境的内源性刺激，如轻度酸性和过量的过氧化氢(h2o2)，已被利用来控制co的释放，以实现有效的气体治疗。在之前的研究中，co气体单药治疗不能有效抑制肿瘤，肿瘤容易复发。因此，迫切需要设计多功能纳米颗粒来控制co的释放，用于癌症联合治疗。技术实现要素：5.本发明针对co气体单药治疗不能有效抑制肿瘤的技术问题，提供一种基于共轭聚合物的纳米粒子，利用在肿瘤微环境下，过氧化氢触发纳米颗粒释放出大量的一氧化碳气体，抵抗多药耐药性，实现了在近红外照射下，co协同光热促进肿瘤治疗效果。6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供基于共轭聚合物的纳米粒子，所述纳米粒子是由共轭聚合物、两亲性分子和co气体组装成的球形结构，所述共轭聚合物为式i所示的化合物：所述纳米粒子在h2o2刺激下释放co气体。7.在一个技术方案中，所述共轭聚合物和两亲性分子的质量体积比为1：1。8.在一个技术方案中，所述两亲性分子为巯基聚乙二醇。9.在一个技术方案中，所述共轭聚合物的制备方法包括以下步骤：将in1023和dpp39在氮气气氛下用甲苯溶解，用pd(pph3)4作为催化剂，将反应体系加热到110℃，反应48h；将三(二亚苄基丙酮)二钯溶于含有甲苯和溴苯的反应物中，分别除去端基，粗产物经(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯和溴苯过滤除去催化剂；加热，将粗产物在四氢呋喃、氯仿和丙酮中纯化，在甲醇中沉淀，得到共轭聚合物。10.在一个技术方案中，所述纳米粒子的制备方法包括以下步骤：将共轭聚合物纳米粒子溶液和两亲性分子-co供体溶液溶解在四氢呋喃中超声搅拌混匀，再将混合溶液用四氢呋喃稀释；在超声下，将混合溶液迅速注入去离子水中，在冰水浴中继续超声，并用氮气除去四氢呋喃，经滤膜过滤纯化，浓缩，收集得到纳米粒子，保存在冰箱中。11.本发明还提供上述基于共轭聚合物的纳米粒子在制备用于光热和co协同治疗肿瘤的药物上的应用。12.本发明还提供上述基于共轭聚合物的纳米粒子在制备用于治疗肿瘤的光热试剂上的应用。13.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明以in-dpp和mpegco为原料，设计了一种基于共轭聚合物的纳米颗粒(in-dppco nps)，用于控制co释放与光热协同治疗癌症，该协同治疗体系不仅能够有效地解决co前药的生物相容性和体内给药等棘手问题，而且利用在肿瘤微环境下，过氧化氢触发纳米颗粒中的co气体供体释放出大量的一氧化碳气体，避免了多药耐药性，实现了在近红外照射下，co协同光热促进肿瘤治疗效果。附图说明14.图1为本发明纳米粒子in-dppco合成路线示意图，其中：图1a为聚合物in-dpp的合成路线；图1b为mpeg(co)的合成路线；图1c为由mpeg(co)和in-dpp组成纳米粒子in-dppco的合成路线。15.图2为本发明聚合物in-dpp、纳米粒子in-dppconps的性能表征，其中：图2a为聚合物in-dpp的红外光谱图；图2b为聚合物in-dpp的凝胶渗透色谱分析；图2c为聚合物in-dpp在thf中的紫外-可见-近红外吸收光谱和700nm处的吸收与浓度(插入)之间的线性关系；图2d为in-dppco nps的tem图像及dls分析，比例尺＝500nm；图2e为in-dppco nps水溶液的动态光散射图像；图2f为in-dpp nps和in-dppco nps的紫外-可见光吸收光谱；图2h为不同批次in-dpp nps间dls测定的重现性；图2i为不同批次in-dppco nps间dls测定的重现性。16.图3为本发明聚合物in-dpp、纳米粒子in-dppco nps的光热性能表征，其中：图3a和2b分别为在808nm激光(1w/cm2)照射下，不同浓度的in-dpp nps和in-dppco nps在10min内的温度升高曲线，去离子水作为对照；图3c和3d分别为100μg/m l的in-dpp nps和in-dppco nps在不同功率密度808nm近红外照射下的温度变化曲线；图3e和3f分别为in-dpp nps和in-dppco nps在808nm(1w/cm2)近红外光照射下的温度变化曲线和五个开关周期；图3g为在808nm(1w/cm2)激发下100μg/ml cpnps的光热转换与不含纳米粒子的对照实验：在激光下连续光照10min，记录温度，然后关闭激光，记录10min内的温度；图3h通过对冷却循环施加线性时间数据，确定了从冷却周期获得的时间与-lnθ的线性关系；图3i为去离子水、in-dpp nps和in-dppco nps溶液在近红外照射10min下的光热图像。17.图4为本发明纳米粒子in-dppco nps的co释放性能及体外治疗效果，其中：图4a为紫外光谱的变化显示了还原血红蛋白测试的in-dppco nps中co的释放；图4b为在不同浓度的h2o2条件下，in-dppco nps水溶解中co随着时间的释放量；图4c-4e为黑暗条件下，纳米粒子溶液处理mcf-7、hela和hepg2细胞24h后的细胞存活率；图4f-4h光照条件下，纳米粒子溶液处理mcf-7、hela和hepg2细胞，照射5min后的细胞存活率(808nm，1w/cm2)；图4i为不同条件处理hela细胞的活/死细胞染色荧光图像，标尺＝200μm。具体实施方式18.以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。19.实施例一1.1试剂药品与仪器2,8-双(三甲基锡)-4,10-二辛氧基-二噻唑(in1023，98％)，苏州纳凯科技有限公司；3,6-双(5-溴噻吩-2-基)-2,5-双(2-癸基十二烷基)吡咯并[3,4-c]吡咯-1,4(2h,5h)-二酮(dpp39，98％)，深圳睿迅光电材料科技有限公司；四(三苯基膦)钯(pd(pph3)4，98％)，北京百灵威科技有限公司；三(二亚苄基丙酮)二钯(98％)，北京百灵威科技有限公司；(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯(98％)，上海毕得医药科技股份有限公司；十二羰基三铁(fe3co121-10％methyl alcohol)，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；巯基聚乙二醇(mpeg2000-sh，95％)，上海芃硕生物科技有限公司；功能聚合物聚苯乙烯-co-顺丁烯二酸酐(psma，mn～1,900)，上海麦克林生化科技有限公司；溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑(mtt，98％)，西格玛奥德里奇公司；吖啶橙(ao，85％)，西格玛奥德里奇公司；溴化乙锭(eb,98％)，西格玛奥德里奇公司；二甲亚砜(dmso，99.9％)，西格玛奥德里奇公司；四氢呋喃(thf，99.9％)，西格玛奥德里奇公司。[0020]纳米球的形貌和粒径分布分别用透射电镜(tem,hitachi h-600)和动态光散射(dls,malvern zetasize nano zs)来进行表征；紫外可见吸收光谱通过uv-2550紫外可见光谱仪获得；通过gpc方法(515hplc泵，waters，2414折射率检测器)测量聚合物的分子量。[0021]1.2in-dppco nps的合成1.2.1共轭聚合物in-dpp的合成根据经典的给体-受体(d-a)结构，利用stille聚合反应，以给体单体in1023和受体单体dpp39为原料，设计合成了一种新的π-共轭聚合物，参照图1a。[0022]在50ml单口烧瓶中，将in1023(0.25mmol，246.3mg)和dpp39(0.25mmol，282.9mg)在氮气气氛下用10ml甲苯溶解。然后，使用pd(pph3)4(8.6mg)作为催化剂，将体系加热到110℃，反应48h。然后将20mg的三(二亚苄基丙酮)二钯溶于含有1ml甲苯和0.4ml溴苯的反应物中，分别除去端基，粗产物经(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯和溴苯过滤除去固体催化剂。加热后，粗产物在四氢呋喃、氯仿和丙酮中纯化，在甲醇中沉淀。最终得到黑绿色固体产物in-dpp。[0023]1.2.2一氧化碳供体mpeg(co)的合成参照图1b。将十二羰基三铁(50mg)和mpeg-sh(m.w.≈2000)(200mg)溶于50ml四氢呋喃(thf)中，在50℃氮气保护下搅拌2h。反应结束后，溶液由深蓝色变为棕色。冷却至-20℃，加入正己烷得到棕色沉淀，用乙醚洗涤，干燥后得到mpeg(co)(105.3mg)。[0024]1.2.3in-dpp nps的制备首先将in-dpp和psma分别溶解在thf中配制成1mg/ml的原始溶液，然后将in-dpp溶液和psma溶液以4:1的比例溶解在thf中超声搅拌混匀，然后将混合液用thf稀释20倍。在超声下，将3ml混合溶液迅速注入9ml去离子水中，混合物在冰水浴中继续超声5min，并用氮气除去thf。剩余纳米粒经0.22μm滤膜过滤纯化后，按要求浓缩，最后将收集到的in-dppnps保存在冰箱中。[0025]1.2.4in-dppco nps的制备参照图1c。首先将in-dpp nps和mpeg(co)分别溶解在thf中配制成1mg/ml的原始溶液，然后将in-dpp nps原始溶液和mpeg(co)原始溶液以1:1的比例溶解在thf中超声搅拌混匀，然后将混合溶液用thf稀释20倍。然后，在超声下，将3ml混合溶液迅速注入9ml去离子水中，混合物在冰水浴中继续超声5min，并用氮气除去thf。剩余纳米粒子经0.22μm滤膜过滤纯化后，按要求浓缩，最后将收集到的in-dppco nps保存在冰箱中。[0026]1.3表征1.3.1血红蛋白法测量in-dppco nps中co的释放利用血红蛋白法研究in-dppco nps在不同浓度的h2o2溶液下的co释放过程。通过测定血红蛋白(hb)向一氧化碳血红蛋白(hbco)的转化，用分光光度法测定溶液中释放的co。首先将牛红细胞血红蛋白(aladdin)完全溶解在磷酸盐缓冲盐水(10mm，ph＝7.4pbs)中，然后在氮气气氛下加入二亚硫酸钠(sdt，1.6mg)进行还原。将in-dppco水溶液充氮脱氧后加入上述hb溶液中。立即将3ml上述混合液和3μl的h2o2溶液混合并密封在4ml紫外石英试管中。在紫外-可见分光光度计上采集了溶液在近红外光照射下的紫外吸附光谱(350-600nm)。为了消除影响因素，提高准确性，在410nm和430nm处分别使用了两条强吸附带(分别归属于hbco和hb)来量化hb向hbco的转化。利用beer-lambert定律计算释放的co浓度，其公式为：[0027]1.3.2光热效应和光稳定性在相同的激光功率照射下，将不同浓度的in-dppco nps和in-dpp nps水溶液(0.5ml)分别暴露于808nm激光(1w/cm2)中10min。以相同体积的去离子水作为对照组。在不同激光功率下照射相同浓度的in-dppco nps和in-dpp nps水溶液。在整个测试过程中，通过红外热像仪对温度进行拍像。[0028]将in-dppco nps和in-dpp nps水溶液(0.5ml，100μg/ml)用激光照射10min，然后在激光关闭后让in-dppco nps和in-dpp nps水溶液自然冷却。当温度降至接近室温时，再次用激光照射in-dppco nps和in-dpp nps水溶液。重复上述操作5次。每隔1min记录溶液的温度。[0029]1.3.3in-dppco nps的光热转换效率为了测量光热转换效率，在ep管中分别加入0.5ml的in-dpp nps和in-dppco nps。然后将纳米粒子水溶液置于808nm(1w/cm2)激光照射下达到温度平衡，然后冷却至室温。光热转换效率(η)计算如下：式中：h代表b@p@c的传热系数，s代表容器的表面积，tmax和tmin分别代表整个过程的最高温度和室温，qdis代表水的散热量，i是照射激光功率(1w/cm2)，a是in-dpp nps或in-dppco nps在808nm处的吸光度。hs通过以下公式计算：其中：τs是溶液传热的时间常数，m为溶解纳米颗粒的去离子水的质量(200mg)，c为水的热容(4.2j/g)。[0030]1.3.4细胞实验1.3.4.1细胞培养及毒性试验用含10％胎牛血清(fbs)、1％青霉素、1％链霉素的dmem细胞培养基培养hela细胞、mcf-7细胞、hepg2和4t-1细胞。所有细胞均在细胞培养瓶中于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。[0031]1.3.4.2in-dppnps和in-dppco nps的细胞毒性研究采用mtt法和活/死细胞染色法评价纳米粒对hela细胞、mcf-7细胞和hepg2细胞的毒性和光热毒性。[0032]mtt：将mcf-7/hela细胞以每孔7000个细胞接种于96孔板中，培养24h。次日，用含有不同浓度in-dpp nps和in-dppco nps的培养基孵育细胞，24h后每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，37℃继续孵育4h。然后移除溶液，每孔加入150ml二甲基亚砜(dmso)。最后将96孔板振荡10min，用酶标仪测定490nm处的吸光度，对照组为未经处理的细胞，计算细胞存活率。[0033]光热毒性：体外光热毒性也是利用mtt检测评估的，方法同上，不同之处，在加过纳米粒子之后，先在培养箱里培养4h，接着置于808nm(1w/cm2)的nir激光下照射每孔细胞，持续5min，照射完之后接着培养12h后，mtt法同上。[0034]活/死细胞染色：将hela细胞以每孔20万个细胞的数量接种于12孔板中，培养24h，吸出原培养基，加入含有in-dpp nps和in-dppco nps的培养基继续孵育细胞24h，然后用不同的方式分别处理细胞：(1)pbs处理；2)pbs+nir处理；3)in-dpp nps处理；4)in-dpp nps+nir处理；5)in-dppco nps处理；6)in-dppco nps+nir处理。弃去原培养液，每孔用pbs洗涤3次。将预先制备好的吖啶橙/溴化乙胺(ao/eb)荧光染料加入孔中，轻轻晃动孔板，使染色液均匀铺在细胞上。然后在荧光显微镜下观察细胞并拍照。[0035]1.4试验结果与讨论1.4.1纳米粒子的合成与表征合成出来新的π-共轭聚合物in-dpp的化学结构由ft-ir谱得到验证(见图2a)。in-dpp聚合物表现出电子给体-受体(d-a)交替主链、平面结构和强电子缺位，进而有nir-ii区域的宽带光学吸收。[0036]凝胶渗透色谱(gpc)测定结果显示，in-dpp的数均分子量(mn)和重均分子量(mw)分别为33683da和94934da，多分散指数(pdi)为2.8(见图2b)。[0037]为了评估聚合物的吸收能力，进一步测定了840nm处的峰值质量消光系数，为85.82l g-1cm-1(见图2c)，该值高于此前报道的氧化石墨烯(5.94l g-1cm-1)(见zhaohua miao,sheng chen.pegylated rhenium nanoclusters:a degradablemetal photothermal nanoagent for cancer therapy[j].chemical science,2019(21).)。[0038]采用纳米再沉淀法制备的in-dppco nps在透射电镜(tem)下呈现球形形貌(见图2d)，动态光散射(dls)显示pdots的平均直径约为64nm(见图2e)。分别测试了in-dpp nps和in-dppco nps的吸收光谱(见图2f)。此外，zeta电位结果表明，in-dpp nps和in-dppco nps都具有-52mv和-55mv的负电位(见图2g)，表明纳米粒子可以在水溶液中保持稳定。从图2h和2i的结果可以看出，制备不同批次的in-dpp nps和in-dppco nps具有相同的粒径。[0039]1.4.2in-dpp nps和in-dppco nps的光热性能受聚合物近红外吸收的启发，在808nm激光照射下，估算了in-dpp nps和in-dppco nps的光热效应。如图3a、3b所示，在808nm(1w/cm2)激光照射下，in-dpp nps和in-dppco nps水溶液均表现出显著的浓度依赖性升温。在激光照射下，当in-dppco nps的浓度达到100μg/ml时，溶液的最高温度在10min内迅速上升到59.2℃(δt＝35.6℃)(见图3b)。相比之下，在相同辐照条件下，去离子水的温度几乎没有升高。此外，100μg/ml的in-dpp nps和in-dppco nps的平台温度与激光功率密度呈正相关(见图3c和3d，p《0.01)。[0040]经过100min的反复加热-冷却循环，in-dpp nps和in-dppco nps在每10min照射(808nm，1w/cm2)后稳定地上升到几乎相同的平均温度(59.7±0.5℃)，说明材料在808nm激光照射(1w/cm2)下具有优异的稳定性(见图3e，3f)。根据图3h中的测量值得到τsin-dppco nps＝176.6，根据加热-冷却循环计算in-dppco nps的光热转换效率(η)为41.5％(图3g)。[0041]通过光热成像结果可以看出，in-dpp nps和in-dppco nps在相同的激光照射下，具有较高的升温效果(图3i)，这表明它们具有良好的光热性能。[0042]1.4.3in-dppco nps的co释放性能此外，为了在体外验证in-dppco nps的co释放能力，采用还原血红蛋白(hb)测定co含量。如图4a所示，根据还原hb和hbco的吸收峰的值可以计算出co的含量。[0043]据报道，肿瘤微环境下h2o2浓度在微摩尔每升范围。在h2o2浓度分别为0、10、20、30和40μm时，90min内测试co释放量和释放速度，验证in-dppco nps在肿瘤微环境中的表达情况。如图4b所示，在无h2o2的条件下，co几乎不释放。随着h2o2浓度接近肿瘤细胞中的表达水平，in-dppco nps剧烈释放co，体外实验证实了in-dppco nps具有优异的co释放能力。[0044]1.4.4体外治疗效果为了进一步的生物应用，在评估光热治疗效果之前，研究in-dppco nps和in-dpp nps的细胞毒性。使用三种癌细胞系(hela、mcf-7和hepg2)通过mtt实验评估in-dppco nps和in-dpp nps的体外细胞毒性。与不同浓度的in-dpp nps孵育24h后，没有观察到明显的细胞活力下降(见图4c-4e)，表明in-dppco nps的细胞毒性较低。需要注意的是，在没有近红外光照射的情况下，in-dppco nps对癌细胞也有杀伤作用，这可能与co本身的抗肿瘤作用有关。[0045]此外，研究了一氧化碳是否促进光热治疗效果。在808nm(1w/cm2)的激发光照射每孔细胞持续5min后，细胞活力出现明显下降的趋势，如图4f-4h所示，ptt和co处理可以有效抑制癌细胞的增殖，并且治疗效果明显优于单独的ptt治疗效果。[0046]为了进一步评价in-dppco nps的细胞光热毒性，使用ao/eb双荧光染料法检测hela细胞的凋亡，绿色代表活细胞，红色代表死细胞，在激光共聚焦显微镜下观察到，用in-dppco nps处理过之后细胞毒性显著增强(见图4i)，这些结果与mtt保持一致，说明ptt和co协同治疗可有效地杀死肿瘤细胞。[0047]以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。









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