一种放疗增敏并激活远隔效应的中性粒细胞膜包裹纳米颗粒及其制备方法与应用 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明属于医药领域，具体涉及一种放疗增敏并激活远隔效应的中性粒细胞膜包裹纳米颗粒及其制备方法与应用。背景技术：2.化疗、手术以及放射治疗(radiotherapy，rt)是目前临床的三大肿瘤治疗方式，目前超过50％的癌症患者接受放射治疗。部分接受rt的患者出现了“远隔效应”的激活，即在局部病灶上进行rt时，未照射病灶或转移病灶也随rt缩小的现象。近年来，免疫治疗与rt联合治疗于各类实体肿瘤实现了协同治疗的疗效，并诱导远隔效应的增强。3.r837是toll样受体7激动剂，通过激活先天免疫反应表现出突出的抗肿瘤和抗病毒效应。已有研究表明r837可以增强rt诱导产生的抗肿瘤免疫。但r837水溶性低，难以系统给药，限制了其临床转化。通过纳米颗粒在实体瘤中的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect)能够显著提高药物在肿瘤的摄取，是目前解决脂溶性药物瘤内浸润效率低的主要方法。4.近年来，利用细胞膜包裹进行表面修饰的纳米颗粒展现了更好的稳定性以及更丰富的生物学功能，为纳米颗粒在生物医学应用中创造了更多的可能性。多种来源的细胞膜能够通过挤出的方法制备细胞膜包裹的纳米颗粒，能够保留细胞膜表面原有的生物学功能。活化的中性粒细胞能够通过rt募集中性粒细胞的过程相关。当前仍未有报道明确中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒具备放疗后肿瘤的靶向性。技术实现要素：5.本发明的目的是提供一种协同放疗并激活远隔效应的中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒及其制备方法。该纳米颗粒制备成本低、在体内稳定性好，具有良好的放疗后肿瘤靶向性，能够显著协同放疗并激活远隔效应。6.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：7.一种中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒(r837@plga@neu)，包括r837@plga纳米颗粒以及包覆于所述纳米颗粒外部的活化的中性粒细胞膜；8.其中，所述r837@plga纳米颗粒是利用plga聚合物对r837(咪喹莫特)进行包裹得到的。9.进一步的，所述中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒的粒径为80-200nm。10.进一步的，所述r837@plga纳米颗粒的粒径为60-150nm。11.上述采用活化的中性粒细胞膜，是因为由于常规的中性粒细胞的生物活性较低，通过lps外来抗原激活后才具有显著的生物学效应。12.本发明中所述的plga聚合物具体可为mpeg2000-bplga1000聚合物固体(r-pl1001-3kd，西安瑞禧生物)。13.本发明提供的中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒的制备方法，包括下述步骤：14.1)制备r837@plga纳米颗粒；15.2)将所述r837@plga纳米颗粒与中性粒细胞膜混合后，通过挤出器得到新型纳米颗粒r837@plga@neu。16.上述纳米颗粒r837@plga@neu的制备流程图如图1所示。17.上述方法步骤1)中，制备r837@plga纳米颗粒的具体方法如下：将plga聚合物的丙酮溶液与r837的dmso溶液混合，分散均匀；再利用注射器将得到的r837与plga的混合溶液滴入搅拌状态下的双蒸水中，滴加后反应30-60min待水化形成纳米颗粒后，用旋蒸仪快速将有机溶剂蒸发，用双蒸水洗涤纳米粒子离心收集得到r837@plga，通过测定洗涤后得到的上清液r837浓度，计算r837的载药量以及合成得到的r837@plga的质量。18.上述方法中，plga聚合物与r837的质量比可为1：2-1：3。19.所述plga聚合物的丙酮溶液的具体配制方法如下：取plga聚合物固体10mg，溶解于1ml丙酮中，超声使其溶解分散均匀。20.所述r837的dmso溶液的具体配制方法如下：取20mg的r837固体溶解于0.05ml dmso中。21.所述r837与plga的混合溶液的滴加速度可为1-2滴/s。22.所述搅拌为磁力搅拌，其搅拌转速可为600-800rpm。23.所述双蒸水的体积可为r837与plga的混合溶液体积的50-100倍。24.上述方法步骤2)中，所述活化的中性粒细胞膜按照本领域的常规方法进行提取，制备方法如下：密度梯度离心的方法获得的中性粒细胞在含有lps(100ng/ml)培养24h以进行活化，活化后的中性粒细胞在0.25×pbs溶液中裂解后进行离心，通过梯度离心组合处理除去细胞内容物，获得活化的中性粒细胞的细胞膜。冻干后中性粒细胞膜能够保存在-80℃条件下，并进行精准称量。25.上述方法步骤2)中，所述r837@plga纳米颗粒与中性粒细胞膜的质量配比为1：2-1：5。26.上述方法步骤2)中，所述混合为低功率(60-100w)超声混合，27.上述方法步骤2)中，所述挤出器的挤出孔径为200nm以及100nm。28.本发明利用中性粒细胞膜制备的一种新型纳米颗粒r837@plga@neu能够通过表面分子大量募集于放疗后肿瘤，用于将r837递送到放疗后肿瘤并达到协同放疗并激活远隔效应的目的。29.本发明还提供了上述中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒的应用。30.本发明所提供的中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒的应用，包括下述1)-3)至少一方面：31.1)在制备肿瘤放疗增敏剂中的应用；32.2)在制备治疗肿瘤产品中的应用；33.3)在制备抑制肿瘤组织生长的产品中的应用。34.其中，所述肿瘤为实体肿瘤，包括结直肠癌、肝癌、食管癌、胃癌、乳腺癌和肺癌等。35.所述肿瘤细胞，包括结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞和肺癌细胞等，具体可为ct26小鼠结肠癌细胞以及多种人源结直肠癌细胞(sw480、sw620、ht29、km12sm、hct116。36.本发明利用新型纳米颗粒与放疗进行综合治疗，将小分子免疫激动剂递送到肿瘤以刺激肿瘤免疫的形成。在纳米颗粒r837@plga的基础上，利用中性粒细胞膜包裹制备新型纳米颗粒r837@plga@neu，相比较传统的纳米颗粒，具有更高的生物相容性，更长的在体代谢时间，本发明首次明确中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒能够靶向放疗后肿瘤组织，为激活远隔效应提出了一个崭新的方法，提高了r837在肿瘤的递送效率，明确了中性粒细胞膜制备的仿生纳米药物与放疗结合的可行性，具有较高的临床转化应用前景。附图说明37.图1为本发明制备r837@plga@neu的流程图；38.图2为实施例1制备的r837@plga与r837@plga@neu的透射电镜图片；39.图3为实施例1制备的r837@plga与r837@plga@neu的粒径与zeta电位分析；40.图4为实施例1制备的r837@plga与r837@plga@neu的药物释放曲线；41.图5为实施例1制备的r837@plga与r837@plga@neu在结直肠癌细胞的毒性检测；42.图6为实施例1制备的r837@plga与r837@plga@neu治疗小鼠中主要器官的h&e染色切片；43.图7为实施例1制备的r837@plga与r837@plga@neu在单侧ct26荷瘤小鼠的荧光显像与定量分析；44.图8为实施例1制备的r837@plga与r837@plga@neu在双侧ct26荷瘤小鼠的荧光显像与定量分析；45.图9为实施例1制备的r837@plga与r837@plga@neu在单侧ct26荷瘤小鼠的治疗疗效；46.图10为实施例1制备的r837@plga与r837@plga@neu在双侧ct26荷瘤小鼠的治疗疗效。具体实施方式47.下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。48.实施例1、49.制备r837@plga：50.取mpeg2000-bplga1000聚合物固体(r-pl1001-3kd，西安瑞禧生物)10mg，溶解于1ml丙酮(270725，sigma-aldrich)中，超声使其溶解分散均匀。取20mg的r837固体溶解于0.05ml dmso(d2650，sigma-aldrich)中，随后与plga溶液混合，在超声发散下至溶液无显著悬浮固体。利用注射器将r837与plga混合溶液以1滴/s的速度加入800rpm转速磁力搅拌50倍体积的双蒸水中，滴加后反应30min待水化形成纳米颗粒后，用旋蒸仪快速将有机溶剂蒸发。用双蒸水洗涤纳米粒子离心收集得到r837@plga。51.进一步地，此步可以在制备过程中，在plga溶液中加入dylight649荧光染料1mg混匀，制备荧光标记的r837@plga。52.中性粒细胞膜提取与r837@plga@neu制备：53.中性粒细胞从6周龄sd大鼠血液中提取，使用中性粒细胞膜提取试剂盒(索莱宝)，通过密度梯度离心的方法获得中性粒细胞。中性粒细胞在含有lps(100ng/ml)的rpmi-1640培养基中培养24-48小时。离心后用pbs洗涤得到活化的中性粒细胞。通过0.25×pbs中的低渗裂解与反复冻融造成的机械破坏，活化中性粒细胞被裂解，通过800g、4℃离心10min除去细胞，10000g、4℃离心30min去除细胞器，最终100000g离心90min的梯度离心组合处理除去细胞内容物，获得活化中性粒细胞的细胞膜。将中性粒细胞膜与r837@plga以1：2的质量比混合，低功率超声使体系均匀，通过微型挤出机上的200nm纳米孔将细胞膜包被的纳米载体挤出，得到纳米粒r837@plga@neu。54.用tem观测r837@plga@neu形貌，用dls r837@plga@neu的尺寸和电位进行表征。结果如图2、3所示。55.由图2可知，r837@plga与r837@plga@neu在投射电镜下展示了粒径均一的球形结构，且r837@plga@neu周围存在细胞膜结构。56.由图3可知，r837@plga的粒径大小为180.9±41.9nm，zeta电位为-15.67±1.03mv；r837@plga@neu的粒径为250.2±54.7nm，zeta电位为-18.43±1.90mv。57.r837@plga@neu的载药量与药物释放测定：利用hplc测定不同浓度r837的hplc吸收峰面积，绘制吸收峰-浓度直线。取上述制备的纳米粒子时的初次离心上清液，根据标准曲线测定未结合r837浓度，并用于计算r837负载药物的剂量，计算公式为：载药量(drug loading content，dlc％)＝(投入r837总质量-未结合r837的质量)/纳米粒的质量×100％。58.结果如图4所示。由图4可知，r837在纳米药物中能够缓慢释放，在96h后达到50％左右的药物释放量。59.r837@plga@neu细胞毒性检测：实验中利用的ct26小鼠结肠癌细胞以及多种人源结直肠癌细胞(sw480、sw620、ht29、km12sm、hct116)购自美国模式培养物集存库(american type culture collection，atcc)，使用含有10％热灭活胎牛血清、1％青霉素和1％链霉素的rpmi 1640培养基培养，并置于二氧化碳浓度为5％的37℃恒温细胞培养箱中进行孵育。含720μg r837 r837@plga或r837@plga@neu与多种癌细胞系共培养72h，未处理的空白细胞作为对照；用cck-8试剂盒及活/死细胞染色等方法，检测纳米药物的细胞毒性。60.结果如图5所示。由图5可知，ct26细胞在孵育r837@plga或r837@plga@neu 24、48与72h后均无显著细胞生长抑制，在sw480、sw620、ht29、km12sm、hct116中，r837@plga或r837@plga@neu处理72h后同样无显著的细胞生长抑制。61.r837@plga@neu在体毒性检测：将含720μg r837的r837@plga或r837@plga@neu通过尾静脉注射法打入小鼠血液，注射后14天将小鼠安乐死取出心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺并在福尔马林溶液中固定。固定后进行切片与h&e染色，观察各器官的组织结构形态的变化。62.结果如图6所示。由图6可知，心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺在治疗过程中均不存在显著的器官毒性。63.在体验证纳米药物的肿瘤靶向性：纳米药物制备过程中，同时加入荧光染料，通过近红外荧光成像对纳米药物进行显像。将染色的(含720μg r837)r837@plga或r837@plga@neu注射到荷ct26的balb/c小鼠体内，利用maestro显像设备进行荧光显像，分析r837@plga或r837@plga@neu在体内的分布以及代谢时间，以及对肿瘤的靶向性。选取ct26小鼠右侧腿部荷瘤小鼠若干，随机分为放疗组(rt，n＝3)与未放疗组(non rt，n＝3)，放疗后进行显像，通过图像分析肿瘤部位的荧光强度。另外，选取ct26双侧腿部荷瘤小鼠，对右一侧进行放疗，放疗后注射r837@plga或r837@plga@neu并进行显像，分析两侧肿瘤荧光强度的变化与差异。64.结果如图7、图8所示。65.由图7可知，r837@plga与r837@plga@neu在单侧ct26荷瘤小鼠中存在显著的肿瘤摄取，在注射24h后达到最高的纳米药物摄取。66.由图8可知，r837@plga与r837@plga@neu在双侧ct26荷瘤小鼠中存在显著的肿瘤摄取差异，在注射24h后放疗后肿瘤的纳米药物摄取比对侧未照射肿瘤显著提高。67.肿瘤治疗效果：将右侧小腿荷ct26的balb/c小鼠随机分成6组(n＝6)：对照组、放疗组、r837@plga组、r837@plga@neu组、r837@plga+放疗组与r837@plga@neu+放疗组。待肿瘤体积达50-100mm3时开始治疗，纳米药物(含720μg r837)通过尾静脉注射的方式进行注射，放疗剂量为3次8gy的照射持续观察各组小鼠状态，测量小鼠肿瘤体积和体重。同时，构建双侧ct26的balb/c小鼠，连续观察小鼠待肿瘤体积达50-100mm3，进行与之前相同的治疗实验，放疗仅针对右侧肿瘤进行，并持续观察各组小鼠状态，测量小鼠肿瘤体积和体重。68.结果如图9、图10所示。69.由图9可知，r837@plga@neu在单侧ct26荷瘤小鼠展示了显著的放疗协同作用。70.由图10可知，r837@plga@neu在双侧ct26荷瘤小鼠展示了显著的放疗协同作用，且对于未照射肿瘤同样具有一定的抑制效果，表明远隔效应的产生。









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