一种适于链霉菌无细胞蛋白合成体系的质粒及其构建方法和应用 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于生物技术领域，涉及一种用于链霉菌无细胞蛋白合成的质粒、合成体系及其构建方法和应用，具体涉及原核生物启动子和rbs库构建，以及通过替换转录翻译元件制备适用于链霉菌无细胞蛋白合成体系的高活性dna模板从而制备高产的链霉菌无细胞蛋白体系的方法。背景技术：2.为了可持续利用现有地球资源，减少有害工业化学品的污染，绿色环保的生物合成方法已广泛应用于各种化学品、药物、新型生物材料等的生产。然而，尽管生物体可以被调节以生产感兴趣的产品，但整个过程的效率和可控性仍然不理想。鉴于此，科学家开发了无细胞蛋白合成(cfps)系统，摆脱了活细胞的限制，同时为产物合成提供了一个可变的开放环境。3.cfps系统的主要成分是细胞提取物和蛋白质合成的一些关键成分，包括盐离子(mg2+、k+、na+)、能量 (atp、gtp、utp和ctp)、核酸模板和氨基酸等。由于体系中资源充分且集中，cfps平台可以在短时间内合成出目标蛋白质，而无需经历繁琐的蛋白表达周期。目前，该系统在天然产物生物合成、有机化合物制造、生物传感、和蛋白质工程中有一些实际的应用。此外，它还能够与一些现有的先进技术相结合，如高通量微流控和基因编辑等。在这些应用中，由于大肠杆菌的细胞提取物制备简单且投入的成本较低，基于大肠杆菌提取物的cfps体系被广泛使用。同时，该体系是所有已开发系统中最健壮的。不过，该平台也并非万能的，在表达某些基因时它也存在着有限的翻译后修饰、溶解度较差、具有密码子偏好性等问题。4.由于链霉菌基因组的gc含量较高，因此该系统在理论上可以作为cfps更好地表达一些高gc含量的蛋白质或复杂的基因簇。然而，利用链霉菌构建的cfps系统仍然存在蛋白产量较低，不足以表达复杂蛋白质的问题。技术实现要素：5.本发明的目的在于克服现有技术的上述缺陷，获得链霉菌强转录翻译元件，对链霉菌cfps系统进行改造，进一步提高链霉菌的cfps系统的产量。本发明还通过转录组数据和生物信息学相结合的方法，构建一套适合于链霉菌cfps系统的天然启动子和rbs文库，以供表达不同蛋白时选择。6.本发明一方面是提供一种适于原核生物无细胞蛋白合成的质粒，所述质粒包括启动子和/或rbs序列；所述启动子选自如seq id no:1～38、seq id no:51～60、seq id no:61～66所示的序列或与其具有85％序列同源性的变体中的至少一种；所述rbs序列选自如seq id no:39～50、seq id no:67～70所示的序列或与其具有85％序列同源性的变体中的至少一种。7.其中，所述原核生物选自链霉菌属(streptomyces)，埃希氏菌属(escherichia)；代尔夫特菌属(delftia)；芽孢杆菌属(bacilluss)；乳杆菌属(lactobacillus)；乳球菌属(lactococcus)；梭菌属(clostridia)；棒状杆菌属(corynebacteria)；贪铜菌属(cupriavidus)；假单胞菌属(pseudomonas)；和红球菌属(rhodococcus)中的一种或几种。8.其中，所述质粒还包括复制起始位点、信号肽基因、操纵子、终止子、核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子、多克隆位点、选择标记基因区中的一个或多个元件。其中，所述多克隆位点用于克隆入目的蛋白基因。9.其中，所述元件可以来源于任何生物，包括但不限于是噬菌体或原核生物等。在一优选实施方式中，所述元件构建于pjl1-egfp。10.本发明另一方面是提供如上所述的质粒在构建适于原核生物无细胞蛋白合成体系或在蛋白合成中的应用。11.本发明另一方面是提供如上一种适于原核生物无细胞蛋白合成的质粒的构建方法，所述方法包括以下步骤：12.(1)构建候选启动子库，依据候选启动子库中各启动子在原核生物无细胞蛋白合成体系中的活性，筛选出适于原核生物无细胞蛋白合成的启动子库；13.(2)构建候选rbs库，依据候选rbs库中各rbs在原核生物无细胞蛋白合成体系中的活性数据，筛选出适于原核生物无细胞蛋白合成的rbs库；14.(3)构建候选质粒库，所述质粒库中的各质料包含至少一个选自适于原核生物无细胞蛋白合成的启动子库的启动子，以及至少一个选自适于原核生物无细胞蛋白合成的rbs库的rbs，依据候选质粒库中各候选质粒在原核生物无细胞蛋白合成体系中的活性，筛选出适于原核生物无细胞蛋白合成的质粒。15.其中，所述步骤(1)中，构建候选启动子库具体包括：16.1.1构建启动子序列组i：17.包括从数据库中找到目标原核生物的rna-seq数据，及其所有基因的转录强度数据，选择转录强度靠前的基因，在所述目标原核生物的基因组中找到其具体的位置以及其上游基因的位置，分别将这些基因与它们的上游基因之间的碱基截取出来作为假定的启动子序列，获得启动子序列组i；同时对启动子序列组i 中各启动子的活性进行检测；18.1.2基于启动子序列组i获得启动子序列组ii：19.包括将启动子序列组i中的各假定的启动子序列利用启动子预测软件进行预测，获得缩短的启动子序列，获得启动子序列组ii；20.1.3基于启动子序列组i获得启动子序列组iii：21.将启动子序列组i中活性较高但未被步骤1.2筛选出的启动子，利用启动子预测软件进行预测，获得缩短的启动子序列，获得启动子序列组iii；22.1.4从文献中归纳出经体内验证过的强合成型的启动子，获得启动子序列组iv；23.1.5启动子序列组i～iv组成候选启动子库；24.其中，所述步骤(2)中，构建候选rbs库具体包括：25.1.1构建rbs序列组i：26.包括从数据库中找到目标原核生物的基因组中所有基因的上游序列，其中富含a/g的连续碱基的序列且出现频率较高的序列为假定的rbs序列，获得rbs序列组i；27.1.2构建rbs序列组ii：28.包括从数据库中找到与所述目标原核生物基因组相似的野生型菌株的基因组中翻译水平靠前的基因的上游序列，其中富含a/g的连续碱基的序列且出现频率较高的序列为rbs序列组ii；29.1.3构建rbs序列组iii：30.从文献中归纳出经体内验证过的强合成型的rbs序列，获得rbs序列组iii；31.1.4rbs序列组i～iii组成所述候选rbs库。32.在一些实施方式中，所述适于原核生物无细胞蛋白合成体系的质粒的构建方法，所述方法包括以下步骤：33.(一)适于原核生物无细胞蛋白合成的启动子库构建34.1)启动子序列组i筛选(原生启动子)，启动子库i构建及活性检测35.1.1启动子序列组i筛选36.从数据库中找到目标原核生物的rna-seq数据，得到其所有基因的转录强度，选择转录强度位于靠前的基因，在所述目标原核生物的基因组中找到其具体的位置以及其上游基因的位置，分别将这些基因与它们的上游基因之间的碱基截取出来作为调控这些基因转录的启动子，即假定的启动子序列，标记为启动子序列组i；37.1.2构建启动子库i，对其中假定的启动子序列进行活性检测38.通过将启动子序列组i中假定的各启动子序列构建到质粒中，对假定的启动子序列进行活性检测；步骤包括：扩增假定的启动子序列，构建假定的启动子库，构建含假定启动子的质粒以及检测启动子活性；39.1.2.1设计引物、扩增启动子，构建启动子库i40.在数据库上比对所述目标原核生物相对应的序列以及具体大小，设计引物扩增启动子序列组i中的启动子，构建启动子库i；41.其中，对于较短的启动子，选择直接将全部序列构建到引物上，利用引物二聚得到目的假定的启动子片段；42.1.2.2设计引物、扩增质粒骨架43.在启动子区域的上下游分别设计正反向引物，将质粒骨架从原质粒上扩增出来，得到骨架片段；44.1.2.3构建含假定的启动子的质粒45.回收上述步骤1.2.1得到的目的假定的启动子片段和质粒骨架片段，通过同源连接，将假定的启动子片段替换原质粒的原始启动子，构建用于验证启动子活性的质粒；46.1.2.4检测启动子活性47.将构建好的质粒加入到目标原核生物的无细胞蛋白合成体系中，进行反应，测定假定的启动子的活性；48.2)启动子序列组ii～iv筛选，启动子库ii～iv构建及活性检测49.2.1软件预测和缩短，构建启动子序列组ii50.将假定的启动子序列输入启动子预测软件中，进行二次预测，以缩短启动子，只保留核心区域(预测出其中可能存在的启动子序列)，简化启动子库的碱基数量，构建启动子序列组ii；51.2.2从假定的启动子中补充筛选，构建启动子序列组iii52.通过步骤1.2.4对假定的启动子序列进行活性检测，若极强或中等强度的启动子未被步骤2.1的预测软件预测出来时，可以再次从假定的启动子中选择极强或中等强度的启动子，输入预测软件中，不论分值，最终得出缩短后的启动子，标记为“启动子序列组iii”；53.2.3从文献中筛选，构建启动子序列组iv54.从文献中归纳出经体内验证过的强合成型的启动子，标记为“启动子序列组iv”；55.2.4构建启动子库ii～iv，对其中的启动子序列进行活性检测56.通过将启动子序列组ii～iv中的启动子序列构建到质粒中，对其中的启动子序列进行活性检测；步骤包括：扩增启动子序列，构建启动子库，构建含启动子的质粒，检测启动子活性；57.2.4.1设计引物、扩增启动子，构建启动子库ii～iv58.对于启动子序列组ii～iv，在数据库上比对目标原核生物相对应的序列以及具体大小，设计引物扩增启动子(启动子序列组ii～iv)，构建启动子库；59.其中，对于较短的启动子，选择直接将全部序列构建到引物上，利用引物二聚得到目的启动子片段；60.其中，对于从文献中检索得到的强启动子序列(启动子序列组iv)直接将其分成带有重叠序列的前后两部分分别设计到引物中，利用前后引物的互补以及二聚得到片段；61.2.4.2设计引物、扩增质粒骨架62.同步骤1.2.2；63.2.4.3构建含启动子的质粒64.同步骤1.2.3；65.2.4.4检测启动子活性66.同步骤1.2.4；67.3)获得适于原核生物无细胞蛋白合成的启动子库68.依据启动子库i～iv中各启动子的活性，筛选活性较高的启动子，作为适于原核生物无细胞蛋白合成的启动子库；69.二、适于原核生物无细胞蛋白合成的rbs库构建70.4)rbs序列组i筛选71.4.1从数据库中筛选目标原核生物的基因组72.从数据库中找到目标原核生物的基因组，整理所有基因的上游序列，认为组成型的核糖体结合位点 (rbs)包含其中，在这些序列中富含a/g的连续碱基的设定为假定的rbs序列(rbs区域)，标记为 rbs序列组i；73.4.2从假定rbs序列组i中，分析出在目标原核生物所有基因上游出现频率较高的假定的rbs序列，构成rbs序列组i；74.4.3rbs序列组ii筛选75.从与所述目标原核生物基因组相似的野生型菌株(如天蓝色链霉菌菌株)中补充筛选，获得rbs序列，标记为rbs序列组ii，包括：分析出与所述目标原核生物基因组相似的野生型菌株基因组中翻译水平靠前的基因的上游序列，其中富含a/g的连续碱基的序列且出现频率较高的序列为rbs序列组ii；76.5)rbs序列组iii筛选77.从文献中归纳出经体内验证过的强合成型的rbs序列，标记为rbs序列组iii；78.6)构建rbs库，对其中的rbs序列进行活性检测79.6.1扩增rbs，构建rbs库80.由rbs组i～ii构成rbs库i～ii，在一实施方式中，本发明筛选出来的12个短碱基即可视为rbs库；81.根据从文献中检索到的rbs序列，将它们的序列分别设计到上下游引物上，利用引物二聚化得到目的片段，构建rbs库iii；82.所述rbs库i～iii共同构成rbs库；83.6.2对rbs序列活性进行检测84.通过将rbs序列(rbs序列组i～ii)构建到线性dna模板中，对rbs序列进行活性检测，测定的活性较高的rbs序列为适于作为质粒模板的转录翻译元件的rbs序列；在文献中检索得到的强rbs(rbs 序列组iii)被直接与最强的启动子组合构建到质粒模板上，进行活性检测；85.6.3获得适于原核生物无细胞蛋白合成的rbs库86.依据rbs库i～iii中各rbs的活性数据，筛选适于原核生物无细胞蛋白合成的rbs库。87.三、筛选适用于无细胞蛋白体系的质粒模板88.7)筛选适于原核生物无细胞蛋白合成的质粒89.将一3)和二6.2中所述的适于原核生物无细胞蛋白合成的启动子库中的至少一个启动子和适于原核生物无细胞蛋白合成的rbs库中的至少一个rbs，组合构建到质粒上，测定质粒的活性，依据活性筛选得到适于原核生物无细胞蛋白合成的质粒；90.8)构建适用于无细胞蛋白合成的质粒模板91.将筛选获得的最佳组合的启动子序列和rbs序列构建到质粒骨架中，转化入大肠杆菌中，在固体培养基如lb培养基平板上培养，而后挑选单菌落，利用液体lb培养基活化后，提取质粒，测序正确的质粒即为所述适于链霉菌无细胞蛋白体系的质粒模板。92.本发明另一方面是提供一种在原核生物中构建启动子库的方法，所述方法包括如上所述的步骤1)～3)。93.本发明另一方面是提供一种启动子库，所述启动子库通过如上所述方法获得，所述启动子库中包含不同表达强度的启动子；或，94.所述启动子库中包含如seq id no:1～38、seq id no:51～60序列中的一种或多种，包含或不包含seqid no:61～66中的一种或多种。95.本发明另一方面是提供如上所述的启动子库在构建适于无细胞蛋白合成体系的质粒模板、无细胞蛋白合成表达体系中的应用。96.本发明另一方面是提供一种在原核生物中构建rbs库的方法，所述方法包括如上所述的步骤4)～6)。97.本发明另一方面是提供一种rbs库，所述rbs库通过如上所述方法获得，所述rbs库中包含不同表达强度的rbs；或，98.所述rbs库中包含如seq id no:39～50所示的序列中的一种或多种，包含或不包含seq id no:67～70 所示的序列中的一种或多种。99.本发明另一方面是提供一种原核生物无细胞蛋白合成体系，所述体系中的模板包括如上所述的质粒。本发明另一方面是提供如上所述的原核生物无细胞蛋白合成表达体系在蛋白合成中的应用。100.本发明另一方面是提供一种用于筛选原生强rbs序列的方法。101.本发明的有益效果在于：102.本发明提供了一种通过改变转录翻译元件强度来调整无细胞体系蛋白产量和蛋白多样性的技术方案，构建获得的高活性质粒模板(dna模板)可以用于在体外表达多种链霉菌来源的酶或蛋白，提高链霉菌依赖的无细胞蛋白合成体系的蛋白产量。在体系中无需添加额外的rna聚合酶的情况下，蛋白产量超过500μ g/ml，解决了链霉菌可用的遗传元件较少，且无细胞体系产量过低从而难以表达复杂蛋白的问题。103.本发明提供的构建启动子库和rbs库的方法以及构建获得的启动子库和rbs库，可以增加链霉菌遗传元件的多样性，构建的元件库可以供表达不同蛋白时选择。附图说明104.下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。105.图1为本发明中根据野生型链霉菌的转录组数据对基因转录强度进行排序后列出的前38个较强转录水平的基因。106.图2为显示启动子库在链霉菌的无细胞蛋白合成体系中表达强度的图。107.图3为显示经缩短后的启动子在链霉菌的无细胞蛋白合成体系中表达强度的图。灰色表示原始启动子序列，黑色为缩短后的启动子序列。108.图4为显示经报道的合成型启动子在链霉菌的无细胞蛋白合成体系中表达强度的图。109.图5为显示rbs库在链霉菌的无细胞蛋白合成体系中表达强度的图。r*表示对照组，r1-12表示筛选出的假定的原生rbs。110.图6为显示经实验验证最强的合成型启动子与较强的原生rbs以及文献中报道的强rbs组合后在链霉菌的无细胞蛋白合成体系中表达强度的图。具体实施方式111.本发明利用生物信息学的分析方法，根据转录组数据的强弱，构建了一组转录翻译元件库，包括组成型启动子库和rbs库，同时通过pcr和同源重组将质粒模板pjl1上的t7启动子和rbs替换成已报道的强合成型元件，构建出一种在体系中无需添加额外的rna聚合酶并且产量能超过500μg/ml的高活性dna 模板。本发明提供了一种适用于链霉菌无细胞蛋白体系的高活性质粒模板的构建方法以及由该方法获得的高活性质粒模板。112.本发明提供的适于链霉菌无细胞蛋白体系的质粒模板的构建方法，具体包括以下步骤：113.一、适于原核生物无细胞蛋白合成的启动子库构建114.1)启动子序列组i筛选(原生启动子)，启动子库i构建及活性检测115.1.1启动子序列组i筛选116.从数据库中找到目标原核生物的rna-seq数据，得到其所有基因的转录强度，选择转录强度位于靠前的基因，在所述目标原核生物的基因组中找到其具体的位置以及其上游基因的位置，分别将这些基因与它们的上游基因之间的碱基截取出来作为调控这些基因转录的启动子，即假定的启动子序列，标记为“启动子序列组i”。117.其中，所述数据库可以是公知的任何包含目标原核生物转录组数据的数据库。本发明中，采用nationalcenter for biotechnology information(ncbi)数据库。118.原核生物选自下组：链霉菌属(streptomyces)，埃希氏菌属(escherichia)；代尔夫特菌属(delftia)；芽孢杆菌属(bacilluss)；乳杆菌属(lactobacillus)；乳球菌属(lactococcus)；梭菌属(clostridia)；棒状杆菌属 (corynebacteria)；贪铜菌属(cupriavidus)；假单胞菌属(pseudomonas)；和红球菌属(rhodococcus)中的一种或几种。119.进一步地，所述原核生物选自变铅青链霉菌tk24、大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌 (corynebacterium glutamicum)、食油假单胞菌(pseudomonas oleavorans)、食酸代尔夫特菌(delftiaacidovorans)、杨氏梭菌(clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(clostridium autoethanogenum)、克鲁佛梭菌 (clostridium kluyveri)、钩虫贪铜菌(cupriavidus necator)、耐金属贪铜菌(cupriavidus metallidurans)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、枯草芽胞杆菌(bacillus subtillis)、德氏乳杆菌(lactobacillus delbrueckii)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、和马红球菌(rhodococcus equi)中的一种或几种。120.优选地，所述目标原核生物为链霉菌，所述链霉菌可以是任何合适的链霉菌。进一步优选地，所述链霉菌为变铅青链霉菌tk24。121.当数据库中没有目标原核生物的转录组数据时，可以采用与其同源较近或基因组序列较近的野生型原核生物的转录组数据。在一优选实施方式中，目标原核生物为变铅青链霉菌tk24，当ncbi中缺少目标原核生物变铅青链霉菌tk24的转录组数据时，本发明选用野生型天蓝色链霉菌a(3)2的转录组数据，所述 a(3)2的rna-seq数据的序列号是gse111126；在ncbi中的基因组序列号为：al645882.2。122.所述转录强度靠前是指转录强度大于5900的基因。或，123.所述转录强度靠前是指转录强度位于前50的基因，可以是转录强度位于前20-50的基因，可以是转录强度位于前45的基因，转录强度位于前40的基因，转录强度位于前38的基因，转录强度位于前35的基因，转录强度位于前30的基因，转录强度位于前28的基因，转录强度位于前25的基因，转录强度位于前20的基因。在一具体实施方式中，目标原核生物为变铅青链霉菌tk24，以野生型天蓝色链霉菌a(3)2 的转录组数据进行筛选，选择转录强度位于前38的基因，得到38个假定的启动子序列，序列分别如seqid no:1～seq id no:38所示。124.1.2构建启动子库i，对其中假定的启动子序列进行活性检测125.通过将启动子序列组i中假定的各启动子序列构建到质粒中，对假定的启动子序列进行活性检测；步骤包括：扩增假定的启动子序列，构建假定的启动子库i，构建含假定的启动子的质粒以及检测启动子活性。126.1.2.1设计引物、扩增启动子，构建启动子库i127.在数据库上比对目标原核生物相对应的序列以及具体大小，设计引物扩增启动子(启动子序列组i)，得到假定的启动子片段，构建启动子库i；128.其中，对于较短的启动子，选择直接将全部序列构建到引物上，利用引物二聚得到目的启动子片段。129.其中，所述较短的启动子是指启动子数小于25个碱基的假定的启动子。130.在一优选实施方式中，启动子库i中包含的启动子序列组i中的序列分别如seq id no:1～38所示，引物分别为seq id no:71～146所示。131.在一优选实施方式中，当目标原核生物为链霉菌时，扩增启动子是指从链霉菌基因组中利用q5聚合酶扩增。其中，50μl的扩增体系包括10μl 5×q5 reaction buffer，1μl 10mm dntps，2.5μl 10μm 上下游引物，5ng dna模板(基因组模板0.5μg-1μg)，0.5μl q5高保真dna聚合酶，余量用双蒸水补充。具体扩增程序为：98℃预变性30秒，98℃变性10秒，50-72℃退火30秒，72℃延伸20-30 秒/kb，扩增过程包括35个循环，最后72℃延伸10分钟。得到假定的启动子片段(假定的启动子pcr 产物)，构建启动子库i。132.1.2.2设计引物、扩增质粒骨架133.在启动子区域的上下游分别设计正反向引物，将质粒骨架从原质粒上扩增出来，得到骨架片段。134.从启动子序列两边分别设计25bp左右的上下游引物，利用pjl1-egfp质粒(带有kana抗性基因，原始启动子为t7启动子)作为模板，通过聚合酶链式反应扩增出质粒骨架，引物序列如seq id no:202-203 所示。所述扩增可以利用q5聚合酶进行，其中，pcr扩增体系与扩增假定的启动子片段相同，扩增模板加入5ng，扩增方法中72℃延伸90秒；即，其中，50μl的扩增体系包括10μl 5×q5 reaction buffer， 1μl 10mm dntps，2.5μl 10μm上下游引物，5ng dna模板(基因组模板0.5μg-1μg)，0.5μl q5高保真dna聚合酶，余量用双蒸水补充。扩增程序是：98℃预变性30秒、98℃变性10秒、58℃退火 30秒、72℃延伸90秒，循环35次，72℃反应10分钟，得到质粒骨架片段(质粒骨架pcr产物)。135.1.2.3构建含启动子的质粒136.回收上述步骤得到的假定的启动子片段和质粒骨架片段，通过同源连接，将假定的启动子片段替换原质粒的原始启动子，构建用于验证启动子活性的质粒。137.该步骤中，可以用本领域任何公知的合适的回收pcr产物的方法回收得到的启动子片段和质粒片段，包括pcr产物回收试剂盒或者琼脂糖凝胶回收试剂盒。138.所述同源连接的过程可以采用本领域公知的任何合适的方法进行。在一优选实施方式中，同源连接中，同源臂在引物设计时即加在两端，约20bp。同源连接体系为20μl，包括0.03pmol质粒片段(克隆载体)， 0.06pmol启动子片段(插入片段)，4μl重组缓冲液，2μl重组酶，余量为双蒸水。139.1.2.4检测启动子活性140.将构建好的假定的启动子质粒加入到目标原核生物的无细胞蛋白合成体系中，进行反应，测定假定的启动子产生蛋白的活性。141.在一优选实施方式中，每15μl无细胞蛋白合成体系中包含：3μl s30缓冲液，0.7μl 0.1m醋酸镁溶液，4μl合成混合物(包含200mm hepes-koh ph8.2、140mm醋酸铵、280mm醋酸钾、7mm二硫苏糖醇(dtt)、5mm atp、3.4mm ctp、gtp和utp、100mm磷酸烯醇式丙酮酸(pep)、1.4mm 20种标准氨基酸、7.5％(w/v)聚乙二醇(peg)8000、0.14mg/ml叶酸和245u/ml丙酮酸激酶)、200ng dna 模板(含有基因表达必须元件的质粒模板或线性dna模板)和5μl链霉菌细胞提取物。142.所述链霉菌细胞提取物包括变铅青链霉菌tk24细胞提取物。或所述链霉菌细胞提取物的制备方法包括超声破碎法、高压匀质破碎法、化学法等。143.所述反应在水浴中进行；144.所述反应的温度为15-35℃。在一优选实施方式中，所述反应的温度为23℃。145.所述反应的时间为4-20h。在一优选实施方式中，所述反应的时间为8小时。在一更优选实施方式中，所述反应在23℃水浴锅中静置反应8h左右。146.其中，对于蛋白产量的测定方法可以根据实际需要进行选择。在一实施方式中，所述测定蛋白产量的方法包括：将反应后的体系加入到96孔板，利用酶标仪检测蛋白产量。147.2)启动子序列组ii～iv筛选，启动子库ii～iv构建及活性检测148.2.1软件预测和缩短，构建启动子序列组ii149.将假定的启动子序列组i输入启动子预测软件中，进行二次预测，以缩短启动子，只保留核心区域(预测出其中可能存在的启动子序列)，简化启动子库的碱基数量，构建启动子序列组ii。150.所述预测软件可以采用任何本领域公知的能够预测启动子的软件。在一优选实施方式中，所述预测软件为bprom和bacpp两种启动子预测软件。所述软件预测过程中，存在对结果打分的步骤，所述bprom 主要是对σ70可能的识别基序打分，软件预测的过程中会自动过滤低分序列，保留打分值高的序列；所述 bacpp主要是对六种sigma因子(σ24，28，32，38，54，70)可能的识别基序进行打分，人为设定只保留存在任一sigma因子σ的打分值高于50的序列；两个预测软件共同预测出来的缩短后的启动子序列，认定是启动子，标记为启动子序列组ii；在一实施方式中，通过两种软件预测得到的缩短后的启动子序列分别如seq id no:54、55、57、58、60所示。151.2.2从假定的启动子中补充筛选，构建启动子序列组iii152.通过步骤1.2.4对假定的启动子序列进行活性检测，若极强或中等强度的启动子未被步骤2.1的预测软件预测出来时，可以再次从假定的启动子序列组i中选择极强或中等强度的启动子，输入预测软件中，不论分值，最终得出缩短后的启动子，标记为“启动子序列组iii”；153.其中，所述极强的启动子是指38个假定的原生启动子中活性经体外验证高于ermep*的启动子。154.其中，所述中等强度的启动子是指在38个假定的原生启动子中活性排在中间的启动子。155.在一实施方式中，通过从假定的启动子中补充筛选，获得的缩短后的启动子序列分别如seq id no:51、 52、53、56、59所示。156.2.3从文献中筛选，构建启动子序列组iv157.从文献中归纳出经体内验证过的强合成型的启动子，标记为“启动子序列组iv”。158.在一实施方式中，本发明通过从文献中归纳出6个经体内验证过的强合成型的启动子，序列分别如seq 61-66所示。159.2.4构建启动子库ii～iv，对其中的启动子序列进行活性检测160.通过将启动子序列组ii～iv中的启动子序列构建到质粒中，对其中的启动子序列进行活性检测；步骤包括：扩增启动子序列，构建启动子库，构建含启动子的质粒，检测启动子活性。161.2.4.1设计引物、扩增启动子，构建启动子库ii～iv162.对于启动子序列组ii～iv，在数据库上比对目标原核生物相对应的序列以及具体大小，设计引物扩增启动子(启动子序列组ii～iv)，构建启动子库；163.其中，对于较短的启动子，选择直接将全部序列构建到引物上，利用引物二聚得到目的启动子片段；164.其中，对于从文献中检索得到的强启动子序列(启动子序列组iv)直接将其分成带有重叠序列的前后两部分分别设计到上下游引物中，利用引物的互补以及二聚得到片段。165.对于启动子序列组ii～iii，通过设计引物从原长启动子上pcr扩增出来。在一优选实施方式中，获得的缩短后的启动子序列如seq id no:51～seq id no:60所示，引物分别为seq id no:162～181所示。166.对于启动子序列组iv，通过设计引物从原长启动子上pcr扩增出来。在一优选实施方式中，启动子序列组iv包含的启动子序列如seq id no:61～seq id no:66所示，引物分别为seq id no:182～193所示。167.其中，所述较短的启动子是指启动子数小于25个碱基的启动子。168.在一优选实施方式中，当目标原核生物为链霉菌时，扩增启动子是指从链霉菌基因组中利用q5聚合酶扩增。其中，50μl的扩增体系包括10μl 5×q5 reaction buffer，1μl 10mm dntps，2.5μl 10μm 上下游引物，5ng dna模板(基因组模板0.5μg-1μg)，0.5μl q5高保真dna聚合酶，余量用双蒸水补充。具体扩增程序为：98℃预变性30秒，98℃变性10秒，50-72℃退火30秒，72℃延伸20-30 秒/kb，扩增过程包括35个循环，最后再72℃延伸10分钟。得到假定的启动子片段(假定的启动子pcr 产物)，构建启动子库i。169.2.4.2设计引物、扩增质粒骨架170.同步骤1.2.2，即将质粒骨架从原质粒上扩增出来。171.在一优选实施方式中，当质粒为pjl1-egfp时(带有kana抗性基因，原始启动子为t7启动子)，从启动子序列两边分别设计25bp左右的上下游引物，利用质粒作为模板，通过聚合酶链式反应扩增出质粒骨架，引物序列如seq id no:202～203所示。所述扩增可以利用q5聚合酶进行，其中，pcr扩增体系与扩增假定的启动子片段相同，扩增模板加入5ng，扩增方法中72℃延伸90秒；即，其中，50μl的扩增体系包括10μl 5×q5 reaction buffer，1μl 10mm dntps，2.5μl 10μm上下游引物，5ng dna模板(基因组模板0.5μg-1μg)，0.5μl q5高保真dna聚合酶，余量用双蒸水补充。扩增程序是：98℃预变性30秒、 98℃变性10秒、58℃退火30秒、72℃延伸90秒，循环35次，72℃反应10分钟，得到质粒片段(质粒骨架pcr产物)。172.2.4.3构建含启动子的质粒173.同步骤1.2.3，即回收上述步骤得到的启动子片段和质粒片段，通过同源连接，将启动子片段替换原质粒的原始启动子，构建构建含启动子的质粒。174.该步骤中，可以用本领域任何公知的合适的回收pcr产物的方法回收得到的启动子片段和质粒片段，包括pcr产物回收试剂盒或者琼脂糖凝胶回收试剂盒。175.所述同源连接的过程可以采用本领域公知的任何合适的方法进行。在一优选实施方式中，同源连接中，同源臂在引物设计时即加在两端，约20bp。同源连接体系为20μl，包括0.03pmol质粒片段(克隆载体)， 0.06pmol启动子片段(插入片段)，4μl重组缓冲液，2μl重组酶，余量为双蒸水。176.2.4.4检测启动子活性177.同步骤1.2.4，即将构建好的启动子质粒加入到目标原核生物的无细胞蛋白合成体系中，进行反应，测定启动子产生蛋白的活性，选择活性较高的启动子。178.在一优选实施方式中，每15μl无细胞蛋白合成体系中包含：3μl s30缓冲液，0.7μl 0.1m醋酸镁溶液，4μl合成混合物(同上文)、200ng dna模板(同上文)和5μl链霉菌细胞提取物。179.所述链霉菌细胞提取物包括变铅青链霉菌tk24细胞提取物。或所述链霉菌细胞提取物的制备方法包括超声破碎法、高压匀质破碎法、化学法等。180.所述反应在水浴中进行；181.所述反应的温度为15-35℃。在一优选实施方式中，所述反应的温度为23℃。182.所述反应的时间为4-20h。在一优选实施方式中，所述反应的时间为8小时。在一更优选实施方式中，所述反应在23℃水浴锅中静置反应8h左右；183.其中，所述测定蛋白产量的方法包括：将反应后的体系加入到96孔板，利用酶标仪检测蛋白产量。184.3)获得适于原核生物无细胞蛋白合成的启动子库185.依据启动子库i～iv中各启动子的活性，筛选活性较高的启动子，作为适于原核生物无细胞蛋白合成的启动子库，即适于作为质粒模板的转录翻译元件的启动子序列；所述序列与后续筛选的活性较高的rbs 进行组合，构建到质粒中，进一步验证启动子和rbs组合产生蛋白的活性，确定作为转录翻译元件的启动子和rbs组合。186.二、适于原核生物无细胞蛋白合成的rbs库构建187.4)rbs序列组i筛选188.4.1从数据库中筛选目标原核生物的基因组189.从数据库中找到目标原核生物的基因组，整理所有基因的上游序列，认为组成型的核糖体结合位点 (rbs)包含其中，在这些序列中富含a/g的连续碱基的设定为假定的rbs序列(rbs区域)，标记为 rbs序列组i。190.所述数据库可以是公知的任何包含转录组数据的数据库。本发明中，采用national center forbiotechnology information(ncbi)数据库。191.在一优选实施方式中，所述目标原核生物为变铅青链霉菌tk24，从其7,439个基因中选择rbs序列，其中富含a/g的连续碱基的序列数设定最多取8。192.4.2从假定rbs序列组i中，分析出在目标原核生物所有基因上游出现频率较高的假定的rbs序列，构成假定的rbs序列，标记为rbs序列组i；193.所述“频率较高”是指在所有基因的上游序列中出现次数最多和较多。194.在一优选实施方式中，所述假定的rbs序列是从变铅青链霉菌tk24的7,439个基因上游的a/g富集区域按照出现频率进行排序得到，筛选获得的rbs序列如seq id no:39～48。195.4.3rbs序列组ii筛选196.从与目标原核生物基因组相似的野生型菌株如天蓝色链霉菌菌株中补充筛选，获得rbs序列，标记为 rbs序列组ii。197.通过与目标原核生物基因组相似的野生型菌株中补充筛选rbs序列，标记为rbs序列组ii。198.在一优选实施方式中，所述目标原核生物为变铅青链霉菌tk24，由于变铅青链霉菌tk24和天蓝色链霉菌a(3)2基因组极为相似，因此，选用野生型天蓝色链霉菌a(3)2基因组作为rbs序列补充筛选。199.分析出在野生型天蓝色链霉菌a(3)2基因组中翻译水平靠前的基因中出现频率较高的假定的rbs序列。200.所述翻译水平靠前是指翻译水平位于前60的基因，可以是翻译水平位于前20-60的基因，可以是翻译水平位于前58的基因，翻译水平位于前56的基因，翻译水平位于前53的基因，翻译水平位于前50的基因，翻译水平位于前45的基因，翻译水平位于前40的基因，翻译水平位于前35的基因，翻译水平位于前30的基因，翻译水平位于前25的基因，翻译水平位于前20的基因。在一优选实施方式中，选择翻译水平位于前53的基因，所述的翻译水平较高的前53个基因来自对野生型天蓝色链霉菌a(3)2的转录组分析数据。在一优选实施方式中，分析出在天蓝色链霉菌a(3)2中转录强度排在前53的基因上游的序列进行 a/g富集序列出现频率的分析，这部分的序列多样性很高，找到两段a/g富集序列出现频率为3次，序列见seq id no:49-50。201.5)rbs序列组iii筛选202.从文献中归纳出经体内验证过的强合成型的rbs序列，标记为rbs序列组iii。203.在一实施方式中，本发明通过从文献中归纳出4个经体内验证过的强合成型的rbs，序列分别如seq 67-70所示。204.6)构建rbs库，对其中的rbs序列进行活性检测205.6.1扩增rbs，构建rbs库206.由rbs组i～ii构建rbs库i～ii，在一实施方式中，本发明筛选出来的12个短碱基即可视为rbs库。207.根据从文献中检索到的rbs序列，将它们的序列分别设计到上下游引物上，利用引物二聚化得到目的片段，构建rbs库iii。在一优选实施方式中，从文献中检索到的rbs序列为rbs组iii，序列分别如seqid no:67-70所示，相应的引物序列分别如seq id no:194-201所示。208.所述rbs库i～iii共同构成rbs库。209.6.2对rbs序列活性进行检测210.通过将rbs序列(rbs序列组i～ii)构建到线性dna模板中，对rbs序列进行活性检测，测定的活性较高的rbs序列为适于作为质粒模板的转录翻译元件的rbs序列；在文献中检索得到的强rbs(rbs 序列组iii)被直接与最强的启动子组合构建到质粒模板上，进行活性检测。211.所述构建的方法可以采用本领域公知的任何合适方法。在一优选实施方式中，所述构建的方法主要采用pcr扩增的方法，分三部分进行构建重组，获得线性dna模板(包括转录翻译所需的元件，即启动子， rbs和终止子，启动子前加了233bp的保护碱基，用于防止线性dna降解)。212.所述方法包括：213.①在线性dna模板启动子上游233bp的位置设计正向引物以及rbs位点紧邻的上游位置(不包括rbs) 设计反向引物，通过聚合酶链式反应扩增第一段包括启动子以及保护碱基的线性dna；214.②在rbs位点前18个碱基的位置设计一段正向引物(该引物包含需要检测的rbs的序列以及与上一段反向引物具有互补碱基)，同时在t7终止子后几十个碱基的位置设置反向引物，通过聚合酶链式反应扩增第二段包括rbs，报告基因egfp和终止子的线性dna；215.③将这两段dna作为扩增模板，以启动子前的正向引物和终止子后的反向引物作为引物，利用两段dna 存在的互补碱基进行重叠pcr得到一段完整的线性dna模板，经琼脂糖凝胶电泳验证长度后，进行活性检测。216.本发明线性dna模板的构建是由两部分dna片段经过重叠pcr扩增出来的，它们分别是启动子和 rbs前的片段以及rbs、报告蛋白和终止子部分，两片段带有重叠碱基，通过重叠pcr扩增得到线性dna 模板。217.构建过程同时设立对照组：利用上述的正反向引物将原质粒(pjl1-egfp)上的t7启动子至t7终止子部分扩增出来，作为对照组。218.在一优选实施方式中，所述rbs序列如seq id no:39-50所示，构建到线性dna模板上使用的引物序列如seq id no:147～161所示。219.其中，构建前，所述线性dna模板是指一段包括转录翻译所需的元件且能够作为正常转录和翻译模板的线性dna。220.6.3获得适于原核生物无细胞蛋白合成的rbs库221.依据rbs库i～iii中各rbs的活性数据，筛选适于原核生物无细胞蛋白合成的rbs库。222.三、筛选适用于无细胞蛋白体系的质粒模板223.7)筛选适于原核生物无细胞蛋白合成的质粒224.将一3)和二6.2中所述的适于作为质粒模板的转录翻译元件的适于原核生物无细胞蛋白合成的启动子序列库中的至少一个启动子，和适于作为质粒模板的转录翻译元件的适于原核生物无细胞蛋白合成的 rbs库中的至少一个rbs，组合构建到质粒上，测定质粒的活性，依据活性筛选启动子序列和rbs序列的最佳组合，得到适于原核生物无细胞蛋白合成的质粒。225.在一优选实施方式中，所述质粒是指pjl1，载体上带有kana抗性基因。226.8)构建适用于无细胞蛋白合成的质粒模板227.将筛选获得的最佳组合的启动子序列和rbs序列构建到质粒骨架中，转化入大肠杆菌中，在固体lb 培养基平板上过夜培养，而后挑选单菌落，利用液体lb培养基活化后提取质粒，送生物公司测序验证连接产物，测序正确的质粒即为所述适于链霉菌无细胞蛋白体系的质粒模板。228.本发明还提供了一种在原核生物中构建启动子库的方法，所述方法包括如上所述的步骤1)～3)。229.本发明还提供了一种通过如上所述方法获得的启动子库，所述启动子库中包含不同表达强度的启动子。在一优选实施方式中，所述启动子库中包含如上所述的启动子序列组i～iii，还可以包含启动子序列组 iv中的序列。在一更优选实施方式中，所述启动子库中包含如seq id no:1～38、seq id no:51～60序列中的一种或多种，还可以包含seq id no:61～66中的一种或多种。230.本发明还提供了如上的启动子库在构建适于无细胞蛋白合成体系的质粒模板、无细胞蛋白合成表达体系中的应用。231.本发明还提供了一种在原核生物中构建rbs库的方法，所述方法包括如上所述的步骤4)～6)。232.本发明还提供了一种通过如上所述方法获得的rbs库，所述rbs库中包含不同表达强度的rbs。在一优选实施方式中，所述rbs库中包含如上所述的rbs组i～ii中的序列，还可以包含rbs组iii中的序列。在一更优选实施方式中，所述rbs库中包含如seq id no:39～50所示的序列中的一种或多种，还可以包含seq id no:67～70所示的序列中的一种或多种。233.本发明还提供了如上的rbs库在构建适于无细胞蛋白合成体系的质粒模板、无细胞蛋白合成表达体系中的应用。234.本发明还提供了一种适于链霉菌无细胞蛋白体系的质粒模板，所述质粒模板包括启动子库中的启动子、rbs库中的rbs中的一种或几种；所述启动子库中包含如seq id no:1～38、seq id no:51～60、seqid no:61～66中的一种或多种；所述rbs库中包含如seq id no:39～50、seq id no:67～70所示的序列中的一种或多种。在一优选实施方式中，所述质粒模板包含的启动子为sp44(序列如seq id no:66所示)， rbs序列为sr41(序列如seq id no:70所示)。235.本发明还提供了如上所述的质粒模板在构建适于链霉菌无细胞蛋白合成表达体系中的应用。236.本发明还提供了一种原核生物无细胞蛋白合成表达体系，所述原核生物无细胞蛋白合成表达体系中包含启动子库中的启动子、rbs库中的rbs、质粒模板中的一种或几种；所述启动子库中包含如seq idno:1～38、seq id no:51～60、seq id no:61～66所示的序列；所述rbs库中包含如seq id no:39～50、 seq id no:67～70所示的序列；所述质粒模板如上所述。在一优选实施方式中，本发明所述无细胞蛋白合成表达体系为链霉菌的无细胞蛋白合成表达体系。在一优选实施方式中，所述原核生物无细胞蛋白合成表达体系中所使用的模板中启动子库包括经缩短后的启动子序列。237.本发明还提供了一种用于筛选原生强rbs序列的方法，基于rbs的结构特征和位置特征，进行了rbs 的预测与筛选步骤包括：238.(1)从链霉菌tk24的基因组上，依据ncbi所提供的注释信息，提取基因组上所有已知基因的上游 200个碱基序列；239.(2)从提取的上游序列中筛选连续的、富含(连续出现a/g数大于等于4)a/g的区域，并对这些序列进行统计与排序；240.(3)选取在整个基因组中高频出现的rbs预测序列，进行测定，筛选符合要求的原生强rbs序列。241.定义目标菌株所有基因上游或者具有强转录水平的基因上游频繁出现的a/g富集区可能是强rbs序列。在一实施方式中，本发明所述的用于筛选原生强rbs序列的方法包括步骤：数据库中定位目标菌株的基因组，利用生物信息学技术筛选出所有基因上游的连续a/g富集区，并对出现的频率进行排序，所得到的前10个序列认定为可能的原生强rbs序列。除此之外，在对应的基因组数据中，对基因转录强度进行排序，对于转录水平高的基因上游的连续a/g富集区也认定为可能的原生强rbs序列。242.本发明还提供了一种用于筛选原生强rbs序列的系统，所述系统包括：243.提取模块：用于从链霉菌tk24的基因组上，依据ncbi所提供的注释信息，提取基因组上所有已知基因的上游200个碱基序列；244.筛选模块：用于从提取的上游序列中筛选连续的、富含(连续出现a/g数大于等于4)a/g的区域，并对这些序列进行统计与排序；245.测定模块：选取在整个基因组中高频出现的rbs预测序列，进行测定，筛选符合要求的原生强rbs 序列。246.本发明所称的启动子活性，指的是当该启动子作为蛋白表达模板上的元件在无细胞蛋白合成体系能够合成外源蛋白的能力(如在链霉菌依赖的无细胞蛋白合成体系中合成外源蛋白的能力)。可以用外源蛋白的浓度、产量等来表示。247.本发明所称的rbs活性，指的是当该rbs作为蛋白表达模板上的元件在无细胞蛋白合成体系能够合成外源蛋白的能力(如在链霉菌依赖的无细胞蛋白合成体系中合成外源蛋白的能力)。可以用外源蛋白的浓度、产量等来表示。248.本发明质粒模板的活性，指的是当该质粒模板在无细胞蛋白合成体系能够合成外源蛋白的能力(如在链霉菌依赖的无细胞蛋白合成体系中合成外源蛋白的能力)。可以用外源蛋白的浓度、产量等来表示。249.以下结合具体实施实例和附图，对本发明作进一步的详细说明。250.下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。251.下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。252.所用酶试剂采购自thermofisher公司和new england biolabs(neb)公司，提取质粒以及回收dna片段所用的试剂盒购自南京诺唯赞生化科技有限公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。253.本发明在具体实施中，可由以下实施例给出：254.实施例1：启动子和rbs的筛选及优化255.1.1目标菌株为变铅青链霉菌tk24菌株，因ncbi数据库中缺少该菌株的转录组数据，因此，选择分析与目标变铅青链霉菌tk24菌株基因组十分相近的野生型天蓝色链霉菌a(3)2，该菌株的转录组数据(序列号：gse111126)已存在于ncbi数据库中。下载表格后，利用排序工具对7814个基因的转录水平从高到低排列，选择前38个具有较高转录水平(图1)的基因进行后续研究。256.1.2根据38个基因的基因名称，在天蓝色链霉菌a(3)2的ncbi(序列号：al645882.2)中定位这38个基因以及这些基因的上游基因的位置，随后将这38个基因与上游基因之间的碱基序列拷贝下来，分别编号为xp1-xp38,其序列分别如seq id no:1-38所示，作为假定的强组成型启动子。257.1.3根据目标变铅青链霉菌tk24菌株，选择分析其本身的基因组，人为规定在每个基因上游的a/g富集区即为该段基因的rbs区域，在7,439个基因上游出现频率较高的rbs碱基序列认为是假定的强组成型rbs。经过分析，有10个rbs碱基序列出现频率较高，分别编号r1-r10,其序列分别如seq id no:39-48所示。258.除此之外，由于变铅青链霉菌tk24和天蓝色链霉菌a(3)2基因组极为相似将天蓝色链霉菌a(3)2基因组中转录强度排在前53的基因上游的序列进行序列出现频率的分析，发现这部分的rbs区域序列多样性很高，仅找到两段rbs区域序列出现频率为3次，编号为r11-r12，序列分别如seq id no:49-50 所示。259.1.4根据已筛选出来的可能的38个原生启动子序列，本发明利用两个常用的预测原核生物启动子的软件 bprom和bacpp度对38个启动子序列进行二次预测，目的是希望可以缩短启动子，尽量只保留核心区域，简化整个启动子库的碱基数量。将38个启动子序列输入到两个软件后，bprom自动过滤低打分值的启动子序列，最终识别出14个启动子，而在bacpp中，由于缺少自动过滤，因此人为的设定该软件仅保留至少存在一个σ因子的打分值高于50的序列，最终软件识别出12个启动子。综合起来，两软件共同识别出来的启动子有五个，分别是缩短后的xp12,16,18,22和31。260.然而，最强的启动子并没有被预测出来，因此为了进一步缩短较强的原生启动子的长度以及检测软件的可信度，挑选了三个极强的启动子xp28，4和11以及两个中等强度的启动子xp10和xp17,将这五个启动子序列输入两个软件，不论分值，最终得出缩短后的五个启动子。十个启动子缩短后的序列分别如seqid no:51-60所示。261.1.5通过检索已发表的文献，找到了6种已在链霉菌体内验证的强启动子和4种已在链霉菌体内验证的强 rbs，它们的序列分别为seq id no:61-70。262.表1263.[0264][0265]表2[0266][0267]表3[0268][0269][0270]表4[0271][0272][0273]实施例2：启动子库和rbs库的构建以及表达模板的构建[0274]2.1根据启动子序列，首先在ncbi上比对变铅青链霉菌tk24基因组上相对应的序列以及具体大小，然后设计引物从变铅青链霉菌tk24基因组中扩增启动子。对于较短的启动子，选择直接将全部序列构建到引物上，利用引物二聚得到目的启动子片段。从文献中检索得到的6个强启动子序列同样直接设计到引物中，利用引物二聚得到片段。具体的用于扩增启动子的引物如下，其中小写字母表示启动子两侧与质粒骨架的同源臂：[0275]表5[0276][0277][0278][0279]2.2分析a/g富集区出现频率的结果，得到了12个可能的原生rbs序列，为了能够快速检测rbs的活性，免除酶切、连接等复杂的操作步骤，选择采用线性dna作为模板。主要的制备过程分为三步：[0280]rbs无需扩增，本发明将rbs的序列直接构建到了引物上，通过在pcr仪中进行等温扩增rbs位点前后两段，然后利用前后两段引物扩增出dna线性模板，经过纯化即可利用到后续的反应中。[0281](1)扩增第一段dna序列：在启动子上游233bp的位置设计正向引物(seq id no:147)以及rbs位点紧邻的上游位置(不包括rbs)设计反向引物(seq id no:148)，通过聚合酶链式反应扩增第一段包括启动子以及保护碱基的线性dna。[0282](2)扩增第二段dna序列：在rbs位点上游18个碱基的位置设计一段正向引物(seq id no:149-160)[0283](该引物包含本实施例需要检测的rbs的序列以及与第一段反向引物具有互补的碱基序列)，同时在 t7终止子后方几十个碱基的位置设置反向引物(seq id no:161)，通过聚合酶链式反应扩增第二段，包括rbs，报告基因egfp和终止子的线性dna。[0284](3)在具备了转录翻译所需的位点和元件之后，以这两段dna作为扩增模板，以启动子前的正向引物和(seq id no:147)终止子后的反向引物(seq id no:161)作为引物，利用两段dna存在的互补碱基进行重叠pcr得到一段完整的线性dna模板，经琼脂糖凝胶电泳检测长度后保存在-20℃，以待后续的活性检测。[0285]为了在实验中有所对照，利用上述的正向引物(seq id no:147)、反向引物(seq id no:161)将原质粒(pjl1-egfp)上的t7启动子至t7终止子部分扩增出来作为对照组。[0286]过程中涉及的引物序列如下，其中深色的部分表示的是筛选出的12个rbs序列：[0287]表6[0288][0289][0290]2.3利用启动子预测软件bprom和bacpp对已筛选的38个启动子进行预测和缩短，通过过滤筛选得到10 个缩短后的启动子，这些缩短后的启动子片段从2.1中得到的启动子片段中扩增得到，引物序列如下，其中小写字母表示启动子两侧与质粒骨架的同源臂：[0291]表7[0292][0293]2.4根据从文献中检索到的启动子和rbs序列，将它们的序列分别设计到上下游引物上，利用引物二聚化得到目的片段。引物序列如下，其中小写字母表示启动子两侧与质粒骨架的同源臂：[0294]表8[0295][0296]2.5构建连接启动子片段的质粒骨架，从启动子序列两边分别设计25bp左右的上下游引物，利用质粒 (pjl1-egfp)作为模板，通过聚合酶链式反应扩增出质粒骨架，引物序列如下：[0297][0298]2.6构建用于连接rbs片段的质粒骨架时，利用xbai和ndei限制性内切酶消化pjl1-egfp质粒(包含筛选的启动子的质粒)；50μl的消化体系包括：5μg质粒，3μl ndei，3μl xbai，5μl fastddigestgreen buffer，余量用双蒸水补充。消化程序为：37℃孵育30分钟左右。消化完成利用1％琼脂糖凝胶电泳确定pcr产物的大小，大小比对正确后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行pcr产物切胶回收，使用无酶水洗脱质粒骨架，并检测dna浓度。[0299]2.7构建过程中涉及到的聚合酶链式反应均利用q5 dna聚合酶。[0300]10μl 5×q5 reaction buffer，1μl 10mm dntps，2.5μl 10μm上下游引物，5ng dna模板(基因组模板0.5μg-1μg)，0.5μl q5高保真dna聚合酶，余量用双蒸水补充。具体扩增程序为：98℃预变性30秒，98℃变性10秒，50-72℃退火30秒，72℃延伸20-30秒/kb，扩增过程包括35个循环，最后再72℃延伸10分钟。扩增结束使用1％琼脂糖凝胶电泳确定pcr产物的大小，大小比对正确后使用pcr产物纯化试剂盒纯化pcr产物，使用无酶水洗脱dna，随后检测dna浓度。[0301]2.8将质粒骨架与启动子和rbs通过同源重组方法连接起来。连接过程使用的是同源重组试剂盒，利用连接酶和连接缓冲液，具体连接体系为：20μl体系中包括0.03pmol质粒骨架，0.06pmol插入片段，4 μl 5×ceii buffer，2μl exnase ii，余量使用双蒸水补充，具体连接程序为：37℃反应30分钟。[0302]2.9将连接产物转化进大肠杆菌中。连接产物与大肠杆菌感受态混合，热激90秒，在液体lb培养基中培养1h后涂布于含固体lb培养基平板上，培养12-16小时，然后挑取单克隆在液体lb培养基活化，利用质粒提取试剂盒提取质粒。取适量质粒送往生物公司测序，测序正确的质粒保存在-20℃，以待后续活性检测使用。[0303]转化过程所使用的受体菌是大肠杆菌dh5α，培养基使用的分别是液体lb培养基和固体lb培养基。[0304]液体lb培养基配方是：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母抽提物，10g/l氯化钠。固体lb培养基配方是： 10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母抽提物，10g/l氯化钠，20g/l琼脂粉。[0305]实施例3：启动子和rbs活性的检测[0306]利用链霉菌的无细胞蛋白合成体系完成对基因回路中启动子和rbs转录翻译元件活性的检测。[0307]3.1将38个构建好的带有原生启动子的质粒模板加入到链霉菌的无细胞蛋白合成体系中，每15μl体系中包含3μl s30缓冲液，0.7μl 0.1m醋酸镁溶液，4μl合成混合物、200ng dna模板和5μl链霉菌细胞提取物。每组反应至少有三次平行实验。同时，本实验设置了对照组，即将原t7启动子替换成最常用的合成型启动子ermep*的质粒加入到体系中以及设置了一组不加质粒的阴性对照。tunedgeneexpressioninactinomycetes.metabeng.19,98-106.[0316]4.zhao,m.,wang,s.l.,tao,x.y.,zhao,g.l.,ren,y.h.,wang,f.q.andwei,d.z.(2019)engineeringdiverseeubacteriapromotersforrobustgeneexpressioninstreptomyceslividans.jbiotechnol.289,93-102.[0317]5.bai,c.,zhang,y.,zhao,x.,hu,y.,xiang,s.,miao,j.,lou,c.andzhang,l.(2015)exploitingaprecisedesignofuniversalsyntheticmodularregulatoryelementstounlockthemicrobialnaturalproductsinstreptomyces.procnatlacadsciusa.112,12181-6.[0318]6.n.,corte-rodríguez,m.,r.,rioseras,b.,lópez-garcía,m.t.,fernández-garcía,g.,montes-bayón,m.,manteca,a.andyagüe,p.(2019)cytosoliccopperisamajormodulatorofgermination,developmentandsecondarymetabolisminstreptomycescoelicolor.scientificreports.9,4214.[0319]以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。









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