一种基于双金属化合物的双模式光电化学生物传感器的制备与应用 专利技术说明

测量装置的制造及其应用技术1.本发明涉及一种光电化学免疫传感器的制备与应用，具体说是一种以znin2s4/nico2s4/ptca为传感平台，以cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps为标记物的夹心型免疫传感器，本发明属于新型功能材料、生物传感技术领域。背景技术：2.癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，cea）是首先从结肠癌和胚胎组织中提取的一种肿瘤相关抗原，是一种具有人类胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，存在于内胚层细胞分化而来的癌症细胞表面，以往把cea作为早期诊断结肠癌和直肠癌的特异性标志物，经大量的临床实践，发现不仅胃肠道的恶性肿瘤cea值可以升高，在乳腺癌、肺癌及其他恶性肿瘤的血清中也有升高。因此，癌胚抗原是一种广谱肿瘤标志物，虽然不能作为诊断某种恶性肿瘤的特异性指标，但在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测、疗效评价等方面，仍有重要临床价值，因此我们需要开发新的检测方法完成对cea的检测。3.光电化学免疫传感器是基于免疫传感器更加进步的一种分析检测技术，而且是免疫传感器中研究最早也较为成熟的一个分支。光电化学生物传感器基于激发光源和分析系统的分离，广泛应用于生物标记物的检测。电化学免疫传感器具有高选择性、高灵敏性和低检出限等优点，在免疫分析方面具有广泛的应用。4.nico2s4和znin2s4都表现出n型半导体特性，两者形成的异质结可以降低表面反应能垒并利用其协同作用，加强两种半导体之间的电荷自扩散，这意味着形成强电场；nico2s4的导带和价带与znin2s4匹配良好，但是znin2s4的带隙相对较窄，光生电子空穴复合率高有机物苝四羧酸（ptca）是一种理想的敏化剂，导致光生电子空穴复合率降低增加光电流信号；双金属氧化物cu1.5mn1.5o4-cfnss显示氧化物酶活性，在没有h2o2存在的情况下催化tmb变蓝，实现对cea的视觉检测；根据此方法构建的光电化学免疫传感器用于测定实际血清样本的pct浓度，表现出优异的稳定性和选择性，为pct的检测提供了一种新的方法。技术实现要素：5.本发明的目的之一是制备一种以znin2s4/nico2s4/ptca为传感平台，以cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps为标记物的夹心型免疫传感器。6.本发明的目的之二是将该传感器用于cea的高灵敏、特异性检。7.本发明的技术方案如下：1. 一种基于双金属化合物的双模式光电化学生物传感器的制备方法如下：(1) 将氧化铟锡（ito）玻璃被切割成0.8cmx2.0cm然后进行预处理作为电极使用，再使用去丙酮、乙醇和离子水进行超声清洗，清洗后在干燥箱中干燥；(2) 将10 μl，1 ~ 3 mg/ml znin2s4/nico2s4/ptca溶液滴加在电极上，室温下干燥；hs前体放入坩埚中，然后在马弗炉中在550℃（加热速度为1℃/min）下处理3h；(2) cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps的合成通过剧烈搅拌制备了cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps，首先，将10~ 20 mgcu1.5mn1.5o4-cfns溶于10~20mlau nps溶液中，然后在室温条件下震荡24h，之后通过离心收集并用超纯水洗涤三次，放置在60℃的真空烘箱中干燥过夜，获得cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps粉末产品； (3) cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps‑ꢀab2的合成称取6 mg cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps，加入3 ml pbs (ph=7.38)充分溶解之后，加入100 μl cea-ab2(10 μg/ml)，4 ℃恒温振荡24 h，在4℃下离心，向得到的沉淀物中加入3 ml pbs溶液得到cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps‑ꢀab2。10.4. 如权利1所述的一种基于双金属化合物的双模式光电化学生物传感器的制备与应用，其特征为用于cea的检测，检测步骤如下：(1) 光使用电化学工作站的三电极体系进行测试，所有的电化学测量都采用传统的三电极系统：一个饱和甘汞电极作为参考电极，一个铂电极作为对电极，所制备的光电化学免疫传感器为工作电极，通过恒电位电解i-t曲线法在ph为7.38的pbs缓冲液中进行电化学测量；(2) 在10 ml、ph 6.0 ~ 9.2的pbs缓冲溶液中，通过电化学方法，检测对不同浓度的cea标准溶液产生的电化学信号，绘制工作曲线；(3) 可视化检测采用uv-vis光谱进行测试，显色反应是含有tmb的hac-naac（ph=4.0）缓冲溶液进行,显色30min后进行的uv-可见光测量,检测对不同浓度的cea标准溶液产生的紫外吸收信号，绘制工作曲线；(4) 将待测cea样品溶液代替cea标准溶液进行测定。11.本发明的有益成果：(1) 本发明采用znin2s4/nico2s4/ptca作为基底材料，其具有优异的电化学活性和较低的电荷转移电阻，同时能够更大限度的结合抗体，具有较高且稳定的电化学信号，提高了检测cea的灵敏度；(2) 采用cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps作为标记物，与二抗进行孵化，表现出了优异的电化学性能；(3) 本发明采用znin2s4/nico2s4/ptca及cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps复合材料构建的超灵敏光电化学免疫传感器，基于此构建的传感器可应用于cea的临床检测，具有操作简单，检测快速，信号线性范围宽(0.1 pg/ml ~ 100 ng/ml)和检出限低(18 fg/ml)的优点。12.具体实施方式：实施例1一种基于双金属化合物的双模式光电化学生物传感器的制备与应用，其所述的znin2s4/nico2s4/ptca材料的制备步骤如下：(1) znin2s4的合成采用改进的水热法合成了花状结构的znin2s4材料：将1mmolzncl2、0.5mmolincl3和2mmol的硫代乙酰胺（taa）与10ml水和5ml乙醇混合，通过使用0.1m盐酸将混合溶液的ph值调节至1，将所得溶液加入聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，并在160 ℃下加热12小时，然后用乙醇洗涤获得的黄色沉淀物，并在60℃下干燥，取出后研磨成粉末，密封保存以备使用，获得znin2s4；(2) nico2s4的合成将0.20mmol co（no3）2·6h2o、0.50 mmol ni（no3）2·6h2o和2.0mmtaa加入到60ml去离子水中，然后加入10ml乙二醇并滴加1ml氨，并进行超声分散20min并进行搅拌1h，将所得溶液加入聚四氟乙烯不锈钢高压釜中在180℃持续12小时，反应后，用去离子水和乙醇洗涤多次，并在60℃的真空烘箱中干燥持续10小时，取出后研磨成粉末，密封保存以备使用，获得nico2s4； (3) znin2s4/nico2s4/ptca的合成通过剧烈搅拌制备了znin2s4/nico2s4/ptca：首先，将10mg znin2s4、15mg nico2s4和8mg ptca溶于15ml水溶液中，然后将混合液超声10 min，在室温条件下搅拌6h，之后通过离心收集并用超纯水洗涤三次，放置在60℃的真空烘箱中干燥过夜，获得znin2s4/nico2s4/ptca。13.实施例2所述的一种基于双金属化合物的双模式光电化学生物传感器的制备与应用，其所述的znin2s4/nico2s4/ptca材料的制备步骤如下：(1) znin2s4的合成采用改进的水热法合成了花状结构的znin2s4材料：将2mmolzncl2、1.0mmolincl3和3mmol的硫代乙酰胺（taa）与15ml水和10ml乙醇混合，通过使用0.1m盐酸将混合溶液的ph值调节至1，将所得溶液加入聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，并在160 ℃下加热18小时，然后用乙醇洗涤获得的黄色沉淀物，并在60℃下干燥，取出后研磨成粉末，密封保存以备使用，获得znin2s4；(2) nico2s4的合成将0.25mmol co（no3）2·6h2o、0.55 mmol ni（no3）2·6h2o和2.5mmtaa加入到60ml去离子水中，然后加入15ml乙二醇并滴加2ml氨，并进行超声分散20min并进行搅拌1h，将所得溶液加入聚四氟乙烯不锈钢高压釜中在180℃持续12小时，反应后，用去离子水和乙醇洗涤多次，并在60℃的真空烘箱中干燥持续10小时，取出后研磨成粉末，密封保存以备使用，获得nico2s4； (3) znin2s4/nico2s4/ptca的合成通过剧烈搅拌制备了znin2s4/nico2s4/ptca：首先，将15 mg znin2s4、16mg nico2s4和9mgptca溶于20 ml水溶液中，然后将混合液超声10 min，在室温条件下搅拌6h，之后通过离心收集并用超纯水洗涤三次，放置在60℃的真空烘箱中干燥过夜，获得znin2s4/nico2s4/ptca。14.实施例3所述的一种基于双金属化合物的双模式光电化学生物传感器的制备与应用，其所述的znin2s4/nico2s4/ptca材料的制备步骤如下：(1) znin2s4的合成采用改进的水热法合成了花状结构的znin2s4材料：将3mmolzncl2、1.5mmolincl3和4mmol的硫代乙酰胺（taa）与10~20ml水和5ml乙醇混合，通过使用0.1m盐酸将混合溶液的ph值调节至1，将所得溶液加入聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，并在160 ℃下加热24小时，然后用乙醇洗涤获得的黄色沉淀物，并在60℃下干燥，取出后研磨成粉末，密封保存以备使用，获得znin2s4；(2) nico2s4的合成将0.30mmol co（no3）2·6h2o、0.60 mmol ni（no3）2·6h2o和3.0mmtaa加入到60ml去离子水中，然后加入20ml乙二醇并滴加3ml氨，并进行超声分散20min并进行搅拌1h，将所得溶液加入聚四氟乙烯不锈钢高压釜中在180℃持续12小时，反应后，用去离子水和乙醇洗涤多次，并在60℃的真空烘箱中干燥持续10小时，取出后研磨成粉末，密封保存以备使用，获得nico2s4； (3) znin2s4/nico2s4/ptca的合成通过剧烈搅拌制备了znin2s4/nico2s4/ptca：首先，将20 mg znin2s4、17 mg nico2s4和10mgptca溶于25 ml水溶液中，然后将混合液超声10 min，在室温条件下搅拌6h，之后通过离心收集并用超纯水洗涤三次，放置在60℃的真空烘箱中干燥过夜，获得znin2s4/nico2s4/ptca。15.实施例4一种基于双金属化合物的双模式光电化学生物传感器的制备与应用，其所述的cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps-ab2材料的制备步骤如下： (1) cu1.5mn1.5o4-cfnss的合成采用水热法和退火合成了cu1.5mn1.5o4材料：将0.50g pvp、1.0 g尿素、1 mmol cu（no3）2·3h2o和0.5 mmol mn（no3）2·6h2o加入到30 ml混合溶液（eg:h2o=1:2）中，搅拌30分钟，然后转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应器中，并置于烘箱中在90℃下反应10h，反应结束时，将反应器中的产物转移到500ml烧杯中，并加入100ml去离子水,将烧杯放入超声仪器中超声处理1小时，得到cu-mn氢氧化物空心球（cu-mn-oh-hs）前体分散液，通过分级离心对产物进行纯化，首先，通过低速离心（100rpm，5分钟）去除尺寸较大的杂质,然后通过高速离心（8000rpm，3分钟）进一步处理上部分散液以获得纯cu-mn-oh-hs前体，将获得的cu-mn-oh-hs前体分别用去离子水和乙醇洗涤数次，并放入真空干燥炉中，在80℃下处理12h，制备cu1.5mn1.5o4-cfnss，通过煅烧制备了cu1.5mn1.5o4-cfnss，将cu-mn-oh-hs前体放入坩埚中，然后在马弗炉中在550℃（加热速度为1℃/min）下处理3h；(2) cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps的合成通过剧烈搅拌制备了cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps，首先，将10mgcu1.5mn1.5o4-cfns溶于10mlau nps溶液中，然后在室温条件下震荡24h，之后通过离心收集并用超纯水洗涤三次，放置在60℃的真空烘箱中干燥过夜，获得cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps粉末产品； (3) cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps‑ꢀab2的合成称取6 mg cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps，加入3 ml pbs (ph=7.38)充分溶解之后，加入100 μl cea-ab2(10 μg/ml)，4 ℃恒温振荡24 h，在4 ℃下离心，向得到的沉淀物中加入3 ml pbs溶液得到cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps‑ꢀab2。16.实施例5一种基于双金属化合物的双模式光电化学生物传感器的制备与应用，其所述的cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps-ab2材料的制备步骤如下： (1) cu1.5mn1.5o4-cfnss的合成采用水热法和退火合成了cu1.5mn1.5o4材料：将0.55g pvp、1.1g尿素、1.5mmol cu（no3）2·3h2o和0.6mmol mn（no3）2·6h2o加入到35ml混合溶液（eg:h2o=1:2）中，搅拌30分钟，然后转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应器中，并置于烘箱中在90℃下反应10h，反应结束时，将反应器中的产物转移到500ml烧杯中，并加入100ml去离子水,将烧杯放入超声仪器中超声处理1小时，得到cu-mn氢氧化物空心球（cu-mn-oh-hs）前体分散液，通过分级离心对产物进行纯化，首先，通过低速离心（100rpm，5分钟）去除尺寸较大的杂质,然后通过高速离心（8000rpm，3分钟）进一步处理上部分散液以获得纯cu-mn-oh-hs前体，将获得的cu-mn-oh-hs前体分别用去离子水和乙醇洗涤数次，并放入真空干燥炉中，在80℃下处理12h，制备cu1.5mn1.5o4-cfnss，通过煅烧制备了cu1.5mn1.5o4-cfnss，将cu-mn-oh-hs前体放入坩埚中，然后在马弗炉中在550℃（加热速度为1℃/min）下处理3h；(2) cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps的合成通过剧烈搅拌制备了cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps，首先，将15 mgcu1.5mn1.5o4-cfns溶于15mlau nps溶液中，然后在室温条件下震荡24h，之后通过离心收集并用超纯水洗涤三次，放置在60℃的真空烘箱中干燥过夜，获得cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps粉末产品； (3) cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps‑ꢀab2的合成称取6 mg cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps，加入3 ml pbs (ph=7.38)充分溶解之后，加入100 μl cea-ab2(10 μg/ml)，4 ℃恒温振荡24 h，在4 ℃下离心，向得到的沉淀物中加入3 ml pbs溶液得到cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps‑ꢀab2。17.实例6 一种基于双金属化合物的双模式光电化学生物传感器的制备与应用，其所述的cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps-ab2材料的制备步骤如下： (1) cu1.5mn1.5o4-cfnss的合成采用水热法和退火合成了cu1.5mn1.5o4材料：将0.60g pvp、1.2 g尿素、2 mmol cu（no3）2·3h2o和0.7mmol mn（no3）2·6h2o加入到40 ml混合溶液（eg:h2o=1:2）中，搅拌30分钟，然后转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应器中，并置于烘箱中在90℃下反应10h，反应结束时，将反应器中的产物转移到500ml烧杯中，并加入100ml去离子水,将烧杯放入超声仪器中超声处理1小时，得到cu-mn氢氧化物空心球（cu-mn-oh-hs）前体分散液，通过分级离心对产物进行纯化，首先，通过低速离心（100rpm，5分钟）去除尺寸较大的杂质,然后通过高速离心（8000rpm，3分钟）进一步处理上部分散液以获得纯cu-mn-oh-hs前体，将获得的cu-mn-oh-hs前体分别用去离子水和乙醇洗涤数次，并放入真空干燥炉中，在80℃下处理12h，制备cu1.5mn1.5o4-cfnss，通过煅烧制备了cu1.5mn1.5o4-cfnss，将cu-mn-oh-hs前体放入坩埚中，然后在马弗炉中在550℃（加热速度为1℃/min）下处理3h；(2) cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps的合成通过剧烈搅拌制备了cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps，首先，将20 mgcu1.5mn1.5o4-cfns溶于20mlau nps溶液中，然后在室温条件下震荡24h，之后通过离心收集并用超纯水洗涤三次，放置在60℃的真空烘箱中干燥过夜，获得cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps粉末产品； (3) cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps‑ꢀab2的合成称取6 mg cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps，加入3 ml pbs (ph=7.38)充分溶解之后，加入100 μl cea-ab2(10 μg/ml)，4 ℃恒温振荡24 h，在4 ℃下离心，向得到的沉淀物中加入3 ml pbs溶液得到cu1.5mn1.5o4-cfnss-au nps‑ꢀab2。18.实施例7一种基于双金属化合物的双模式光电化学生物传感器的制备方法如下：(1) 将氧化铟锡（ito）玻璃被切割成0.8cmx2.0cm然后进行预处理作为电极使用，再使用去丙酮、乙醇和离子水进行超声清洗，清洗后在干燥箱中干燥；(2) 将10 μl，1 mg/ml znin2s4/nico2s4/ptca溶液滴加在电极上，室温下干燥；(3) 将6 μl，1μg/ml cea一抗滴加在电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗体，室温下干燥；(4) 将3 μl，质量分数为1 % bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，室温下干燥；(5) 将6 μl，0. 1 pg/ml ~ 100 ng/ml一系列不同浓度的cea抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，室温下干燥；(6) 将10μl，1 mg/ml cu1.5mn1.5o4-cfnss-au npsꢀ‑ab2滴加于电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余二抗，室温下干燥。19.实例8一种基于双金属化合物的双模式光电化学生物传感器的制备方法如下：(1) 将氧化铟锡（ito）玻璃被切割成0.8cmx2.0cm然后进行预处理作为电极使用，再使用去丙酮、乙醇和离子水进行超声清洗，清洗后在干燥箱中干燥；(2) 将10 μl，2mg/mlznin2s4/nico2s4/ptca溶液滴加在电极上，室温下干燥；(3) 将6 μl，1.5μg/ml cea一抗滴加在电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗体，室温下干燥；(4) 将3 μl，质量分数为1.5% bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，室温下干燥；(5) 将6 μl，0. 1 pg/ml ~ 100 ng/ml一系列不同浓度的cea抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，室温下干燥；(6) 将10μl，2mg/ml cu1.5mn1.5o4-cfnss-au npsꢀ‑ab2滴加于电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余二抗，室温下干燥。20.实例9一种基于双金属化合物的双模式光电化学生物传感器的制备方法如下：(1) 将氧化铟锡（ito）玻璃被切割成0.8cmx2.0cm然后进行预处理作为电极使用，再使用去丙酮、乙醇和离子水进行超声清洗，清洗后在干燥箱中干燥；(2) 将10 μl，3 mg/ml znin2s4/nico2s4/ptca溶液滴加在电极上，室温下干燥；(3) 将6 μl，2 μg/ml cea一抗滴加在电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗体，室温下干燥；(4) 将3 μl，质量分数为2% bsa溶液滴加于电极上，用以封闭非特异性结合位点，干燥之后使用pbs洗去多余bsa，室温下干燥；(5) 将6 μl，0. 1 pg/ml ~ 100 ng/ml一系列不同浓度的cea抗原标准溶液滴加于电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余抗原，室温下干燥；(6) 将10μl，3 mg/ml cu1.5mn1.5o4-cfnss-au npsꢀ‑ab2滴加于电极上，室温下干燥之后，用pbs清洗，除去多余二抗，室温下干燥。21.实施例10 cea的检测步骤如下： (1) 光使用电化学工作站的三电极体系进行测试，所有的电化学测量都采用传统的三电极系统：一个饱和甘汞电极作为参考电极，一个铂电极作为对电极，所制备的光电化学免疫传感器为工作电极，通过恒电位电解i-t曲线法在ph为7.38的pbs缓冲液中进行电化学测量；(2) 在10 ml、ph 6.0 ~ 9.2的pbs缓冲溶液中，通过电化学方法，检测对不同浓度的cea标准溶液产生的电化学信号，绘制工作曲线；(3) 可视化检测采用uv-vis光谱进行测试，显色反应是含有tmb的hac-naac（ph=4.0）缓冲溶液进行,显色30min后进行的uv-可见光测量,检测对不同浓度的cea标准溶液产生的紫外吸收信号，绘制工作曲线；(4) 将待测cea样品溶液代替cea标准溶液进行测定。









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