一种Ti-SSC-Ag杀菌材料及其制备方法和应用 专利技术说明

农业,林业,园林,畜牧业,肥料饲料的机械,工具制造及其应用技术一种ti-ssc-ag杀菌材料及其制备方法和应用技术领域1.本发明属于抗菌材料领域，涉及一种ti-ssc-ag杀菌材料及其制备方法和应用。背景技术：2.蚕丝纤维由外层的丝胶（ss）和内层的丝素组成。在蚕丝脱胶过程中，ss被当成生物废物丢弃。由于其良好的亲水性、生物相容性、生物降解性和低免疫反应性，ss已被用于药物递送、组织工程和伤口愈合等领域。ss中含有酪氨酸，该氨基酸具有独特的反应性，可被酪氨酸酶氧化为3,4-二羟基苯丙氨酸（dopa）。因此，dopa结构可通过蛋白质侧链修饰引入到ss中，生成含儿茶酚的丝胶蛋白（ssc）。3.dopa在贻贝足蛋白的表面黏附过程中起着至关重要的作用。由于dopa独特的结构，含邻苯二酚的化合物和大分子被广泛用于材料表面改性和后功能化修饰。例如，通过儿茶酚衍生物或聚多巴胺的表面沉积，可进一步在表面引入两性离子聚合物、抗菌肽（amps）、壳聚糖、聚乙二醇（peg）、超支化聚甘油和聚（n-乙烯基吡咯烷酮）等具有抗菌/抗污性能的结构单元。儿茶酚修饰的peg、阳离子聚合物、两性离子聚合物、peg、amps、超支化聚甘油、硫酸化透明质酸等也可以直接黏附在基材表面。此外，表面固定的儿茶酚基团可原位还原金属离子（如ag+和au3+），在基材表面后修饰金属纳米粒子。原位形成的银纳米粒子（ag nps）可以产生氧化应力和释放银离子，具有较强的抗菌活性。4.钛（ti）及其合金具有高强度、低密度、良好的生物相容性以及在生理环境中的耐腐蚀性，常用于颅面修复、种植牙、人工关节、骨固定等生物医用材料。与体液或外部环境接触后，钛基植入物容易引起细菌黏附和细菌生物被膜形成，导致植入物相关感染（iais）。iais会引起炎症反应，影响血管生成和组织愈合，造成植入手术失败，严重的会导致患者死亡。为了使钛表面具有抗菌性能，通常需要在其表面构筑杀菌涂层，如在表面沉积纳米材料、抗生素、amps和阳离子型聚合物。5.受贻贝黏附蛋白启发，含儿茶酚的丝胶蛋白（ssc）能够沉积在钛片表面，表面残留的儿茶酚基团能够原位还原银离子，使得表面后修饰引入银纳米粒子，得到具有持久抗菌活性的ti-ssc-ag表面。技术实现要素：6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种ti-ssc-ag杀菌材料及其制备方法和应用，制备的ti-ssc-ag杀菌材料具有良好的生物相容性和抗菌性能。7.为实现上述目的，本发明具体提供了如下的技术方案：一种ti-ssc-ag杀菌材料，其特征在于，以钛片为基底，钛片上涂覆儿茶酚修饰的丝胶蛋白和银纳米颗粒，所述儿茶酚修饰的丝胶蛋白涂层由酪氨酸酶和丝胶蛋白的氧化反应制得，所述氧化反应是指丝胶蛋白上的酪氨酸集团被酪氨酸酶（多酚氧化酶）氧化为3,4-二羟基苯丙氨酸（dopa），形成儿茶酚修饰的丝胶蛋白（ssc）。ssc沉积的表面含有多余的儿茶酚基团，能够原位还原ag+离子，从而形成ag nps，所述结构与机理如说明书附图1所示。8.所述的一种ti-ssc-ag杀菌材料的制备方法，其特征在于，步骤为：1）将蚕茧去除杂质，采用碱提取法提取ss。经透析、离心和过滤后，得到纯化的ss溶液，将其储存在4℃冰箱中用于后续合成；2）将酪氨酸酶溶解在去离子水中，加入步骤1）所述的ss溶液进行反应，得到儿茶酚修饰丝胶蛋白（ssc溶液）；3）将步骤2）所述的儿茶酚修饰的ssc置于培养皿中，将钛片浸泡其中，冲洗、干燥后得到ssc沉积的钛片（ti-ssc）；4）将步骤3）所述的ti-ssc浸泡在agno3水溶液中，冲洗、干燥后得到银纳米颗粒和丝胶蛋白共沉积的钛片（ti-ssc-ag）。9.进一步，所述步骤1）中，碱提取法中na2co3的浓度为5 wt%，ss溶液在6000 rpm下离心10 min，通过0.45ꢀµm针筒过滤器，使用分子量截留为3500 da的透析袋在去离子中透析72 h。取部分纯化的ss溶液冻干获取溶液浓度为6.1 mg/ml，剩余的ss溶液储存在4℃冰箱中用于后续合成；进一步，所述步骤2）中，制备酪氨酸酶储备液（1 mg/ml）并与ss溶液以1:10的体积比比混合；进一步，所述步骤3）中，钛片浸入在ssc溶液中，浸泡时间为24小时，浸泡条件为室温；进一步，所述步骤4）中，agno3水溶液浓度为1 mg/ml，浸泡时间为24小时，浸泡条件为室温；进一步，所属步骤3），4）中，得到的ti-ssc和ti-ssc-ag衬底用去离子水彻底清洗并在室温下干燥。10.3.ti-ssc-ag杀菌材料在抑制细菌黏附和抑制细菌生长上的应用。11.本发明的有益效果在于：本发明制备得到的ti-ssc-ag杀菌材料不仅具有很好的生物相容性，而且还有良好的杀菌效果。该方法具有操作简单、反应条件温和、安全环保、稳定性好等优点。附图说明12.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：图1为ti-ssc-ag的合成路线图。13.图2为ti-ssc-ag对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制曲线图。14.图3为ti-ssc-ag对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈图。15.图4为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与ti-ssc-ag接触后再在表面存活的细菌数量图。16.图5为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在ti-ssc-ag表面形成生物被膜的荧光共聚焦显微镜和荧光强度图。具体实施方式17.下面结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。18.本发明的ti-ssc-ag杀菌材料通过如图1所示的反应制得，以钛片为基底，钛片上涂覆儿茶酚修饰的丝胶蛋白和银纳米颗粒，所述儿茶酚修饰的丝胶蛋白由酪氨酸酶和丝胶蛋白的氧化反应制得，所述氧化反应是指丝胶蛋白上的酪氨酸集团被酪氨酸酶（多酚氧化酶）氧化为3,4-二羟基苯丙氨酸（dopa），形成儿茶酚修饰的丝胶蛋白（ssc）。ssc沉积的表面含有残留的儿茶酚基团，能够原位还原ag+离子，从而形成ag nps，制得ti-ssc-ag功能化涂层。在本方法中，选取金黄色葡萄球菌(s. aureus)和大肠杆菌(e. coli) 作为革兰氏阳性菌和阴性菌的代表对ti-ssc-ag的杀菌效果进行测试。19.实施例1ti-ssc-ag杀菌材料的制备：1）将蚕茧去除杂质，采用碱提取法从家蚕茧中提取ss，使用分子量截留为3500 da的透析袋对在去离子水中透析72 h，然后在6000 rpm下离心10 min，最后通过0.45ꢀµm的针筒过滤器过滤出去大颗粒，得到纯化的ss溶液。将部分纯化的ss溶液冻干以确定浓度为6.1 mg/ml，剩余的ss溶液储存在4℃冰箱中用于后续合成。20.2）将酪氨酸酶溶解在去离子水中，制备酪氨酸酶储备液（1 mg/ml）加入步骤1）所述的ss溶液以1:10的体积比混合反应，得到儿茶酚修饰丝胶蛋白（ssc溶液）；3）将步骤2）所述的儿茶酚修饰的ssc置于培养皿中，将钛片浸泡其中，沉积过程在室温下进行24小时。用去离子水冲洗ssc修饰的ti基板，在室温下干燥，得到ssc沉积的钛片（ti-ssc）；4）将步骤3）所述的ti-ssc浸泡在20 ml硝酸银溶液（1mg/ml）中，遮光后在室温反应24 h，随后用去离子水彻底清洗，并在室温下干燥，得到银纳米颗粒和丝胶蛋白共沉积的钛片（ti-ssc-ag）。21.实施例2利用细菌生长曲线评价ti-ssc-ag对溶液中细菌生长抑制作用，具体内容如下：1. 细菌的培养：从-20℃冰箱中取出装有菌株的冻存管，使之融化，然后接种于胰蛋白胨大豆肉汤(tryptone soya broth, tsb)培养基中，并在37℃摇床培养，备用。22.2. 细菌生长曲线：细菌生长曲线是将少量的单细胞微生物接种到一定容积的液体培养基后，在适宜的条件下培养，定时取样测定细胞数量。以时间为横坐标，以活菌数的对数为纵坐标，可得出一条生长曲线，曲线显示了细菌生长繁殖的四个时期：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期。具体步骤为（下述所用器材及液体均事先灭菌）：1)将磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline, pbs)和tsb 培养基以1:1的体积比混合，所得溶液将细菌悬浮液稀释至浓度为1ꢀ×ꢀ105 cells/ml。23.2)在24孔板的孔中，依次放入未改性或改性的钛片（pristine ti、ti-ssc或ti-ssc-ag）和0.9 ml的细菌悬浮液，每种样品同时进行三个平行实验，随后将24孔板置于37°c恒温培养箱；3)2小时后，取出24孔板，在生物安全柜内用移液枪将24孔板的细菌溶液转移到96孔板中，每孔加入100 μl；4)将96孔板置于37°c恒温培养箱，每隔2小时用酶标仪（biotek elx800）读取96孔板每个孔在570 nm处的吸光度（od）；以时间为横坐标，以od值为纵坐标，绘制细菌生长曲线。24.图2为ti-ssc-ag杀菌材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线：与对照组相比，ti-ssc几乎不能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，而ti-ssc-ag对两种细菌均显示出较好的杀菌效果。25.实施例3利用抑菌圈实验评价ti-ssc-ag的接触杀菌性能，具体内容如下：1. 细菌的培养：从-20℃冰箱中取出装有菌株的冻存管，使之融化，然后接种于tsb培养基中，并在37℃摇床培养，备用。26.2. 具体步骤为（下述所用器材及液体均事先灭菌）：1）用pbs缓冲液将细菌悬浮液稀释到浓度为1×105 cells/ml；2）取100 μl细菌溶液加入到tsb琼脂板上，用涂布棒涂布直至细菌溶液被完全吸收；3）将规格为1 cmꢀ×ꢀ1 cm 未改性或改性的钛片（pristine ti、ti-ssc或ti-ssc-ag）轻轻置于涂有细菌的琼脂板上，在37℃恒温培养箱中培养24小时；图3为ti-ssc-ag对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈图：从图中可以看出， ti-ssc-ag底部和周围无细菌菌落形成，而空白ti和ti-ss区域布满了细菌菌落。该实验定性地说明了ti-ssc-ag表面具有接触杀菌性能。27.实施例4利用涂板计数法评价ti-ssc-ag表面抑制细菌黏附性能，具体内容如下：1. 细菌的培养：从-20℃冰箱中取出装有菌株的冻存管，使之融化，然后接种于tsb培养基中，并在37℃摇床培养，备用。28.2.具体步骤为（下述所用器材及液体均事先灭菌）：1)用pbs缓冲液将细菌悬浮液稀释到浓度为1×107 cells/ml；2)将规格为1 cmꢀ×ꢀ1 cm 未改性或改性的钛片（pristine ti、ti-ssc或ti-ssc-ag）放置于24孔板中，每孔分别加入1 ml细菌溶液，在37℃恒温培养箱培养4小时；3)吸出细菌溶液，再沿孔壁加入1 ml pbs缓冲液以清洗钛片表面，改步骤重复三次；4)在15 ml离心管中加入3 ml pbs缓冲液，将上述清洗过的钛片放到离心管中，超声5分钟以剥离表面黏附的细菌；5)在1.5 ml离心管中加入900 μl pbs缓冲液，吸取100 μl上述超声剥离的细菌溶液，振荡混匀并进行梯度稀释；6)吸取100 μl梯度稀释后的溶液加到tsb琼脂板上，用涂布棒涂布直至细菌溶液被完全吸收，琼脂板在37℃培养24小时，拍照计数；图4为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与ti-ssc-ag接触后再在表面存活的细菌数量图：吸附在ti表面的（a）大肠杆菌和（b）金黄色葡萄球菌经超声剥离和稀释1000倍在tsb琼脂板上形成的菌落图；（c）吸附在ti表面的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌个数。黏附在空白ti上活的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的数量分别约为3.2×106和1.9×106 cells/cm2。黏附在ti-ssc表面上活的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的数量分别约为2.3×106和1.8×106 cells/cm2,与空白ti相比没有显著性降低。而黏附在ti-ssc-ag上的活细菌的数量接近于0，表明ti-ssc-ag能够通过ag nps的杀菌作用杀死接触于表面的细菌或抑制细菌在表面的粘附。29.实施例5利用荧光成像法评价ti-ssc-ag对细菌生物被膜形成的抑制能力，具体内容如下：1. 细菌的培养：从-20℃冰箱中取出装有菌株的冻存管，使之融化，然后接种于tsb培养基中，并在37℃摇床培养，备用。30.2. 具体步骤为（下述所用器材及液体均事先灭菌）：1)用体积比为1:1的tsb培养基和pbs缓冲溶液将细菌悬浮液稀释至浓度为1×105 cells/ml；2)将规格为1 cmꢀ×ꢀ1 cm 未改性或改性的钛片（pristine ti、ti-ssc或ti-ssc-ag）放置于24孔板中，每孔中分别加入1 ml细菌溶液，将24孔板置于37℃恒温培养箱培养24小时；3)吸出细菌溶液，再沿孔壁加入1 ml pbs缓冲液以清洗钛片表面，改步骤重复二次；4)吸取15 μl的syto9和碘化铵（pi）的组合染料滴加到钛片上，着色15分钟；5)吸取1 ml蒸馏水加入到24孔板中，小心地洗去钛片表面多余的荧光染料；图5为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在ti-ssc-ag表面形成生物被膜的荧光共聚焦显微镜和荧光强度图：左图是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌黏附后未改性和改性钛片表面的荧光显微镜图，右图是钛片表面红绿荧光信号的强度，图中活细胞发出绿色荧光，而死细胞发出红色荧光。空白ti表面发出强烈的绿色荧光并带有少量的红色荧光，ti-ssc表面具有较弱的抗菌性能，因而绿色荧光信号强度同样强烈。ti-ssc-ag表面的绿色荧光信号较弱，而红色荧光信号略有增强。因此，ti-ssc-ag可以有效地抑制细菌生物被膜形成并能杀死黏附在表面的细菌。31.最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。









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