一种基于CRISPR/Cas13a融合蛋白的RNA甲基化编辑工具 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术一种基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具技术领域1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具。背景技术：2.围绕中心法则的经典遗传学中，遗传信息由dna传递到rna再翻译成为蛋白质。近些年来随着生命科学的发展，越来越多的研究表明，中心法则之外诸多因素影响着遗传信息的传递，如染色体的高级结构，dna、rna和蛋白质的化学修饰等，学术界将它们统称为表观遗传学。同时，越来越多的证据表明，表观遗传在诸多人类的生理现象如疾病、衰老、干细胞再生的过程中起到关键的作用。随着第一个rna去甲基化酶fto的发现，rna的表观修饰被越来越多的研究者重视，其中，rna的m6a甲基化修饰作为丰富度最高的rna修饰形式，被诸多研究证明在多种生理过程中尤其是疾病的发生中起到关键作用。对rna的m6a修饰的精确研究，尤其是单基因水平的研究，是目前rna的m6a研究领域内有待突破的关键点，同时对特定基因的rna进行修饰已达到对基因表达调控和特定生理过程的调控方面有着重要意义的实用价值。3.然而，尽管目前学界对rna的修饰尤其是m6a的修饰在不同物种、同一物种不同细胞以及人类疾病中研究颇多，但基本都是通过对m6a相关基因进行敲除、敲低从而改变在目标物种或细胞中全局m6a水平实现的。这主要存在四方面局限：首先，诸多研究证实m6a的调控机制十分精确，很有可能每个基因的产物的m6a修饰都有其特定功能，全局改变m6a修饰并不能直接反应某个基因的rna的修饰与全局敲除后所表现出的形状有完全直接的关系；第二，诸多证据表明m6a修饰相关基因在功能上除了与m6a修饰相关还有其它功能，例如fto作为去m6a修饰酶的同时还与肥胖相关细胞通路有关系，如果直接将这些m6a基因进行限制而得出的结果有可能是敲除、敲低该基因后引起的副作用而非m6a改变引起；第三，m6a目前已经被证实在基因表达调控，尤其是基因组3d结构中起到了关键作用，如果为了研究某个基因的m6a修饰而敲除、敲低m6a相关基因导致全局m6a改变，很可能引起基因组3d结构的改变最终影响到基因表达，因此也会对最终得到的科学结果产生影响；第四，目前有个别国外团队试图通过第二代测序技术以及敲除、敲低m6a相关基因来实现基于m6a的精准医疗，但进展均不顺利，如何实现对m6a修饰的精确调控是该精准疗法的关键所在。4.因此，现有技术对实现单基因水平的m6a修饰的调控编辑依然具有很高的挑战性，这也为基于编辑m6a修饰的基因治疗构成了瓶颈。故而，现有技术还有待改进。技术实现要素：5.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，旨在从单基因水平上对特定rna靶向并调控靶向rna的m6a修饰，实现在不改变细胞全局m6a水平的前提下精准调控特定rna的m6a水平，解决目前rna m6a修饰领域无法对特定rna靶向并调控靶向rna的m6a修饰情况的问题；同时，针对多个crrna在细胞内表达效率低且无法实现多crrna同时表达期间每个crrna表达量相同，本发明设计并构建可通过单个u6启动子实现表达多个crrna的载体，解决了针对多个靶点的rna靶向以及靶向后m6a的编辑。6.本发明的技术方案如下：7.一种基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，其中，所述工具包括crispr/cas13a反应体系、cas13a融合蛋白、crrna以及单u6启动子介导的多crrna表达体系；其中，所述cas13a融合蛋白为cas13a蛋白与m6a相关修饰蛋白融合得到，所述m6a相关修饰蛋白为甲基化酶或去甲基化酶，所述crrna特异性靶向目标rna，所述单u6启动子介导的多crrna表达体系由单个u6启动子介导多crrna表达并靶向多目标rna。8.所述的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，其中，所述甲基化酶为mettl3蛋白，所述去甲基化酶为fto蛋白。9.所述的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，其中，所述cas13a蛋白为dcas13a蛋白。10.所述的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，其中，所述cas13a融合蛋白为dcas13a-mettl3融合蛋白，和/或dcas13a-fto融合蛋白。11.所述的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，其中，所述dcas13a-mettl3融合蛋白由dcas13a-mettl3瞬转载体或dcas13a-mettl3病毒载体表达得到，所述dcas13a-fto融合蛋白由dcas13a-fto瞬转载体或dcas13a-fto病毒载体表达得到。12.所述的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，其中，所述dcas13a-mettl3瞬转载体以pst1374质粒为骨架，n端到c端分别为nls细胞核定位信号、dcas13a蛋白、连接多肽链、mettl3蛋白、nls细胞核定位信号、p2a多肽以及mcherry荧光蛋白；所述dcas13a-fto瞬转载体以pst1374质粒为骨架，n端到c端分别为nls细胞核定位信号、fto蛋白、连接多肽链、mettl3蛋白、nls细胞核定位信号、p2a多肽以及mcherry荧光蛋白；所述dcas13a-mettl3病毒载体以lenticas9质粒为骨架，包括u6启动子以及crrna表达序列，由n端到c端分别为nls细胞核定位信号、dcas13a蛋白、连接多肽链、mettl3蛋白、nls细胞核定位信号、p2a多肽以及mcherry荧光蛋白；所述dcas13a-fto病毒载体以lenticas9质粒为骨架，包括u6启动子以及crrna表达序列，由n端到c端分别为nls细胞核定位信号、fto蛋白、连接多肽链、mettl3蛋白、nls细胞核定位信号、p2a多肽以及mcherry荧光蛋白。13.所述的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，其中，所述工具还包括m6a修饰水平报告系统，所述m6a修饰水平报告系统包括定点检测m6a丰度的环状rna载体。14.所述的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，其中，所述环状rna载体的ires元件下游区域加入了m6a甲基酶识别序列。15.一种基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具的应用，其中，将如上任一所述的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具应用于单基因水平上对目标rna的靶向并调控目标rna的m6a修饰。16.所述的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具的应用，其中，调控目标rna的m6a修饰包括提高目标rna的m6a水平或者降低目标rna的m6a水平。17.有益效果：本发明提供了一种基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，利用cas13a融合蛋白和特异性靶向目标rna的crrna进行甲基化编辑，其中所述cas13a融合蛋白为cas13a蛋白与m6a相关修饰蛋白融合得到，所述m6a相关修饰蛋白为甲基化酶或去甲基化酶。本发明证实了工具dcas13a-mettl3融合蛋白可有效提高目标rna的m6a水平，相反dcas13a-fto融合蛋白可有效降低目标rna的m6a水平。同时，本发明设计了靶向内源性rna的crrna，证实工具dcas13a-mettl3以及dcas13a-fto在有crrna引导的情况下可以靶向并编辑内源性目标rna的m6a，从而影响靶向rna的稳定性及半衰期，证实工具u6启动子介导多crrna表达载体配合工具dcas13a-mettl3或dcas13a-fto可靶向并编辑多个目标rna的m6a。与传统rna甲基化研究方法对比，本发明实现了在不影响全转录组m6a水平的前提下对单个rna把靶向及m6a的精准且高效的编辑，大大提高了m6a研究的精确性以提高了基于m6a的编辑来实现对基因表达、rna稳定性、基因组结构的可靠性，同时提高了通过对m6a的编辑来实现表观遗传治疗的可行性。本发明与其它rna甲基化编辑工具相比，具有以下优势：1：可在普通细胞系表达外可通过病毒载体在难以表达的细胞中如小鼠胚胎干细胞中高效表达，扩宽了本应用广泛性；2：利用dcas13a的特性，设计并实现了表达单个u6启动子即可对多个rna或同一种rna的多个不同位点进行高效靶向及m6a的编辑；3：可应用于特定的m6a相关的生理过程如x染色体活跃性检测中。附图说明18.图1为本发明实施例提供的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具的概念示意图。19.图2为本发明实施例提供的crrna、dcas13a-mettl3及dcas13a-fto瞬转载体示意图。20.图3为本发明实施例提供的瞬转载体质粒图谱。21.图4为本发明实施例提供的crrna、dcas13a-mettl3及dcas13a-fto病毒载体示意图。22.图5为本发明实施例提供的病毒载体质粒图谱。23.图6为本发明实施例提供的多crrna同时表达载体示意图。24.图7为本发明实施例提供的基于环状rna表达水平的m6a报告工具示意图。25.图8为本发明实施例提供的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具的构建流程以及应用示意图。26.图9为本发明实施例提供的dcas13a-mettl3、dcas13a-fto瞬转载体在hek293t细胞中的表达结果示意图。27.图10为本发明实施例提供的dcas13a-mettl3、dcas13a-fto病毒载体在小鼠胚胎干细胞中的表达结果示意图。28.图11为本发明实施例利用western-blot验证dcas13a-mettl3、dcas13a-fto对环状rna报告系统的靶向以及特定位点的m6a修饰编辑能力结果示意图。29.图12为本发明实施例利用qpcr验证dcas13a-mettl3、dcas13a-fto对环状rna报告系统的靶向以及特定位点的m6a修饰编辑能力结果示意图。30.图13为本发明实施例利用m6a qpcr在hek293t细胞里测试dcas13a-mettl3、dcas13a-fto对内源性基因的m6a编辑能力结果示意图。31.图14为本发明实施例在hek293t细胞中利用dcas13a-mettl3或dcas13a-fto编辑特定基因m6a对靶向rna的稳定性影响结果示意图。32.图15为本发明实施例在小鼠胚胎干细胞中利用dcas13a-mettl3或dcas13a-fto编辑特定基因m6a对靶向rna的稳定性影响结果示意图。33.图16为本发明实施例通过结构设计实现单u6启动子表达多个crrna并引导dcas13a-mettl3或dcas13a-fto对不同rna进行靶向及编辑m6a结果示意图。具体实施方式34.本发明提供一种基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。35.本发明实施例提供一种基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，所述工具包括crispr/cas13a反应体系、cas13a融合蛋白、crrna以及单u6启动子介导的多crrna表达体系；述cas13a融合蛋白为cas13a蛋白与m6a相关修饰蛋白融合得到，所述m6a相关修饰蛋白为甲基化酶或去甲基化酶，所述crrna特异性靶向目标rna，所述单u6启动子介导的多crrna表达体系由单个u6启动子介导多crrna表达并靶向多目标rna。36.图1所示为本发明提供的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具的概念示意图。由图可知，dcas13a蛋白的c端融合了mettl3蛋白或fto蛋白，融合蛋白与可特异匹配rna某一段序列的crrna结合，靶向特定rna的特定序列，并由融合的mettl3对靶向rna进行加甲基或由融合的fto对靶向rna进行去甲基。与全基因组的敲除、敲降mettl3或fto相比，该技术有效的避免了全转录组m6a的干扰，并可特异性的靶向并编辑特定rna特定区域的m6a修饰。37.在一些实施方式中，所述m6a相关修饰蛋白为甲基化酶或去甲基化酶。在哺乳动物细胞中rna的m6a甲基化主要由mettl3mettl14wtap聚合物实现，其中mettl3因为包含m6a催化结构，因此rna的加m6a过程主要由mettl3实现，因此本发明选择将mettl3与dcas13a融合来作为m6a甲基化编辑工具。另外，哺乳动物中rna的m6a去甲基化过程主要由fto、alkbh5相关蛋白单独完成，fto蛋白作为第一个被报道的m6a去甲基化酶以及后续诸多研究表明fto具备去m6a功能，因此本发明将dcas13a与fto融合来作为m6a去甲基化编辑工具。除此之外，alkbh5蛋白可潜在的作为fto的替换蛋白来与dcas13a融合实现去甲基化编辑的功能。38.在一些具体的实施方式中，所述cas13a蛋白为dcas13a蛋白。但不限于此，还可以为dcas9蛋白，dcas13b蛋白或dcas13d蛋白。39.在一些实施方式中，所述cas13a融合蛋白为dcas13a-mettl3融合蛋白，和/或dcas13a-fto融合蛋白。其中，所述dcas13a-mettl3融合蛋白由dcas13a-mettl3瞬转载体或dcas13a-mettl3病毒载体表达得到，所述dcas13a-fto融合蛋白由dcas13a-fto瞬转载体或dcas13a-fto病毒载体表达得到。40.在一些实施方式中，本发明实施例成功构建了cas13a融合蛋白的瞬转载体及慢病毒载体：41.dcas13a-mettl3瞬转载体：以pst1374为骨架的质粒表达载体，由上游到下游包括nls细胞核定位信号、dcas13a蛋白、连接多肽链、mettl3蛋白、nls细胞核定位信号、p2a多肽以及mcherry荧光蛋白，如图2a所示；同时，还构建了dcas13a-mettl3瞬转对照载体，如图2b，以及包含mettl3核心结构域的dcas13a-mtd瞬转载体，如图2c，其与dcas13a-mettl3瞬转载体的区别在于表达的是第395位甲硫氨酸突变为甘氨酸的功能缺失的mettl3突变蛋白。42.dcas13a-fto瞬转载体：以pst1374为骨架的质粒表达载体，由n端到c端分别为nls细胞核定位信号、fto蛋白、连接多肽链、fto蛋白、p2a多肽以及mcherry荧光蛋白，如图2d所示；同时，还构建了dcas13a-fto瞬转对照载体，如图2e，其与dcas13a-fto瞬转载体的区别在于表达的是第108位组氨酸突变为甘氨酸的功能缺失的突变fto蛋白。43.本发明实施例设计并构建了dcas13a-mettl3和dcas13a-fto瞬转载体以及对照载体，载体图谱如图3所示，利用lipo3000转染试剂将设计好的靶向内源性rna的crrna分别与瞬转载体或对照载体共转染进入细胞中，并利用mchrry荧光鉴定表达水平。转染48小时后加入终浓度为5μg/ml的转录抑制物质放线菌素(actinomycin d)，设置三组时间梯度分别为不加药加药、加药2小时、加药4小时，后分别提取每个对照组的总rna，并通过qpcr来对比“crrna-nt组”和“crrna-靶向组”直接目标rna降解速率，并算出rna的半衰期。经过测算“crrna-靶向组”的rna在dcas13a-mettl3共转染时半衰期要低于“crrna-nt组”与dcas13a-mettl3的共转染的rna的半衰期。相反的，dcas13a-fto靶向组的rna的半衰期对比“crrna-nt组”有显著提高。以上结果表明，本发明构建的dcas13a-mettl3和dcas13a-fto瞬转载体在有crrna引导的情况下可以靶向并编辑内源性rna的m6a，从而影响其降解速率及半衰期。44.dcas13a-mettl3病毒载体：以lenticas9为骨架的质粒表达载体为基础，构建包括u6启动子以及crrna表达序列，由n端到c端分别为nls细胞核定位信号、dcas13a蛋白、连接多肽链、mettl3蛋白、nls细胞核定位信号、p2a多肽以及mcherry荧光蛋白；同时，还构建了dcas13a-mettl3病毒对照载体，其与dcas13a-mettl3病毒载体的区别在于表达的是第395位甲硫氨酸突变为甘氨酸的功能缺失的mettl3突变蛋白，如图4所示。45.dcas13a-fto病毒载体：以lenticas9为骨架的质粒表达载体，包括u6启动子以及crrna表达序列，由n端到c端分别为nls细胞核定位信号、fto蛋白、连接多肽链、mettl3蛋白、p2a多肽以及mcherry荧光蛋白；同时，还构建了dcas13a-fto病毒对照载体，其与dcas13a-fto病毒载体的区别在于表达的是第108位组氨酸突变为甘氨酸的功能缺失的突变fto蛋白，如图4所示。46.针对难转染细胞如胚胎干细胞，外源dna转染效率低及外源蛋白表达效率低，本发明实施例设计并构建了可以通过慢病毒感染的crrna-dcas13a-mettl3以及crrna-dcas13a-fto慢病毒表达载体，质粒图谱如图,5所示。所述载体以慢病毒表达载体为基础，在慢病毒的5’ltr以及3’ltr中插入u6启动子和crrna骨架，以及ef1a启动子和细胞核定位多肽，dcas13a-mettl3或dcas13a-fto，细胞核定位多肽，2a多肽以及mcherry荧光蛋白。将上述载体与病毒包装载体pcmv-dr8.91和pmd2.g通过lipo3000转染进hek293t细胞内，48后收病毒，再将病毒感染小鼠胚胎干细胞。感染12小时后换液，并于48小时后提取总rna，利用m6aqpcr检测47.crrna-dcas13a-mettl3以及crrnadcas13a-fto靶向rna的m6a修饰情况。通过计算得到crrna-dcas13a-mettl3对靶向rna的m6a修饰有提高作用，相反crrnadcas13a-fto对靶向的rna的m6a修饰有降低作用。同时，在感染48小时后的细胞分别加入终浓度为5μg/ml的转录抑制物质放线菌素(actinomycin d)，设置时间梯度对照：不加药、加药2小时、加药4小时，后分别提取总rna，利用qpcr测试并计算靶向rna的半衰期，与crrna-nt进行半衰期相比，crrna-dcas13a-mettl3靶向的rna半衰期有所降低，相反crrna-dcas13a-fto靶向的rna半衰期有所升高。最终，本发明提供的crrna-dcas13a-mettl3以及crrna-dcas13a-fto慢病毒表达载体可以在小鼠胚胎干细胞中稳定表达，并可以靶向编辑目标rna的m6a修饰，从而影响靶向rna的稳定性及半衰期。48.在一些实施方式中，本发明实施例还构建了若干靶向细胞内源性rna的crrna，并将构建好的crrna分别与dcas13a-mettl3瞬转载体和dcas13a-fto瞬转载体转入细胞内，并提取总rna利用qpcr、select、免疫沉淀(ip)等手段检测dcas13a-mettl3、dcas13a-fto在有crrna引导的情况下对目标rna的靶向及m6a的编辑能力。通过检测结果得出dcas13a-mettl3以及dcas13a-fto可以靶向并编辑内源性rna的m6a。具体的，靶向细胞内源性rna的crrna包括靶向sgk1、malat1、h1f0、xist以及不靶向任何rna的nt-crrna。49.在一些实施方式中，本发明实施例还构建了单crrna表达序列以及多crrna表达序列。单crrna表达序列的u6启动子后接crrna序列；多crrna表达序列通过对多crrna表达框的设计，实现通过一个u6启动子同时表达多个crrna，如图6所示。50.本发明实施例通过优化通过单u6启动子表达多个crrna，从而靶向多个rna或单个rna多个位点。由于m6a的修饰在转录组中普遍存在，同时单个rna上也有多个m6a修饰热点，因此要深入研究m6a修饰，必然需要同时靶向多个rna或靶向同一rna不同位点，然而同时表达多个u6 crrna载体时各个crrna的表达效率无法统一，同时多质粒载体表达有可能降低载体转化效率。针对此，本发明根据cas13a蛋白可自行组装包含多个crrna的序列，将一条包含多个crrna的rna链切割为多个单独crrna这一特性，设计了单u6启动子表达多个crrna的序列。51.在一个具体的实施例中，本发明将包含靶向三个基因(malat1、id3、h1f0)的crrna盒子分别与dcas13a-mettl3、dcas13-fto共转染进入细胞中，48小时后收集总rna，对靶向的三个基因的m6a水平检测，相比crrna-nt、dcas13a-mettl3与crrna盒子靶向的rna的m6a水平显著提升；相反，dcas13a-fto与crrna盒子靶向的rna的m6a水平显著降低。结果表明，本发明设计的单u6启动子的crrna盒子配合dcas13a-mettl3或dcas13a-fto可以对多个rna靶点的m6a进行修饰。52.在一些实施方式中，所述的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具还包括m6a修饰水平报告系统，所述m6a修饰水平报告系统包括定点检测m6a丰度的环状rna载体。53.具体的，所述环状rna载体的核糖体进入位点(ires)元件下游区域加入了m6a甲基酶识别序列ggacu。54.本发明实施例还构建了可以反映特定位点碱基的m6a丰度的环状rna表达载体，如图7所示。根据m6a在环状rna上的核糖体进入位点(ires)与下游翻译区域第一个aug之间区域的胞嘧啶a的m6a修饰会促进环状rna翻译这一特点，本发明设计了一种可以报告环状rna特定位点(ires与aug间)的a的m6a修饰水平的报告系统，该系统通过将ires与下游翻译区域第一个aug间加入m6a甲基酶识别序列ggacu来影响该区域m6a水平，从而直接影响环状rna翻译水平，进而通过检测环状rna翻译水平来报告ires与下游翻译区域第一个aug间区域a的m6a修饰水平。本发明设计并构建了可以靶向ggacu区域的多个crrna，分别与dcas13a-mettl3或者dcas13a-fto转染入细胞中，检测dcas13a-mettl3和dcas13a-fto融合蛋白对环状rna特定位点的m6a修饰的编辑能力。结果表明，dcas13a-mettl3融合蛋白可有效提高靶向环状rna的目标序列的m6a水平，相反dcas13a-fto融合蛋白可有效降低靶向环状rna的目标序列的m6a水平。55.本发明实施例还提供了一种基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具的应用，将所述的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具应用于单基因水平上对目标rna的靶向并调控目标rna的m6a修饰。图8所示即为本发明基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具的构建流程以及应用示意图。56.在一些实施方式中，调控目标rna的m6a修饰包括提高目标rna的m6a水平或者降低目标rna的m6a水平。57.本发明提供的基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，可以从单基因水平上对特定rna靶向并调控靶向rna的m6a修饰，实现在不改变细胞全局m6a水平的前提下精准调控特定rna的m6a水平，解决了目前rna m6a修饰领域无法对特定rna靶向并调控靶向rna的m6a修饰情况的问题。58.下面通过具体实施例对本发明一种基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具做进一步的解释说明：59.实施例1构建cas13a融合蛋白瞬转载体及病毒载体60.构建dcas13a-mettl3瞬转载体、dcas13a-fto瞬转载体(图2)，并利用荧光显微镜验证dcas13a-mettl3、dcas13a-fto瞬转载体在hek293t细胞中的表达效率。结果如图9所示，由图可知，本发明构建的dcas13a-mettl3、dcas13a-fto瞬转载体可在hek293t细胞中高效表达。61.构建crrna-dcas13a-mettl3病毒载体以及crrna-dcas13a-fto病毒载体(图4)，用于在小鼠胚胎干细胞中表达crrna以及dcas13a-mettl3、dcas13a-fto。所述载体以慢病毒表达载体为基础，在慢病毒的5’ltr以及3’ltr中插入u6启动子和crrna骨架，以及ef1a启动子和细胞核定位多肽，dcas13a-mettl3或dcas13a-fto，细胞核定位多肽，2a自剪接多肽以及mcherry荧光蛋白。转染慢病毒载体与病毒包装载体进入hek293t细胞中，48小时后收病毒，并将含有病毒的培养基加入到小鼠胚胎干细胞中感染，12小时后换为小鼠胚胎干细胞培养液，48小时后观察红色荧光蛋白以判断dcas13a-mettl3或dcas13a-fto的表达水平。结果如图10所示，由图可知，dcas13a-mettl3或dcas13a-fto病毒载体可高效表达于小鼠胚胎干细胞中。62.实施例2构建定点检测m6a丰度的环状rna载体63.根据m6a在环状rna上某些特定位点会促进环状rna翻译这一特点，设计了一种可以报告环状rna特定位点的m6a修饰水平的报告系统，如图7所示。该系统通过将核糖体进入位点(ires)下游区域加入m6a甲基酶识别序列ggacu来影响该区域m6a水平，直接影响环状rna翻译水平从而直观反映特定位点rna的m6a修饰水平。64.本发明设计并构建了可以靶向ggacu区域的多个crrna，其靶向的位点序列如表1所示：65.表1dcas13a-mettl3或crrna-dcas13a-fto载体，在hek293t细胞中包装并生产慢病毒，感染小鼠胚胎干细胞，48小时后收集全rna，利用m6a qpcr对比crrna和dcasa-mettl3或dcas13a-fto靶向的细胞sox2、klf4特定位点的m6a修饰水平，结果如图14所示。结果显示，相比对照的crrna-nt，crrna-dcas13a-mettl3或crrna-dcas13a-fto转染细胞，crrna靶向的dcas13a-mettl3显著提高了靶向rna的m6a修饰水平；相反的，crrna靶向的dcas13a-fto显著降低了靶向rna的m6a修饰水平。75.实施例5特定rna的m6a编辑对靶向rna的降解速率的影响76.利用dcas13a-mettl3或dcas13a-fto对特定rna的m6a进行编辑，改变靶向rna的降解速率，从而影响基因表达。设计并构建可以靶向hek293t细胞中基因的crrna：sgk1、h1f0和对照crrna-nt。利用lipo3000试剂将不同crrna和dcasa-mettl3或dcas13a-fto分别转染进hek293t细胞中，转染48小时后将同一个crrna转染的细胞分为3组，分别加入5μg/ml的转录抑制物质放线菌素(actinomycin d)，时间对照为加药0小时、加药2小时、加药4小时，反应时间到达后分别提取rna，利用qpcr测试并计算靶向rna的降解速率并得出半衰期(如图14)，与crrna-nt进行半衰期相比，crrna-dcas13a-mettl3靶向的rna半衰期有所降低，相反crrna-dcas13a-fto靶向的rna半衰期有所升高。77.包装能够表达靶向sox2或klf4的crrna、dcas13a-mettl3或dcas13a-fto的慢病毒并感染小鼠胚胎干细胞，感染48小时后小时后将同一个crrna转染的细胞分为3组，分别加入5μg/ml的转录抑制物质放线菌素(actinomycin d)，时间对照为加药0小时、加药2小时、加药4小时，反应时间到达后分别提取rna，利用qpcr测试并计算靶向rna的降解速率并得出半衰期(如图15)，与crrna-nt进行半衰期相比，crrna-dcas13a-mettl3靶向组的rna半衰期有所降低，相反crrna-dcas13a-fto靶向组的rna半衰期有所升高。78.实施例6单u6启动子表达多个crrna对不同rna进行靶向及m6a的编辑79.根据cas13a组装未成熟的crrna的核糖核酸酶结构域与切割靶向rna的核糖核酸酶结构域不同这一特点，即使本发明使用突变切割靶向rna核糖核酸酶结构域的dcas13a也并不影响dcas13a蛋白对未成熟的crrna的组装，因此通过结构设计出包含三个未成熟crrna的crrna链并由单u6启动子启动表达，藉由dcas13a-mettl3或dcas13a-fto对crrna链中未成熟的crrna处理得到三条靶向不同位置的成熟的crrna，从而实现对不同rna进行靶向及编辑m6a的目的。由于m6a的修饰在转录组中普遍存在，同时单个rna上也有多个m6a修饰热点，因此要深入研究m6a修饰，必然需要同时靶向多个rna或靶向同一rna不同位点，然而同时表达多个包含u6启动子crrna的载体时各个载体的转染效率无法统一而导致crrna表达效率不一，同时多质粒载体表达有可能降低载体转化效率。针对此，根据cas13a组装未成熟的crrna的核糖核酸酶结构域与切割靶向rna的核糖核酸酶结构域不同这一特点，即使本发明使用突变切割靶向rna核糖核酸酶结构域的dcas13a也并不影响dcas13a蛋白对未成熟的crrna的组装，因此通过结构设计出包含三个未成熟crrna的crrna链并由单u6启动子启动表达(见图7)，将包含靶向三个基因(malat1、id3、h1f0)的crrna的组装载体分别与dcas13a-mettl3、dcas13-fto共转染进入细胞中，48小时后收集总rna，对靶向的三个基因的m6a水平检测，相比crrna-nt，dcas13a-mettl3与crrna组装载体靶向的rna的m6a水平显著提升，相反，dcas13a-fto与crrna组装载体靶向的rna的m6a水平显著降低(图16)。结果表明本发明设计的单u6启动子的crrna组装序列载体配合dcas13a-mettl3或dcas13a-fto可以靶向多个rna并成功实现目标对rna位点m6a修饰的编辑。80.综上所述，本发明提供了一种基于crispr/cas13a融合蛋白的rna甲基化编辑工具，利用cas13a融合蛋白和特异性靶向目标rna的crrna进行甲基化编辑，其中所述cas13a融合蛋白为cas13a蛋白与m6a相关修饰蛋白融合得到，所述m6a相关修饰蛋白为甲基化酶或去甲基化酶。本发明设计并构建了cas13a融合蛋白的瞬转载体及慢病毒载体，以及可以定点检测m6a丰度的环状rna载体，以及所述单u6启动子介导的多crrna表达载体，证实了工具dcas13a-mettl3融合蛋白可有效提高目标rna的m6a水平，相反dcas13a-fto融合蛋白可有效降低目标rna的m6a水平。同时，本发明设计了靶向内源性rna的crrna，证实工具dcas13a-mettl3以及dcas13a-fto在有crrna引导的情况下可以靶向并编辑内源性目标rna的m6a，从而影响靶向rna的稳定性及半衰期，证实工具u6启动子介导多crrna表达载体配合工具dcas13a-mettl3或dcas13a-fto可靶向并编辑多个目标rna的m6a。与传统rna甲基化研究方法对比，本发明实现了在不影响全转录组m6a水平的前提下对单个rna把靶向及m6a的精准且高效的编辑，大大提高了m6a研究的精确性以提高了基于m6a的编辑来实现对基因表达、rna稳定性、基因组结构的可靠性，同时提高了通过对m6a的编辑来实现表观遗传治疗的可行性。本发明与其它rna甲基化编辑工具相比，具有以下优势：1、可在普通细胞系表达外可通过病毒载体在难以表达的细胞中如小鼠胚胎干细胞中高效表达，扩宽了本应用广泛性；2、利用dcas13a的特性，设计并实现了表达单个u6启动子即可对多个rna或同一种rna的多个不同位点进行高效靶向及m6a的编辑；3：可应用于特定的m6a相关的生理过程如x染色体活跃性检测中。81.应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。









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