目标蛋白的改造和蛋白质结构解析的通用方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于蛋白质结构解析领域，涉及目标蛋白的改造方法以及结构解析通用方法。具体来说，本发明提供目标蛋白-p1-p2或目标蛋白-p1-p3的改造方法、p1的结合蛋白ap1、胶水分子以及蛋白质结构解析通用方法。背景技术：2.gpcr参与的生理功能几乎涉及生命活动的各个方面，包括听觉、嗅觉、味觉、神经传递以及免疫调控等等。正因为在众多生理过程中发挥作用，gpcr成为极其重要的药物靶点。在美国fda批准的上市药物中，约34％的药物作用对象是gpcr。目前的药物筛选手段以靶标蛋白的三维结构为基础，结合计算机模拟进行化合物的筛选及设计，因此靶标蛋白的三维立体结构至关重要。3.(1)x射线晶体衍射技术4.在2007年，science杂志的“high-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic g protein-coupled receptor”文章中，brian kobilka课题组用t4溶菌酶取代g蛋白偶联受体(gpcr)中位于第五段跨膜螺旋(tm5)和第六段跨膜螺旋(tm6)之间的第三个细胞内环(icl3)后，运用x射线晶体学方法，首次获得分辨率为的g蛋白偶联受体晶体结构。这种方法通过引入外源融合蛋白，增加了极性表面积，从而促进了晶体生长。结合脂立方相方法(lipid cubic phase)使得超过400多个gpcr的结构被解析。尽管后来引入了更多不同的融合蛋白，晶体生长的时间和条件不确定性导致gpcr结晶仍旧十分困难，此外，结晶需要大量的蛋白样品，而gpcr通常表达量低，且状态不稳定，这种方法极大的提高了实验成本。因此，运用x射线晶体衍射技术获得g蛋白偶联受体结构的方法成本高昂，结果不可预测，依旧充满挑战。5.(2)冷冻电镜技术6.2013年，程亦凡课题组首次报道利用低温冷冻电镜技术解析了膜蛋白瞬时受体亚型1(trpv1)分辨率为的冷冻电镜结构。随后，在2017年，brian kobilka课题组利用冷冻电镜技术首次解析了胰高血糖素样肽1结合受体(glp-1r)在激活状态下与其下游g蛋白复合物的冷冻电镜结构，这一成果发表在nature杂志上。随着研究的深入，越来越多的激活状态下的g蛋白偶联受体与下游g蛋白复合物的结构被测定。因为当gpcr同g蛋白形成复合物后，其稳定性、分子量都达到冷冻电镜结构解析要求。但该方法有一个先决条件即所用的配基必须能高效地激活相应的受体从而形成gpcr-g蛋白复合物。7.对于无法高效激活gpcr的配基，比如部分激动剂、拮抗剂、反向激动剂、别构调节剂等诱导受体处于不同活化状态的调控分子都无法使用该方法进行结构解析。除此之外，对于那些尚未有高效激动剂的gpcr，同样无法使用该方法进行结构解析。实际上，对于800多个gpcr，只有一部分受体有高效激动剂。因此，目前流行的使用冷冻电镜进行gpcr-g蛋白复合物结构解析并不能系统性地解释gpcr的激活机制。而要完整的揭示gpcr的作用机理，往往还需要不同状态的结构。因此，无论是从回答gpcr激活机制的基础研究角度出发，还是从帮助药物设计的应用研究角度看，开发基于冷冻电镜技术而不依赖于激动剂的gpcr-g蛋白复合物的单体gpcr结构解析方法都非常必要。8.gpcr由7次跨膜螺旋tm1-7和第8段螺旋h8构成，螺旋由3个胞内环和3个胞外环组成。其跨膜部分将细胞外信号传递到细胞内，因此，gpcr本质上柔性较高，体外纯化相对不易。另外，gpcr的配体结合部位在不同的受体家族中具有很大的多样性，因此关于gpcr的结构解析一直都具有挑战性。但是，基于gpcr整体构象的相似性，通用的结构解析方法成为可能。技术实现要素：9.发明要解决的问题10.虽然目前gpcr相关的结构及其药理研究取得了很大的进展，但是，现有的技术手段并不能根本地解决领域内存在的问题，这一点在缺乏高效激动剂或拮抗剂的gpcr上尤为明显。即使目前有文献报导关于gpcr结构解析的方法，但都不具有通用性。2022年，程亦凡课题组于nature communications发表了“fusion protein strategies for cryo-em study of gprotein-coupled receptors“，文献中介绍了通过对a2ar腺苷受体的icl3融合bril，结合bril的抗体获得了中等分辨率的冷冻电镜结构，但这种方法只适用于个例gpcr家族a中的成员，很难适用于gpcr其他家族以及其他活化状态，因此其方法很难说通用性高。11.表1提供了当前(2022年)不同家族类型的gpcr已解结构分布图。其中统计数据来自https://gpcrdb.org/structure/statistics[0012][0013]本发明针对上述实际情况，通过将目标蛋白质进行最小范围的改造，开发一种适用范围更广、更加通用的结构解析方法，使得目前为止不能进行结构解析或者难以进行结构解析的目标蛋白能够有效地进行的结构解析。[0014]解决问题的方法[0015]本发明在开发结构解析通用方法的同时，提供了目标蛋白的改造方法。同时还提供了bril蛋白的改造方法、抗bril抗体或其抗原结合片段以及稳定整体结构的胶水分子。从而使目标蛋白在无配体或各种类型配体的刺激下，体外获得稳定的蛋白复合物，用于后续的研究。[0016]具体来说，本发明提供以下技术方案：[0017]一方面，本发明提供对bril蛋白进行改造的方法，其特征在于：所述方法包括将所述bril蛋白的第二段螺旋c段和第三段螺旋n端之间的部分区域氨基酸删除，用无明显二级结构的柔性氨基酸肽段代替。[0018]在一些实施方案中，柔性氨基酸肽段一般选用丝氨酸(s)、甘氨酸(g)和丙氨酸(a)随机串联组成，具体氨基酸序列排布不固定，长度可以根据具体设计方案做调整。例如，所述柔性氨基酸肽段选自gs、ggs、sgg、gggs、sggg、ggggs、sgggg、gggggs、sggggg、ggggggs、sgggggg和sgsg。[0019]在一些实施方案中，删除位点为所述bril蛋白的n端起第44位苏氨酸到第54位天冬氨酸之间的氨基酸。[0020]在一些实施方案中，所述无明显二级结构的柔性氨基酸肽段为sgsg。[0021]在一些实施方案中，所述bril蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。[0022]在一些实施方案中，改造的bril蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。[0023]另一方面，本发明提供改造的bril蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no:2所示。[0024]另一方面，本发明提供抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段既结合野生型bril蛋白又结合根据上述的方法获得的改造的bril蛋白或上述改造的bril蛋白，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括：[0025]hcdr1，其包含seq id no：6所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，[0026]hcdr2，其包含seq id no：7所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和[0027]hcdr3，其包含seq id no：8所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％，92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，[0028]并且所述抗体还包含：[0029]lcdr1，其包含seq id no：10所示的氨基酸，或与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，[0030]lcdr2，其包含seq id no：11所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和[0031]lcdr3，其包含seq id no：12所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。[0032]在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包括：[0033]重链，其包含seq id no：5所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，[0034]轻链，其包含seq id no：9所示的序列，与所述序列具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。[0035]另一方面，本发明提供目标蛋白的改造方法，其特征在于：1)将目标蛋白一处的柔性氨基酸删除，融合可溶蛋白p1；2)将目标蛋白一端的柔性氨基酸删除，融合可溶蛋白或短肽p2或多个可溶蛋白或短肽p3。即目标蛋白被改造成目标蛋白-p1-p2或目标蛋白-p1-p3。[0036]在一些实施方案中，p1可为天然存在或模拟设计合成。[0037]在一些实施方案中，p2或p3融合在目标蛋白的一端，可以为目标蛋白的n端或c端。[0038]在一些实施方案中，p2为可溶蛋白或短肽，可为任意结构，可为天然存在也可模拟设计合成。p3为任意数目的可溶蛋白或短肽串联，其串联形式可由连接序列实现，即p31-连接序列-p32-连接序列-p33-连接序列-p34......。p3可为任意结构，可为天然存在也可模拟设计合成。用于目标蛋白改造的连接序列，其序列、长度以及二级结构不固定，可以是无明显二级结构的柔性肽段、螺旋结构肽段或β-折叠结构肽段，因此可以根据目标蛋白的设计自行选择。[0039]在一些实施方案中，所述目标蛋白为膜表达蛋白，优选具有两段相邻螺旋束结构的蛋白质，优选选自g蛋白偶联受体、离子通道和转运子。[0040]在一些实施方案中，所述目标蛋白为g蛋白偶联受体。[0041]在一些实施方案中，将g蛋白偶联受体的tm5和tm6间柔性序列删除，融合可溶蛋白p1，所述p1为上述的方法获得的改造的bril蛋白或上述改造的bril蛋白。[0042]在一些实施方案中，p2或p3融合在gpcr的c端h8后面。[0043]在一些实施方案中，所述p2为一个螺旋结构的短肽，所述p3为两个串联的螺旋结构的短肽，所述两个串联的螺旋结构的短肽通过连接序列连接。[0044]在一些实施方案中，所述p2为螺旋结构短肽alfa，氨基酸序列如seq id no:3所示；p3为两个串联的螺旋结构短肽k3-alfa，其氨基酸序列如seq id no:4所示。[0045]在一些实施方案中，目标蛋白改造后的模式组成是：gpcr-mbril-alfa。[0046]在一些实施方案中，目标蛋白改造后的模式组成是：gpcr-mbril-k3-alfa。[0047]一方面，本发明提供了p1的相互作用蛋白ap1。[0048]在一些实施方案中，ap1是可以与p1蛋白、融合p1的蛋白相互作用的蛋白。[0049]在一些实施方案中，ap1是可以与bril(mbril)相互作用的抗体或其抗原结合片段，命名为1b3 fab，如seq id no:13所示。[0050]另一方面，本发明提供了能与ap1与p2或p3同时相互作用的双特异性结合的胶水分子。[0051]在一些实施方案中，胶水分子可为任意结构蛋白，可为天然存在、模拟设计合成、已知三维结构或未知三维结构的单体融合蛋白、短肽或两个(或以上)蛋白组成的蛋白分子对。[0052]在一些实施方案中，胶水分子可为单体融合蛋白，本发明中的单体融合胶水分子由识别ap1与p2或p3的蛋白通过连接序列串联组成。识别ap1的蛋白，命名为aap1，识别p2的蛋白或短肽，命名为ap2，识别p3的蛋白或短肽，命名为ap3，p3由于是多个可溶蛋白或短肽串联组成，即p31-连接序列-p32-连接序列-p33-连接序列-p34......，因此，ap3也为多个可溶蛋白或短肽串联组成，即ap31-连接序列-ap32-连接序列-ap33-连接序列-ap34......。本发明中，目标蛋白的结构解析可以通过目标蛋白-p1-p2、ap1、ap2-连接序列-aap1三组分组装完成；或目标蛋白-p1-p31-p32、ap1、ap31-连接序列-aap1-连接序列-ap32三组分组装完成；或目标蛋白-p1-p31-p32、ap1、ap31-ap32-连接序列-aap1三组分组装完成。在一些实施方案中，目标蛋白改造为gpcr-mbril-h8-k3-alfa，ap1为识别mbril的1b3 fab，胶水分子为识别k3的e3螺旋-连接序列l6-识别1b3fab的纳米抗体-连接序列l7-识别alfa螺旋的纳米抗体。胶水分子处的连接序列均由无明显二级结构的柔性氨基酸串联组成，柔性氨基酸一般选用丝氨酸(s)、甘氨酸(g)和丙氨酸(a)等，具体氨基酸序列排布不固定，长度可以根据具体设计方案做调整。[0053]在一些实施方案中，胶水分子可为两个蛋白组成的蛋白对a+b组成。a为识别p2或p3的蛋白或短肽，命名为ap2或ap3。b为识别ap1的蛋白或短肽，命名为aap1。其中a+b即ap2或ap3+aap1，a与b的相互作用则由ap2与aap1直接相互作用提供；a也可以为融合其他蛋白或肽段的ap2或ap3即ap2或ap3-连接序列-m，其中m可以是蛋白或肽段。b也可以为融合其他蛋白或肽段的aap1即aap1-连接序列-n，其中n则是可以与m直接相互作用的蛋白或肽段，此种模式中a与b的相互作用不由ap2或ap3与aap1提供，而是由m与n提供。在一些实施方案中，目标蛋白改造为gpcr-mbril-h8-alfa，ap1为识别mbril的1b3 fab，胶水分子为a+b模式。a：alfa的纳米抗体-连接序列l8-k3螺旋；b：识别1b3 fab的纳米抗体-连接序列l9-e3螺旋，其中e3/k3介导a与b的相互作用。[0054]最后，本发明提供蛋白结构解析通用方法的组装方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：[0055]a.在目的基因上确认两段相邻结构的基因序列，将位于此之间的基因序列删除，用p1蛋白的基因进行替换；在目的基因上确认一处基因序列，将此基因序列删除，用p2蛋白或短肽或p3蛋白或短肽的基因进行替换，将目标蛋白改造成目标蛋白-p1-p2或目标蛋白-p1-p3；[0056]b.将目标蛋白-p1-p2或目标蛋白-p1-p3融合蛋白质克隆到表达载体进行表达并纯化；[0057]c.加入p1的相互作用蛋白ap1和胶水分子进行体外组装，制备蛋白质复合物；[0058]e.制备目标蛋白质复合物的冷冻电镜样品，进行冷冻电镜蛋白质结构解析。[0059]在一些实施方案中，所述目标蛋白质为膜表达蛋白质，优选具有两段相邻螺旋束结构的蛋白质，优选地选自由gpcr、离子通道和转运子组成的组。[0060]在一些实施方案中，目标蛋白质为gpcr时，融合p1的位置在gpcr的第五段跨膜螺旋和第六段跨膜螺旋之间，融合p2或p3的位置在h8后的柔性区域。[0061]更具体地说，本发明提供以下内容：[0062]1)bril蛋白改造方法[0063]bril蛋白是指在apocytochrome(脱辅基细胞色素)b562的氨基酸序列中引入m7w、h102i和r106l的耐热性突变体蛋白，拥有h1、h2、h3、h4四个螺旋束结构，如seq id no:1所示。其中的h1为bril蛋白n端起第1位丙氨酸到第20位丙氨酸的序列，h2为bril蛋白n端起第22位天冬酰胺到第42位赖氨酸的序列，h3为bril蛋白n端起第55位丝氨酸到第81位谷氨酸的序列，h4为bril蛋白n端起第83位赖氨酸到第106位亮氨酸的序列。[0064]本发明提供bril蛋白的改造方式，将bril蛋白的h2的c段和h3的n端之间的部分区域氨基酸删除，用较短的无明显二级结构的柔性氨基酸肽段代替。改造后的bril蛋白命名为mbril，如seq id no:2所示。[0065]氨基酸删除区域包括bril的h2和h3之间的所有柔性区域，在不影响bril基本四螺旋束结构的情况下，可以根据需要进行氨基酸的删除。本发明中改造位点为bril的n端起第44位苏氨酸到第54位天冬氨酸之间的氨基酸，改造后的mbril既保持了野生型bril的四螺旋束特性，又避免了其与目标蛋白融合后对目标蛋白整体结构的破坏。[0066]柔性氨基酸肽段是指无明显二级结构的氨基酸肽段，具体氨基酸排布序列不固定，可以根据具体设计方案做调整。本发明使用sgsg作为柔性氨基酸肽段。[0067]2)目标蛋白的融合改造方法[0068]本发明的目标蛋白质优选g蛋白偶联受体gpcr、离子通道和转运子中的任意一种，改造模式分目标蛋白-p1-p2、目标蛋白-p1-p3两种。此处将以本发明的实施例β2-肾上腺素受体(β2ar)、黏附gpcr受体adgrl3为对象，进行目标蛋白改造方法的说明。[0069]将β2ar的tm5与tm6之间的柔性氨基酸(即第231位谷氨酰胺到262位丝氨酸)删除，将mbril融合在此处，也可以在mbril的两侧分别添加连接序列l1、l2，用来调整mbril与β2ar的相对构象，连接序列的序列、长度及二级结构不固定，可以根据目标蛋白自行选择。本发明β2ar-mbril的融合没有添加连接序列l1、l2。同时将β2ar的c端h8后的柔性氨基酸序列(即第341位半胱氨酸至413位亮氨酸)删除，将螺旋短肽k3与螺旋短肽alfa串联后融合在h8之后，形成β2ar-mbril-h8-k3-alfa，可以在k3、alfa的前面分别添加连接序列l3、l4，用来调整k3-alfa与h8的相对构象，连接序列的序列、长度及二级结构不固定，可以根据目标蛋白自行选择。本发明的实施例中β2ar-mbril-h8与k3的融合没有添加连接序列，在alfa融合前添加了连接序列l4，l4的序列选用了aeekra。[0070]将黏附gpcr受体adgrl3的tm5与tm6之间的柔性氨基酸(即第1038位丙氨酸到1047位亮氨酸)删除，将mbril融合在此处，也可以在mbril的两侧分别添加连接序列l1、l2，用来调整mbril与adgrl3的相对构象，连接序列的序列、长度及二级结构不固定，可以根据目标蛋白自行选择。本发明adgrl3-mbril的融合中添加了连接序列l2，l2的序列选用了era。同时将adgrl3的c端h8后的柔性氨基酸序列(即第1120位半胱氨酸到1447位亮氨酸)删除，将螺旋短肽alfa融合在h8之后，形成adgrl3-mbril-h8-alfa，在alfa前端添加连接序列l5，用来调整alfa与h8的相对构象，连接序列的序列、长度及二级结构不固定，可以根据目标蛋白自行选择，本发明l5的序列选用了aa。[0071]3)bril(mbril)的结合抗体或其抗原结合片段[0072]本发明通过噬菌体展示技术，从全合成文库中，筛选分离得到一种bril(mbril)蛋白的结合抗体或抗原结合片段，命名为1b3。进一步本发明解析了1b3 fab结合bril的复合物晶体结构，确定了1b3在bril蛋白上的结合位点。该位点包括两个区域，分别是bril的h3和h4结构域。具体地，与bril结合的抗体或其抗原结合片段具有以下特征中的任意一种：[0073](1)与抗体h链可变区(vh)的cdr1～3所示的氨基酸序列(seq id no:6～8)，或抗体l链可变区(vl)的cdr1～3所示的氨基酸序列(seq id no:10～12)的抗体竞争性结合的抗体或其抗原结合片段；[0074](2)与抗体h链可变区(vh)的cdr1～3所示的氨基酸序列(seq id no:6～8)，或抗体l链可变区(vl)的cdr1～3所示的氨基酸序列(seq id no:10～12)的抗体所结合的表位结合的抗体或其抗原结合片段；[0075](3)与抗体h链可变区(vh)的cdr1～3所示的氨基酸序列(seq id no:6～8)，或抗体l链可变区(vl)的cdr1～3所示的氨基酸序列(编seq id no:10～12)的抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体或其抗原结合片段；[0076](4)与bril结合的抗体或其结合片段，抗体的vh的cdr1～3分别包含显示与seq id no:6～8所示的氨基酸序列具有90％或以上同一性的氨基酸序列，或抗体的vl的cdr1～3分别包含显示与seq id no:10～12所示的氨基酸序列具有90％或以上同一性的氨基酸序列；该抗体可以与bril、mbril、不涉及h3/h4氨基酸表位突变的所有bril突变体以及与bril、mbril以及不涉及h3/h4氨基酸表位突变的所有bril突变体相融合的所有融合蛋白相结合，用于体外表达纯化、促进(制造)结晶以及立体结构解析。[0077]抗原结合片段是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区，例如一个或多个cdr。抗体的片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。抗原结合片段包括选自fab、fab'、fab'-sh、fv、scfv、f(ab')2、双抗体、包含cdr的肽等。[0078]fab片段由一条轻链和一条重链的ch1及可变区组成。[0079]fc区含有包含抗体的ch1和ch2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过ch3结构域的疏水作用保持在一起。[0080]fab'片段含有一条轻链和包含vh结构域和ch1结构域以及ch1和ch2结构域之间区域的一条重链的部分，两个fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成f(ab')2分子。[0081]f(ab')2片段含有两条轻链和两条包含ch1和ch2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，f(ab')2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个fab'片段组成。[0082]fv区包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。[0083]单链fv抗体(scfv抗体)是指包含抗体的vh和vl结构域的抗原结合片段，这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，scfv多肽在vh和vl结构域之间包含多肽接头，该接头使得scfv能形成用于抗原结合的所需结构。[0084]双抗体为具有两个抗原结合位点的小抗原结合片段。所述片段包含在相同的多肽链中与轻链可变结构域(vl)连接的重链可变结构域(vh)(vh-vl或vl-vh)。通过使用短至不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，使得所述结构域与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。[0085]4)胶水分子双特异性结合目标融合蛋白[0086]本发明的目标蛋白质优选g蛋白偶联受体gpcr、离子通道和转运子中的任意一种，目标蛋白改造模式分目标蛋白-p1-p2、目标蛋白-p1-p3两种。ap1是与p1(融合p1的蛋白)相互作用的蛋白。胶水分子是能与ap1和p2或p3相互作用的双特异性分子，可以是单体融合胶水分子也可以是两个(或以上)蛋白组成的胶水分子对。此处将以本发明实施例中的β2-肾上腺素受体(β2ar)、黏附gpcr受体adgrl3为对象，对单体融合胶水分子和两个蛋白组成的胶水分子对分别进行说明。[0087]本发明的实施例中β2ar改造后的模式为β2ar-mbril-h8-k3-alfa，1b3 fab作为本发明中筛选获得的识别bril(mbril)的蛋白，可以与bril(mbril)结合，胶水分子为能与k3-alfa以及1b3 fab同时相互作用的蛋白即识别k3的e3螺旋-连接序列l6-识别1b3 fab的纳米抗体-连接序列l7-识别alfa螺旋短肽的纳米抗体。其中连接序列l6和l7为无明显二级结构的氨基酸组成的短肽，其序列不固定，可根据不同的gpcr结构进行适当调整。在β2ar的非活化结构解析中，胶水分子是e3螺旋-gsgs-1b3 fab的纳米抗体-ggsgasgasgsa-alfa纳米抗体(seq id no:16)。在β2ar的活化结构解析中，胶水分子是e3螺旋-gsgs-1b3 fab的纳米抗体-ggsgasgas-alfa纳米抗体(seq id no:17)。[0088]本发明的实施例中adgrl3改造后的模式为adgrl3-mbril-h8-alfa，1b3 fab作为本发明中筛选获得的识别bril(mbril)的蛋白，可以与bril(mbril)结合，胶水分子为能与alfa以及1b3 fab同时相互作用的蛋白分子对a+b。其中a：alfa的纳米抗体-连接序列l8-k3螺旋、b：识别1b3 fab的纳米抗体-连接序列l9-e3螺旋，其中e3/k3介导a与b的相互作用。具体序列分别为：a：alfa的纳米抗体-gsgs-k3螺旋(seq id no:18)；b：识别1b3 fab的纳米抗体-gsgsg-e3螺旋(seq id no:19)。[0089]本发明的应用[0090]本发明提供了一种稳定目标蛋白质的方法、一种解析目标蛋白三维结构的通用方法，使目前为止不能进行结构解析的蛋白质顺利进行结构解析。体现在膜蛋白gpcr上，首先，打破了目前流行的依赖高效激动剂制备gpcr-g蛋白复合物从而解析完全激动剂结合下的gpcr结构的现状。本发明实现了gpcr与激动剂、部分激动剂、偏好激动剂、反向激动剂、拮抗剂、别构调节剂以及无配体结合状态的中高等分辨率冷冻电镜结构解析。其次，该发明适用性广，不仅适用于所有的gpcr家族a的成员，对所有的家族都适用，甚至适用目前难以解析结构的黏附gpcr，而且可重复性高。虽然目前也有关于gpcr融合bril，结合bril的抗体进行结构解析的文献，但其方法有较大的局限性并不适合所有的gpcr家族，并且不适合所有的gpcr状态。[0091]同时，本发明提供了目标蛋白的改造方法、bril蛋白的改造方法、bril(mbril)的抗体或抗原结合片段、胶水分子的设计(使用)方法。最后，本发明提供了改造后的目标蛋白、mbril蛋白、bril(mbril)的抗体或抗原结合片段以及胶水分子的氨基酸序列、编码上述序列的核酸、生产上述蛋白的细胞、生产上述蛋白的制造方法及上述蛋白在结构解析中的使用方法。[0092]定义[0093]gpcr：g蛋白偶联受体(g protein-coupled receptors)，是哺乳动物中成员最多的膜蛋白受体超家族，有800多名成员，整体由七次跨膜螺旋(tm1-7)和第八段螺旋(h8)组成。根据序列保守性及结构的特征，gpcr被分为a、b、c、d、e及f六个家族。虽然这六个家族成员在跨膜螺旋排布上有一定区别，但其激活机制大致相同。当接收到细胞外激活信号后，gpcr发生构象变化从而结合g蛋白，完整的g蛋白被活化后激活下游的信号转导。目前发现作用于gpcr的内源性信号分子多种多样，可以是光、离子、代谢物、短肽、神经递质以及蛋白质等。因此，gpcr参与的生理功能几乎涉及生命活动的各个方面，包括听觉、嗅觉、味觉、神经传递以及免疫调控等等。正因为在众多生理过程中发挥作用，gpcr成为极其重要的药物靶点。在美国fda批准的上市药物中，约34％的药物作用对象是gpcr。随着gpcr相关研发的大量投入，可以预测的是，未来将会产生更大市场规模的新型gpcr靶向药物。[0094]g蛋白：g蛋白由gα、gβ和gγ三个亚基组成。人体的gα亚基有16种，gβ亚基有5种，gγ亚基有10种。基于序列同源性，人体的gα亚基被分为四个亚家族，分别是gαs、gαi、gαq、gα12/gα13亚家族。不同gα亚基的氨基酸序列虽然存在差异，但同源性较高，其核心区域都主要由α螺旋组成，能够结合三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate,gtp)或二磷酸鸟苷(guanosine diphosphate,gdp)，并具有gtpase(guanosine triphosphatase)活性。gβ亚基主要由一系列的β折叠组成，gγ亚基为伸展的单链结构，生理状态下，gβ和gγ亚基以二聚体的形式存在。[0095]完全激动剂：gpcr的调控分子，与gpcr结合后，能将gpcr受体完全激活的调控分子称为完全激动剂。[0096]部分激动剂：gpcr的调控分子，与gpcr结合后，能激活gpcr受体，但不能将受体完全激活的配体称为部分激动剂。[0097]反向激动剂：gpcr的调控分子，与gpcr结合后，能够降低受体本底活性的配体称为反向激动剂。[0098]拮抗剂：gpcr的调控分子，与激动剂竞争结合位点，并且将受体的活性降低到本底水平的配体称为拮抗剂。[0099]别构调节剂：gpcr的调控分子，不直接与蛋白活性位点结合，而是与靶标蛋白的别构位点结合从而调控受体活性的调控分子。[0100]class a家族的gpcr：a类gpcr数量最多，也是目前结构解析数量最多的家族，有700多个成员，被细分为α、β、γ和δ四个分支。α分支的成员包括含多种重要的胺类和小分子化合物的受体，比如肾上腺素受体(adrenoceptors)、五羟色胺受体(5-hydroxytryptamine receptors)、组胺受体(histamine receptors)等；β分支主要为多肽受体(peptide receptors)；γ分支包括阿片受体(opioid receptors)、趋化因子受体(chemokine receptors)等，δ分支主要为嗅觉受体(olfactory receptors)和糖蛋白受体(glycoprotein receptor)。在34％的靶向gpcr的上市药物中，a类家族的上市药物占比高达94％。[0101]黏附gpcr：adhesion gpcr，一类隶属于class b、在细胞与细胞以及细胞与基质相互作用中发挥重要重要的g蛋白偶联受体。粘附gpcr家族共包含33个成员，是继class a之后的成员数第二多的gpcr家族，参与调控神经、免疫等众多生理过程。被分为9个亚家族即adgra～g、adgrl和adgrv 9，该家族大部分成员的内源性配体尚未发现，多为“孤儿受体”，因此该类家族的成员的活化与非活化结构解析非常困难。[0102]β2-肾上腺素受体(β2ar)：β2-adrenoceptors，隶属gpcr a家族成员，主要分布在全身平滑肌中，与哮喘、高血压和心力衰竭等多种疾病密切相关。[0103]黏附gpcr受体l3(adgrl3)：latrophilin 3，隶属gpcr b家族成员，与注意缺陷多动障碍、多巴胺代谢紊乱等多种疾病密切相关，是大脑突触发挥功能和维持平衡的调节器，介导运动、注意力以及记忆功能。[0104]分辨率：一种衡量数据质量的度量指标，分辨率越高，蛋白质结构信息越可靠。[0105]冷冻电镜技术：冷冻电子显微镜技术，cryo-electron microscopy(cryo-em)，是指将生物大分子快速冷冻后，在低温环境下利用透射电子显微镜对样品进行成像，再经图像处理和重构计算获得样品三维结构的方法，冷冻电镜已经成为结构测定的一种革命性的方法。但冷冻电镜技术并非适用于所有的样品。当样品的分子量低于100kda时，冷冻电镜很难获取高分辨率结构。而对所有的gpcr而言，除了c家族约20个成员外，其单体分子量大都在40kda左右。因此，很难直接使用单颗粒冷冻电镜技术获取其三维结构。于是，当下流行将gpcr同g蛋白制备成复合物后，再对其进行结构解析。但是该方法有一个先决条件即所用的配基必须能高效地激活相应的受体从而形成gpcr-g蛋白复合物。因此，对于无法高效激活gpcr的配基，比如部分激动剂、拮抗剂、反向激动剂、别构调节剂，都无法使用该方法进行结构解析。[0106]alprenolol：阿普洛尔，化学名称为1-(异丙基氨基)-3-(2-烯丙基苯氧基)-2-丙醇，是一种非选择性β2-肾上腺素受体拮抗剂，对β2-肾上腺素受体的抑制常数ki值为1nm。alprenolol可用作抗高血压、抗心绞痛和抗心律失常剂。[0107]formoterol：福莫特罗，化学名称为3-甲酰胺基-4-羟基-α[n-[1-甲基-2-(p-甲氧基苯基)乙基]胺基甲基]苄醇，是一种长效的β2-肾上腺素受体激动剂，对β2-肾上腺素受体的抑制常数ki值为23nm。formoterol可用作支气管哮喘的治疗。[0108]转运子：膜蛋白的一大类，位于组织细胞膜上，介导生物膜内外的化学物质以及信号交换。[0109]有益效果[0110](1)本发明提供了解析目标蛋白三维结构的通用方法，使目前为止不能进行结构解析的蛋白质顺利进行结构解析。体现在膜蛋白gpcr上，打破了目前流行的依赖高效激动剂制备gpcr-g蛋白复合物从而解析完全激动剂结合下的gpcr结构的现状。本发明实现了gpcr与激动剂、部分激动剂、偏好激动剂、反向激动剂、拮抗剂、别构调节剂以及无配体结合状态的中高等分辨率冷冻电镜的结构解析。[0111](2)本发明提供的结构解析通用方法适用范围广泛，不仅适用于gpcr家族a的成员，而且适用于目前难以解析结构的黏附gpcr，黏附gpcr属于class b家族，由于缺乏高效激动剂与拮抗剂，黏附gpcr的研究一直十分困难。本发明的通用方法适用所有的gpcr家族，这是目前其他结构解析方法不可比拟的。[0112](3)本发明的结构解析通用方法以冷冻电镜技术为手段，因此所需的样品量相对较少，只需要几十微克的样品量，跳过了x射线晶体学中艰难的蛋白质结晶步骤，大大节约了时间及经济成本。[0113](4)本发明提供了目标蛋白的融合改造方法，融合改造后的目标蛋白引入了额外的相互作用位点，更有利于结构解析。[0114](5)本发明提供了bril蛋白的改造方法，改造后的bril(mbril)保留了野生型bril的结构与功能，大大降低了融合对目标蛋白整体结构的影响，因此适用范围更加广泛。[0115](6)本发明提供了bril(mbril)的抗体或抗原结合片段。[0116](7)本发明提供了胶水分子的设计及应用方法。附图说明[0117]图1.1b3 fab对bril和mbril的亲和力表征结果。1b3 fab对bril和mbril的elisa结合曲线。bril和mbril分别用黑色和红色表示，两者结合1b3 fab的ec50值分别为12.02±1.33nm和20.49±1.35nm。[0118]图2.抗体1b3的表位表征结果。图a是bril与mbril的三维结构比较。其中mbril的h2与h3之间用绿色结构表示，bril的h2与h3之间用红色结构表示。图b是bril与1b3 fab的晶体结构模式图。说明改造后的bril不影响其与抗体1b3的结合。[0119]图3.目标蛋白-p1-p2/目标蛋白-p1-p3的改造模式图。图示中的目标蛋白改造模式图以gpcr为目标蛋白、mbril为p1蛋白、alfa螺旋短肽为p2、k3-alfa螺旋短肽为p3进行说明。[0120]图4.单体融合胶水分子与胶水分子对a+b的设计模式图。图示中的单体融合胶水分子以e3螺旋-连接序列l6-1b3 fab的纳米抗体-连接序列l7-alfa纳米抗体进行说明；胶水分子对a+b以alfa纳米抗体-连接序列l8-k3/1b3 fab的纳米抗体-连接序列l9-e3为模型进行说明。[0121]图5.根据本发明实施方案的非活化β2ar的改造模式、胶水分子、冷冻电镜下的整体结构图。图a是非活化β2ar的改造模式+1b3 fab+单体融合胶水分子(e3螺旋-gsgs-1b3 fab的纳米抗体-ggsgasgasgsa-alfa纳米抗体)的结构模式图。图b是fsc分辨率曲线图。图c是目标蛋白的局部分辨率估算密度图。[0122]图6.根据本发明实施方案的活化β2ar的改造模式、胶水分子、冷冻电镜下的整体结构图。图a是活化β2ar的改造模式+1b3 fab+单体融合胶水分子(e3螺旋-gsgs-1b3 fab的纳米抗体-ggsgasgas-alfa纳米抗体)的结构模式图。图b是fsc分辨率曲线图。图c是目标蛋白的局部分辨率估算密度图。[0123]图7.根据本发明实施方案的非活化adgrl3的改造模式、胶水分子、冷冻电镜下的整体结构图。图a是非活化adgrl3的改造模式+1b3 fab+胶水分子对a+b(a：alfa的纳米抗体-gsgs-k3螺旋；b：1b3 fab的纳米抗体-gsgsg-e3螺旋)的结构模式图。图b是fsc分辨率曲线图。图c是目标蛋白的局部分辨率估算密度图。具体实施方式[0124]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。[0125]本发明的结构解析通用方法的开发，涉及内容较多，将分以下内容阐述：[0126]1)bril蛋白的改造[0127]bril蛋白是指在apocytochrome(脱辅基细胞色素)b562的氨基酸序列中引入m7w、h102i和r106l的耐热性突变体蛋白，拥有h1、h2、h3、h4四个螺旋束结构，如seq id no:1所示。本发明提供bril蛋白的改造方式，将bril蛋白的h2的c段和h3的n端之间的部分区域氨基酸删除，用较短的无明显二级结构的柔性氨基酸肽段代替，改造后的bril蛋白命名为mbril，如seq id no:2所示。删除区域包括bril的h2和h3之间的所有柔性区域，在不影响bril基本四螺旋束结构的情况下，可以根据需要进行氨基酸的删除。本发明中改造位点为bril的n端起第44位苏氨酸到第54位天冬氨酸之间的氨基酸，删除后使用的柔性氨基酸肽段，是指无明显二级结构的氨基酸肽段，具体氨基酸排布序列不固定，可以根据具体设计方案做调整。本发明使用sgsg作为柔性氨基酸肽段。本发明中mbril包含与seq id no:2的氨基酸序列具有优选90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上的序列同一性的蛋白质，更优选具有95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的蛋白质。[0128]改造后的mbril既保持了野生型bril的四螺旋束特性，又避免了其与目标蛋白融合后对目标蛋白整体结构的破坏。[0129]2)目标蛋白的改造[0130]本发明目标蛋白的改造包括两个区域，一是将目标蛋白一处的氨基酸删除，融合任意可溶蛋白p1，这部分的改造位点可以是目标蛋白的n端、c端和中间区域，可溶蛋白p1可为任意蛋白，可以是天然存在、模拟设计合成、已知三维结构或未知三维结构的蛋白。改造的第二处是将目标蛋白的一处的氨基酸删除，融合任意可溶蛋白或短肽p2或多个可溶蛋白或短肽p3，这部分的改造位点可以是目标蛋白的n端、c端和中间区域。p2或p3可为任意蛋白，可以是天然存在、模拟设计合成、已知三维结构或未知三维结构的(多个)蛋白或(多个)短肽。因此目标蛋白改造后成两种模式：目标蛋白-p1-p2、目标蛋白-p1-p3。[0131]本发明优选具有螺旋束特征的蛋白质，以gpcr为例。以两个gpcr蛋白(β2-肾上腺素受体(β2ar)和黏附gpcr受体adgrl3)为对象，进行目标蛋白改造方法的说明。[0132]将β2ar的tm5与tm6之间的柔性氨基酸(即第231位谷氨酰胺到262位丝氨酸)删除，将mbril融合在此处，也可以在mbril的两侧分别添加连接序列l1、l2，用来调整mbril与β2ar的相对构象，连接序列的序列、长度及二级结构不固定，可以根据目标蛋白自行选择。本发明的实施例中β2ar-mbril的融合没有添加连接序列l1、l2。同时将β2ar的c端h8后的柔性氨基酸序列(即第341位半胱氨酸至413位亮氨酸)删除，将螺旋短肽k3与螺旋短肽alfa串联后融合在h8之后，形成β2ar-mbril-h8-k3-alfa，可以在k3、alfa的前端分别添加连接序列l3、l4，用来调整k3-alfa与h8的相对构象，连接序列的序列、长度及二级结构不固定，可以根据目标蛋白自行选择。本发明β2ar-mbril-h8与k3的融合没有添加连接序列，在alfa融合前添加了连接序列l4，l4的序列选用了aeekra，因此本发明的β2ar改造后的序列为β2ar-mbril-h8-k3-aeekra-alfa，如seq id no:20所示。[0133]将黏附gpcr受体adgrl3的tm5与tm6之间的柔性氨基酸(即第1038位丙氨酰胺到1047位亮氨酸)删除，将mbril融合在此处，也可以在mbril的两侧分别添加连接序列l1、l2，用来调整mbril与adgrl3的相对构象，连接序列的序列、长度及二级结构不固定，可以根据目标蛋白自行选择。本发明adgrl3-mbril的融合中添加了连接序列l2，l2的序列选用了era。同时将adgrl3的c端h8后的柔性氨基酸序列(即第1120位半胱氨酸到1447位亮氨酸)删除，将螺旋短肽alfa融合在h8的后，形成adgrl3-mbril-h8-alfa，可以在alfa前端添加连接序列l5，用来调整alfa与h8的相对构象，连接序列的序列、长度及二级结构不固定，可以根据目标蛋白自行选择，本发明的实施例中l5的序列选用了aa，因此本发明的adgrl3改造后的序列为adgrl3-mbril-h8-aa-alfa，如seq id no:21所示。[0134]改造后的目标蛋白基本不改变其结构，但是外源蛋白的融合既增强了自身稳定性，又额外引入了相互作用功能位点，在一定程度上，进一步增强了稳定性。[0135]3)bril(mbril)蛋白的结合抗体或其抗原结合片段[0136]本发明目标蛋白改造后成目标蛋白-p1-p2、目标蛋白-p1-p3两种模式。ap1作为可以与p1蛋白、融合p1的蛋白相互作用的蛋白，可以是天然存在、模拟设计合成、已知三维结构或未知三维结构的蛋白。本发明中的mbril蛋白为p1，为了获得p1的相互作用蛋白ap1，本发明通过噬菌体展示技术，从全合成文库中，筛选分离得到一种bril(mbril)蛋白的结合抗体或抗原结合片段，命名为1b3。进一步本发明解析了1b3 fab结合bril的复合物晶体结构，确定了1b3在bril蛋白上的结合位点。该位点包括两个区域，分别是bril的h3和h4结构域。具体地，与bril结合的抗体或其抗原结合片段具有以下特征中的任意一种：[0137](1)与抗体h链可变区(vh)的cdr1～3所示的氨基酸序列(seq id no:6～8)，或抗体l链可变区(vl)的cdr1～3所示的氨基酸序列(seq id no:10～12)的抗体竞争性结合的抗体或其抗原结合片段；[0138](2)与抗体h链可变区(vh)的cdr1～3所示的氨基酸序列(seq id no:6～8)，或抗体l链可变区(vl)的cdr1～3所示的氨基酸序列(seq id no:10～12)的抗体所结合的表位结合的抗体或其抗原结合片段；[0139](3)与抗体h链可变区(vh)的cdr1～3所示的氨基酸序列(seq id no:6～8)，或抗体l链可变区(vl)的cdr1～3所示的氨基酸序列(编seq id no:10～12)的抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体或其抗原结合片段；[0140](4)与bril结合的抗体或其结合片段，抗体的vh的cdr1～3分别包含显示与seq id no:6～8所示的氨基酸序列具有90％或以上同一性的氨基酸序列，或抗体的vl的cdr1～3分别包含显示与seq id no:10～12所示的氨基酸序列具有90％或以上同一性的氨基酸序列；该抗体可以与bril、mbril、不涉及h3/h4氨基酸表位突变的所有bril突变体以及与bril、mbril以及不涉及h3/h4氨基酸表位突变的所有bril突变体相融合的所有融合蛋白相结合，用于体外表达纯化、促进(制造)结晶以及立体结构解析。[0141]4)胶水分子的设计及使用[0142]本发明目标蛋白改造后成目标蛋白-p1-p2、目标蛋白-p1-p3两种模式、ap1是p1的相互作用蛋白、胶水分子是能与ap1和p2或p3同时相互作用的蛋白。其中胶水分子可以是任意结构蛋白，可为天然存在、模拟设计合成、已知三维结构或未知三维结构的单体融合蛋白或短肽或两个(或以上)蛋白或短肽组成的蛋白对或短肽对。[0143]单体融合胶水分子由能与ap1和p2或p3同时相互作用的蛋白通过无明显二级结构的连接序列串联组成，能与ap1相互作用的蛋白或短肽是aap1，能与p2相互作用的蛋白或短肽是ap2，能与p3相互作用的蛋白或短肽是ap3，由于p3是多个可溶蛋白或短肽串联组成，即p31-连接序列-p32-连接序列-p33-连接序列-p34......，因此，ap3也为多个可溶蛋白或短肽串联组成，即ap31-连接序列-ap32-连接序列-ap33-连接序列-ap34......。目标蛋白的结构解析可以通过目标蛋白-p1-p2、ap1、ap2-连接序列-aap1三组分组装完成；或目标蛋白-p1-p31-p32、ap1、ap31-连接序列-aap1-连接序列-ap32三组分组装完成；或目标蛋白-p1-p31-p32、ap1、ap31-ap32-连接序列-aap1三组分组装完成。本实施例中的mbril蛋白为p1、1b3 fab为ap1、k3-alfa为p3(p31-p32)，单体胶水分子的形式为与k3相互作用的e3螺旋(ap31)-连接序列l6-1b3 fab的纳米抗体-连接序列l7-alfa的纳米抗体(ap32)。[0144]蛋白对胶水分子由两个蛋白组成的蛋白对a+b组成。a为识别p2或p3的蛋白或短肽，命名为ap2或ap3。b为识别ap1的蛋白或短肽，命名为aap1。其中a+b即ap2或ap3+aap1，a与b的相互作用则由ap2与aap1直接相互作用提供；a也可以为融合其他蛋白或肽段的ap2或ap3即ap2或ap3-连接序列-m，其中m可以是蛋白或肽段。b也可以为融合其他蛋白或肽段的aap1即aap1-连接序列-n，其中n则是可以与m直接相互作用的蛋白或肽段，此种模式中a与b的相互作用不由ap2或ap3与aap1提供，而是由m与n提供。本实施例中的mbril蛋白为p1、1b3 fab为ap1、alfa为p2，蛋白对胶水分子a+b中，a：alfa的纳米抗体-连接序列l8-k3螺旋短肽；b：1b3 fab的纳米抗体-连接序列l9-e3螺旋短肽，其中e3/k3介导a与b的相互作用。胶水分子处的连接序列均由无明显二级结构的柔性氨基酸串联组成，柔性氨基酸一般选用丝氨酸(s)、甘氨酸(g)和丙氨酸(a)等，具体氨基酸序列排布不固定，长度可以根据具体设计方案做调整。[0145]5)目标蛋白复合物的组装及结构解析[0146]本发明目标蛋白改造后成目标蛋白-p1-p2、目标蛋白-p1-p3两种模式、ap1是p1的相互作用蛋白、胶水分子是能与ap1和p2或p3同时相互作用的蛋白。为了完成结构解析，可以将改造后的目标蛋白、ap1蛋白及胶水分子分别单独制备，最后按照1：1：1的摩尔比进行蛋白混合孵育，最后分离掉多余的组分，即可制备成完整的目标蛋白复合物，用于后续的冷冻电镜结构解析。[0147]实施例1表达纯化bril、mbril、1b3 fab[0148]将bril、mbril、1b3 fab的基因导入大肠杆菌表达载体pet-22b(+)(sigma-aldrich，cat#69744)，通过化学转化的方法，将其转化进大肠杆菌表达菌株bl21(de3)(thermo scientific，ec0114)，挑取单克隆于37℃培养，当细菌长至od600为0.8时，加0.5mm iptg(millipore，cat#420291)诱导剂在16℃诱导表达，18-20个小时后，8000rpm，5min收集细胞，将收集的细胞使用低温超声破碎，随后12000rpm，30min收集上清，采用ni-nta亲和层析柱(cytiva)对上清中的蛋白进行纯化。[0149]实施例2抗体1b3的亲和力和结合表位[0150]1)非竞争性elisa初步表征抗体1b3对bril和mbril的结合能力[0151]通过噬菌体展示技术从本发明的全合成文库中，筛选获得结合bril的抗体1b3，并通过上述方法获得1b3 fab蛋白。将bril(seq id no:1)、mbril(seq id no:2)用pbs溶液稀释至1μg/ml，按照每孔50μl的量加入到nunc maxisorb plate酶标板(thermo fisher，cat#44-2404)中，室温锚定2小时；使用封闭溶液(含有0.5％牛血清白蛋白的pbs溶液)室温封闭两小时；使用清洗溶液(含有0.05％ tween-20的pbs溶液)洗三次，每次200μl，将梯度稀释的1b3 fab溶液加入到酶标板中，每孔50μl，室温孵育一小时；使用清洗溶液洗涤四次，之后加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶偶联的抗人ig kappa链的抗体(赫澎生物)，每孔30μl，室温孵育30分钟；使用清洗溶液洗涤六次，之后每个孔加入120μl tmb溶液(碧云天)，反应2分钟至10分钟，之后加入50μl硫酸溶液终止显色反应，读取每个孔在450nm处的吸光度值。结果如图1所示，bril和mbril结合1b3 fab的ec50值分别为12.02±1.33nm和20.49±1.35nm。[0152]2)采用x射线晶体衍射的方式解析1b3 fab结合bril的表位[0153]将抗体1b3的抗原结合片段(fab)(seq id no:13)与bril(seq id no:1)分别导入大肠杆菌表达菌株bl21(de3)(thermo scientific，ec0114)中，然后通过带有组氨酸标签使用ni-nta亲和层析柱(cytiva)分别纯化，得到1b3 fab与bril蛋白，随后将两者按照摩尔比1：1的比例混合孵育；使用superdex 200increase 10/300层析柱(cytiva)进行复合物的精细纯化，得到1b3 fab+bril的蛋白复合物；将纯化得到的复合物浓缩至蛋白浓度大于8mg/ml，使用多种商业化晶体生长试剂盒进行筛选；根据初始出晶条件进行进一步组合优化。我们成功在0.1m乙酸钠ph 5.0,15％(w/v)peg 6000的条件下获得了衍射分辨率为的晶体并进行了数据收集。通过分子置换解析了1b3 fab+bril复合物结构模型，确定1b3 fab结合在bril中的h3和h4两个区域位点。结果如图2所示，mbril的改造不影响1b3抗体或抗原结合片段的结合。[0154]实施例3β2-肾上腺素受体(β2ar)的改造及表达纯化[0155]本发明的目标蛋白改造后的形式分目标蛋白-p1-p2、目标蛋白-p1-p3两种模式，基于构象需要可在p1的两侧添加连接序列l1/l2，在p2的前面添加连接序列l5，在p3的前面添加连接序列l3，p3也可由p31-连接序列-p32-连接序列-p33......组成。本实施例将以β2-肾上腺素受体(β2ar)为目标蛋白进行目标蛋白-p1-p3模式的详细说明，如图3所示。[0156]将β2ar上位于第5～6跨膜螺旋之间从第231位谷氨酰胺到262位丝氨酸删除，用改造后的bril(mbril)进行替代。同时，将β2ar第八段螺旋(h8)上的从第341位半胱氨酸至413位亮氨酸进行删除，在其后面融合一段k3螺旋序列，接着添加一段连接序列l4(aeekra)，再融合一段alfa螺旋序列，从而将β2ar改造成β2ar-mbril-k3-alfa融合蛋白质，如seq id no:20所示。[0157]重组β2ar基因克隆到哺乳动物表达系统中，在其n末端依次为ha分泌信号肽序列与flag标签序列，c末端为8×his标签序列。然后将质粒用polyethylenimine(pei，polysciences，cat#23966)转染至哺乳动物细胞expi293ftmcells(thermo fisher，cat#a14527)中表达重组β2ar蛋白，60小时后收取细胞。将收集的细胞使用低渗缓冲液[10mm hepes ph 7.5、1mm pmsf(苯甲基磺酰氟)、0.5mm edta]重悬后继续收集细胞，然后重悬于含有拮抗剂/激动剂的缓冲液[20mm hepes ph7.5、500mm nacl、10％甘油、1％(w/v)n-dodecyl-b-d-麦芽糖苷(ddm，anatrace cat#d310)、0.1％(w/v)cholesteryl hemisuccinate(chs，sigma cat#c6512)]中，4℃萃取2h，随后12000rpm收集含有β2ar重组蛋白的上清液，将其与ni-nta亲和层析柱(cytiva)4℃孵育2h，用含有拮抗剂/激动剂的10mm咪唑缓冲液[20mm hepes ph 7.5、150mm nacl、10％glycerol、0.03％(w/v)ddm(ddm，anatrace cat#d310)、0.02％(w/v)chs(chs，sigma cat#c6512)]洗去杂蛋白，最终用含有拮抗剂/激动剂的250mm咪唑的缓冲液[20mm hepes ph 7.5、150mm nacl、10％glycerol、0.03％(w/v)ddm(ddm，anatrace cat#d310)、0.02％(w/v)chs(chs，sigma cat#c6512)]将目的蛋白洗脱下来。[0158]实施例4黏附gpcrs(adgrl3)的改造及表达纯化[0159]本实施例将以黏附gpcrs(adgrl3)为目标蛋白进行目标蛋白-p1-p2模式的详细说明，如图3所示。[0160]将adgrl3上位于第5～6跨膜螺旋之间从第1038位丙氨酸到1047位亮氨酸删除，用mbril代替，基于构想构象需要在mbril的c端添加连接序列l2(era)。同时，将adgrl3第八段螺旋(h8)上的从第1120位半胱氨酸至1447位亮氨酸)进行删除，在其后面添加一段连接序列l5(aa)，再融合一段alfa螺旋序列，从而将adgrl3改造成adgrl3-mbril-alfa融合蛋白质，如seq id no:21所示。alfa纳米抗体(seq id no:16)按照摩尔比1:1:1冰上混合孵育2h，然后将此蛋白混合物与m1resin(sigma-aldrich，cat#a4596)4℃孵育1h，用含有100ug/ml flag小肽(millipore，cat#f3290)的含拮抗剂阿普洛尔的洗脱缓冲液[20mm hepes ph7.5、150mm nacl、0.00075％(w/v)lmng(lmng，anatrace cat#4216588)、0.00025％(w/v)glycol-diosgenin(gdn，anatrace cat#gdn101)，0.0001％ chs(chs，sigma cat#c6512)]从m1 resin上洗脱下来。随后使用superdex 200increase 10/300层析柱(cytiva)进行复合物的精细纯化，得到alprenolol结合下的β2ar-mbril-k3-alfa+1b3 fab+e3螺旋-gsgs-1b3 fab的纳米抗体-ggsgasgasgsa-alfa纳米抗体的蛋白复合物。将样品浓缩到10mg/ml，随后使用vitrobot mark iv(thermo fisher scientific)制样机，制备冷冻电镜样品。在300kv titan krios gi3显微镜(thermo fisher scientific fei)上收集图片，使用cryosparc v.3.2.0进行冷冻电镜结构解析，最终获得分辨率的结构，具体设计模式及整体结构如图5所示。[0168]实施例8β2-肾上腺素受体(β2ar)激动剂福莫特罗(formoterol)复合物冷冻电镜结构[0169]将激动剂福莫特罗(medchemexpress，cat#hy-b0010)结合下的β2ar-mbril-k3-alfa融合蛋白质与1b3 fab、胶水分子e3螺旋-gsgs-1b3 fab的纳米抗体-ggsgasgas-alfa纳米抗体，按照摩尔比1:1:1冰上混合孵育2h，然后将此蛋白混合物与m1 resin(sigma-aldrich，cat#a4596)4℃孵育1h，用含有100ug/ml flag小肽(millipore,cat#f3290)的含激动剂福莫特罗的洗脱缓冲液[20mm hepes ph7.5、150mm nacl、0.00075％(w/v)lmng(lmng，anatrace cat#4216588)、0.00025％(w/v)glycol-diosgenin(gdn，anatrace cat#gdn101)，0.0001％ chs(chs，sigma cat#c6512)]从m1 resin上洗脱下来。随后使用superdex 200increase10/300层析柱(cytiva)进行复合物的精细纯化，得到福莫特罗结合下的β2ar-mbril-k3-alfa+1b3 fab+e3螺旋-gsgs-1b3 fab的纳米抗体-ggsgasgas-alfa纳米抗体的蛋白复合物。将样品浓缩到10mg/ml，随后使用vitrobot mark iv(thermo fisher scientific)制样机，制备冷冻电镜样品。在300kv titan krios gi3显微镜(thermo fisher scientific fei)上收集图片，使用cryosparc v.3.2.0进行冷冻电镜结构解析，最终获得终获得分辨率的结构，具体设计模式及整体结构如图6所示。[0170]实施例9黏附gpcr(adgrl3)的非活化结构解析[0171]将adgrl3-mbril-alfa融合蛋白质与1b3 fab、胶水分子a+b(a：alfa的纳米抗体-gsgs-k3螺旋；b：1b3 fab的纳米抗体-gsgsg-e3螺旋)，按照摩尔比1:1:1冰上混合孵育2h，然后将此蛋白混合物与m1 resin(sigma-aldrich，cat#a4596)4℃孵育1h，用含有100ug/ml flag小肽(millipore,cat#f3290)的洗脱缓冲液[20mm hepes ph7.5、150mm nacl、0.00075％(w/v)lmng(lmng，anatrace cat#4216588)、0.00025％(w/v)glycol-diosgenin(gdn，anatrace cat#gdn101)，0.0001％ chs(chs，sigma cat#c6512)]从m1 resin上洗脱下来。随后使用superdex 200increase10/300层析柱(cytiva)进行复合物的精细纯化，得到adgrl3-mbril-alfa+1b3 fab+alfa的纳米抗体-gsgs-k3螺旋/1b3 fab的纳米抗体-gsgsg-e3螺旋的蛋白复合物。将样品浓缩到10mg/ml，随后使用vitrobot mark iv(thermo fisher scientific)制样机，制备冷冻电镜样品。在300kv titan krios gi3显微镜(thermo fisher scientific fei)上收集图片，使用cryosparc v.3.2.0进行冷冻电镜结构解析，最终获得分辨率的结构，具体设计模式及整体结构如图7所示。[0172]序列：[0173]seq id no:1bril蛋白的氨基酸序列[0174]adlednwetlndnlkviekadnaaqvkdaltkmraaaldaqkatppkledkspdspemkdfrhgfdilvgqiddalklanegkvkeaqaaaeqlkttrnayiqkyl[0175]seq id no:2mbril蛋白的氨基酸序列[0176]adlednwetlndnlkviekadnaaqvkdaltkmraaaldaqkasgsgspemkdfrhgfdilvgqiddalklanegkvkeaqaaaeqlkttrnayiqkyl[0177]seq id no:3alfa螺旋短肽的氨基酸序列[0178]srleeelrrrlte[0179]seq id no:4k3螺旋-aeekra-alfa螺旋的氨基酸序列[0180]kiaalkekiaalkekiaalke-aeekra-srleeelrrrlte[0181]seq id no:5bril的抗体或抗原结合片段的重链氨基酸序列[0182]evqlvesggglvqpggslrlscaasgfniyyssmhwvrqapgkglewvasispysgstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarpwypwsywsgldywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepks[0183]seq id no:6bril的抗体或抗原结合片段的hcdr1氨基酸序列[0184]yssmh[0185]seq id no:7bril的抗体或抗原结合片段的hcdr2氨基酸序列[0186]sispysgstyyadsvkg[0187]seq id no:8bril的抗体或抗原结合片段的hcdr3氨基酸序列[0188]pwypwsywsgldy[0189]seq id no:9bril的抗体或抗原结合片段的轻链氨基酸序列[0190]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsvssavawyqqkpgkapklliysasslysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqpwswgsalitfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdsqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrg[0191]seq id no:10bril的抗体或抗原结合片段的lcdr1氨基酸序列[0192]rasqsvssava[0193]seq id no:11bril的抗体或抗原结合片段的lcdr2氨基酸序列[0194]sasslys[0195]seq id no:12bril的抗体或抗原结合片段的lcdr3氨基酸序列[0196]qqpwswgsalit[0197]seq id no:13 1b3 fab的氨基酸序列[0198]evqlvesggglvqpggslrlscaasgfniyyssmhwvrqapgkglewvasispysgstyyadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycarpwypwsywsgldywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepks[0199]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsvssavawyqqkpgkapklliysasslysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqpwswgsalitfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdsqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrg[0200]seq id no:14alfa纳米抗体的氨基酸序列[0201]evqlqesggglvqpggslrlsctasgvtisalnamamgwyrqapgerrvmvaavsergnamyresvqgrftvtrdftnkmvslqmdnlkpedtavyychvledrvdsfhdywgqgtqvtvss[0202]seq id no:15 1b3 fab的纳米抗体的氨基酸序列[0203]qvqlqesggglvqpggslrlscaasgrtisryamswfrqapgkerefvavarrsgdgafyadsvqgrftvsrddakntvylqmnslkpedtavyycaidsdtfysgsydywgqgtqvtvss[0204]seq id no:16e3螺旋-gsgs-1b3 fab的纳米抗体-ggsgasgasgsa-alfa纳米抗体的氨基酸序列[0205]eiaalekeiaalekeiaalek[0206]-gsgs-qvqlqesggglvqpggslrlscaasgrtisryamswfrqapgkerefvavarrsgdgafyadsvqgrftvsrddakntvylqmnslkpedtavyycaidsdtfysgsydywgqgtqvtvss[0207]-ggsgasgasgsa–[0208]evqlqesggglvqpggslrlsctasgvtisalnamamgwyrqapgerrvmvaavsergnamyresvqgrftvtrdftnkmvslqmdnlkpedtavyychvledrvdsfhdywgqgtqvtvss[0209]seq id no:17e3螺旋-gsgs-1b3 fab的纳米抗体-ggsgasgas-alfa纳米抗体的氨基酸序列[0210]eiaalekeiaalekeiaalek[0211]-gsgs-qvqlqesggglvqpggslrlscaasgrtisryamswfrqapgkerefvavarrsgdgafyadsvqgrftvsrddakntvylqmnslkpedtavyycaidsdtfysgsydywgqgtqvtvss[0212]-ggsgasgas-[0213]evqlqesggglvqpggslrlsctasgvtisalnamamgwyrqapgerrvmvaavsergnamyresvqgrftvtrdftnkmvslqmdnlkpedtavyychvledrvdsfhdywgqgtqvtvss[0214]seq id no:18alfa纳米抗体-gsgs-k3螺旋的氨基酸序列[0215]evqlqesggglvqpggslrlsctasgvtisalnamamgwyrqapgerrvmvaavsergnamyresvqgrftvtrdftnkmvslqmdnlkpedtavyychvledrvdsfhdywgqgtqvtvss[0216]-gsgs-[0217]kiaalkekiaalkekiaalke[0218]seq id no:19 1b3 fab的纳米抗体-gsgsg-e3螺旋的氨基酸序列[0219]qvqlqesggglvqpggslrlscaasgrtisryamswfrqapgkerefvavarrsgdgafyadsvqgrftvsrddakntvylqmnslkpedtavyycaidsdtfysgsydywgqgtqvtvss[0220]-gsgsg-[0221]eiaalekeiaalekeiaalek[0222]seq id no:20改造后的β2-肾上腺素受体β2ar-mbril-k3-aeekra-alfa的氨基酸序列[0223]devwvvgmgivmslivlaivfgnvlvitaiakferlqtvtnyfitslacadlvmglavvpfgaahilmkmwtfgnfwcefwtsidvlcvtasietlcviavdryfaitspfkyqslltknkarviilmvwivsgltsflpiqmhwyrathqeaincyaeetccdfftnqayaiassivsfyvplvimvfvysrvfqeakrql[0224]adlednwetlndnlkviekadnaaqvkdaltkmraaaldaqkasgsgspemkdfrhgfdilvgqiddalklanegkvkeaqaaaeqlkttrnayiqkyl[0225]kfclkehkalktlgiimgtftlcwlpffivnivhviqdnlirkevyillnwigyvnsgfnpliysrspdfriafqell[0226]kiaalkekiaalkekiaalke[0227]aeekra[0228]srleeelrrrlte[0229]seq id no:21改造后的adgrl3-mbril-aa-alfa的氨基酸序列[0230]aveareimwfktrqgqiakqpcpagtigvstylclapdgiwdpqgpdlsncsspwvnhitqklksgetaaniarelaeqtrnhlnagditysvramdqlvglldvqlrnltpggkdsaarslnklqkrerscrayvqamvetvnnllqpqalnawrdlttsdqlraatmllhtveesafvladnllktdivrentdniklevarlstegnledlkfpenmghgstiqlsantlkqngrngeirvafvlynnlgpylstenasmklgtealstnhsvivnspvitaainkefsnkvyladpvvftvkhikqseenfnpncsfwsyskrtmtgywstqgcrllttnkthttcscnhlanfavlmahvevkhsdavhdllldvitwvgillslvclliciftfcffrglqsdrntihknlcislfvaellfliginrtdqpiacavfaallhffflaaftwmflegvqlyimlvevfesehsrrkyfylvgygmpalivavsaavdyrsygtdkvcwlrldtyfiwsfigpatliiml[0231]nviflgialykmfhht[0232]adlednwetlndnlkviekadnaaqvkdaltkmraaaldaqkasgsgspemkdfrhgfdilvgqiddalklanegkvkeaqaaaeqlkttrnayiqkyl[0233]era[0234]dnikswvigaiallcllgltwafglmyinestvimaylftifnslqgmfififhcvlqkkvrkeygkalrth[0235]aa[0236]srleeelrrrlte[0237]以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。









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