一株甲基营养型芽孢杆菌在促生马铃薯上的应用 专利技术说明

农业,林业,园林,畜牧业,肥料饲料的机械,工具制造及其应用技术1.本发明涉及植物根际促生菌技术领域，甲基营养型芽孢杆菌在促生马铃薯上的应用。背景技术：2.马铃薯(solanum tuberosum l.)是多年生草本植物，块茎可供食用，与小麦、稻谷、玉米、高粱并称为世界五大作物。同时，马铃薯具有多种用途，可用作粮食、饲料、工业原料等，市场销路广，经济效益高，具有明显的产业优势。我国南方冬闲田较多，马铃薯可种植面积大，逐渐成为广东省常种薯种，且广东省冬春季马铃薯收获期正值北方马铃薯供应淡季，商品用马铃薯市场供不应求。在传统马铃薯生产过程中，农户大量使用化学肥料，造成土地酸化板结、土壤有益微生物减少、化肥利用率降低及土壤速效氮、磷、钾极易流失等问题，导致马铃薯营养不均衡，病害严重，产量和品质降低，严重影响了马铃薯产业的可持续发展。在农业生产中，有益的微生物能够获得特定的肥料效应，在植株生长过程中起到关键作用。为此，亟须通过现代农业技术研发高效、绿色的微生物肥料用于改善土壤性状，从而提高马铃薯的产量和品质。我国陆续推出能改善土壤问题、提高肥料利用率以及土壤肥力的绿色环保型微生物肥料，这类肥料通过有益微生物的生命活动，将土壤中难溶的磷元素和钾元素活化为可被植物吸收利用的状态，在一定程度上改善土壤理化性质的基础上，充分发挥多种营养型微生物养分互补的特性。除此之外，还能预防病害的发生。因此，研究微生物菌剂在马铃薯上的施用效果非常有必要。3.甲基营养型芽孢杆菌(bacillus methylotrophicus)是一种能利用甲醇、三乙胺和乙醇的革兰氏阳性菌。madhaiyan等于2010年从水稻根际土中首次分离和报道bmecbmb205t。随后，夏艳等从烟草青枯病田中分离出菌株h34，具有产铁载体和iaa的能力，对烟草表现出较好的促生效果，冀小草等人从江苏南通沿海滩涂的互花米草根际土壤中分离筛选出耐盐促生菌株6,其中y3菌株的耐盐及产酶活性最强，能显著促进盐胁迫下黄瓜种子的发芽率及幼苗的生长,并具有较强的产iaa和固氮的能力；黎肇家等人将甲基营养型芽孢杆菌进行发酵培养并配制成0～1000倍菌液处理黄柏幼苗,测定处理后发现甲基营养型芽孢杆菌浓度在1×106～1×108cfu/ml范围内对黄柏苗的促生效应显著。然而，甲基营养型芽孢杆菌促进马铃薯快速生长的研究尚未报道。4.已报道的研究表明，植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，pgpr) 生活在土壤或附生于植物根系，可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物。目前已鉴定出多种pgpr菌株，其中主要种类包括芽孢杆菌(bacillus)和假单胞菌属(pseudomonas)；植物根际促生菌促进植物生长的机理较多，大体上可以通过直接和间接2个方面对植物起作用。pgpr直接促进植物生长指的是某些植物根际促生菌可合成某些对植物生长发育有直接作用的物质(如生长素等)和(或)改变土壤中某些无效元素的形态，使之有效化而利于植物吸收(如固氮、解磷等)。间接作用指的是某些植物根际促生菌抑制或减轻某些植物病害对植物生长发育和产量的不良影响。王丹丹等人从连作12年的花生发病土壤中获得多株具有降解酚酸类自毒化感物质、抑制植物病原菌生长及促进植物生长的多功能花生根际促生菌，并选取bacillussp.b28初步验证对花生种子萌发及幼苗生长的影响，结果表明根际促生菌可显著缓解酚酸对花生种子发芽的抑制，并明显促进花生幼苗的生长；在此基础上，本发明采用超高效液相色谱-质谱联用(uplc-ms)方法，首次研究了甲基营养型芽孢杆菌发酵物中脂肽类抗菌化合物种类。在平板拮抗实验中研究了脂肽类抗菌化合物合成基因表达的制备方法。5.许多菌株往往在平板实验中表现出促生效应，但在盆栽与大田阶段却很难有理想效果。因此，为研究该促生菌株在植株根际土壤的促生能力，本发明在分子生物学水平，利用real-time pcr技术，定量测定了菌株在植物根际土壤中的dna拷贝数，首次研究了甲基营养型芽孢杆菌对马铃薯植株在田间的促生潜力。技术实现要素：6.针对上述问题，本发明的目的是提供一种甲基营养型芽孢杆菌的应用，该甲基营养型芽孢杆菌能在土壤中产生有效的促生效果，能有效促进马铃薯的生长。7.为此，本发明提供的技术方案是这样的：8.一株甲基营养型芽孢杆菌在促生马铃薯上的应用，所述的甲基营养型芽孢杆菌用于提高马铃薯出苗率。9.一株甲基营养型芽孢杆菌在促生马铃薯上的应用，所述的甲基营养型芽孢杆菌用于增加增加马铃薯产量。10.一株甲基营养型芽孢杆菌在促生马铃薯上的应用，所述的甲基营养型芽孢杆菌用于促进马铃薯生长。11.上述的一株甲基营养型芽孢杆菌在促生马铃薯上的应用，所述的甲基营养型芽孢杆菌为2016年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.12124的甲基营养型芽孢杆菌。12.与现有技术相比，由于甲基营养型芽孢杆菌f7具备产铁载体、产纤维素酶、产蛋白酶等多种特性，对马铃薯的生长有显著的促进效果。具体表现如下：13.(1)本发明提供提供的技术方案利用甲基营养型芽孢杆菌f7有高效的产iaa的能力，促进植物体细胞内遗传物质和蛋白质的合成,加快细胞的分裂与分化，对马铃薯有高效的促生能力，能显著提高马铃薯出苗率，有效增加马铃薯的产量。14.(2)本发明提供提供的技术方案利用甲基营养型芽孢杆菌f7能产生铁载体来给植物体提供充足的铁元素，菌株产出的蛋白酶具有显著的水解蛋白质的能力，有较强的利用蛋白质的潜力，由此来促进植物体内铁蛋白的合成，提高土壤可利用养分的供给。附图说明：15.图1是f7菌促进马铃薯生长田间效果试验照片16.图2是iaa定性实验图17.图3是f7菌革芽孢染色显微照片；18.图4是f7菌游泳swim(a)和蠕动swarm(b)的照片19.图5是f7菌产铁载体照片；20.图6是f7菌产纤维素酶照片；21.图7是f7菌为产蛋白酶照片。具体实施方式22.下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。23.实施例124.f7菌促进马铃薯生长田间效果试验25.采用f7菌制得的农用微生物浓缩制剂和空白对照进行对比实验，共分为4个处理组。26.处理一：ck1，全期不施用任何肥料+种薯切块后晾干播种；27.处理二：ck2，常规施肥+种薯切块后晾干播种；28.处理三：ck3，常规施肥+灭活农业微生物浓缩制剂拌种薯块；29.处理四，常规施肥+农业微生物浓缩制剂拌种薯块；30.其中，处理三中采用的灭活农业微生物浓缩制剂为甲基营养型芽孢杆菌活菌数 200cfu/g，其余全是硅藻土；使用量为50g/小区。31.其中，处理二，处理三，处理四中采用的常规施肥为采用复合肥为芭田马铃薯复合肥 (15-8-22)100千克/亩；有机肥(其中有机质33％,氮1.63％,磷1.54％,钾0.85％)为400 千克/亩；折算每小区常规施肥量为：有机肥施肥量为18.9公斤，复合肥施肥量为4.72 公斤。每垄中间开沟条施。32.每组4个小区(每小区面积31.2m)，每个小区三垄,加上保护行面积50m2，总面积为550m2，。马铃薯成块，重量不应低于25克，每块1+2个芽点。于种植后26天调查出苗率，118天收获，并测量每株鲜重、各区产量，如表1和图1所示。33.表1不同处理对马铃薯生物量和产量的影响[0034][0035]注：数值为平均值±标准误差(n＝4)，同列数据中相同字母者表示无显著性差异(duncan法，p＜0.05)[0036]结果表明：种薯切块后，农业微生物浓缩制剂拌种薯块，可有效促进马铃薯生长，有效提高马铃薯出苗率，有效增加马铃薯产量。农用微生物浓缩制剂可促进马铃薯生长，提高出苗率和产量。比全期不施任何肥料的空白对照亩增产58％，比同期常规施肥对照亩增产29％，比同期常规施肥+灭活基质处理亩增产23％。增产差异均达到极显著水平。[0037]为了更好实施本发明，下面给出本发明采用的f7菌分离方法和性能测试。[0038]菌株的分离、纯化[0039](1)分离[0040]配制lb固体培养基：细菌学蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，ph调为7.0～7.2。[0041]以广州市华南农业大学农场番茄种植基地的赤红壤为筛选土样，称取10g土样加入装有90ml无菌水的250ml三角瓶中(加玻璃珠)，摇床振荡30min，使细菌充分分散，静置20-30s。然后于90℃水浴10min,取上清液进行10倍递减梯度稀释，采用10-3-10-5稀释度，用移液枪吸取各梯度稀释液100μl在lb固体培养基上涂布，在37℃恒温培养箱中倒置培养24h。观察并按照菌落形态、大小等生长特征，分别挑取菌落于lb固体培养基上纯化，保存分离到的菌以备用。[0042](2)筛选[0043]将分离到的菌接种至含有l-色氨酸(100mg/l)的4ml lb液体培养基中，于30℃、180r/min摇床培养24h后，取200μl菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入200μl salkowski 比色液(50ml 35％高氯酸+1ml 0.5mol/l氯化铁)。室温、避光条件下放置30min后观察，记录颜色变红的菌株。(图2)[0044]特性鉴定[0045](1)菌体形态特性：革兰氏染色阳性，菌体形态呈杆状，产芽孢，具运动性，好氧。菌体芽孢染色照片见图3。[0046](2)菌落形态特性：将筛选的菌株接种到lb培养基上，37℃培养24h，观察菌落，在lb培养基上培养了24h后形成的菌落呈同心圆状或不规则形，表面湿润。继续观察 24h后菌落全部呈现圆形，颜色是乳白色半透明状，半径约为0.5～1mm，菌落边缘不齐，表面湿润。因f7在含0.3％琼脂的lb培养基上过夜培养后，生长扩散至整个培养皿上,在含琼脂0.7％的lb培养基过夜培养,所以f7菌具有游泳(swim)和蠕动(swam)两个性质。[0047](图4)[0048](3)生长特性：在酵母提取粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，水1000ml的液体培养基中，将培养基在转速180rpm，温度30℃，起始ph值为7.0的条件下培养18h 取出测活菌数，得出的活菌数结果为(3.83±0.60)×108cfu/ml。[0049](4)生理、生化特性：对菌株进行过氧化氢酶试验、蛋白酶试验、解淀粉酶试验、产氨试验、铁载体试验、纤维素降解试验以及产iaa试验得到其生理生化指标。实验结果见表2。[0050]表2菌株f7生理生化试验[0051][0052]注：+表示反应呈阳性或者可以生长、利用；－表示反应呈阴性或者不可以生长或利用。[0053]f7菌产铁载体实验[0054]将菌株转移并接种到到lb平板上，在培养箱培养1-2d后，使用点接种法，用灭菌枪头将菌种接在cas固体检测板上，点3个重复，置于28℃培养箱培养3d。因为嗜铁素竞争培养基中的edta螯合的铁离子会使培养基由蓝色转变为黄色，所以通过观察菌落周围有无出现黄色晕圈，可判断菌株是否能产铁载体。铁载体可作为铁和其他矿物或有机化合物中其他金属的增溶剂，以增加植物和微生物对铁的利用。实验结果显示，该菌株的周围出现明显的黄色晕圈，表明该菌株产生了铁载体。[0055]实验结果见图5。[0056]f7菌产纤维素酶实验[0057]将菌株转移并接种到羧甲基纤维素(cmc)平板上，放置于30℃培养箱中培养2d，用1/1000的刚果红溶液(1g/l)染色30min后，用1mol/l的氯化钠溶液固定30min，最后用流动水冲洗平板，通过观察菌落周围有无出现透明圈来判断菌株是否能产出纤维素酶。实验结果显示，该菌落周围出现了透明圈，表明该菌株能够生成纤维素酶。(图6)[0058]f7菌产蛋白酶实验[0059]将菌株转移并接种到蛋白酶检测培养基上，放置于30℃培养箱培养2d，通过观察菌落周围的透明圈大小来判断菌株水解蛋白质的能力，透明圈越大代表该菌株水解能力越强。实验结果得出，与对照平板相比，蛋白酶检测培养基上几乎所有的蛋白质得到了充分的利用，说明该菌株水解蛋白质的能力很强，有较强的利用蛋白质的潜力。(图7)。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!