一种近视眼动物模型的构建方法及其应用 专利技术说明

农业,林业,园林,畜牧业,肥料饲料的机械,工具制造及其应用技术96 hpf在暴露液中加入待检测药物。15.本发明的有益效果如下：本发明发现化学品n-(1,3-二甲基丁基)-n'-苯基对苯二胺（6ppd）在胚胎发育期急性暴露可引起斑马鱼幼体期眼球凸出和融合血管的近视样表型，这一模型可以为近视的研究提供模型支持。附图说明16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。17.图1为6ppd介导的斑马鱼轴性近视模型示意图。18.图2为野生型胚胎暴露于0、0.025、0.1、0.2、0.4、0.8和1.2 mg/l的6ppd后的畸形表型，以及120 hpf的累积畸形率和死亡率。a.在120 hpf时畸形率和死亡率n = 3 * 20。b.对照组和6ppd处理的幼鱼在120 hpf下的代表性俯视图和侧面图。e,眼睛;lp，色素较少;pe，心包水肿;uy，未吸收蛋黄;usb，未充气的鱼鳔;ja，颌骨畸形;bt，弯曲的躯干。*p《0.05， **p《0.001与对照组比较。19.图3为在120 hpf下，对对照组和6ppd处理的幼鱼进行俯视图拍照和眼睛尺寸的测量与分析的结果。a.对照组和6ppd处理的幼虫的代表性俯视图。b.眼尺寸参数的量化，包括眼径、眼轴长、巩膜膜直径、眼轴长/眼径、巩膜膜直径/眼径的比值。n = 18-23。d,直径;al，轴长;scd，巩膜膜直径。*p《0.05， **p《0.001与对照组比较。c.对照组和6ppd处理后幼虫眼睛的代表性俯视图和侧面图。星号指向眼球，三角形指向眼睛里的血管。d. atr治疗显著减少0.4和0.8mg/l 6ppd暴露引起的近视眼发生率。*p《0.05，与对照组比较。20.图4为6ppd暴露对整个幼鱼转录基因的表达影响。ab野生型胚胎在8 ~ 120 hpf范围内暴露于对照或0.4 mg/l 6ppd中。在120 hpf下，用暴露的幼鱼进行全转录mrna-seq，比较6ppd和对照组的差异表达基因。a.每组4个重复进行pca分析（主成分分析）。b. 6ppd与对照组差异表达基因的热图。21.图5为在6ppd处理下，前20个基因、go_enrichment和kegg_pathway的变化。ab野生型胚胎在8 ~ 120 hpf范围内暴露于对照或0.4 mg/l 6ppd中。在120 hpf下，用暴露的幼鱼进行全转录mrna-seq，比较6ppd的差异表达基因。a.6ppd调控前20个基因的火山图。b.6ppd引起的前20名go_富集6。c. 6ppd的kegg富集散点图。具体实施方式22.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。23.如图1所示，本发明提供了一种近视眼动物模型的构建方法，通过化学品n-(1,3-二甲基丁基)-n'-苯基对苯二胺（6ppd）在胚胎发育期急性暴露可引起斑马鱼幼体期眼球凸出和融合血管的近视样表型，进一步采用阿托品atr干预。发现阿托品atr可以缓解6ppd暴露的轴性近视率。以下为本发明的一些具体实施例。24.在以下实施例中，所采用的实验材料与仪器具体如下：试剂： n-(1,3-二甲基丁基)-n'-苯基对苯二胺（6ppd，(cas: 793-24-8, purity:》98.0%，tanmo quality control technology co., ltd ），二甲基亚砜（dmso，sigma公司）阿托品（atr，cas: 51-55-8, purity:》98.0%，sigma）。25.仪器：斑马鱼培育箱，孵化器，rxz智能型人工气候箱（宁波江南仪器厂），体视显微镜（nikon smz1500，上海千欣仪器有限公司），12孔板，培养皿，6孔板。26.实施例1：（1）以野生型ab品系和fli：egfp血管转基因1.斑马鱼为实验对象。饲养水温26±1℃，ph值为6.5~7.5，饲养水体中加入海盐，电导率保持在450-1000us/cm范围内，光照周期为14l: 10d。实验前一晚，将正常发育的雌鱼和雄鱼按照1:1的比例配对，关灯前放入孵化器，第二天清晨开灯后，雌雄鱼自发进行交配，得到实验所需胚胎。27.（2）将6ppd溶解于100%二甲基亚砜(dmso)中制备原液(0.025 ~1.2 mg/ml)，ꢀ‑20°c保存。28.（3）在实验使用前立即稀释原液制备工作溶液。通过对每一步使用相同的稀释因子（胚胎培养基）进行dmso的连续稀释，以产生最终dmso浓度为0.1%的稀释。对照组也给予0.1%的dmso(胚胎培养基中v/v)。实验采用12孔板，每孔20个胚胎，每孔3 ml暴露液。曝光板用锡纸覆盖以消除光解。29.（4）在120 hpf（hpf，生物学专用术语，指受精后的时间，120hpf embryo 指受精后120小时的胚胎。）拍照记录畸形表型，以及120hpf的累积畸形率和死亡率。每个重复20个胚胎，每组3个生物三复制。在120hpf，拍照幼鱼的俯视图，并测量眼睛的直径（d），眼轴长度（al），巩膜直径（scd），同时计算获得al/d，scd/d。同时利用fli：egfp转基因品系观察120hpf幼鱼的眼睛部位的侧面图和俯视图，以观察眼睛中的血管分布。30.（5）利用对照组和6ppd处理组的斑马鱼幼鱼，并进行全鱼转录组测序分析。采用trizol试剂(thermofisher，目录# 15596018)按照制造商的程序提取总rna，从120个hpf幼鱼(20个幼鱼合并为一个重复×4个重复)中提取总rna。使用bioanalyzer 2100和rna 6000 nano labchip kit (agilent, ca, usa，目录#5067-1511)分析总rna数量和纯度。根据制造商说明书(中国杭州lc-bio科技有限公司)，使用illumina novaseq™6000平台对rin为》7.0的高质量rna样本进行mrna表达测序。在移除序列适配器测序仪后，使用tophat2将获得的mrna-seq与斑马鱼基因组(danrer10)进行比对。斑马鱼的基因注释来源于ensembl。计数每个基因的reads后，用主成分分析(pca)分析样本变异。以q《0.05、绝对折叠变化≥2的deseq2作为显著性截断，称为差异表达基因。对差异表达基因进行基因本体(go)功能富集分析和途径富集分析(kegg)途径富集分析。31.（6）prism 6.0进行数据分析和绘图。采用单因素方差分析(anova)和tukey多重比较检验来比较不同处理组的差异，数据满足参数检验的假设。在mrna-seq分析和atr处理分析，采用t检验分析差异表达基因。所有数据均以均数±标准误差(sem)报告。32.如图2所示，在0.025 ~ 1.2 mg/l浓度范围暴露下，6ppd依剂量增加显著增加120 hpf的畸形率(≥0.025 mg/l具有显著性差异)，但不引起明显的死亡率增加（图2a）。6ppd在120 hpf主要导致的畸形包括眼凸、卵黄囊未吸收、游囊畸形，身体弯曲，下颚畸形，心包囊水肿等（图2b）。可见，6ppd暴露影响胚胎发育，特异性诱导幼鱼轴性近视毒性表型。33.如图3所示，在120 hpf下，对对照组和6ppd处理的幼鱼进行俯视图拍照和眼睛尺寸的测量与分析。测量或计算眼直径、眼轴长、巩膜膜直径及眼轴长/眼直径、巩膜膜直径/眼直径的比值（图3a）。与对照组相比，暴露于0.1 mg/l、0.4 mg/l和0.025 mg/l 6ppd时，眼直径、眼轴长和巩膜直径显著减小。然而，从0.4 mg/l组开始，眼轴长/眼直径和巩膜膜直径/眼直径的比值显著增加（图3b）。我们在120 hpf下使用fli:egfp转基因胚胎进一步研究了6ppd诱导的近视眼内的血管模式。随着6ppd浓度的增加，从俯视图观察到明显的眼球突出。我们观察到，侧面图上，暴露在6ppd下的眼内诱发了融合血管模式（图3c）。眼轴长度延长是近视的一个特征。可见，暴露于6ppd可导致近视样表型，损害眼血管，野生型或fli: egfp胚胎暴露于0、0.025、0.1、0.2、0.4、0.8和1.2 mg/l的6ppd (8 ~ 120 hpf)中，幼鱼眼内以浓度依赖方式形成近视样、凸眼球和融合血管。34.在120 hpf下，利用rna-seq分析发现，我们使用mrna-seq来定义6ppd诱导的发育基因表达的影响。ab野生型胚胎在8 ~ 120 hpf范围内暴露于对照或0.4 mg/l 6ppd中。在120 hpf下，用暴露的幼鱼进行全转录mrna-seq，比较6ppd和对照组的差异表达基因。如图4所示，pca分析证实，每组4个重复均在限制性范围内(图4a)。热图显示，与对照组相比，暴露于6ppd的基因明显受到干扰(图4b)。6ppd处理的幼鱼中有240个基因表达异常(50个基因上调，190个基因下调)(图4b)。35.在6ppd处理下，前20个基因、go_enrichment和kegg_pathway发生变化。ab野生型胚胎在8 ~ 120 hpf范围内暴露于对照或0.4 mg/l 6ppd中。在120 hpf下，用暴露的幼鱼进行全转录mrna-seq，比较6ppd的差异表达基因。如图5所示，从前20个调控基因列表中，我们看到6ppd激活了参与视黄醇代谢的cyp26a(图5a)。视黄醇代谢下游通路基因类视黄醇异构水解酶rpe65a (rpe65a)、视黄醇结合蛋白1b (rlbp1b)和视黄醇脱氢酶5(rdh5)、光异构酶视网膜g蛋白偶联受体a (rgra)、视网膜g蛋白偶联受体b(rgrb)均下调(图5a)。光信号转导相关基因g蛋白偶联受体激酶7a (grk7a)和视蛋白1短波敏感1 (opn1sw1)也因在6ppd的暴露下而被下调(图a)。暴露于6ppd后富集最多的go项包括光信号转导、光感受器外段、视觉感知和光感受器活性(图5b)。此外，暴露于6ppd后kegg富集的最显著变化包括视黄醇代谢、光信号转导和代谢途径(图5c)。36.综上所述，6ppd重现了类似近视的表型。具体来说，6ppd显著减小了眼睛的整体尺寸，这与之前的研究一致。我们还发现，与对照组相比，暴露于6ppd会导致眼轴长/眼直径和巩膜膜直径/眼直径的比率发生变化，显示出突出的眼球凸和巩膜膜增大。此外，利用fli: egfp转基因胚胎，我们发现眼内融合血管模式伴有6ppd诱导的近视。6ppd诱导的视网膜血管生长可能会对眼睛功能造成更高的压力，因为早前的一份报告显示，视网膜血管生成异常是晚期糖尿病眼病的一个标志。这些观察结果表明，6ppd对眼睛的发育有严重影响。近视可引起视网膜和脉络膜萎缩、脉络膜下新生血管、视网膜脱离等严重并发症，导致视力损害甚至失明。我们首次报道了在脊椎动物发育过程中暴露于低mg/ml浓度的6ppd对斑马鱼造成近视风险。37.差异基因表达和通路分析表明，暴露于6ppd可导致视黄醇代谢、光信号传导、视觉和光感受器的潜在功能障碍，这与其在眼睛中的表型，特别是近视样表型一致。目前遗传和药理学研究表明，视黄酸(ra)、乙酰胆碱、视网膜多巴胺、巩膜转化生长因子-β2 (tgf-β2)、受体介导信号和腺苷a2a受体等分子参与了近视的形成。另一项研究表明，外部视觉刺激可能通过调节脉络膜血流量，导致巩膜微环境缺氧而导致近视。我们目前的mrna-seq表明，6ppd主要影响视黄酸代谢通路和光转导通路。在前20位调控基因中，6ppd显著增加cyp26a1，参与ra代谢。作为细胞色素p450酶的产物，cyp26氧化酶与视网膜脱氢酶raldhs (aldh1a2基因产物)协同维持ra在体内的平衡。此外，另外三个参与视黄酸代谢的基因均因接触6ppd而显著降低，包括rpe65a(rpe65是视网膜色素上皮细胞（rpe）的一种主要蛋白质，对视紫红质的再生非常重要)、rlbp1b(视网膜müller胶质细胞中大量表达的视黄酸结合蛋白)和rdh5(视网膜色素上皮细胞中大量表达的脱氢酶)。基于这些异常的基因表达，我们得出结论，6ppd暴露影响ra代谢。38.对于6ppd暴露引起的光信号转导功能障碍，我们有些惊讶地发现g蛋白偶联受体激酶(grk7a)是mrna-seq分析中下调最多的基因。先前的研究表明，grk7a在视网膜视锥细胞中广泛表达，并参与视蛋白磷酸化。另一项研究发现，在斑马鱼幼鱼视网膜中敲低g蛋白偶联受体激酶grk7会损害视锥光反应的恢复并延迟暗适应。总的来说，视锥细胞特异性激酶的功能对视网膜上的视锥视觉至关重要，而6ppd暴露可能会损害幼鱼眼睛的这一功能。39.实施例2：本实施例与实施例1步骤大致相同，主要区别在于：步骤（3）中，在受精后48-96 h (hpf)暴露液中加入0.5% atr（阿托品）。依据文献资料，近视可由atr治疗得以缓解，我们在48-96hpf，添加0.5%atr，通过在120hpf 6ppd单独暴露和添加atr的治疗组的近视发生比例的比较分析，确定atr近视治疗效果。如图3（d）所示，我们的结果显示，在48-96 hpf期间，atr治疗显著降低了0.4和0.8 mg/l 6ppd组的近视表型。由本实施例可以确定，0.5%阿托品可显著挽救6ppd暴露的近视表型胚胎。同时，可以应用本方法筛选或鉴定出其它能够预防、缓解或者治疗近视眼的药物。40.以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。









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