一种副流感病毒5型作为溶瘤病毒在抗肿瘤中的应用 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本技术涉及医疗医药技术领域，尤其涉及一种副流感病毒5型作为溶瘤病毒在抗肿瘤中的应用。背景技术：2.近年来，肿瘤的发病率和死亡率均在明显上升，也是威胁人类健康的重大疾病之一。手术治疗作为传统的治疗手段之一，虽可以切除肉眼明显可见的病灶，但无法保证所有的肿瘤细胞都可以被清除干净，而残存的癌细胞则又可以引起肿瘤的复发与转移。放疗、化疗作为手术治疗有力的辅助治疗手段，对清除残留癌细胞，防止肿瘤的复发与转移大有裨益，但因其本身存在的严重的毒副作用，使其临床应用受到了很大的限制。溶瘤病毒由于其选择性地靶向癌细胞而不会对癌症病人引起严重的不良反应。因此，溶瘤病毒疗法的出现为癌症治疗提供了更多的可能。3.溶瘤病毒(oncolytic virus，ov))是一类选择性的感染并杀伤肿瘤细胞，而不损伤正常细胞的可复制病毒。溶瘤病毒疗法是一种创新的肿瘤靶向治疗策略，它利用天然的或经基因工程改造的病毒选择性的感染肿瘤细胞，并在肿瘤细胞中复制，达到靶向性溶解、杀伤肿瘤细胞的作用，但是对正常细胞没有损伤。目前为止，仅有四种基于ov的药物被批准用于癌症治疗。然而，由于受到癌症类型的限制，并非所有患者用药后都存在响应情况。4.副流感病毒5型(parainfluenza virus type 5，piv5)属于副粘病毒科、腮腺炎病毒属成员，为单股负链rna病毒，能够从多种哺乳动物及细胞培养物中分离得到。单独的piv5感染往往不会引起临床症状，致病性低，因此用作溶瘤病毒安全性较高。现阶段，由于其基因组相对稳定，易于培养和进行遗传操作等优势，piv5常作为疫苗活载体，用以防控人类和动物疫病。值得注意的是，目前piv5对肿瘤细胞的溶瘤活性尚无报道，本发明试图通过研究发现piv5治疗肿瘤的特异性，从而为抗肿瘤用药方案提供更为安全有效的解决方案。技术实现要素：5.鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种副流感病毒5型作为新型溶瘤病毒在抗肿瘤中的应用，提供能够对多种肿瘤细胞系产生直接溶瘤作用的新型溶瘤病毒，并用于脑胶质瘤及卵巢癌的治疗应用中，制备有效的抗肿瘤药物，改善脑胶质瘤及卵巢癌患者病情。6.本技术提供的一种副流感病毒5型作为溶瘤病毒在抗肿瘤中的应用，包括副流感病毒5型作为溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。7.优选的，肿瘤包括脑胶质瘤及卵巢癌。8.优选的，脑胶质瘤细胞选自u87 mg细胞系(人源胶质瘤)及c6细胞系(鼠源胶质瘤)。9.优选的，卵巢癌细胞选自a2780细胞系(人源卵巢癌)及a2780ppx细胞系(紫杉醇耐药的乳腺癌)。10.优选的，副流感病毒5型能够杀伤体内肿瘤细胞及抑制体内肿瘤的生长。11.优选的，副流感病毒5型能够减小体内肿瘤的体积或使体内肿瘤消失。12.优选的，副流感病毒5型能够改善肿瘤细胞的侵袭转移能力。13.优选的，副流感病毒5型介导的肿瘤细胞杀伤机制包括直接溶瘤机制及诱导抗肿瘤免疫细胞反应机制。14.优选的，药物是以副流感病毒5型为活性成分，单独或与其他药物组方，加入药学上可接受的辅料、辅助性成分或载体制备成药学上可接受的剂型。15.优选的，药物的剂型为口服制剂、黏膜给药制剂及注射剂。16.优选的，药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体。17.相对于现有技术而言，本技术的有益效果是：18.(1)本发明通过研究和筛选，首次发现piv5作为溶瘤病毒对人源和鼠源脑胶质瘤细胞系(u87 mg和c6)以及卵巢癌和耐药卵巢癌细胞系(a2780和a2780ppx)均可产生不同程度的溶瘤效果，发现piv5作为溶瘤病毒在抗肿瘤应用中效果卓越；19.(2)本发明首次通过建立细胞病变效应(cpe)实验、mts细胞活力分析实验、细胞划痕实验、体内抗肿瘤效果实验及免疫组化实验来考察piv5作为溶瘤病毒在抗肿瘤中的应用及效果，并得出有效结论，拓宽了抗肿瘤治疗中溶瘤病毒的应用领域，为piv5作为溶瘤病毒进行抗肿瘤治疗提供了实验依据，具有良好的应用前景。20.应当理解，本发明中的药学上可接受的辅料、辅助性成分或载体是指与活性成分一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应、并发症或其它问题，并且具有合理的益处/风险比。21.应当理解，本发明中，所用术语“治疗”，包括缓和、抑制或改善疾病的症状或状况；抑制并发症的产生，改善或预防潜在代谢综合征；抑制疾病或症状的产生，如控制疾病或情况的发展；减轻疾病或症状；使疾病或症状减退；减轻由疾病或症状引起的并发症，或预防或治疗由疾病或症状引起的征兆。如本文所用，给药后，可以使某一疾病、症状或情况得到改善，尤指其严重度得到改善，延迟发病，减缓病情进展，或减少病情持续时间。22.应当理解，发明内容部分中所描述的内容并非旨在限定本技术的实施例的关键或重要特征，亦非用于限制本技术的范围。本技术的其它特征将通过以下的描述变得容易理解。附图说明23.通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：24.图1为本发明实施例的piv5溶瘤谱实验中多种细胞的细胞形态学的变化图；25.图2为本发明实施例的mts细胞活力分析实验中多种细胞在不同浓度piv5感染下的细胞存活率图；26.图3为本发明实施例的细胞划痕实验中肿瘤细胞在不同浓度piv5作用下的生长曲线图，其中，a图和c图：u87 mg和c6细胞在不同浓度piv5感染后的伤口愈合图像；b图和d图：u87 mg和c6细胞在不同浓度piv5感染后伤口愈合面积的百分比，***p《0.05。27.图4为本发明实施例中piv5对体内肿瘤的影响效果图，其中，a图：不同剂量piv5治疗组小鼠的肿瘤生长曲线图；b图：不同组荷瘤小鼠的肿瘤生长情况；c图：对照组及高剂量piv5治疗组小鼠的代表图。28.图5为本发明实施例的免疫组化实验中piv5对免疫细胞的诱导效果图。具体实施方式29.下面结合附图和实施例对本技术作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关申请，而非对该申请的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与申请相关的部分。30.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本技术。31.实施例一：32.1.细胞病变效应(cpe)实验33.将ma细胞、huvec细胞、u87 mg、c6、a2780、a2780ppx细胞分别接种于6孔培养板中，培养24h后，分别接种piv5病毒，之后观察72h内肿瘤细胞的病变情况，并在病毒感染24h及72h时，分别用倒置相差显微镜采集肿瘤细胞图片并记录piv5导致的细胞病变效应。34.2.实验结果及结论35.通过对上述两种正常细胞和四种肿瘤细胞进行溶瘤谱实验，观察cpe细胞病变现象，并在24h和72h分别进行拍照记录。实验结果显示，ma细胞和huvec细胞这两种正常细胞未产生明显的病变。然而，a2780、a2780ppx、u87 mg和c6细胞系在piv5作为溶瘤病毒的影响下均能够产生明显的病变现象，相比较对照组，肿瘤细胞在接种piv5后细胞数量减少、出现细胞溶解、裂解碎片(图1)，证明了piv5对脑胶质瘤细胞和卵巢癌细胞均具有显著的杀伤能力。并且，经过对比发现piv5对u87 mg和c6细胞的杀伤能力最强。36.实施例二：37.1.mts细胞活力分析实验38.将ma细胞、huvec细胞、u87 mg、c6、a2780和a2780ppx细胞分别接种于96孔板中并培养24小时后，使piv5分别以不同浓度的moi值感染正常细胞和肿瘤细胞，每个实验组设置3个复孔。在接种72小时后进行mts检测。39.2.实验结果及结论40.通过mts法比较，在感染不同浓度的piv5后，ma细胞和huvec细胞这两种正常细胞未见明显的杀伤作用。然而，在感染不同浓度的piv5后，piv5对u87 mg、c6、a2780和a2780ppx细胞均具有体外杀伤效果。实验结果显示，随着piv5感染数量的增加，肿瘤细胞的活力呈现明显的逐渐降低的趋势，并具有一定的剂量依赖性(图2)，证明了piv5能够降低脑胶质瘤细胞和卵巢癌细胞的活性，具有显著的肿瘤细胞体外杀伤能力。41.实施例三：42.1.细胞划痕实验43.将u87 mg和c6细胞分别接种于6孔培养板中，培养24h后，用200μl无菌枪头在细胞平面上划伤，之后用无菌pbs清洗细胞3次以清除碎屑。以指定的感染倍数将细胞暴露于piv5，感染后在不同时间点在光学显微镜下拍摄伤口愈合过程的图像。44.2.实验结果及结论45.通过划痕实验考察肿瘤细胞的侵袭转移能力。实验结果显示，与对照组相比，piv5感染明显减弱了u87 mg和c6细胞向划痕区域的迁移能力，并具有一定的剂量依赖性(图3)，证明了piv5能够降低或减弱肿瘤细胞的侵袭转移能力。46.实施例四：47.1.体内抗肿瘤效果实验48.通过对c6细胞系建立小鼠皮下瘤模型，根据小鼠的体重及肿瘤大小进行随机分组，共分为4组：对照组以及高、中、低三个不同给药剂量的piv5治疗组，以肿瘤体积变化和肿瘤组织he染色为指标评价piv5的体内抗肿瘤效果。49.2.实验结果及结论50.图4a、图4b和图4c的体内抗肿瘤效果结果显示，与对照组相比，piv5作为溶瘤病毒对肿瘤细胞的体内生长具有良好的抑制作用；实验结果显示，随着溶瘤病毒piv5感染系数的增加，抗肿瘤效果逐渐增强，并具有一定的剂量依赖性。图4d为肿瘤组织的he染色图，he染色结果表明，与对照组相比，piv5感染下的肿瘤组织肿瘤细胞明显减少，有明显的坏死灶，证明了piv5能够减小肿瘤的体积及使肿瘤消失。51.实施例五：52.1.免疫组化实验53.首先将石蜡切片脱蜡，然后进行抗原修复；再进行阻断内源性过氧化物酶后，采用血清封闭；再加一抗后，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜；然后加二抗：玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(hrp标记)覆盖组织，室温孵育50min；dab显色：玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色；采用苏木素复染细胞核；最后脱水封片；然后将其置于白光显微镜下进行结果判读。54.2.实验结果及结论55.通过免疫组化染色研究考察piv5在抗脑胶质瘤中的可能机理。实验结果显示，与给药组相比，对照组免疫相关细胞(cd3+和cd8+细胞)很少，这一发现与免疫沉默或“冷”肿瘤相一致，piv5治疗后显示cd3+和cd8+细胞的快速浸润(图5)，这表明免疫相关细胞对piv5有免疫反应，并向免疫“热”肿瘤转移，证明了piv5能够诱导抗肿瘤免疫细胞反应。56.本发明通过建立细胞病变效应(cpe)实验、mts细胞活力分析实验、细胞划痕实验、体内抗肿瘤效果实验及免疫组化实验来考察piv5作为溶瘤病毒在抗肿瘤中的应用及效果，并得出结论，副流感病毒5型对卵巢癌和神经胶质瘤具有明显的溶瘤效果，尤其对胶质瘤细胞溶瘤效果更为显著。因此，副流感病毒5型具有作为溶瘤病毒的潜力，有希望为抗肿瘤用药方案提供更为安全有效的解决方案。57.在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本技术的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。58.以上仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。









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