促进番茄红素生物合成的基因用途 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于植物遗传学领域，具体涉及一个促进番茄果实中番茄红素生物合成的基因用途。背景技术：2.番茄红素(lycopene)是一种天然色素，广泛存在于番茄、胡萝卜、西瓜、木瓜及石榴等成熟的红色植物果实中，以番茄果实中其含量最高，也是衡量番茄果实品质的一项重要指标。因为，番茄红素是目前被认为具有最强抗氧化能力的植物性营养素之一，可以通过清除人体细胞产生的自由基，达到抗氧化、延缓衰老的作用，并且还在预防神经系统疾病、抑制肿瘤、预防心血管疾病、提高免疫力和延缓骨质疏松等诸多方面起到较好的保健功效，在保健营养食品开发领域具有广阔的应用前景。3.目前，番茄红素的生物合成途径及其相关酶已经研究的比较清楚。在植物体中，番茄红素优先通过1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸(doxp)途径进行生物合成，其直接前体物质是异戊烯焦磷酸(ipp)，在质体中由doxp经过一系列酶催化合成，然后ipp在其异构酶作用下生成二甲基丙烯焦磷酸酯(dmapp)，ipp与dmapp在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(ggps)作用下形成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)；再经八氢番茄红素合成酶(psy)这一关键酶的催化，合成八氢番茄红素；八氢番茄红素又依次在八氢番茄红素脱氢酶(pds)和ζ-胡萝卜素脱氢酶(zds)催化下逐步进行脱氢反应形成番茄红素。4.研究发现促进番茄红素合成途径中关键酶基因psy、pds、zds的表达能显著提高番茄红素的产量；细胞分裂素cks合成基因slipt4通过直接影响ζ-胡萝卜素异构酶基因ziso和zds正向调节番茄红素的生物合成；番茄果实成熟正调控因子nor-like1调控slacs2的表达，促进番茄红素积累；抑制cul4基因会增加质体数量，从而导致番茄果实中番茄红素的积累；抑制slnac1基因会通过调控acc合酶2基因acs2、番茄红素β-环化酶基因lcyb、psy1等相关基因的表达，使番茄果实中的番茄红素含量增加。因此，发掘调控番茄红素生物合成的新基因，促进番茄红素的产量并开展育种应用，具有重要的理论意义和生产价值。5.发明专利《基因增强对番茄灰霉病抗性的用途》(申请号：202110058943.x)公布了solyc05g004600基因具有抗番茄灰霉病的功能。技术实现要素：6.本发明要解决的技术问题是如何有效促进植物中番茄红素的生物合成量。7.为了解决上述技术问题，本发明提供了促进植物中番茄红素生物合成的基因(负调节植物中番茄红素生物合成的基因)的用途：所述基因是核苷酸序列如seq id no：1所示的solyc05g004600，在番茄中敲除solyc05g004600基因能促进(有效促进)植物果实中番茄红素生物合成量。8.作为本发明的用途的改进：所述植物为番茄。9.作为本发明的用途的进一步改进：在solyc05g004600基因中设计crispr/cas9编辑靶点的sgrna序列：5'-gttgttcaacatgagcagag-3’；根据该sgrna序列人工合成引物并构建至crispr/cas9载体中。10.作为本发明的用途的进一步改进：敲除solyc05g004600基因后所得的纯合突变株系的核苷酸序列如seq id no:2所示。11.作为本发明的用途的进一步改进：与野生型番茄品种microtom相比，敲除基因solyc05g004600后番茄果实的番茄红素含量显著性增高；番茄红素生物合成途径中关键酶编码的基因psy表达水平也显著性增高。12.本发明提供了番茄的solyc05g004600基因，该基因编码蛋白的核苷酸序列如seq id no：1所示。13.本发明还同时提供了在番茄中敲除solyc05g004600基因的方法，包括以下步骤：14.1)、设计crispr/cas9编辑的靶向序列：5'-gttgttcaacatgagcagag-3’；15.2)、利用步骤1)所得的序列构建solyc05g004600基因的crispr/cas9基因编辑载体；16.3)、将步骤2)所得的载体遗传转化至野生型番茄中，对其基因组中的solyc05g004600基因进行定向编辑，获得敲除基因solyc05g004600的突变植株，其果实的番茄红素生物合成量显著高于野生型对照品种。17.本发明的技术方案具体如下：18.首先，利用crispr/cas9基因编辑技术，设计特异性靶向编码solyc05g004600基因的sgrna序列(seq id no:1)，构建crispr/cas9载体，并将该敲除载体遗传转化到野生型番茄品种micro-tom中，获得相应的转基因植株。19.然后，采用pcr技术对转基因植株中solyc05g004600基因进行扩增和测序，鉴定获得了敲除该基因的突变株系ko-#1与ko-#2，其突变位点的测序结果如图1所示，这两个突变株系来自不同的转化愈伤，它们中solyc05g004600基因的序列均为seq id no:2。待番茄果实成熟后，通过检测野生型micro-tom与突变株系ko-#1与ko-#2植株果实的番茄红素含量，发现突变植株的番茄红素含量均显著性高于野生型micro-tom(图2)。20.为了证明solyc05g004600基因调控了番茄中番茄红素的生物合成，利用pcr扩增获得基因solyc05g004600序列(seq id no：1)，并构建solyc05g004600基因的过表达载体，再将该过表达载体遗传转化到野生型番茄品种micro-tom中，获得相应的转基因植株。然后，采用qrt-pcr技术检测转基因植株中solyc05g004600基因的表达水平，鉴定获得了该基因的过表达株系oe-#1与oe-#2，其目的基因的表达水平如图3所示。待番茄果实成熟后，通过检测野生型micro-tom与过表达株系oe-#1与oe-#2植株果实的番茄红素含量，发现过表达株系oe-#1与oe-#2的番茄红素含量均显著性低于野生型micro-tom(图4)。21.同时，选取了番茄红素生物合成途径中一个关键酶(八氢番茄红素合成酶)的编码基因psy，用qrt-pcr技术分析了野生型micro-tom、突变株系ko-#1与ko-#2、过表达株系oe-#1与oe-#2的果实中psy基因的表达水平，发现在突变植株中psy基因的表达显著性高于野生型micro-tom，而在过表达植株中psy基因的表达显著性低于野生型micro-tom(图5)。这些结果进一步表明，solyc05g004600基因负调控了番茄中番茄红素的生物合成，因此在番茄中敲除solyc05g004600基因能促进番茄红素的生物合量，从而提高了果实的番茄红素含量。solyc05g004600基因及其用途具有重要的应用价值。22.需要强调的是：发明专利《基因增强对番茄灰霉病抗性的用途》(申请号：202110058943.x)仅仅公布了solyc05g004600基因具有抗番茄灰霉病的功能，与本发明涉及的促进番茄红素生物合成的用途没有任何相关性。附图说明23.图1是solyc05g004600基因敲除株系ko-#1与ko-#2的编辑位点测序结果；24.图2是solyc05g004600基因敲除株系ko-#1与ko-#2果实的番茄红素含量；25.图3是solyc05g004600基因过表达株系oe-#1与oe-#2的鉴定；26.图4是solyc05g004600基因过表达株系oe-#1与oe-#2果实的番茄红素含量；27.图5是番茄红素合成关键酶基因psy的表达分析。28.图中**表示其与野生型对照品种间具有极显著性差异。具体实施方式29.步骤1、solyc05g004600基因敲除的crispr/cas9载体构建(参照202110058943.x的发明专利《基因增强对番茄灰霉病抗性的用途》)30.根据solyc05g004600基因的编码序列(seq id no:1)，利用guide design resources在线软件(http://crispr.mit.edu/)，设计sgrna序列：5'-gttgttcaacatgagcagag-3’；并根据该序列合成相应的引物：31.上游5'-tgattgttgttcaacatgagcagag-3'，32.下游5'-aaacctctgctcatgttgaacaaca-3'。33.采用crispr/cas9试剂盒(biogle)构建相应的crispr/cas9载体，构建方法按照产品说明进行操作。34.步骤2、solyc05g004600基因crispr/cas9载体的番茄遗传转化35.将步骤1构建的crispr/cas9载体遗传转化到番茄品种micro-tom，使其对基因组中的solyc05g004600基因进行定向编辑，转基因方法根据采用kimura等方法(kimura s et al,chs protoc,2008)，获得相应该的转基因番茄植株。36.步骤3、转基因番茄中solyc05g004600基因编辑位点的鉴定37.采用sds法，提取转基因番茄植株及其野生型micro-tom的基因组dna。取番茄叶片0.1g，用液氮研磨后，加600μl提取液(15.76g tris-cl，29.22g nacl，15.0g sds粉末加超纯水定容至1l，调节ph＝8.0)，65℃温育60min；加200μl kac(5mol/l)，混匀后，冰浴10min；再加500μl氯仿，混匀，10000rpm离心5min；取上清，加入500μl异丙醇，混匀，12000rpm离心3min，弃去上清；用75％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心3min，弃去上清；倒置干燥dna 15min后，加30μl纯水溶解dna。38.用以上提取的番茄基因组dna为模板，采用hs dna polymerase(takara)进行pcr扩增，pcr引物为f1：5’‑tagagttggaacctttgtaat-3’与r1：5’‑ttgttcctccaaagtcaatat-3’。pcr扩增体系为：primestar hs(premix)25μl，f1与r1引物(10μm)各1μl，模板dna 2μl(《200ng)，无菌水21μl；pcr扩增程序为：95℃预变性5min；98℃变性10sec，58℃退火15sec，72℃延伸60sec，30个循环；72℃延伸5min。39.pcr产物经寄生物公司进行测序分析后，测序引物为f1。从中鉴定出3’与r4：5’‑ctgtggacaatggaaggac-3’。49.pcr反应体系为：cdna 2μl、green premix ex taq 10μl、f3与r3引物(或f4与r4；浓度均为10μm)各1μl、ddh2o 5.6μl、rox reference dye 0.4μl。在stepone plustm real-time pcr system(applied biosystems)运行pcr，运行程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环，并采用2‑△△ct法分析solyc05g004600基因的表达水平。测定结果采用t检验分析突变体与野生型对照之间的显著性差异。50.结果如图3所示，在过表达株系oe-#1与oe-#2植株中solyc05g004600基因的表达量远远高与野生型品种micro-tom。51.说明：作为常识，内参的作用是：在检测目的基因的表达时，为了去除不同标本在rna的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别，从而获得目标基因特异性表达的真正差异，通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。52.步骤7、solyc05g004600基因过表达植株的番茄红素含量测定53.按照步骤4所述方法，对solyc05g004600基因过表达株系oe-#1与oe-#2植株、及其野生型对照品种micro-tom果实的番茄红素进行测定，结果如图4所示，过表达株系oe-#1与oe-#2的番茄红素含量均显著性低于野生型micro-tom。54.solyc05g004600基因的表达量与番茄红素含量及其合成基因的表达水平成反比。55.步骤8、番茄红素合成关键酶基因psy的表达分析56.按照步骤6所述方法，检测solyc05g004600基因的突变株系ko-#1与ko-#2、过表达株系oe-#1与oe-#2、及其野生型对照品种micro-tom的果实中psy基因的表达水平。测定结果采用t检验分析突变体与野生型对照之间的显著性差异。psy基因的pcr引物的序列为f5:5’‑acgaaacagaaatacttggc-3’与r5:5’‑cttccgacaacttcttttgg-3’。所得结果如图5所示，突变株系ko-#1与ko-#2植株果实的psy基因表达水平都显著性高于野生型micro-tom，而过表达株系oe-#1与oe-#2植株果实的psy基因表达水平都显著性低于野生型micro-tom。证明solyc05g004600基因参与调控了番茄红素合成关键酶基因psy的表达，从而影响了番茄红素的生物合成。57.最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。









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