桂花品种鉴定的SNP标记组合、引物组合及分子身份证 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术桂花品种鉴定的snp标记组合、引物组合及分子身份证技术领域本发明涉及分子标记技术领域，具体而言，涉及桂花品种鉴定的snp标记组合、引物组合及分子身份证。背景技术：桂花(osmanthus fragrans lour.)隶属于木犀科(oleaceae)木犀属(osmanthus)，是一种观赏与实用价值兼备的木本经济树种，也是我国传统的十大名花之一，在中国的园林、花文化中有着重要的地位。在人工引种驯化的漫长过程中，桂花由天然野生至人工栽培，由南方向北方推进，应用范围日益扩大。通过种内变异的积累和与木犀属近缘种的杂交，桂花形成了丰富的种内变异和品种资源，目前已明确的品种数目约有160余个。然而，现有的桂花种质资源之间缺乏谱系关系的记载，且存在严重的同物异名和同名异物现象，既不利于标准化栽培技术的推广应用和品种优良特性的发挥，也不利于国际交流与贸易的正常开展。因此，建立一套经济、高效、准确的品种鉴别方法，是实现品种权保护与科学管理的重要前提，对于桂花产业发展具有重要意义。近年来，植物品种资源鉴定技术已经从形态标记向高通量分子鉴定技术发展。dna指纹鉴定技术具有不受周围环境影响、快捷、准确和精准等优点，是植物新品种保护技术体系的重要组成部分。利用先进的生物技术和物联网等信息技术，建立品种dna身份信息数据库和全国统一查询平台，推行标签标识品种dna身份信息，能够实现品种身份快捷化、智能化查询。因此非常有必要在利用形态学方法鉴定品种纯度和真实性的同时，选择主流的高通量分型技术筛选核心引物，构建现有植物栽培品种的分子指纹图谱和数字指纹身份证，为后期进一步整合电子计算机技术的优势建立现有植物品种形态学数据和指纹图谱数据信息平台打下基础，实现植物品种快速检索和比对的功能。分子标记中具有共显性的特点的ssr和snp标记在稳定性和有效性上优势明显，被国际植物新品种保护联盟分子测试指南推荐作为指纹图谱数据库构建的首选标记。与ssr相比，snp标记为第三代分子标记，具有密度大、变异来源丰富、潜在数量巨大、适合数据库整合和数据共享、与功能基因甚至植物表型关联度高等优点。此外，随着各种snp高通量检测平台的出现，snp标记被公认是极具应用前景的分子标记技术，已在生物学、农业、医学和生物进化等领域得到了广泛应用。其中，lgc公司推出的kasp(kompetitive allele specific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)技术，具有更加高效、灵活、准确、低成本的优势特点，在葡萄、甘蓝、玉米等作物的品种鉴定和品种保护工作中得到成功应用。但是至今为止，snp标记和kasp基因组分型技术在桂花品种鉴定中的应用仍是空白，尚未有研究筛选出最少的snp位点组合来区分更多的主流桂花品种，并构建桂花品种分子身份证或条形码，以达到高效、准确、经济的鉴定目的。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供桂花品种鉴定的snp标记组合、引物组合及分子身份证以通过尽可能少的snp标记组合构建特异单倍型，实现桂花品种高效、准确、经济的鉴定。本发明是这样实现的：第一方面，本发明提供了一种桂花品种鉴定的snp标记组合，snp标记组合包括14个snp标记，14个snp标记分别为snp1、snp2、snp3、snp4、snp5、snp6、snp7、snp8、snp9、snp10、snp11、snp12、snp13和snp14，snp1标记位于桂花1号染色体，其在桂花全基因组序列第2570938位的碱基为g或a；snp2标记位于桂花2号染色体，其在桂花全基因组序列第27947738位的碱基为c或t；snp3标记位于桂花3号染色体，其在桂花全基因组序列第24737420位的碱基为g或a；snp4标记位于桂花6号染色体，其在桂花全基因组序列第3953530位的碱基为g或a；snp5标记位于桂花7号染色体，其在桂花全基因组序列第4581291位的碱基为c或g；snp6标记位于桂花9号染色体，其在桂花全基因组序列第11920715位的碱基为g或a；snp7标记位于桂花11号染色体，其在桂花全基因组序列第7705120位的碱基为c或t；snp8标记位于桂花13号染色体，其在桂花全基因组序列第24914140位的碱基为a或c；snp9标记位于桂花14号染色体，其在桂花全基因组序列第1455309位的碱基为c或t；snp10标记位于桂花15号染色体，其在桂花全基因组序列第27882455位的碱基为t或a；snp11标记位于桂花18号染色体，其在桂花全基因组序列第26280736位的碱基为g或t；snp12标记位于桂花23号染色体，其在桂花全基因组序列第10404919位的碱基为a或c；snp13标记位于桂花23号染色体，其在桂花全基因组序列第17820664位的碱基为c或t；snp14标记位于桂花23号染色体，其在桂花全基因组序列第20338374位的碱基为t或g；snp的物理位置是基于桂花“日香桂”(genbank no.prjna529305)的全基因组序列确定。上述snp标记组合是发明人基于生物信息学方法结合数理统计等科学算法挑选出的14个桂花核心snp标记设计得到，利用该套标记引物组合进行kasp分型，分型结果稳定准确，鉴定效率高，可完全区分涵盖四个品种群的89个桂花品种。在一种可选的实施方式中，桂花的品种包括如下品种群中的至少2个：四季桂品种群、金桂品种群、银桂品种群和丹桂品种群。例如包括四季桂品种群、金桂品种群和银桂品种群。在一种可选的实施方式中，四季桂品种群包括9个品种、金桂品种群包括29个品种、银桂品种群包括28个品种、丹桂品种群包括23个品种。四季桂品种群包括：橙黄四季桂、淡妆、墨宝香、日香桂黄、日香桂、四季桂(齿叶四季桂)、天女散花、天香台阁和圆叶四季桂；金桂品种群包括：编金桂、长瓣金桂、长柄金桂、丛中笑、大花金桂、大叶黄、大叶金桂、芙蓉桂、杭州黄、黑珍珠、金桂河边、金球桂、金秋早、金狮桂、镰叶金桂、柳叶黄、柳叶金桂、柳叶苏桂、漓锗金桂、球桂、软叶金桂、山茶金桂、速生金桂、小花金桂、湘金、小叶金桂、圆瓣金桂、柱冠金桂和早秋红；银桂品种群包括：白洁、波叶银桂、柴桂、长叶碧珠、串银球、长叶银桂、大叶银桂、宽叶籽银、绿梗籽银、柳叶桂、密结银桂、青尖、速生银桂、晚银桂、尾叶银桂、秀丽银桂、香云、小叶苏桂、玉帘碧珠、玉玲珑、玉帘银丝、杨梅叶银桂、银星、银盏碧珠、玉柱、中华龙桂、籽银桂和早银桂；丹桂品种群包括：齿丹桂、橙红丹桂、橙香丹桂、鄂橙、红桂、火炼金丹、娇容、莲籽丹桂、满条红、平脉丹桂、软叶丹桂、上海丹桂、桃叶丹桂、晚霞、武夷丹桂、雄黄桂、象山丹桂、小叶丹桂、堰虹桂、硬叶丹桂、醉肌红、朱砂丹桂和状元红。第二方面，本发明还提供了检测上述的桂花品种鉴定的snp标记组合的引物组合，14个snp标记组合标记snp1、snp2、snp3、snp4、snp5、snp6、snp7、snp8、snp9、snp10、snp11、snp12、snp13和snp14分别依次通过以下引物扩增得到：seq id no:1–3，seq id no:4–6，seq id no:7–9，seq id no:10–12，seq id no:13–15，seq id no:16–18，seq idno:19–21，seq id no:22–24，seq id no:25–27，seq id no:28–30，seq id no:31–33，seq id no:34–36，seq id no:37–39，seq id no:40–42。上述每组检测snp标记的引物组合都包括两个正向pcr引物，和一个反向pcr引物。通过这三个引物配合荧光pcr实现该snp位点的可能基因型的确认，从而对品种进行鉴定。在一种可选的实施方式中，引物组合为kasp引物组合。第三方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括上述的引物组合；在一种可选的实施方式中，试剂盒还包括pcr buffer。在一种可选的实施方式中，上述试剂盒还包括探针，在探针的5’端标记有荧光基团，在探针的3’端标记有猝灭基团。第四方面，本发明还提供了一种构建桂花品种分子身份证的方法，包括以下步骤：s1，采用重测序技术对目标桂花品种的桂花基因组dna进行测序，筛选出核心snp位点；s2，根据筛选出的核心snp位点设计合成kasp引物组合，用设计出的kasp引物组合进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行检测；s3，根据检测结果挑选核心kasp标记，采用r语言脚本从中筛选出能鉴定所有品种的snp标记组合；然后根据筛选出的snp标记组合进行桂花品种分子身份证的构建。在本发明应用较佳的实施方式中，上述目标桂花的品种包括如下品种群中的至少2个：四季桂品种群、金桂品种群、银桂品种群和丹桂品种群；在一种可选的实施方式中，四季桂品种群包括9个品种、金桂品种群包括29个品种、银桂品种群包括28个品种、丹桂品种群包括23个品种；四季桂品种群包括：橙黄四季桂、淡妆、墨宝香、日香桂黄、日香桂、四季桂(齿叶四季桂)、天女散花、天香台阁和圆叶四季桂；金桂品种群包括：编金桂、长瓣金桂、长柄金桂、丛中笑、大花金桂、大叶黄、大叶金桂、芙蓉桂、杭州黄、黑珍珠、金桂河边、金球桂、金秋早、金狮桂、镰叶金桂、柳叶黄、柳叶金桂、柳叶苏桂、漓锗金桂、球桂、软叶金桂、山茶金桂、速生金桂、小花金桂、湘金、小叶金桂、圆瓣金桂、柱冠金桂和早秋红；银桂品种群包括：白洁、波叶银桂、柴桂、长叶碧珠、串银球、长叶银桂、大叶银桂、宽叶籽银、绿梗籽银、柳叶桂、密结银桂、青尖、速生银桂、晚银桂、尾叶银桂、秀丽银桂、香云、小叶苏桂、玉帘碧珠、玉玲珑、玉帘银丝、杨梅叶银桂、银星、银盏碧珠、玉柱、中华龙桂、籽银桂和早银桂；丹桂品种群包括：齿丹桂、橙红丹桂、橙香丹桂、鄂橙、红桂、火炼金丹、娇容、莲籽丹桂、满条红、平脉丹桂、软叶丹桂、上海丹桂、桃叶丹桂、晚霞、武夷丹桂、雄黄桂、象山丹桂、小叶丹桂、堰虹桂、硬叶丹桂、醉肌红、朱砂丹桂和状元红。在本发明应用较佳的实施方式中，上述步骤s1包括：采用重测序技术对目标桂花品种进行测序，获得全基因组snp变异位点；对获得的全基因组范围的snp位点进行四次特异性筛选，得到核心snp位点。在本发明应用较佳的实施方式中，上述四次特异性筛选包括：(1)筛选出snp位点在89份桂花品种中基因型无缺失，次要等位基因频率maf》0.05的snp位点，完成第一次筛选；(2)去除snp位点前后50bp有其他变异的snp位点，完成第二次筛选；(3)筛选出多态信息含量(pic)在0.2–0.5之间的snp位点，完成第三次筛选；(4)仅保留位于基因外显子区且在染色体上均匀分布的snp位点，完成第四次筛选。在本发明应用较佳的实施方式中，上述s2步骤中，pcr扩增的反应条件包括：预变性95℃10min；梯度降温扩增95℃15s、55℃–61℃60s，10个循环(每循环减少0.6℃)；普通扩增95℃15s、55℃60s，30-32个循环；在一种可选的实施方式中，s3步骤包括：根据分型结果挑选出分型准确、在染色体上均匀分布的标记作为核心标记；然后使用r语言脚本，基于87个核心snp在测序的89份桂花品种的基因型数据，先“初筛”出能鉴别所有供试桂花品种的snp鉴定组合，再在“初筛”基础上“循环精简”snp鉴定组合中的snp，达到“去冗余”的目的，最终筛选出能鉴别全部参试桂花品种的最少snp数量的标记组合。此外，本发明还提供了一种构建桂花品种指纹图谱的方法，包括以下步骤：s1，采用重测序技术对目标桂花品种的桂花基因组dna进行测序，筛选出核心snp位点；s2，根据筛选出的核心snp位点设计合成kasp引物组合，用设计出的kasp引物组合进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行检测；s3，根据检测结果挑选核心kasp标记，采用r语言脚本从中筛选出能鉴定所有品种的snp标记组合。第五方面，本发明还提供了一种桂花品种分子身份证，其由上述的构建桂花品种分子身份证的方法构建获得。利用该套snp标记组合构建桂花品种分子身份证，可有效提升桂花品种纯度和真实性的检测效率。同时，利用条码生成器对14个位点的桂花品种基因型进行了条码表述，为桂花品种身份快捷化、智能化查询提供了便利，也为新品种审定及特异性评价提供科学依据。在一种可选的实施方式中，桂花品种分子身份证包括以一维码和二维码的形式表示的代表品种的分子指纹码；在一种可选的实施方式中，桂花品种分子身份证还包括品种商品信息码；品种商品信息码包括品种群类别、产地和形态特征数据。第六方面，本发明还提供了一种桂花品种鉴定的方法，包括以下步骤：确定待测桂花的dna在上述的桂花品种鉴定的snp标记组合中14个snp位点的基因型，与上述的分子身份证中所有的桂花品种的基因型进行对比；若待测样本的分子指纹码与的桂花分子身份证中任意一种桂花品种的分子指纹码比对结果完全一致，则继续通过株形、皮孔、花色、花香、果实等形态学特征进行比较；若一致，则待测桂花品种为或候选为该桂花品种；若二者分子指纹码比对结果不一致，则与基因型近似品种进行形态学特征比较，若存在差异，则判定待测桂花为新品种；在一种可选的实施方式中，将新品种添加进分子指纹码中。第七方面，本发明还提供了如桂花品种鉴定的snp标记组合、引物组合或分子身份证在桂花分子辅助育种中的应用。本发明具有以下有益效果：本发明公开了一种桂花品种鉴定的snp标记组合，该标记组合基于生物信息学方法结合数理统计等科学算法挑选出14个桂花核心snp标记设计得到，利用该套标记引物组合进行kasp分型，分型结果稳定准确，鉴定效率高，可完全区分涵盖四个品种群的89个桂花品种。利用该套snp标记组合构建桂花品种分子身份证，可有效提升桂花品种纯度和真实性的检测效率。同时，利用条码生成器对14个位点的桂花品种基因型进行了条码表述，为桂花品种身份快捷化、智能化查询提供了便利，也为新品种审定及特异性评价提供科学依据。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为利用位点snp 7对应的引物进行kasp基因分型技术的检测图谱；图2为利用位点snp 9对应的引物进行kasp基因分型技术的检测图谱；图3为桂花品种“状元红”的snp指纹二维码；图4为14个snp位点的鉴别效率。具体实施方式现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:alaboratory manual)》，第二版(sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)》(m.j.gait编，1984)；《动物细胞培养(animal cell culture)》(r.i.freshney编，1987)；《酶学方法(methods in enzymology)》(学术出版社有限公司(academic press，inc.)；《实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)》(j.m.miller和m.p.calos编，1987)；《当代分子生物学方法(current protocols in molecular biology)》(f.m.ausubel等人编，1987)；《pcr:聚合酶链反应(pcr:the polymerase chain reaction)》(mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(current protocols in immunology)》(j.e.coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供了一种用于桂花分子身份证构建的snp位点组合，以及获得对应位点的桂花特异snp标记引物。所述snp位点snp1～snp14如表2所示：表2snp1～snp14在基因组上的位置信息引物组合序列为seq id no:1～seq id no:42，其标记名称和序列组成如表3所示。表3 14个snp位点seq id no:1～seq id no:42的kasp引物信息表实施例2本实施例提供一套包含实施例1中的用于桂花分子身份证构建的kasp引物组合的桂花snp指纹图谱库，且该指纹图谱库的构建方法包括以下步骤：s1，提取所有实验品种的基因组dna，本实施例中一共89种；s2，对该89个样本进行高通量重测序，获得全基因组snp标记10,320,901个，同时使用gatk、vcftools、plink等软件进行过滤，筛选出高质量snp位点；s3，根据筛选出的高质量snp位点设计合成出kasp引物组合，用设计出的kasp引物组合进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行检测；s4，根据分型结果挑选出分型准确、在染色体上均匀分布的标记作为核心标记，采用r语言脚本从中筛选出能鉴定所有品种的snp标记组合；本实施例采用具有代表性的89份桂花品种为实验对象，具体为四季桂品种9种、金桂品种29种、银桂品种28种、丹桂品种23种(见表1，该89个桂花品种来自浙江省杭州市余杭区国家桂花种质资源库)。表1 89份桂花品种信息步骤s1中采用ctab法提取桂花叶片dna，采用nanodrop 1000spectrophotometer(themo)紫外分光光度计检测dna浓度和纯度(od 260/280＝1.7–2.1)，并用超纯水将浓度稀释至100ng·μl-1，按编号装入96孔pcr板中，用于高通量扩增检测。步骤s2中采用全基因组重测序技术对所有实验桂花品种进行测序(每个样品的平均测序深度为8.09×)，将测序结果对比“日香桂”基因组草图(genbank no.prjna529305)，获得10,320,901个snp位点。基于这10,320,901个snp，依次进行如下四次特异性筛选：(1)筛选出snp位点在89份桂花品种中基因型无缺失，次要等位基因频率maf》0.05的snp位点，筛选出9,202,331个snp，完成第一次筛选；(2)去除snp位点前后50bp有其他变异的snp位点，剩余929,606个snp，完成第二次筛选；(3)筛选出多态信息含量(pic)在0.2–0.5之间的snp位点，筛选出467,736个snp，完成第三次筛选；(4)仅保留位于基因外显子区且在染色体上均匀分布的snp位点，完成第四次筛选，共筛选出533个高质量snp位点。为检验上述高质量snp标记的准确和稳定性，采用kasp技术对89份桂花品种进行基因分型验证。步骤s3中，通过与桂花品种‘日香桂’基因组比对，获得533个高质量snp位点前后各100bp的侧翼序列，设计合成kasp引物，其中有521个位点被成功设计出kasp引物，可用来进行kasp基因分型检测。合成引物时，所有正向引物1的5’端加上gaaggtgaccaagttcatgct接头序列；正向引物2的5’端加上gaaggtcggagtcaacggatt接头序列，正向引物1、正向引物2和反向引物带有不同的荧光基团，所述荧光基团分别为fam、hex和rev。在进行荧光实时定量pcr扩增时，按下表(如表4)配置反应体系，并放入abi quantstudio5荧光定量pcr仪中进行扩增及检测数据分析。采用的pcr反应条件表5所示。表4kasp基因分型pcr反应体系表5荧光实时定量pcr反应条件pcr扩增产物的荧光结果读取，具体过程为：待pcr扩增产物温度降至30℃以下时通过酶标仪的fam、hex光束扫描读取荧光值(fam荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，hex荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断89个桂花品种基于每个snp位点的基因型。具体的基因型判断原则如下：聚合在x轴的显示红色的样本的基因型为连接fam荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近y轴上的显示蓝色的样本的基因型为连接hex荧光标签序列的等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，显示为黑色的样本为阴性对照。依据上述判断标准，从分型结果中挑选出分型准确、在染色体上均匀分布的snp作为核心标记，最终从521个snp位点中筛选出87个核心snp位点。进一步采用一个r语言脚本，基于87个核心snp在89份桂花品种中的基因分型结果，筛选能鉴定所有供试桂花品种的最少snp数量的鉴定组合，即一组仅用14个编码区snp就能完全区分所有试验桂花品种的标记组合。每份桂花品种在每个snp位点的分析结果如表6所示，其中snp7和snp9位点的分型结果如图1、图2所示。表6 89个桂花品种基因组上14个snp位点的分型情况利用位点snp1–snp14鉴定89份桂花品种，14个snp位点次要等位基因变异频率的变异范围为0.174–0.489，平均值为0.352；多态信息含量(pic)的变异范围为0.246–0.375，平均值为0.335，期望杂合度(he)指数的变异范围为0.288–0.500，平均值为0.431，在14个snp标记中，4个非同义突变，10个同义突变，有6个snp发生颠换，8个snp位点发生转换。如表7所示。表6指纹图谱中14个snp标记信息snp名称基因名称染色体物理位置变异类型picmafhesnp1vps35b12570938ts0.3750.4830.499snp2e5.1.3.15227947738ts0.3490.3430.451snp3glu324737420ts0.2750.2080.329snp4map65-363953530ts0.3510.3480.454snp54cll774581291tv0.2460.1740.288snp6recql5911920715ts0.3540.3600.461snp7ldl1117705120ts0.3740.4660.498snp8casbpx21324914140tv0.2510.1800.295snp9clasp141455309ts0.2710.2020.323snp10abcb191527882455tv0.3750.4890.500snp11scpl71826280736tv0.3700.4270.489snp12mcm42310404919tv0.3650.3990.480snp13sppl42317820664ts0.3750.4890.500snp14at4g226702320338374tv0.3560.3650.464实施例3本实施例提供一种桂花品种身份证的构建方法。该方法基于实施例2中的桂花指纹图谱，采用35个数字组成桂花品种身份证(如图3)，前1–7位数字为品种商品信息码，包括品种群类别、产地、以及稳定性好的形态特征数据；后8–35位数字为品种分子指纹码，代表品种的特异分子信息，并最终以一维码和二维码的形式表示，为品种资源简易管理与保护利用提供有效途径。包括如下步骤：1)桂花品种商品码的构建桂花品种商品码代表品种的基本商品信息，选择以下三个部分进行编码：(1)品种群代码。以一位数字表示，即金桂为1，银桂为2，丹桂为3，四季桂为4。(2)区域代码。用于表示桂花品种的来源地区，以我国各省的标准编码组成，即河南为41、湖北为37、浙江为33等，品种来源地不明确的用00表示。(3)形态学特征代码。选择花色，花香，花量和结实性四个稳定性好的形态学特征数据，用“1，2，3”表示桂花花色的“白，黄，红”三种类型，用“0，1，2，3”表示桂花花香的“不香，微香，中香，浓香”四种类型，用“1，2，3”表示桂花花量的“稀疏，中等，稠密”三种类型，用“0，1”表示桂花不结实和结实两种类型。例如桂花品种“状元红”的商品码为“3333220”，其中第1位的“3”表示丹桂品种群；第2、3位的“33”是区域代码，表示该品种来源地为浙江省；第4位的“3”表示花色为红色；第5位的“2”表示花香中等；第6位的“2”表示花量中等。第7位的“0”表示不结实。2)snp指纹码构建为构建身份证，对桂花品种的snp数据进行数字化编码。在14个snp标记中，共有10种基因型，分别为aa、gg、cc、tt、ca、gt、ag、ct、gc和ta，用数字1–4对碱基a、g、c、t进行编码。例如，“状元红”的14个snp标记基因型分别为ga、ct、ga、aa、cc、gg、ct、aa、cc、ta、tt、cc、ct和gg，转换成28位的指纹编码为2134211133223411334144333422，其中第1–4位的“2134”表示前两个snp位点snp1和snp2基因型为ga和ct，第5–8位的“2111”表示位列第3、4位的snp位点基因型为ga与aa，其余20位的编码以此类推。3)桂花品种身份证的构建桂花品种身份证由上述的商品码与指纹码构成，总数为35位。以“状元红”的品种身份证为例，身份证号为33332202134211133223411334144333422，即商品码为“3333220”，品种snp指纹码为2134211133223411334144333422。依照此方法对89个桂花品种的商品信息及snp数据进行数字化编码，得到89份桂花品种身份证(表7)，利用条码在线生成器(https://www.hlcode.cn/batch)进行二维码的转换，完成实施例2中的89份桂花品种身份证的构建(表8)。由表7中信息可知，能根据本发明公开的14个snp位点构建鉴定桂花品种身份证，用于区分不同的桂花品种。表7 89份桂花品种身份证90.表8 89份桂花品种的身份证条码信息实施例4本实施例是利用桂花品种身份证检测待测桂花品种是否为“状元红”。基于上述14个桂花分子标记，构建了桂花品种“状元红”的snp指纹，为：gactgaaaccggctaacctattccctgg，该品种的指纹二维码，如图3所示。随机挑选待测桂花品种，按照实施例2的步骤进行dna制备，同时使用14个核心snp标记集进行基因分型检测并获得其snp指纹图谱。pcr平台进行snp基因分型步骤同实施例2的描述。结果分析：通过对待测桂花品种的snp指纹图谱与真实的桂花品种“状元红”的snp指纹图谱进行比较。若二者完全相同，则进一步通过株形、皮孔、花色、花香、果实等形态学特征进行比较，若一致，则说明待测桂花品种是桂花品种“状元红”。若二者snp指纹图谱不一致，则与基因型近似品种进行形态学特征比较，若存在差异，则测试桂花为不同于本发明未涉及的新品种，并可考虑将该新品种添加进指纹图谱库中。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。









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