用于治疗FLT3阳性恶性肿瘤的靶向FLT3的嵌合抗原受体修饰细胞的制作方法 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术用于治疗flt3阳性恶性肿瘤的靶向flt3的嵌合抗原受体修饰细胞1.相关申请的交叉引用本技术根据35u.s.c.ꢀ§ꢀ119(e)要求2020年4月17日提交的美国临时申请第63/011,819号的优先权，其内容通过引用完整地并入本技术中。技术领域：：2.本发明涉及被工程化来与表达fms样酪氨酸激酶3（flt3）的细胞结合的嵌合抗原受体（car）、表达这种car的t细胞或nk细胞、配制这种cart或nk细胞的方法和作为抗癌剂的使用方法。背景技术：：：3.fms样酪氨酸激酶3（flt3）是一种跨膜蛋白，在正常造血干细胞和祖细胞上表达。它也在急性骨髓性白血病（aml）的恶性母细胞中表达。4.表达flt3特异性嵌合抗原受体（car）的细胞可以抑制实体癌和血癌（例如白血病）的体内生长，并延长携带白血病的小鼠的生存期（chenetal.,leukemia31:1830,2017）。因此，仍然需要一种有效地治疗患者的癌症的flt3特异性car疗法。5.发明概述对于癌细胞（例如白血病母细胞）的表面有flt3表达的患者，flt3-cart或nk细胞可被考虑用于治疗难治性疾病或前线治疗，例如在老年aml患者中，鉴于他们在标准疗法下预后惨淡。6.这里描述的是编码flt3特异性car（也称“flt3car”）的核酸分子。该核酸分子包括用于flt3特异性car的改进的编码序列（例如seqidno:1），与先前设计的编码序列相比，其允许更高的car表达和更大的有效性。7.在一个方面，flt3car核酸分子包括以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：。8.seqidno:1编码具有以下序列的多肽：mgwssiilflvatatgvhqvqlqqpgaelvkpgaslklsckssgytftsywmhwvrqrpghglewigeidpsdsykdynqkfkdkatltvdrssntaymhlssltsddsavyycaraitttpfdfwgqgttltvssggggsggggsggggsdivltqspatlsvtpgdsvslscrasqsisnnlhwyqqkshesprllikyasqsisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvetedfgvyfcqqsntwpytfgggtkleikrlepkscdkthtcppcpdpkgtfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（seqidno:2）。9.在一个方面，所述car包括或包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：信号序列（例如mgwssiilflvatatgvh；seqidno:3）；靶向flt3的单链可变片段（scfv）（qvqlqqpgaelvkpgaslklsckssgytftsywmhwvrqrpghglewigeidpsdsykdynqkfkdkatltvdrssntaymhlssltsddsavyycaraitttpfdfwgqgttltvssggggsggggsggggsdivltqspatlsvtpgdsvslscrasqsisnnlhwyqqkshesprllikyasqsisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvetedfgvyfcqqsntwpytfgggtkleikr；seqidno:4），间隔子（即铰链结构域，lepkscdkthtcppcpdpkgt；seqidno:5）；cd28跨膜结构域（fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv；seqidno:6）、cd28共刺激结构域（rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs；seqidno:7）；以及cd3ζ细胞内信号传导结构域（rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr；seqidno:8）。在一些实施方案中，所述scfv包括以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：重链可变区：qvqlqqpgaelvkpgaslklsckssgytftsywmhwvrqrpghglewigeidpsdsykdynqkfkdkatltvdrssntaymhlssltsddsavyycaraitttpfdfwgqgttltvss；或seqidno:4的氨基酸（aa）1至aa118，以及轻链可变区（divltqspatlsvtpgdsvslscrasqsisnnlhwyqqkshesprllikyasqsisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvetedfgvyfcqqsntwpytfgggtkleikr；或seqidno:4的aa134至aa241），由肽连接子（例如ggggsggggsggggs；或seqidno:4的aa119至aa133）连接。10.在某些情况下，可以使用载体来生产car，其中car开放阅读框后面是t2a核糖体跳跃（skip）序列和截短的egfr（在此称为egfrt或tegfr）或截短的cd19（在此称为cd19t或tcd19）。在这种设置下，共同表达egfrt或cd19t提供了惰性的、非免疫原性的表面标记，其可以精确测量基因修饰的细胞，并能对基因修饰的细胞进行阳性选择，以及在过继转移后对体内的治疗性t或nk细胞进行有效的细胞追踪。有效地控制增殖以避免细胞因子风暴和脱靶毒性是t细胞免疫疗法成功的一个重要障碍。结合进载体（例如慢病毒或逆转录病毒载体）中的egfrt或cd19t可以作为自杀基因，以在治疗相关毒性的情况下消减car+t或nk细胞。11.在一个方面，本文提供了一种编码抗fms样酪氨酸激酶3（flt3）嵌合抗原受体（car）的核酸分子。该核酸分子包括以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：seqidno:1的核苷酸（nt）55至nt777的多核苷酸序列或其编码flt3scfv抗原结合片段的等效物。在一些实施方案中，该等效物与seqidno:1的核苷酸（nt）55至nt777（其编码flt3scfv抗原结合片段）至少约75%（包括但不限于至少约90%，或至少约95%，或至少约99%）相同，同时保持至少一个优化的核苷酸变化。此外或替代性地，该等效物包括以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：seqidno:12的核苷酸（nt）55至nt777的多核苷酸或其编码flt3scfv抗原结合片段的等效物。在进一步的实施方案中，该等效物不包括以下序列，或基本上不由以下序列组成，或不由以下序列组成：seqidno:14的（nt）55至nt777。在一些实施方案中，该核酸分子进一步包括以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：编码截短的cd19或截短的egfr的多核苷酸。12.在一些实施方案中，该核酸分子包括以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：seqidno:1的核苷酸（nt）1至nt777的多核苷酸序列或其编码flt3scfv抗原结合片段的等效物。在一些实施方案中，该等效物与seqidno:1的核苷酸（nt）1至nt777至少约75%（包括但不限于至少约90%，或至少约95%，或至少约99%）相同，同时保持优化的核苷酸变化。此外或替代性地，该等效物包括以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：seqidno:12的核苷酸（nt）1至nt777的多核苷酸。在进一步的实施方案中，该等效物不包括以下序列，或基本上不由以下序列组成，或不由以下序列组成：seqidno：14的（nt）1至nt777。13.在一些实施方案中，该核酸分子包括seqidno:1的多核苷酸序列或其等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，该等效物与seqidno:1至少约75％（包括但不限于至少约90％，或至少约95％，或至少约99％）相同，同时保持优化的核苷酸变化。此外或替代性地，该等效物包括seqidno:12的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。14.还提供了一种载体，该载体包括编码本文所公开的flt3car的核酸分子或其互补的核酸分子，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施例中，该载体是质粒载体、病毒载体、表达载体。在进一步的实施方案中，该载体是逆转录病毒载体。在更进一步的实施方案中，该载体是慢病毒载体。15.在另一个方面，提供了一种人类t或nk细胞的群体，其包含如本文公开的编码flt3car的核酸分子或如本文公开的编码flt3car的载体。此外，还提供了一种分离的细胞，其包括如本文所公开的编码flt3car的核酸分子或如本文所公开的编码flt3car的载体，或其群体。在一些实施方案中，该细胞选自：免疫细胞、nk细胞、t细胞、干细胞、所述免疫细胞、nk细胞或t细胞的祖细胞或前体细胞。16.在又一个方面，提供了一种组合物，该组合物包括以下组分，或基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：含有或表达本文所公开的flt3car的细胞的群体，或表达本文所公开的flt3car的分离的细胞，以及载体，以及任选的稳定剂、防腐剂或低温保存剂。17.在一个方面，提供了一种治疗患有癌症（例如急性骨髓性白血病）的人类患者的方法。该方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：施用自体或异体人类t或nk细胞群，该细胞群包含编码本文所公开的flt3car的核酸分子或包含编码本文所公开的flt3car的核酸分子的载体。本领域的技术人员可以利用本领域已知的临床和亚临床参数确定患者何时已经得到治疗，例如与其他已知疗法的治疗相比，或在没有治疗的情况下，肿瘤负担减轻、转移受到抑制、总生存期增强、毒性降低、无进展生存期延长、癌症减缓或停止、肿瘤标志物减少或其他临床症状。这些方法可以与其他已知的抗肿瘤或癌症疗法相结合，作为二线、三线、四线或五线疗法，或者作为一线疗法提供。18.在另一个方面，提供了一种治疗有需要的患者的方法。该方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：向患者施用本文所公开的flt3car细胞群。19.在又一个方面，提供了一种制备cart或nk细胞的方法。该方法以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：提供自体或异体人类t或nk细胞的群体，以及用本文所公开的载体或本文所公开的核酸分子转导所述t或nk细胞。20.另外提供了一种制备flt3-car表达细胞的方法。该方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：用本文所公开的载体或本文所公开的核酸分子转导该细胞。21.还提供了用于本文公开的方法的组合物和试剂盒。附图说明22.图1提供了显示phiv-7如何构建的示意图。23.图2提供了phiv-7的图示。24.图3提供了用于生产表达flt3特异性car的逆转录病毒载体基因组的质粒的图示。25.图4a-4d提供了评估四个t细胞组上的car表达的流式细胞术结果，即：作为对照的表达gfp的t细胞（图4a），同样作为对照的表达tcd19的t细胞（图4b），表达tcd19和由未经优化的核酸分子编码的flt3特异性car的t细胞（图4c），以及表达tcd19和由经优化的核酸分子编码的flt3特异性car的t细胞（图4d）。al.(1995)pcr2:apracticalapproach；harlowandlaneeds.(1999)antibodies,alaboratorymanual；freshney(2005)cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique,5thedition；gaited.(1984)oligonucleotidesynthesis；美国专利号4,683,195；hamesandhigginseds.(1984)nucleicacidhybridization；anderson(1999)nucleicacidhybridization；hamesandhigginseds.(1984)transcriptionandtranslation；immobilizedcellsandenzymes(irlpress(1986))；perbal(1984)apracticalguidetomolecularcloning；millerandcaloseds.(1987)genetransfervectorsformammaliancells(coldspringharborlaboratory)；makridesed.(2003)genetransferandexpressioninmammaliancells；mayerandwalkereds.(1987)immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(academicpress,london)；herzenbergetal.eds(1996)weir’shandbookofexperimentalimmunology；manipulatingthemouseembryo:alaboratorymanual,3rdedition(coldspringharborlaboratorypress(2002))；sohail(ed.)(2004)genesilencingbyrnainterference:technologyandapplication(crcpress)。33.如说明书和权利要求书中所使用的，单数形式的ꢀ“一”、“一种/一个”和“所述”包括复数指代，除非上下文明确规定了其他情况。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。34.如本文所用，术语“包括”意指化合物、组合物和方法包括所提及的元素，但不排除其他元素。当用于定义化合物、组合物和方法时，“基本上由……组成”应指排除对组合物具有任何实质意义的其他元素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物将不排除例如来自分离和纯化方法的微量污染物和药学上可接受的载体、防腐剂等。“由……组成”应指排除微量元素以上的其他成分。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本技术的范围内。35.所有数字名称，例如ph值、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，其以1、5或10%的增量变化（+）或（-）。应该理解的是，尽管并不总是明确指出，但是所有的数字名称前面都有“大约”一词。还应理解的是，尽管并不总是明确指出，但是这里描述的试剂只是示例性的，其等效物在本领域是已知的。36.如本文所使用的，比较性术语，例如高、低、增加、减少、降低，或其任何语法变化，可以指相对于参照物的某些变化。在一些实施方案中，这种变化可以指比参照物高约10%、或约20%、或约30%、或约40%、或约50%、或约60%、或约70%、或约80%、或约90%、或约1倍、或约2倍、或约3倍、或约4倍、或约5倍、或约6倍、或约7倍、或约8倍、或约9倍、或约10倍、或约20倍、或约30倍、或约40倍、或约50倍、或约60倍、或约70倍、或约80倍、或约90倍、或约100倍或更高。在一些实施方案中，这种变化可以指参照物的约1%、或约2%、或约3%、或约4%、或约5%、或约6%、或约7%、或约8%、或约0%、或约10%、或约20%、或约30%、或约40%、或约50%、或约60%、或约70%、或约75%、或约80%、或约85%、或约90%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%。[0037]“任选的”或“任选地”是指随后描述的情况可能发生，也可能不发生，因此该描述包括发生该情况的实例和不发生该情况的实例。[0038]如本文所使用的，“和/或”意指并且包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有可能的组合，以及当被解释为替代时的缺乏组合（“或”）。[0039]“基本上”或“实质上”是指几乎全部或完全，例如，95%或更多的某种给定数量。在一些实施方案中，“基本上”或“实质上”意味着95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%。[0040]术语“可接受的”、“有效的”或“足够的”当用于描述本文公开的任何成分、范围、剂量形式等的选择时，意味着所述成分、范围、剂量形式等适用于所公开的目的。[0041]正如本领域技术人员将理解的那样，对于任何和所有目的，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的子范围和其子范围的组合。此外，正如本领域技术人员将理解的那样，范围包括每个单独的成员。[0042]如本文所用，术语“动物”指的是活的多细胞脊椎动物，该类别包括例如哺乳动物和鸟类。术语“哺乳动物”包括人类和非人类的哺乳动物。[0043]术语“对象/受试者”、“宿主”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，指的是动物，典型地是哺乳动物。任何合适的哺乳动物都可以通过本文所述的方法进行治疗。哺乳动物的非限制性例子包括人类、非人类灵长类动物（例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等）、家畜（例如，狗和猫）、农场动物（例如，马、牛、山羊、绵羊、猪）和实验动物（例如，小鼠、大鼠、兔子、豚鼠）。在一些实施方案中，哺乳动物是人。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段（例如，成人、青少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物）。哺乳动物可以是雄性或雌性。在一些实施方案中，对象是人类。在一些实施方案中，对象患有或被诊断为患有或被怀疑患有某种疾病。[0044]在一些实施方案中，组件名称中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”或类似术语被用来区分和识别在其名称中共享某些特征的一个以上的组件。例如，“第一次给药”和“第二次给药”在整个说明书中被用来区分两个给药。[0045]术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，可以是脱氧核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以有任何三维结构，可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段（例如探针、引物、est或sage标签）、外显子、内含子、信使rna（mrna）、转移rna、核糖体rna、rnai、核酶、cdna、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离dna、任何序列的分离rna、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在组装多核苷酸之前或之后被赋予。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分打断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，如通过与标记成分的连接。该术语还指双链和单链分子。除非另有规定或要求，否则本技术中作为多核苷酸的任何方面既包括双链形式，也包括已知或预测的构成双链形式的两个互补单链形式中的每一个。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链dna或rna、基因组dna、cdna、dna-rna混合体，或由嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生物化学修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基组成的聚合物。[0046]在一些实施方案中，参考核酸、多核苷酸或寡核苷酸的等效物编码与参考物所编码的序列相同的序列。在一些实施方案中，参考核酸、多核苷酸或寡核苷酸的等效物与参考物、互补参考物、反向参考物和/或反向互补（即互补）参考物杂交，任选地在高严格性条件下进行。此外或替代地，等效的核酸、多核苷酸或寡核苷酸与参考核酸、多核苷酸或寡核苷酸具有至少70%、或至少75%、或至少80%的序列同一性、或至少85%的序列同一性、或至少90%的序列同一性、或至少92%的序列同一性、或至少95％的序列同一性、或至少97％的序列同一性、或至少98％的序列同一性，或者等效的核酸在高严格条件下与参考多核苷酸或其互补序列杂交。在另一个方面，等效物与参考核酸、多核苷酸或寡核苷酸具有至少70%、或至少75%、或至少80%的序列同一性、或至少85%的序列同一性、或至少90%的序列同一性、或至少92%的序列同一性、或至少95%的序列同一性、或至少97%的序列同一性、或至少98%的序列同一性，或者等效的核酸在高严格条件下与参考多核苷酸或其互补序列杂交。[0047]“杂交”是指这样的反应，其中一个或多个多核苷酸反应以形成复合物，该复合物通过核苷酸残基之间的氢键而稳定。氢键可以通过watson-crick碱基配对、hoogstein结合或任何其他序列特定的方式发生。该复合物可以包括形成双链结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单一的自杂交链、或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛的过程中的一个步骤，例如pcr反应的启动，或核酸酶对多核苷酸的酶切。[0048]严格杂交条件的例子包括：孵育温度约25℃至约37℃；杂交缓冲液浓度约6xssc至约10xssc；甲酰胺浓度约0%至约25%；以及洗涤溶液约4xssc至约8xssc。中度杂交条件的例子包括：孵育温度约40℃至约50℃；缓冲液浓度约9xssc至约2xssc；甲酰胺浓度约30%至约50%；以及洗涤溶液约5xssc至约2xssc。高严格条件的例子包括：孵育温度约55℃至约68℃；缓冲液浓度约1xssc至约0.1xssc；甲酰胺浓度约55%至约75%；以及洗涤溶液约1xssc、0.1xssc或去离子水。一般来说，杂交孵育时间为5分钟至24小时，有1、2或更多个洗涤步骤，洗涤孵育时间约为1、2或15分钟。ssc是0.15mnacl和15mm柠檬酸盐缓冲液。可以理解的是，可以采用使用其他缓冲系统的ssc的等效物。[0049]在一些实施方案中，可以对编码核酸分子进行优化，例如，使其具有一定的gc含量。gc含量（或鸟嘌呤-胞嘧啶含量）是核酸分子中鸟嘌呤（g）或胞嘧啶（c）的含氮碱基百分比。这一衡量标准表明g和c碱基（即g和c残基）在隐含的总共四个碱基中的比例，这四个碱基还包括dna中的腺嘌呤和胸腺嘧啶以及rna中的腺嘌呤和尿嘧啶。从数量上看，每个gc碱基对由三个氢键固定在一起，而at和au碱基对则由两个氢键固定在一起。因此，与gc含量高的核酸分子相比，gc含量低的核酸分子的热稳定性较低。研究还表明，导致双链核酸热稳定性的最重要因素实际上是由于相邻碱基的堆叠。由于外环基团的相对位置，gc对比at或au对有更有利的堆叠能量。[0050]如本文所用，术语“密码子”是指在蛋白质合成过程中与特定氨基酸残基或停止信号相对应的三个连续核苷酸的序列。在一些实施方案中，密码子是标准的遗传密码，如下表所示。[0051]术语核酸分子的密码子频率是指核酸分子在表达多肽时使用的密码子的重复出现率。在一些实施方案中，本文所用的密码子频率被表示为该密码子的数量占整个核酸分子的总密码子数量的百分比。在其他实施方案中，本文所用的密码子频率被表示为每1000个密码子该密码子的平均数量。例如，具有300个核苷酸残基的核酸分子使用100个密码子，其中10个是由gcc组成的密码子，编码丙氨酸（ala）氨基酸残基。因此，gcc密码子的频率可以表示为10%，或每1000个密码子中有100个。有几个在线工具可用于计算核酸的密码子频率，如www.bioinformatics.org/sms2/codon_usage。[0052]应用于核酸序列的术语“编码”是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，在其原生状态或通过本领域技术人员熟知的方法操作时，可以转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mrna。反义链是这种核酸的互补序列，编码序列可以从中推导出来。[0053]“基因”是指含有至少一个开放阅读框（orf）的多核苷酸，在转录和翻译后能够编码特定多肽或蛋白质。术语“表达”是指基因产物的生产。[0054]如本文所用，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mrna的过程，或转录的mrna随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程，或这两个过程。如果多核苷酸来自基因组dna，则表达可以包括真核细胞中mrna的拼接。基因的表达水平可以通过测量细胞或组织样本中的mrna或蛋白质的数量来确定。[0055]应用于生产car表达细胞的术语“转导”是指将外来核苷酸序列引入细胞的过程。在一些实施方案中，这种转导是通过载体完成的。[0056]如本文所用，术语“载体”是指为在不同宿主之间转移而设计的核酸构建体，包括但不限于质粒、病毒、粘粒（cosmid）、噬菌体、bac、yac等。在一些实施方案中，质粒载体可以从商业上可用的载体中制备。在其他实施方案中，病毒载体可以根据本领域已知的技术从杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、aav等制备。在一个实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。[0057]“质粒”是独立于染色体dna的染色体外dna分子，能够独立于染色体dna进行复制。在许多情况下，它是环状和双链的。质粒为微生物群体内的水平基因转移提供了一种机制，通常在特定的环境状态下提供选择优势。质粒可能携带在竞争性环境中对自然发生的抗生素具有抗性的基因，或者产生的蛋白质在类似情况下可作为毒素。许多质粒在商业上可用于此类用途。要复制的基因被插入到含有使细胞对特定抗生素产生抗性的基因和多克隆位点（mcs，或多链接器）的质粒副本中，多克隆位点是一个包含几个常用限制性位点的短区域，允许在此位置轻松插入dna片段。在一些实施方案中，一个或多个质粒被用于生产病毒载体或病毒基因组。在一些实施方案中，质粒用于复制或扩增多核苷酸。质粒的另一个主要用途是制造大量的蛋白质。在这种情况下，研究人员培养含有携带感兴趣基因的质粒的细菌。正如细菌产生蛋白质以赋予其抗生素抗性一样，它也可以被诱导从插入的基因中产生大量的蛋白质。这是一种大规模生产基因或其编码的蛋白质的廉价而简单的方法。[0058]“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包括多核苷酸，可在体内、离体或体外被送入宿主细胞。病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒（alphavirus）载体等。甲病毒载体，如基于semlikiforest病毒的载体和基于sindbis病毒的载体，也已被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见，schlesingeranddubensky(1999)curr.opin.biotechnol.5:434-439andying,etal.(1999)nat.med.5(7):823-827。[0059]在基因转移由慢病毒载体介导的实施方案中，载体构建体是指包括慢病毒基因组或其一部分以及治疗基因的多核苷酸。如本文所用，“慢病毒介导的基因转移”或“慢病毒转导”具有相同的含义，指的是基因或核酸序列凭借病毒进入细胞并将其基因组整合到宿主细胞中而被稳定地转移到宿主细胞中的过程。病毒可以通过其正常的感染机制进入宿主细胞，也可以进行修改，使其与不同的宿主细胞表面受体或配体结合以进入细胞。逆转录病毒以rna的形式携带其遗传信息；然而，一旦病毒感染了细胞，rna就被逆转录成dna形式，整合到受感染细胞的基因组dna中。整合后的dna形式被称为前病毒。在此，慢病毒载体是指能够通过病毒或类似病毒的进入机制将外源核酸引入细胞的病毒颗粒。“慢病毒载体”是本领域内众所周知的一种逆转录病毒载体，与其他逆转录病毒载体相比，它在转导非分裂细胞方面具有某些优势。参见tronod.(2002)lentiviralvectors,newyork:spring-verlagberlinheidelberg。[0060]本公开的慢病毒载体基于或来自核心逆转录病毒（包含mlv的逆转录病毒亚群），以及慢病毒（包含hiv的逆转录病毒亚群）。例子包括aslv、snv和rsv，它们都被分成包装和载体成分，用于慢病毒载体粒子生产系统。根据公开的内容，慢病毒载体粒子可以基于特定逆转录病毒的基因或其他方式（例如通过特定选择包装细胞系统）改变的版本。[0061]根据本公开的载体粒子“基于”或“来自”特定病毒，意味着该载体来自该特定病毒。载体粒子的基因组包括来自该病毒的成分作为骨架。在一些实施方案中，该病毒是逆转录病毒。载体粒子包含与rna基因组兼容的基本载体成分，包括逆转录和整合系统。通常这些将包括来自特定逆转录病毒的gag和pol蛋白。因此，载体粒子的大部分结构成分通常来自于该逆转录病毒，尽管它们可能经过了基因或其他方面的改变，以提供所需的有用特性。然而，某些结构成分，特别是env蛋白，可能来自于不同的病毒。通过在载体粒子生产系统中使用不同的env基因，可以改变载体宿主的范围和被感染或转导的细胞类型，使载体粒子具有不同的特异性。[0062]本文使用的术语“腺相关病毒”或“aav”是指与此名称相关的病毒类的成员，属于细小病毒科（parvoviridae）依赖性细小病毒（dependoparvovirus）属。这种病毒的多个血清型已知适合于基因传递；所有已知的血清型都能感染各种组织类型的细胞。至少有11种按顺序编号的aav血清型是本领域内已知的。在本文公开的方法中有用的非限制性示范血清型包括11种血清型中的任何一种，例如aav2、aav8、aav9，或变体或合成血清型，例如aav-dj和aavphp.b。aav粒子包括三种主要的病毒蛋白：vp1、vp2和vp3，或基本上由其组成，或由其组成。在一个实施方案中，aav指的是血清型aav1、aav2、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aavphp.b或aavrh74。这些载体是商业上可获得的，或者在专利或技术文献中已经描述过。[0063]本文所用的术语“调控序列”、“调控元件”、“表达控制元件”或“启动子”是指与要转录和/或复制的目标多核苷酸可操作地连接并促进目标多核苷酸的表达和/或复制的多核苷酸。[0064]本文在提到调节性多核苷酸时，术语“可操作地连接”是指调节性多核苷酸和与其连接的多核苷酸序列之间的关联，从而当特定蛋白质与调节性多核苷酸结合时，连接的多核苷酸被转录。[0065]启动子是表达控制元件或调节序列的一个例子。本文中使用的术语“启动子”是指调节编码序列表达的任何序列。启动子可以位于基因或其他多核苷酸的5’或上游，为受控基因转录提供控制点。聚合酶ii和iii是启动子的例子。例如，启动子可以是构成性的、可诱导的、可抑制的或组织特异的。“启动子”是这样的控制序列，它是多核苷酸序列的一个区域，转录的开始和速率在此得到控制。它可以包含这样的遗传元件，在此调节蛋白和分子可以结合例如rna聚合酶和其他转录因子。启动子的非限制性例子包括ef1α启动子、巨细胞病毒（cmv）启动子和mmlv启动子。[0066]ef1α（在此也称为ef-1α）启动子序列是本领域已知的（参见，例如addgene.org/11154/sequences/；ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/j04617，每个最后访问日期为2019年3月13日，以及zhengandbaum(2014)int’l.j.med.sci.11(5):404-408）。在一些实施方案中，ef1α启动子包括以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：aaggatctgcgatcgctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaacgggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgaagcttcgaggggctcgcatctctccttcacgcgcccgccgccctacctgaggccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctac(seqidno:23)，以及任选的其等效物。[0067]巨细胞病毒（cmv）启动子序列也是本领域已知的（参见，例如，snapgene.com/resources/plasmid-files/set=basic_cloning_vectors&plasmid=cmv_promoter，最后访问日期为2019年3月13日，以及zhengandbaum(2014)，同上）。在一些实施方案中，cmv启动子包括以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：或“对齐于”参考序列中的识别位置，是指在感兴趣的序列和参考序列之间的序列对齐中，该残基位置与识别位置对齐。有各种程序可用于进行这种序列比对，如clustalomega和blast。[0073]如本文所用，术语“特异性识别和结合”是指抗体（或其抗原结合片段，或包含这种抗体或抗原结合片段的生物制剂，例如car或car表达细胞）与其目标抗原之间的接触，其结合亲和力大大高于与另一分子的结合亲和力。在一些实施方案中，抗体（或其抗原结合片段，或包含这种抗体或抗原结合片段的生物制剂，例如car或car表达细胞）与其目标抗原之间的结合亲和力至少为10−3m，包括其中的任何数字或任何范围，例如至少约10−6m，或至少约10−7m，优选10−8m、10−9m、10−10m、10−11m或10−12m。[0074]如本文所用，术语“flt3”和“fms样酪氨酸激酶3”可互换使用，是指与此名称相关的受体型酪氨酸蛋白激酶flt3、其任何替代名称（fms-相关酪氨酸激酶、干细胞酪氨酸激酶、fms样酪氨酸激酶、fl细胞因子受体、cd135抗原、ec2.7.10.1、cd135、flk-2、stk1、flk2、生长因子受体酪氨酸激酶iii型、受体型酪氨酸蛋白激酶flt3、胎肝激酶2、胎肝激酶-2、ec2.7.10、flt-3或stk-1）或uniprot登记号p36888和与flt3和其任何变体或异构体具有至少80%的氨基酸序列同一性、优选90%的序列同一性、或者至少95%的序列同一性的任何其他具有类似生物功能的分子。特异性结合flt3的单克隆抗体可从例如bectondickinsonbiosciences和其他商业来源获得，例如列在以下网站地址中的：biocompare.com/search-antibodies/search=flt3&said=0。制备抗原结合片段的方法是本领域已知的。抗原结合结构域可以来自任何适当的物种，例如绵羊或人类。[0075]flt3的非限制性例子包括：人flt3同种型1，由以下序列组成：mpalardggqlpllvvfsamifgtitnqdlpvikcvlinhknndssvgksssypmvsespedlgcalrpqssgtvyeaaavevdvsasitlqvlvdapgnisclwvfkhsslncqphfdlqnrgvvsmvilkmtetqageyllfiqseatnytilftvsirntllytlrrpyfrkmenqdalvcisesvpepivewvlcdsqgesckeespavvkkeekvlhelfgtdirccarnelgrectrlftidlnqtpqttlpqlflkvgeplwirckavhvnhgfgltwelenkaleegnyfemstystnrtmirilfafvssvarndtgyytcssskhpsqsalvtivekgfinatnssedyeidqyeefcfsvrfkaypqirctwtfsrksfpceqkgldngysiskfcnhkhqpgeyifhaenddaqftkmftlnirrkpqvlaeasasqascfsdgyplpswtwkkcsdkspncteeitegvwnrkanrkvfgqwvssstlnmseaikgflvkccaynslgtscetillnspgpfpfiqdnisfyatigvcllfivvltllichkykkqfryesqlqmvqvtgssdneyfyvdfreyeydlkwefprenlefgkvlgsgafgkvmnataygisktgvsiqvavkmlkekadsserealmselkmmtqlgshenivnllgactlsgpiylifeyccygdllnylrskrekfhrtwteifkehnfsfyptfqshpnssmpgsrevqihpdsdqisglhgnsfhsedeieyenqkrleeeedlnvltfedllcfayqvakgmeflefkscvhrdlaarnvlvthgkvvkicdfglardimsdsnyvvrgnarlpvkwmapeslfegiytiksdvwsygillweifslgvnpypgipvdanfykliqngfkmdqpfyateeiyiimqscwafdsrkrpsfpnltsflgcqladaeeamyqnvdgrvsecphtyqnrrpfsremdlgllspqaqveds(seqidno:25)，以及任选的其等效物；以及人flt3同种型2，由以下序列组成：mpalardggqlpllvvfsamifgtitnqdlpvikcvlinhknndssvgksssypmvsespedlgcalrpqssgtvyeaaavevdvsasitlqvlvdapgnisclwvfkhsslncqphfdlqnrgvvsmvilkmtetqageyllfiqseatnytilftvsirntllytlrrpyfrkmenqdalvcisesvpepivewvlcdsqgesckeespavvkkeekvlhelfgtdirccarnelgrectrlftidlnqtpqttlpqlflkvgeplwirckavhvnhgfgltwelenkaleegnyfemstystnrtmirilfafvssvarndtgyytcssskhpsqsalvtivekgfinatnssedyeidqyeefcfsvrfkaypqirctwtfsrksfpceqkgldngysiskfcnhkhqpgeyifhaenddaqftkmftlnirrkpqvlaeasasqascfsdgyplpswtwkkcsdkspncteeitegvwnrkanrkvfgqwvssstlnmseaikgflvkccaynslgtscetillnspgpfpfiqdnisfyatigvcllfivvltllichkykkqfryesqlqmvqvtgssdneyfyvdfreyeydlkwefprenlefgkvlgsgafgkvmnataygisktgvsiqvavkmlkekadsserealmselkmmtqlgshenivnllgactlsgpiylifeyccygdllnylrskrekfhrtwteifkehnfsfyptfqshpnssmpgsrevqihpdsdqisglhgnsfhsedeieyenqkrleeeedlnvltfedllcfayqvakgmeflefksarlpvkwmapeslfegiytiksdvwsygillweifslgvnpypgipvdanfykliqngfkmdqpfyateeiyiimqscwafdsrkrpsfpnltsflgcqladaeeamyqnvdgrvsecphtyqnrrpfsremdlgllspqaqveds(seqidno:26)，以及任选的其等效物。[0076]如本文所用，fms样酪氨酸激酶3（flt3）的激活突变是指导致flt3激酶激活的突变flt3核苷酸序列或氨基酸序列，例如flt3内部串联复制（itd）突变。大约三分之一的急性骨髓性白血病病例中flt3发生了突变。急性骨髓性白血病中最常见的flt3突变是并列膜结构域中的内部串联复制（itd）突变（23%）和酪氨酸激酶结构域中的点突变（10%）。最常见的激酶域突变是将838位的天冬氨酸（相当于人类835位的天冬氨酸残基）替换为酪氨酸（flt3/d835y），将天冬氨酸转换为酪氨酸。即使这两种突变都能构成性地激活flt3，但具有itd突变的病人的预后要差得多。另外，更多细节请见美国专利号6,846,630，该专利通过引用全部内容纳入本文。[0077]本文所使用的术语“嵌合抗原受体”（car）是指这样的融合蛋白，其包括能够与抗原结合的细胞外结构域、来源于不同于细胞外结构域所来源的多肽的多肽的跨膜结构域和至少一个细胞内结构域。“嵌合抗原受体（car）”有时被称为“嵌合受体”、“t-体”或“嵌合免疫受体（cir）”。[0078]“能够与抗原结合的细胞外结构域”是指任何能够与某种抗原结合的寡肽或多肽，例如抗体或其抗原结合片段。[0079]如本文所用，术语“抗体”（在此也称为“免疫球蛋白”）统称为免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，举例包括但不限于iga、igd、ige、igg和igm、其组合，以及在任何脊椎动物（例如哺乳动物，如人类、山羊、兔子和小鼠，以及非哺乳动物物种，如鲨鱼免疫球蛋白）的免疫反应中产生的类似分子。除非特别指出，否则术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白和“抗体片段”或“抗原结合片段”，它们与感兴趣的分子（或一组高度相似的感兴趣的分子）特异性结合，基本上不与其他分子结合（例如，与生物样本中其他分子的结合常数相比，抗体和抗体片段与感兴趣的分子的结合常数为至少103m-1或更大、至少104m-1或更大、或至少105m-1或更大）。术语“抗体”也包括基因工程形式，例如嵌合抗体（例如，小鼠或人源化非灵长类抗体），或异构抗体（例如，双特异性抗体），或两者。另见，piercecatalogandhandbook,1994-1995(piercechemicalco.,rockford,ill.)；owenetal.,kubyimmunology,7thed.,w.h.freeman&co.,2013；murphy,janeway’simmunobiology,8thed.,garlandscience,2014；maleetal.,immunology(roitt),8thed.,saunders,2012；parham,theimmunesystem,4thed.,garlandscience,2014。[0080]就抗体结构而言，免疫球蛋白有重链（h）和轻链（l），通过二硫键相互连接。有两种类型的轻链，λ和κ。有五个主要的重链类别（或同型），决定了抗体分子的功能活性：igm、igd、igg、iga和ige。每条重链和轻链都包含恒定区和可变区（这些区域也被称为“结构域”）。结合起来，重链和轻链可变区特异性地与抗原结合。轻链和重链可变区包含“框架”区，其被三个超可变区（也被称为“互补决定区”或ꢀ“cdr”）打断。框架区和cdr的范围已被定义（参见kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991，其通过引用并入本文）。kabat数据库现在是在线维护的。不同的轻链或重链的框架区的序列在一个物种内是相对保守的。抗体的框架区，也就是组成轻链和重链的组合框架区，主要采用β折叠构象，而cdr形成环，该环连接β折叠结构，在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区的作用是形成支架，通过链间的非共价相互作用将cdr定位在正确的方向。[0081]cdr主要负责与抗原的表位结合。每条链的cdr通常被称为cdr1、cdr2和cdr3，从n端开始依次编号，并且通常也由特定cdr所在的链来识别（重链区域标记为cdrh，轻链区域标记为cdrl）。因此，cdrh3是来自抗体重链可变结构域的cdr3，而cdrl1是来自抗体轻链可变结构域的cdr1。例如，flt3抗体将具有对于flt3相关抗原独特的特定的vh区和vl区序列，因此也有特定的cdr序列。具有不同特异性（即对不同的抗原有不同的结合点）的抗体具有不同的cdr。尽管cdr因抗体而异，但cdr内只有有限的氨基酸位置直接参与抗原结合。cdr中的这些位置被称为特异性决定残基（sdr）。[0082]如本文所用，术语“抗原”是指可被特定体液免疫或细胞免疫的产物（如抗体分子或t细胞受体）特异性结合的化合物、成分或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单的中间代谢物、糖类（如低聚糖）、脂类和激素，以及大分子，例如复杂的碳水化合物（例如多糖）、磷脂和蛋白质。常见的抗原类别包括但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生虫抗原、肿瘤抗原、涉及自身免疫性疾病、过敏和移植排斥的抗原、毒素和其他杂项抗原。[0083]在一些实施方案中，结合分子（例如抗体、其抗原结合片段或car）的抗原可以在此以“抗原”后跟结合分子的格式提供（例如flt3car或flt3特异性car），或在抗原前有“抗”，在抗原后有结合分子（例如抗flt3抗体），或在结合分子前有ꢀ“对”或“针对”随后是抗原（例如对flt3的抗体）。[0084]如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指可特异性地与抗原靶点（如flt3）结合的任何蛋白质或多肽结构域。在一些实施方案中，抗原结合片段可选自fab、f(ab’)2、fab’、scfv或fv。[0085]单链fv片段（scfv）包括用连接子肽（通常长度约5至25个氨基酸）连接的重链可变区和轻链可变区，或基本上由其组成，或由其组成。在scfv中，重链和轻链的可变区可以来自同一个抗体或不同的抗体。在一些实施方案中，flt3scfv在此公开为seqidno:4。其他合适的flt3scfv可以在例如美国专利号10,961,312和wo2020/010284中找到，其中每一个都通过引用而并入本文。[0086]在一些实施方案中，术语“连接子序列”、“连接子肽”和“连接子多肽”可互换使用，涉及由1至10个、或8个氨基酸、或6个氨基酸、或5个氨基酸组成的任何氨基酸序列，可重复1至10次、或约8次、或约6次、或约5次、或4次或3次、或2次。例如，连接子可包括多达15个氨基酸残基，由重复3次的五肽组成。在进一步的实施方案中，连接子序列是包括三个拷贝的gly-gly-gly-ser（seqidno:27）的(甘氨酸4丝氨酸)3（seqidno:4的aa119到aa133）柔性多肽连接子。在其他实施方案中，术语“连接子序列”“连接子肽”和“连接子多肽”是指由一些（例如，约1至约50个）随机氨基酸残基组成的肽。[0087]在一些实施方案中，抗体的术语“等效物”或“生物等效物”是指如通过elisa或其他合适的方法测量的抗体选择性结合其表位/抗原蛋白或其片段的能力。生物学等效抗体包括但不限于与参考抗体结合相同表位的抗体、肽、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物和抗体模拟物。[0088]“跨膜结构域”是指任何已知的跨越细胞膜的寡肽或多肽，其功能是连接细胞外和信号传导结构域。跨膜结构域可以来自天然或合成来源。如果来源是天然的，则该结构域可以来自任何膜结合的或跨膜的蛋白质。在本发明中特别使用的跨膜区可来自cd8、cd28、cd3、cd45、cd4、cd5、cds、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154和tcr。替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将包括主要的疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。优选地在合成的跨膜结构域的两端将会各发现由苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽连接子，优选长度在2到10个氨基酸之间，可以形成跨膜结构域和car的细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双体提供了特别合适的连接子。在一些实施方案中，跨膜结构域包括cd8α跨膜结构域或cd28跨膜结构域，或基本上由其组成，或由其组成。[0089]如本文所用，术语“cd28跨膜结构域”是指与该名称相关的特定蛋白质片段，以及与本文所示的cd28跨膜结构域序列具有至少70%、或至少80%氨基酸序列同一性、至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性的任何其他具有类似生物学功能的分子。与genbank登录号xm_006712862.2和xm_009444056.1相关的片段序列提供了额外的、非限制性的cd28跨膜结构域的实例序列。与所列举的每个登录号相关的序列在此全部通过引用并入本文。在一些实施方案中，cd28跨膜结构域包括seqidno:6或其等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在进一步的实施方案中，seqidno:6的等效物与seqidno:6相比可以包括1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10、或11、或12、或13、或14、或15、或更多个突变，但仍然能够跨越细胞膜，并像seqidno:6那样发挥连接细胞外和信号传导结构域的功能。[0090]“细胞内结构域”、“细胞内信号传导结构域”或ꢀ“细胞质结构域”是指任何已知功能是传递信号以引起细胞内生物过程的激活或抑制的寡肽或多肽。car的细胞内信号传导结构域负责激活被放置了car的免疫细胞的至少一种传统效应子功能。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域指的是蛋白质的一部分，它传递效应功能信号并指导免疫细胞执行其特定功能。可以使用整个信号传导结构域或其截短部分，只要该截短部分足以转导效应功能信号。tcr和共受体的细胞质序列以及其衍生物或变体可以作为细胞内信号传导结构域用于car中。在本发明中特别使用的细胞内信号传导结构域可以来自fcr、tcr、cd3、cds、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。在一些实施方案中，car的细胞内信号传导结构域可以包括cd3ζ（即cd3zeta）信号传导结构域，或基本上由其组成，或由其组成。[0091]如本文所用，术语“cd3ζ信号传导结构域”或“cd3ζ细胞内信号传导结构域”是指与该名称相关的特定蛋白质片段以及与本文所示的cd3ζ信号传导结构域序列具有至少70%、或者至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的任何其他具有类似生物学功能的分子。在一些实施方案中，cd3ζ信号传导结构域包括以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：j.etal.natbiotechnol20:70-75(2002)；haynes,n.m.etal.,jimmunol169:5780-5786(2002)；haynes,n.m.etal.,blood100:3155-3163(2002)提供了cd28共刺激信号传导结构域的示例序列。在一些实施方案中，cd28共刺激结构域包括seqidno:7或其等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在进一步的实施方案中，与seqidno:7相比，seqidno:7的等效物可以包括1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10、或11、或12、或13、或14、或15、或更多个突变，但仍然能够像seqidno:7那样刺激免疫细胞以发挥其特定功能。[0096]信号肽（有时被称为信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、引导序列或引导肽）是存在于大多数新合成的蛋白质的n端的短肽（通常16-30个氨基酸长），其目的是走向分泌途径。这些合成的蛋白质被引导到某些细胞器（内质网、高尔基体或内体）内，从细胞中分泌出来，或插入大多数细胞膜中。在一些实施方案中，本文所公开的信号肽指导蛋白质在细胞膜上表达。[0097]嵌合抗原受体可以任选地包括“铰链结构域”，其作为细胞外和跨膜结构域之间的连接子。[0098]间隔子结构域（在此也被称为间隔子或铰链或铰链结构域）是car的细胞外结构区域，将结合单元与跨膜结构域分开。这些间隔子通常为car的有效表达和活性提供稳定性。这种结构域可以包括例如人类fc结构域的一部分、ch3结构域、或任何免疫球蛋白（如iga、igd、ige、igg或igm）的铰链区、或其变体，或基本上由其组成，或由其组成。例如，一些实施方案可以包括具有或不具有s228p、l235e和/或n297q突变（根据kabat编号）的igg4铰链。额外的间隔子包括但不限于cd4、cd8和cd28铰链区。铰链区可以来自天然或合成来源。在一些实施方案中，铰链区来自分化蛋白簇，例如cd8、cd28、cd3、cd45、cd4、cd5、cds、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154。在一个实施方案中，铰链结构域是cd8α铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域来自免疫球蛋白，例如iga、igd、ige、igg或igm。在一个实施方案中，铰链结构域是igg1铰链结构域。在另一个实施方案中，igg1铰链结构域包括lepkscdkthtcppcpdpkgt(seqidno:5)或其等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，与seqidno:5相比，seqidno:5的等效物包括1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10、或11、或12、或13、或14、或15、或更多个突变，但仍然能够像seqidno:5那样基本保持高效car表达和活性的稳定性。[0099]在细胞表面表达的蛋白质可被用作标记或提供本文所公开的car表达细胞的自杀开关。这种蛋白质的一部分或整个细胞质区域通常被截短，从而使该蛋白质的原生功能被降低或甚至取消。因此，这样的蛋白质在此被称为截短的蛋白标记物。在一些实施方案中，当用作car表达细胞的自杀开关时，截短的蛋白标记物在受试者的正常细胞或与car表达细胞相邻的正常细胞上不表达或以较低的水平表达。因此，在去除car表达细胞时（例如，通过施用特异性识别和结合截短蛋白标记物的中和抗体，或通过施用与引导毒素到截短蛋白标记物的分子结合的毒素），受试者的正常细胞将不会受到危害。[0100]在一些实施方案中，本发明在此显示，与其他标记物（如绿色荧光蛋白（gfp））相比，某些截短的蛋白标记物（例如，截短的cd19或截短的egfr）的表达率较高。参见图4b相比于图4a。在进一步的实施中，因此，那些截短的蛋白标记物特别适合用于本文所公开的car表达细胞中。prot:p00533下找到，其中的每一项都通过引用而整体并入本文。本文提供了示例性的截短的egfr，其包括以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：lvtslllcelphpaflliprkvcngigigefkdslsinatnikhfknctsisgdlhilpvafrgdsfthtppldpqeldilktvkeitgflliqawpenrtdlhafenleiirgrtkqhgqfslavvslnitslglrslkeisdgdviisgnknlcyantinwkklfgtsgqktkiisnrgensckatgqvchalcspegcwgpeprdcvscrnvsrgrecvdkcnllegeprefvenseciqchpeclpqamnitctgrgpdnciqcahyidgphcvktcpagvmgenntlvwkyadaghvchlchpnctygctgpglegcptngpkipsiatgmvgalllllvvalgiglfm(seqidno:10)。[0105]替代地，可以使用seqidno:10的等效物，例如与seqidno:10相比包含1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10、或11、或12、或13、或14、或15、或更多个突变的等效物，或者与seqidno:10具有至少90%、至少95%、至少98%相同的等效物。在进一步的实施方案中，seqidno:10的等效物仍然能够被特异性地识别和结合egfr的分子（如抗体或其抗原结合片段）识别并结合。在更进一步的实施方案中，seqidno:10的等效物并不像野生型egfr那样指导表达该等效物的细胞执行功能。[0106]如本文所使用的，核糖体跳跃序列，也被称为可裂解肽或可裂解连接子，是指可被裂解的肽，例如，通过可在细胞中的蛋白质翻译过程中诱导核糖体跳跃的酶或肽，或两者。一个包含这种可裂解肽的翻译的多肽可以产生两个最终产物，因此，允许从一个开放阅读框中表达一个以上的多肽。因此，核糖体跳跃序列可以用来在如本文所公开的细胞上表达car和截短的蛋白标记物。替代地，也可以用其他方法来实现这种共同表达，例如，通过包括car编码序列、截短的蛋白标记物编码序列、位于其间的内部核糖体进入位点（ires）的核酸分子。[0107]可裂解肽的一个例子是自裂解肽，例如2a自裂解肽。2a自裂解肽，是一类18-22aa长的肽，它可以诱导重组蛋白在细胞中的裂解。在一些实施方案中，2a自裂肽选自p2a、t2a、e2a、f2a和bmcpv2a。参见，例如wangy,etal.2aself-cleavingpeptide-basedmulti-geneexpressionsysteminthesilkwormbombyxmori.scirep.2015;5:16273，2015年11月5日发表。[0108]如本文所用，术语“t2a”和“2a肽”可互换使用，以指任何2a肽或其片段、任何类似2a的肽或其片段，或由相对较短的肽序列（根据来源病毒，约20个氨基酸长）中的必要氨基酸组成的人工肽，该序列含有共有多肽基序d-v/i-e-x-n-p-g-p（seqidno:29），其中x指任何通常被认为是自裂解的氨基酸。[0109]本文所使用的术语“内部核糖体进入位点”或“ires”可互换地指直接促进核糖体结合和mrna翻译，从而允许以不依赖帽（cap）的方式启动翻译的多核苷酸。在一些实施方案中，ires是指信使rna（mrna）上的rna序列。此外或替代地，ires还指与iresrna序列互补的、反向的或既互补又反向的多核苷酸序列（如rna序列、dna序列或其混合体）。ires的非限制性例子可以在hellencuandsarnowp.internalribosomeentrysitesineukaryoticmrnamolecules.genesdev.2001jul1;15(13):1593-612中找到。[0110]“可检测标签”、“标签”、“可检测标记”或“标记”可互换使用，包括但不限于放射性同位素、荧光色素、化学发光化合物、染料和蛋白质（包括酶）。可检测的标签也可以附着在本文所述的多核苷酸、多肽、抗体或组合物上。[0111]如本文所用，术语“标签”或可检测标签意指能够直接或间接检测的化合物或组合物，其直接或间接与要检测的组合物相连接，例如n-末端组氨酸标签（n-his）、磁活性同位素（例如115sn、117sn和119sn）、非放射性同位素（例如13c和15n）、多核苷酸或蛋白质（例如抗体），从而产生“经标记的”组合物。该术语还包括与多核苷酸共轭的序列，其在插入的序列表达时将提供信号，如绿色荧光蛋白（gfp）等。标签可以是本身可检测的（如放射性同位素标签或荧光标签），或者在酶标签的情况下，可以催化底物化合物或组合物的化学变化，而这是可检测的。这些标签可以适用于小规模的检测，也可以更适用于高通量筛选。因此，合适的标签包括但不限于磁活性同位素、非放射性同位素、放射性同位素、荧光色素、化学发光化合物、染料和蛋白质（包括酶）。标签可以被简单地检测，也可以被量化。简单检测的反应一般包括仅确认其存在的反应，而量化的反应一般包括具有可量化（例如，可报告的数值）的反应，例如强度、偏振或其他属性。在发光或荧光检测中，可检测的反应可使用与实际参与结合的检测成分相连的发光体或荧光体直接产生，或使用与另一（如报告或指示）成分相连的发光体或荧光体间接产生。产生信号的发光标签的例子包括但不限于生物发光和化学发光。可检测的发光反应一般包括发光信号的变化或发生。用于发光标记检测成分的合适方法和发光体在本领域是已知的，例如在haugland,richardp.(1996)handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(6thed)中描述。发光探针的例子包括但不限于水母发光蛋白（aequorin）和荧光素酶。[0112]如本文所使用的，术语“免疫结合物”包括与第二药剂相关联或连接的抗体或抗体衍生物，所述第二药剂例如是细胞毒剂、可检测剂、放射性剂、靶向剂、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、半合成抗体或多特异性抗体。[0113]合适的荧光标签的例子包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、芪（stilbene）、路西法黄（luciferyellow）、cascadeblue™和德州红（texasred）。其他合适的光学染料在haugland,richardp.(1996)handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(6thed.)中描述。[0114]在一些实施方案中，荧光标签被官能化以促进与存在于细胞或组织的表面中或其上的细胞成分（例如细胞表面标记物）的共价连接。合适的官能团包括但不限于异硫氰酸酯基团、氨基、卤代乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯和磺酰卤，所有这些都可用于将荧光标签连接到第二分子。荧光标签的官能团的选择将取决于与连接子、药剂、标记物或第二标记剂的附着部位。[0115]如本文所用，纯化标签或标记物是指可用于纯化该标签所连接的分子或成分的标签，例如表位标签（包括但不限于myc标签、人流感血凝素（ha）标签、flag标签）、亲和标签（包括但不限于谷胱甘肽-s转移酶（gst）、多组氨酸（his）标签、钙调蛋白结合蛋白（cbp）或麦芽糖结合蛋白（mbp）），或荧光标签。[0116]该多肽或其各自的等效物，可以在羧基末端跟随有额外的50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4个、或3个、或2个或1个氨基酸。[0117]本文所例举的每个car组分的进一步实施方案包括与所例举的组分具有至少70%、或者至少80%的氨基酸序列同一性、优选90%的序列同一性、更优选至少95%的序列同一性的具有类似生物功能的其他蛋白质。[0118]在没有明确叙述的情况下，除非另有说明，否则应推断出，当本公开内容涉及多肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，在本公开内容的范围内意指此类的等效物或生物等效物。如本文所使用的，术语“其生物等效物”在提及参考蛋白质、抗体、多肽或核酸时，意在与“其等效物”同义，是指具有最小的同源性，同时仍保持所需的结构或功能的。除非在此特别提及，否则本文提到的任何多核苷酸、多肽或蛋白质也包括其等效物。例如，等效物是指至少约70%的同源性或同一性、或至少80%的同源性或同一性、或者至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少98%的同源性或同一性，并表现出与参考蛋白、多肽或核酸基本等同的生物活性。替代地，当提到多核苷酸时，其等效物是指在严格的条件下与参考多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。[0119]多核苷酸或多核苷酸区域（或多肽或多肽区域）与另一个序列具有一定百分比（例如80%、85%、90%或95%）的“序列同一性”，是指当对齐时，该百分比的碱基（或残基）在两个序列的比较中是相同的。对齐和同源性或序列同一性的百分比可以用本领域已知的软件程序来确定，例如在currentprotocolsinmolecularbiology(ausubeletal.,eds.1987)supplement30,section7.7.18,table7.7.1中描述的程序。优选地，使用默认参数进行比对。优选的比对程序是blast，使用默认参数。特别是，优选的程序是blastn和blastp，使用以下默认参数。遗传代码=标准；过滤器=无；链=两个；截止点=60；期望值=10；矩阵=blosum62；描述=50个序列；排序=高分；数据库=非冗余，genbank+embl+ddbj+pdb+genbankcds翻译+swissprotein+spupdate+pir。这些程序的细节可以在以下互联网地址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/blast。另一个优选的比对程序是clustalomega，可在www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/进入，或者pairwisesequencealignment，可在www.ebi.ac.uk/tools/psa/进入，使用默认参数。[0120]如本文所用，细胞可以是原核细胞或真核细胞。在进一步的实施方案中，该细胞是免疫细胞。[0121]“宿主细胞”不仅指特定的主体细胞，而且指这种细胞的后代或潜在后代。因为由于突变或环境的影响，在后代中可能会发生某些修饰，这样的后代事实上可能与母体细胞不完全相同，但仍包括在本文所用术语的范围内。[0122]术语“培养”是指细胞或生物体在各种介质上或介质中的体外或离体繁殖。可以理解的是，在培养中生长的细胞的后代可能与母体细胞不完全相同（即在形态上、遗传上或表型上）。[0123]“免疫细胞”包括例如白细胞（白细胞，如粒细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）、单核细胞和淋巴细胞（t细胞、b细胞、自然杀伤（nk）细胞和nkt细胞））、淋巴细胞（t细胞、b细胞、自然杀伤（nk）细胞）和骨髓衍生细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞）。在一些实施方案中，免疫细胞来源于造血干细胞（hsc）。在进一步的实施方案中，hsc在骨髓中产生。在进一步的实施方案中，hsc分离自脐带血。在其他的实施方案中，hsc分离自外周血。在一些实施方案中，免疫细胞来源于以下中的一种或多种：祖细胞、胚胎干细胞、胚胎干细胞衍生细胞、胚胎生殖细胞、胚胎生殖细胞衍生细胞、干细胞、干细胞衍生细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞（ipsc）、造血干细胞（hsc）、或永生化细胞。在一些实施方案中，hsc来自受试者的脐带血、受试者的外周血、或受试者的骨髓。[0124]在一些实施方案中，免疫细胞是指中央记忆t细胞、nk细胞、幼稚记忆t细胞、泛（pan）t细胞或其任何组合。在一些实施方案中，免疫细胞是指基本上耗尽了cd25+细胞和cd14+细胞的外周血单核细胞（pbmc）。[0125]如本文所用，术语“t细胞”是指一种在胸腺中成熟的淋巴细胞。t细胞在细胞介导的免疫中发挥重要作用，并通过在细胞表面存在t细胞受体而与其他淋巴细胞（如b细胞）区分开来。t细胞可以是分离出来的，也可以从市面上获得。“t细胞”包括所有类型的表达cd3的免疫细胞，包括t辅助细胞（cd4+细胞）、细胞毒性t细胞（cd8+细胞）、自然杀伤性t细胞、t调节细胞（treg）和γ-δt细胞。“细胞毒性细胞”包括cd8+t细胞、自然杀伤（nk）细胞和中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。市售t细胞系的非限制性例子包括细胞系bcl2(aaa)jurkat(atcc®ꢀcrl-2902™)、bcl2(s70a)jurkat(atcc®ꢀcrl-2900™)、bcl2(s87a)jurkat(atcc®ꢀcrl-2901™)、bcl2jurkat(atcc®ꢀcrl-2899™)、neojurkat(atcc®ꢀcrl-2898™)、tall-104细胞毒性人类t细胞系（atcc#crl-11386）。进一步的例子包括但不限于成熟t细胞系，例如deglis、ebt-8、hpb-mlp-w、hut78、hut102、karpas384、ki225、my-la、se-ax、skw-3、smz-1和t34；以及未成熟t细胞系，例如all-sil、be13、ccrf-cem、cml-t1、dnd-41、du.528、eu-9、hd-mar、hpb-all、h-sb2、ht-1、jk-t1、jurkat、karpas45、ke-37、kopt-k1、k-t1、l-kaw、loucy、mat、molt-1、molt3、molt-4、molt13、molt-16、mt-1、mt-all、p12/ichikawa、peer、per0117、per-255、pf-382、pfi-285、rpmi-8402、st-4、sup-t1至t14、tall-1、tall-101、tall-103/2、tall-104、tall-105、tall-106、tall-107、tall-197、tk-6、tlbr-1、-2、-3、以及-4、ccrf-hsb-2(ccl-120.1)、j.rt3-t3.5(atcctib-153)、j45.01(atcccrl-1990)、j.cam1.6(atcccrl-2063)、rs4;11(atcccrl-1873)、ccrf-cem(atcccrm-ccl-119)；以及皮肤t细胞淋巴瘤系，例如hut78(atcccrm-tib-161)、mj[g11](atcccrl-8294)、hut102(atcctib-162)。空白血病细胞系，包括但不限于reh、nall-1、km-3、l92-221，是另一种可通过商业途径获得的免疫细胞来源，还有来自其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例如k562红白血病、thp-1单核细胞白血病、u937淋巴瘤、hel红白血病、hl60白血病、hmc-1白血病、kg-1白血病、u266骨髓瘤。这种商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括americantypeculturecollection或atcc（www.atcc.org/）和germancollectionofmicroorganismsandcellcultures（www.dsmz.de/）。[0126]如本文所用，术语ꢀ“nk细胞”，也称为自然杀伤细胞，是指一种起源于骨髓的淋巴细胞，其在先天免疫系统中发挥关键作用。nk细胞对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其他受压细胞提供快速的免疫反应，即使在细胞表面没有抗体和主要组织相容性复合物的情况下。nk细胞可以是分离出来的，也可以从商业来源获得。商业nk细胞系的非限制性例子包括nk-92(atcc®ꢀcrl-2407™)、nk-92mi(atcc®ꢀcrl-2408™)细胞系。进一步的例子包括但不限于nk细胞系hank1、khyg-1、nkl、nk-ys、noi-90和yt。这种商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括americantypeculturecollection或atcc（www.atcc.org/）和germancollectionofmicroorganismsandcellcultures（www.dsmz.de/）。[0127]术语“干细胞”是指处于未分化或部分分化状态的细胞，具有自我更新或产生分化后代的能力，或两者兼有。自我更新被定义为干细胞增殖并产生更多此类干细胞的能力，同时保持其发育潜力（即全能、多能、多潜能等）。术语“成体干细胞”在这里指的是来自非胚胎组织的任何干细胞，包括胎儿、幼年和成年组织。天然成体干细胞已从各种成人组织中分离出来，包括血液、骨髓、大脑、嗅觉上皮、皮肤、胰腺、骨骼肌和心肌。示例性的自然发生的成体干细胞包括但不限于间质干细胞（msc）和神经或神经元干细胞（nsc）。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞可以是胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（ipsc）。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞是造血干细胞（hsc）。如本文所用，“胚胎干细胞”是指来自受精后但在妊娠结束前形成的组织的干细胞，包括胚胎前组织（例如囊胚）、胚胎组织或妊娠期间任何时间的胎儿组织，通常但不一定是在妊娠约10-12周之前。最常见的是，胚胎干细胞是来自早期胚胎或囊胚的多能细胞。胚胎干细胞可以直接从合适的组织中获得，包括但不限于人体组织，或从建立的胚胎细胞系中获得。“类胚胎干细胞”是指具有胚胎干细胞的一个或多个但不是全部特征的细胞。[0128]“分化”描述的是非专门化的细胞获得专门化细胞（例如心脏、肝脏、免疫或肌肉细胞）特征的过程。“定向分化”是指操纵干细胞培养条件以诱导分化为特定的细胞类型。“去分化”是指恢复到细胞谱系中不太分化（committed）的位置的细胞。如本文所用，术语“分化或分化的”定义了在细胞谱系中采取更分化（“分化”）位置的细胞。[0129]如本文所使用的，术语“分化或分化的”定义了在细胞谱系中采取更分化（“分化”）位置的细胞。“去分化”是指恢复到细胞谱系中不太分化的位置的细胞。诱导多能干细胞是去分化细胞的例子。[0130]如本文所使用的，细胞的“谱系”定义了该细胞的遗传性，即其前辈和后代。细胞的谱系将细胞置于发育和分化的遗传计划中。[0131]“多系干细胞”或“多能干细胞”是指能繁殖其自身和至少两个来自不同发育谱系的进一步分化的后代细胞的干细胞。这些谱系可以来自同一生殖层（即中胚层、外胚层或内胚层），或来自不同的生殖层。[0132]“前体”或“前体细胞”或“祖细胞”意指具有分化为特定类型细胞的能力的细胞。祖细胞可以是干细胞。祖细胞也可以比干细胞更特化。祖细胞可以是单能的或多能的。与成体干细胞相比，祖细胞可能处于细胞分化的后期阶段。祖细胞的例子包括但不限于祖神经细胞。[0133]如本文所用，“多能细胞”定义了一种分化程度较低的细胞，它可以产生至少两个不同的（基因型或表型或两者）进一步分化的后代细胞。在另一个方面，“多能细胞”包括诱导多能干细胞（ipsc），这是一种人工衍生的干细胞，来自非多能细胞，通常是成人体细胞，历史上是通过诱导一个或多个干细胞特异性基因的表达而产生。这种干细胞特异性基因包括但不限于：八聚体转录因子家族，即oct-3/4；sox基因家族，即sox1、sox2、sox3、sox15和sox18；klf基因家族，即klf1、klf2、klf4和klf5；myc基因家族，即c-myc和l-myc；nanog基因家族，即oct4、nanog和rex1；或lin28。ipsc的例子在以下文献中描述：takahashietal.(2007)cell，2007年11月20日提前在线发表；takahashi&yamanaka(2006)cell126:663–76；okitaetal.(2007)nature448:260-262；yuetal.(2007)science，2007年11月20日提前在线发表；以及nakagawaetal.(2007)nat.biotechnol，2007年11月30日提前在线发表。[0134]“诱导多能细胞”是指从成体细胞重新编程为未成熟表型的胚胎样细胞。各种方法在本领域是已知的，例如，"asimplenewwaytoinducepluripotency:acid."nature，2014年1月29日，可在sciencedaily.com/releases/2014/01/140129184445获取，最后一次访问是在2014年2月5日，以及美国专利申请公开号2010/0041054。人类ipsc也表达干细胞标记，能够生成所有三个生殖层的特征细胞。[0135]“孤雌生殖干细胞”是指由卵子的孤雌生殖激活产生的干细胞。创造孤雌性干细胞的方法在本领域是已知的。参见例如cibellietal.(2002)science295(5556):819和vranaetal.(2003)proc.natl.acad.sci.usa100(suppl.1)11911-6。[0136]如本文所用，术语“多能基因或标记物”是指与未成熟或未分化表型相关的表达基因或蛋白质，例如oct3/4、sox2、nanog、c-myc和lin-28。识别这类基因的方法在本领域是已知的，识别这类基因的系统可从例如mdmillipore(milliplex®ꢀmapkit)获得。[0137]如本文所用，造血干细胞（hsc）是指产生所有类型的血细胞（包括但不限于白细胞、红细胞和血小板）的细胞，如干细胞。造血干细胞可以在外周血和骨髓中找到。在一些实施方案中，本文公开的免疫细胞来自造血干细胞。[0138]术语“表型”是指对个体的性状或特征的描述，这些性状或特征是可测量的，并且只在群体中的子集的个体中表达。在本发明的一些实施方案中，个体的表型包括单个细胞、基本上同质的细胞群、分化的细胞群或由细胞群组成的组织的表型。[0139]在一些实施方案中，本文所述的细胞群是基本上同质的。如本文所使用的，“基本上同质”描述了这样的细胞群，其中超过约50%、或超过约60%、或超过70%、或超过75%、或超过80%、或超过85%、或超过90%、或超过95%的细胞具有相同或相似的表型。表型可以通过预先选择的细胞表面标志物或其他标志物来确定。[0140]本文所用的术语“分离的”是指基本上不含其他材料的分子、生物、细胞材料、细胞或生物样本。在一个方面，术语“分离的”是指分别与存在于自然来源中的其他dna或rna、或蛋白质或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离的核酸（如dna或rna）、或蛋白质或多肽（如抗体或其衍生物）、或细胞或细胞器、或组织或器官。术语ꢀ“分离的”也指通过dna重组技术生产时基本不含细胞材料、病毒材料或培养基的核酸或多肽，或通过化学合成时不含化学前体或其他化学品的核酸或多肽。此外，“分离的核酸”是指包括核酸片段，这些片段非天然作为片段存在，在自然状态下不会被发现。术语ꢀ“分离的”在此也用来指从其他细胞蛋白中分离出来的多肽，并意在包括纯化的和重组的多肽。术语“分离的”在此也用于指从其他细胞或组织中分离出来的细胞或组织，意指包括培养的和工程化的细胞或组织。[0141]如本文所用，术语“分离的细胞”一般是指与组织的其他细胞基本分离的细胞。[0142]细胞群（细胞的群体）意指一个以上的细胞集合，其表型或基因型或两者相同（克隆）或不相同。该群体可以是纯化的、高度纯化的、基本上同质的或异质的，如本文所述。[0143]“基本上同质”描述了这样的细胞群，其中超过约50%、或超过约60%、或超过70%、或超过75%、或超过80%、或超过85%、或超过90%、或超过95%的细胞具有相同或相似的表型。表型可以通过预先选择的细胞表面标志物或其他标志物来确定。[0144]如本文所用，术语“纯化的”不要求绝对的纯度；而是，它旨在作为相对性术语。因此，例如，纯化的核酸、肽、蛋白质、生物复合物、细胞或其他活性化合物是指全部或部分从蛋白质或其他污染物中分离出来。一般来说，在将肽、蛋白质、生物复合物、细胞或其他活性化合物与药物载体、赋形剂、缓冲剂、吸收促进剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其他共同成分混合或配制成用于治疗性施用的完整药物制剂之前，用于本公开内容的基本上纯化的肽、蛋白质、生物复合物、细胞或其他活性化合物包括存在于制剂中的所有大分子物种的80%以上。更典型的是，在与其他制剂成分混合之前，肽、蛋白质、生物复合物或其他活性化合物被纯化，以代表纯化制剂中存在的所有大分子种类的90%以上，通常为95%以上。在其他情况下，纯化的制剂可能基本上是均匀的，其中其他大分子种类无法通过常规技术检测。[0145]在一些实施方案中，术语“工程化”或“重组”是指具有至少一种在自然发生的蛋白质、多肽、多核苷酸、菌株、野生型菌株或参考物种的亲本宿主菌株中通常不存在的修改。在一些实施方案中，术语“工程化”或“重组”是指由人类干预合成。[0146]如本文所用，术语“自体”在提及细胞时是指被分离并输回同一主体（受体或宿主）的细胞。“异体”指的是非自体的细胞。[0147]本文所用的“组合物”是指活性剂（例如本文所公开的化合物）和惰性或活性载体。载体可以是但不限于固体（例如珠子或树脂）或液体（例如磷酸盐缓冲盐水）。[0148]“药物组合物”旨在包括活性多肽、多核苷酸、抗体或细胞与惰性或活性载体（如固体支持物）的组合，使该组合物适合在体外、体内或离体用于诊断或治疗。[0149]如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳剂（如油/水或水/油乳剂），以及各种类型的润湿剂。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。关于载体、稳定剂和助剂的例子，参见martin(1975)remington’spharm.sci.,15thed.(mackpubl.co.,easton)。[0150]“联合/组合”施用或治疗是指施用两种药剂，使得其药理作用在同一时间表现出来。联合治疗并不要求在同一时间或基本相同的时间给药，尽管联合治疗可以包括这样的给药。此处描述了这种额外的药剂，例如，细胞减灭疗法。[0151]本文所用的“细胞减灭疗法（cytoreductivetherapy）”包括但不限于化疗、冷冻疗法和放射疗法。作用来减少细胞增殖的药剂在本领域是已知的，并被广泛使用。只在癌细胞分裂时杀死它们的化疗药物被称为细胞周期特异性。这些药物包括作用于s期的药剂，包括拓扑异构酶抑制剂和抗代谢物。[0152]拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶（拓扑异构酶i和ii）作用的药物。在化疗过程中，拓扑异构酶控制复制所需的dna结构的操作，因此是针对细胞周期的。拓扑异构酶i抑制剂的例子包括上述的喜树碱类似物、伊立替康和拓扑替康。拓扑异构酶ii抑制剂的例子包括阿姆沙林、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷。[0153]抗代谢物通常是正常代谢底物的类似物，经常干扰参与染色体复制的过程。它们在周期中非常具体的阶段攻击细胞。抗代谢物包括：叶酸拮抗剂，例如甲氨蝶呤；嘧啶拮抗剂，例如5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、卡培他滨和吉西他滨；嘌呤拮抗剂，例如6-巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤；腺苷脱氨酶抑制剂，例如克拉霉素、氟达拉滨、奈拉滨和喷司他丁；等等。[0154]植物生物碱来源于某些类型的植物。长春花生物碱是由长春花植物（catharanthusrosea）制成。紫杉碱是从太平洋紫杉树（taxus）的树皮中提取的。长春花生物碱和紫杉烷也被称为抗微管剂。鬼臼毒素来自于五月苹果植物。喜树碱类似物来自亚洲的“快乐树”（喜树）。鬼臼毒素和喜树碱类似物也被归类为拓扑异构酶抑制剂。这些植物生物碱通常具有细胞周期特异性。[0155]这些药剂的例子包括：长春花生物碱，例如长春新碱（vincristine）、长春花碱（vinblastine）和长春瑞滨（vinorelbine）；紫杉烷，例如紫杉醇和多西他赛；鬼臼毒素，例如依托泊苷和替尼泊苷；以及喜树碱类似物，例如伊立替康和拓扑替康。[0156]冷冻疗法包括但不限于涉及降低温度的疗法，例如低温疗法。[0157]放射治疗包括但不限于暴露于本领域已知的辐射，例如，电离辐射、紫外线辐射。示例性剂量包括但不限于至少约2gy至不超过约10gy的电离辐射剂量和/或至少约5j/m2至不超过约50j/m2（通常约10j/m2）的紫外线辐射剂量。[0158]如本文所用，联合疗法可以是增加癌细胞上flt3表达的药物。在一些实施方案中，该药物包括flt3抑制剂。如本文所用，术语“flt3抑制剂”是指与flt3结合并降低其活性的分子。不受理论约束，人们认为这种flt3抑制剂可以增加细胞表面flt3的表达。flt3抑制剂的非限制性例子包括吉瑞替尼（gilteritinib）（astellas，cid49803313）、奎扎替尼（quizaritinib）（ambitbiosciences，cid24889392）、米哚妥林（midostaurin）（novartis，cid9829523）、索拉非尼（sorafenib）（bayerandonxypharmaceuticals，cid216239）、舒尼替尼（sunitinib）（pfizer，cid5329102）、lestarutinib（cephalon，cid126565）、ff-10101（fuijfilm）、多韦替尼（dovitinib）（novartisoroncologyventure，cid9886808），以及其等效物，例如但不限于盐和水合物，例如富马酸吉瑞替尼（cid76970819）、二盐酸奎扎替尼（cid25184035）、水合米哚妥林（cid71311854）、甲苯磺酸索拉非尼（cid406563）、硫酸索拉非尼（cid86672519）、氢溴酸索拉非尼（cid44599974）、盐酸索拉非尼（cid44599975）、苹果酸舒尼替尼（cid6456015）、水合lestarutinib（cid45111934）、甲醇lestarutinib（cid131738508）、乳酸多韦替尼（cid44150621）、二乳酸多韦替尼（cid66553150）。[0159]“有效量”是指足以产生有益或预期结果的量。有效量可以通过一次或多次给药、应用或剂量给药。这种递送取决于许多变量，包括单个剂量单位使用的时间段、治疗剂的生物利用率、给药途径等。然而，可以理解的是，本文所公开的治疗剂对任何特定对象的具体剂量水平取决于多种因素，包括所采用的特定化合物的活性、化合物的生物利用度、给药途径、动物的年龄和体重、一般健康状况、性别、动物的饮食、给药时间、排泄率、药物组合、以及所治疗的特定疾病的严重程度和给药形式。一般来说，人们希望给予有效达到与体内发现的有效浓度相称的血清水平的量的化合物。这些考虑因素以及有效的配方和给药程序在本领域是众所周知的，并在标准教科书中有所描述。[0160]药物或药剂的“治疗有效量”是指足以获得药理反应的药物或药剂的量；替代地，是指在对患有特定障碍或疾病的患者施用时足以产生预期效果的药物或药剂的量，所述效果例如是治疗、减轻、改善、缓解或消除患者中特定障碍或疾病的一种或多种表现。治疗效果不一定通过施用一个剂量而发生，可能只有在施用一系列剂量后才会发生。因此，治疗有效量可分一次或多次给药来施用。[0161]如本文所用，术语“接触”是指两个或多个分子或其他实体之间的直接或间接结合或相互作用。直接相互作用的一个特定例子是结合。间接相互作用的一个特定例子是一个实体作用于中间分子，而该中间分子又作用于第二个所指的实体。此处所用的接触包括在溶液中、固相中、体外、离体、细胞中和体内。体内接触可被称为施用或给药。[0162]细胞或载体或其他制剂以及含有这些的组合物的“给药/施用”或“递送”可以在整个治疗过程中以一次剂量、连续或间歇地进行。确定最有效的给药方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并将随着用于治疗的组合物、治疗的目的、被治疗的靶细胞和被治疗的对象而变化。可以进行单次或多次给药，剂量水平和模式由治疗的医生选择，如果是动物，则由治疗的兽医选择。适当的剂量配方和给药方法是本领域内已知的。给药途径也可以确定，确定最有效的给药途径的方法是本领域技术人员已知的，并将随用于治疗的组合物、治疗的目的、被治疗对象的健康状况或疾病阶段以及目标细胞或组织而变化。给药途径的非限制性例子包括静脉内、颅内、口服、腹腔内、输注、鼻腔内给药、吸入、注射和局部应用。在一些实施方案中，给药是瘤内给药，或对肿瘤微环境给药，或两者都包括。在一些实施方案中，给药是在一定时间内输注（例如向受试者的外周血），所述一定时间例如是约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约24小时或更长时间。[0163]术语给药应包括但不限于通过口服、肠外（例如肌肉内、腹膜内、静脉内、脑脊液内（icv）、鞘内、鼻腔内注射或输注、皮下注射、或植入）、通过吸入鼻喷雾剂、阴道、直肠、舌下、尿道（例如尿道栓剂）或局部给药途径（例如凝胶、软膏、霜、气雾剂等），并可单独或一起配制成合适的剂量单位制剂，其中含有适合每种给药途径的常规无毒药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂和载体。本公开内容不受给药途径、制剂或剂量方案的限制。[0164]“给药/施用”可以在整个治疗过程中以一个剂量、连续或间歇地进行。确定最有效的给药方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并将随用于治疗的组合物、治疗的目的、被治疗的靶细胞和被治疗的对象而变化。可以进行单次或多次给药，剂量水平和模式由治疗的医生选择。适当的剂量配方和给药方法是本领域内已知的。给药途径也可以确定，确定最有效的给药途径的方法是本领域技术人员已知的，并将随用于治疗的组合物、治疗的目的、被治疗对象的健康状况或疾病阶段以及目标细胞或组织而变化。在一些实施方案中，向受试者施用1x104至1x1015个或介于两者之间的本文所公开的细胞，例如1x107至1x1010个。在一些实施方案中，给药或其语法变化也指具有一定间隔的一个以上的剂量。在一些实施方案中，间隔为1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年或更长。在一些实施方案中，一个剂量重复一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或以上。例如，本文所公开的细胞可以每周给受试者施用，并持续达四周。本组合物和疗法可与其他疗法相结合，例如，淋巴消退化疗后输注（例如每周输注四次）该疗法，如此定义一个周期，然后再进行其他周期，直到出现部分或完全反应，或者替代性地利用该疗法作为另一种方式的“桥梁”，例如造血干细胞移植或cart细胞疗法。[0165]本公开的药剂可以通过任何合适的给药途径施用以进行治疗。还可以理解的是，最佳途径将随接受者的状况和年龄以及所治疗的疾病而变化。[0166]如本文所使用的，“治疗”受试者的疾病是指（1）防止症状或疾病在有倾向性或尚未显示疾病症状的受试者中发生；（2）抑制疾病或阻止其发展；或（3）改善或导致疾病或疾病症状的消退。正如本领域所理解的那样，“治疗”是获得有益或预期结果的方法，包括临床结果。就本技术而言，有益的或期望的结果可以包括以下中的一个或多个，但不限于：一个或多个症状的缓解或改善，病情（包括疾病）程度的减弱，病情（包括疾病）的稳定（即不恶化）状态，病情（包括疾病）的延迟或减缓，病情（包括疾病）的进展、改善或缓解，状态和缓解（无论是部分还是全部），无论是可检测还是不可检测的。当疾病是癌症时，以下临床终点是治疗的非限制性例子：减少肿瘤负担、减缓肿瘤生长、延长总生存期、延长肿瘤进展时间、抑制转移或减少肿瘤的转移。在一个方面，治疗不包括预防。[0167]在一个实施方案中，本文使用的术语“疾病”或“病症/障碍”是指癌症或肿瘤（可互换使用）、被诊断患有此类疾病的状态、被怀疑患有此类疾病的状态、或高风险患有此类疾病的状态。该疾病可以是原发性、复发性、顽固性或转移性癌症。[0168]在一些实施方案中，所述疾病是癌症。在进一步的实施中，癌症是白血病或淋巴瘤。如本文所用，“白血病”是血液或骨髓的癌症，其特征是不成熟的白血细胞异常增加。在再进一步的实施方案中，该疾病是具有表达flt3的癌细胞。在某些实施方案中，该癌症是急性骨髓性白血病（aml）或急性淋巴母细胞白血病（all）。急性骨髓性白血病（aml）——也被称为急性髓系白血病或急性成髓细胞白血病——是一种骨髓源性血细胞的癌症，其特征是异常的骨髓细胞快速生长，在骨髓中积累并干扰正常血细胞的生成。急性淋巴母细胞白血病（all）——也被称为急性淋巴细胞白血病或急性淋巴细胞性白血病——是一种白血细胞的癌症，其特点是恶性的、不成熟的白细胞（淋巴细胞）的过度生产和积累，导致缺乏正常、健康的血细胞。如本文所用，“淋巴瘤”是一种血癌，其特征是血细胞肿瘤的发展和淋巴结肿大、发烧、出汗、体重意外下降、瘙痒和不断感到疲倦的症状。在一些实施方案中，疾病是实体瘤癌症。非限制性的例子包括组织的肉瘤和癌，例如脑癌、肾癌、乳腺癌、腺癌、神经系统癌症、肺癌、结肠直肠癌或胶质母细胞瘤（gbm）。在一些实施方案中，疾病选自乳腺癌、黑色素瘤、类癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肾癌、胶质瘤、神经系统癌症、皮肤癌、头颈癌、胃癌、肝癌、睾丸癌、肺癌、甲状腺癌、淋巴瘤、尿道癌，或任何其他在www.proteinatlas.org/ensg00000122025-flt3/pathology或sungheelimetal.oncotarget.2017jan10;8(2):3237–3245中鉴定的癌症。在一些实施方案中，疾病是骨髓增生异常综合症。因此，本领域的技术人员可以理解，本文的方法和其他公开中描述的术语癌症可以由术语疾病或骨髓增生异常综合症取代。[0169]与术语“治疗”相关的术语“患有”是指已被诊断出患有或易患本文所公开的疾病的病人或个人。该患者尚未形成特征性的疾病病理。[0170]如本文所使用的，“癌症”是一种疾病状态，其特征是在受试者体内存在表现出异常不受控制的复制的细胞，在某些方面，该术语可与术语“肿瘤”互换使用。术语“癌症或肿瘤抗原”是指已知与癌细胞或肿瘤细胞或组织相关并在其表面表达的抗原，而术语“癌症或肿瘤靶向抗体”是指针对此类抗原的抗体。[0171]术语或“可接受的”、“有效的”或“足够的”当用于描述本文公开的任何成分、范围、剂量形式等的选择时，意味着所述成分、范围、剂量形式等适合于所公开的目的。[0172]术语“一线”或“二线”或“三线”是指患者接受治疗的顺序。一线治疗方案是首先给予的治疗，而二线或三线治疗则分别在一线治疗后或二线治疗后给予。美国国家癌症研究所将一线治疗定义为“对某种疾病或病症的首次治疗。在癌症患者中，初级治疗可以是手术、化疗、放疗，或这些疗法的组合。一线治疗也被本领域的技术人员称为“初级疗法和初级治疗”。参见美国国家癌症研究所网站www.cancer.gov，最后一次访问是在2008年5月1日。通常情况下，由于患者对一线治疗没有表现出积极的临床或亚临床反应，或者一线治疗已经停止，所以患者会被给予后续的化疗方案。本文所述的方法和治疗可以作为一线、二线、三线、四线或五线疗法提供。[0173]实施本公开的方式在本公开中，描述了具有改进的flt3-car编码序列的car的产生和抗肿瘤功效。改进的序列（在此也被称为优化的序列）提供更高的car以及截短的蛋白标记物在细胞上的表达水平，因此特别适合用于转导细胞和识别或分离经转导的细胞。参见，例如图4c与图4d。在进一步的实施方案中，用优化的序列转导的car表达细胞对肿瘤细胞表现出更高的细胞毒性。参见，例如图5a。[0174]在一方面，提供一种编码抗fms样酪氨酸激酶3（flt3）嵌合抗原受体（car）的核酸分子。所述核酸分子包含seqidno:1的核苷酸（nt）55至nt777，或nt1至nt777，或全长的多核苷酸或其等效物，或基本上由其组成，或进一步由其组成。[0175]在一方面，提供一种编码抗fms样酪氨酸激酶3（flt3）抗原结合片段的核酸分子，其包含seqidno:1的核苷酸（nt）55至nt777的多核苷酸或其等效物或seqidno:12的nt55至nt777的多核苷酸，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，所述核酸分子包含seqidno:1的nt1至nt777的多核苷酸或与seqidno:1的nt1至nt777有至少85%同一性或包含seqidno:12的nt1至nt777的多核苷酸的其等效物，或基本上由其组成，或进一步由其组成。[0176]在一些实施方案中，等效物与seqidno:1的核苷酸（nt）55至nt777或nt1至nt777或全长有至少约75％（包括但不限于至少约76%、至少约77%、至少约78%、至少约79%、至少约80%、至少约81%、至少约82%、至少约83%、至少约84%、至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或至少约99%）同一性，条件是在一方面，至少一个seqidno:1的优化的核苷酸被保留在等效物中。此外，替代地，等效物包含的核苷酸（nt）55至nt777或nt1至nt777或全长的多核苷酸，其中小字母表示任何核苷酸（seqidno:12)。在一些实施方案中，小字母表示位于seqidno:1中相应位置的核苷酸。在一些实施方案中，等效物不包含atgggatggagctctatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccaccaggtccaactgcagcagcctggggctgagcttgtgaagcctggggcttcattgaagctgtcctgcaagtcttccgggtacaccttcaccagctactggatgcactgggtgaggcagaggcctggacatggccttgagtggatcggagagattgatccttctgacagttataaagactacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactgtggacagatcctccaacacagcctacatgcacctcagcagcctgacatctgatgactctgcggtctattattgtgcaagagcgattacgacgaccccctttgacttctggggccaaggcaccactctcacagtctcctcaggcggtggcggttctggtggcggtggctccggcggtggcggttctgatattgtgctaactcagtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagcgtcagtctttcctgcagggccagccagagtattagcaacaacctacactggtatcaacaaaaatcacatgagtctccaaggcttctcatcaagtatgcttcccagtccatctctgggatcccctccaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcactctcagtatcaacagtgtggagactgaagattttggagtgtatttctgtcaacagagtaacacctggccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgg(seqidno:14)的核苷酸（nt）55至nt777或nt1至nt777的多核苷酸。[0177]在一些实施方案中，所述核酸分子或其等效物包含：编码如rasqsisnnlh（seqidno:15）所示的轻链互补决定区1（cdrl1）的多核苷酸，编码如yasqsis（seqidno:16）所示的轻链互补决定区2（cdrl2）的多核苷酸，编码如qqsntwpyt（seqidno:17）所示的轻链互补决定区3（cdrl3）的多核苷酸，编码如sywmh（seqidno:18）所示的重链互补决定区1（cdrh1）的多核苷酸，编码如eidpsdsykdynqkfkd（seqidno:19）所示的重链互补决定区1（cdrh2）的多核苷酸，以及编码如aitttpfdf（seqidno:20）所示的重链互补决定区1（cdrh3）的多核苷酸，或基本上由其组成，或进一步由其组成。[0178]在一些实施方案中，所述核酸分子或其等效物包含编码抗体重链可变区qvqlqqpgaelvkpgaslklsckssgytftsywmhwvrqrpghglewigeidpsdsykdynqkfkdkatltvdrssntaymhlssltsddsavyycaraitttpfdfwgqgttltvss（seqidno:21）和抗体轻链可变区divltqspatlsvtpgdsvslscrasqsisnnlhwyqqkshesprllikyasqsisgipsrfsgsgtdftlsinsvetedfgvyfcqqsntwpytfgggtkleikr（seqidno:22）的多核苷酸。[0179]在一些实施方案中，所述核酸分子或等效物编码特异性识别和结合flt3的单链fv（scfv）、信号序列、间隔区、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述核酸分子或等效物包含编码信号肽的多肽、编码flt3抗原结合片段的多肽、编码铰链结构域的多肽、编码跨膜结构域的多肽、编码共刺激信号传导区域的多肽、编码细胞内信号传导结构域的多肽，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，所述核酸分子或等效物包含编码信号肽的多肽、编码flt3抗原结合片段的多肽、编码铰链结构域的多肽、编码cd28跨膜结构域的多肽、编码cd28共刺激信号传导区域的多肽、编码细胞内信号传导结构域的多肽，或基本上由其组成，或进一步由其组成。[0180]在一些实施方案中，本文公开的核酸分子或等效物编码seqidno:2的氨基酸（aa）19至aa259的多肽。在进一步的实施方案中，本文公开的核酸分子或等效物编码seqidno:2的aa1至aa259的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子或等效物编码seqidno:2的多肽。[0181]在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码截短的cd19或截短的egfr的多核苷酸。在进一步的实施方案中，截短的egfr包含seqidno:10的多肽，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在进一步的实施方案中，截短的cd19包含seqidno:13或11的多肽，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，本文公开的核酸分子进一步包含编码截短的cd19的如seqidno:28所示的多核苷酸或其等效物。[0182]在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码位于编码car的多核苷酸和编码截短的cd19或截短的egfr的多核苷酸之间的核糖体跳跃序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含t2a跳跃序列和编码截短的egfr或截短的cd19的序列。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含t2a跳跃序列和编码截短的egfr的序列。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含t2a跳跃序列和编码截短的cd19的序列。在一些实施方案中，所述酸分子进一步包含t2a跳跃序列和编码截短的egfr的序列。[0183]在一些实施方案中，一些实施方案，本文公开的核酸分子包含seqidno:1的等效物，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物由约55%至约60%或其间的任何百分比或范围的g和c残基组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物由约58%的g和c残基组成。[0184]在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约70%的编码丙氨酸（ala）氨基酸残基的密码子由gcc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约60%的编码半胱氨酸（cys）氨基酸残基的密码子由tgc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约60%的编码天冬氨酸（asp）氨基酸残基的密码子由gac组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约75%的编码谷氨酸（glu）氨基酸残基的密码子由gag组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约60%的编码苯丙氨酸（phe）氨基酸残基的密码子由ttc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约55%的编码甘氨酸（gly）氨基酸残基的密码子由ggc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约25%的编码甘氨酸（gly）氨基酸残基的密码子由gga组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约80%的编码组氨酸（his）氨基酸残基的密码子由cac组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约65%的编码异亮氨酸（ile）氨基酸残基的密码子由atc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约70%的编码赖氨酸（lys）氨基酸残基的密码子由aag组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约65%的编码亮氨酸（leu）氨基酸残基的密码子由ctg组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约90%的编码蛋氨酸（met）氨基酸残基的密码子由atg组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约55%的编码天冬酰胺（asn）氨基酸残基的密码子由aac组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约40%的编码脯氨酸（pro）氨基酸残基的密码子由ccc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约95%的编码谷氨酰胺（gln）氨基酸残基的密码子由cag组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约25%的编码精氨酸（arg）氨基酸残基的密码子由agg组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约25%的编码arg氨基酸残基的密码子由cgc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约40%的编码丝氨酸（ser）氨基酸残基的密码子由agc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约45%的编码苏氨酸（thr）氨基酸残基的密码子由acc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约40%的编码thr氨基酸残基的密码子由aca组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约65%的编码缬氨酸（val）氨基酸残基的密码子由gtg组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约90%的编码色氨酸（trp）氨基酸残基的密码子由tgg组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约50%的编码酪氨酸（tyr）氨基酸残基的密码子由tac组成。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物中至少约45%的编码tyr氨基酸残基的密码子由tat组成。[0185]在一些实施方案中，seqidno:1的等效物包含：频率为约0%至约1%，任选地约0.435%的由gcg组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.435%的由gca组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.652%的由gct组成的密码子，频率为约3%或更高，任选地约3.913%的由gcc组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0.652%的由tgt组成的密码子，频率为约1%或更高，任选地约1.087%的由tgc组成的密码子；频率为约0%至约2%，任选地约1.739%的由gat组成的密码子，频率为约3%或更高，任选地约3.478%的由gac组成的密码子；频率为约2%或更高，任选地约2.826%的由gag组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.870%的由gaa组成的密码子；频率为约0%至约2%，任选地约1.304%的由ttt组成的密码子，频率为约1%或更高，任选地约1.957%的由ttc组成的密码子；频率为约0%至约2%，任选地约1.087%的由ggg组成的密码子，频率为约0%至约3%，任选地约2.826%的由gga组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.652%的由ggt组成的密码子，频率为约5%或更高，任选地约5.652%的由ggc组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0.435%的由cat组成的密码子，频率为约1%或更高，任选地约1.957%的由cac组成的密码子；频率为约0%的由ata组成的密码子，频率为约0%至约2%，任选地约1.087%的由att组成的密码子，频率为约2%或更高，任选地约2.174%的由atc组成的密码子；频率为约3%或更高，任选地约3.913%的由aag组成的密码子，频率为约0%至约2%，任选地约1.522%的由aaa组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0.435%的由ttg组成的密码子，频率为约0%的由tta组成的密码子，频率为约5%或更高，约5.435%的由ctg组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.435%的由cta组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.435%的由ctt组成的密码子，频率为约0%至约2%，任选地约1.087%的由ctc组成的密码子；频率为约1%或更高，任选地约1.957%的由atg组成的密码子，频率为约0%至约2%，任选地约1.087%的由aat组成的密码子，频率为约1%或更高，约1.522%的由aac组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0.652%的由ccg组成的密码子，频率为约0%至约2%，任选地约1.304%的由cca组成的密码子，频率为约0%至约2%，任选地约1.304%的由cct组成的密码子，频率为约2%或更高，任选地约2.609%的由ccc组成的密码子；频率为约4%或更高，任选地约4.783%的由cag组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.217%的由caa组成的密码子；频率为约1%或更高，任选地约1.739%的由agg组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.870%的由aga组成的密码子，频率为约0%至约2%，任选地约1.304%的由cgg组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.435%的由cga组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.217%的由cgt组成的密码子，频率为约1%或更高，任选地约1.739%的由cgc组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0.870%的由agt组成的密码子，频率为约4%或更高，约4.348%的由agc组成的密码子，频率为约0%的由tcg组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.217%的由tca组成的密码子，频率为约0%至约3%，任选地约2.826%的由tct组成的密码子，频率为约0%至约3%，任选地约2.609%的由tcc组成的密码子；频率为约0%的由acg组成的密码子，频率为约3%或更高，任选地约3.043%的由aca组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.652%的由act组成的密码子，频率为约3%或更高，任选地约3.261%的由acc组成的密码子；频率为约3%或更高，任选地约3.478%的由gtg组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.217%的由gta组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.435%的由gtt组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.870%的由gtc组成的密码子；频率为约1%或更高，任选地约1.957%的由tgg组成的密码子；频率为约2%或更高，任选地约2.391%的由tat组成的密码子，以及频率为约2%或更高，任选地约2.609%的由tac组成的密码子，或基本上由其组成，或进一步由其组成。[0186]在一些实施方案中，seqidno:1的等效物包含下表所公开的密码子频率或密码子使用偏好。[0187]在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含seqidno:1的nt1至nt777的等效物，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物由约55％至约60％或其间的任何百分比或范围的g和c残基组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物由约58%的g和c残基组成。[0188]在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约80%的编码丙氨酸（ala）氨基酸残基的密码子由gcc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约50%的编码半胱氨酸（cys）氨基酸残基的密码子由tgc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约50%的编码半胱氨酸（cys）氨基酸残基的密码子由tgt组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约60%的编码天冬氨酸（asp）氨基酸残基的密码子由gac组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约70%的编码谷氨酸（glu）氨基酸残基的密码子由gag组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约55%的编码苯丙氨酸（phe）氨基酸残基的密码子由ttc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约60%的编码甘氨酸（gly）氨基酸残基的密码子由ggc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约30%的编码甘氨酸（gly）氨基酸残基的密码子由gga组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约80%的编码组氨酸（his）氨基酸残基的密码子由cac组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约80%的编码异亮氨酸（ile）氨基酸残基的密码子由atc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约80%的编码赖氨酸（lys）氨基酸残基的密码子由aag组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约90%的编码亮氨酸（leu）氨基酸残基的密码子由ctg组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约90%的编码蛋氨酸（met）氨基酸残基的密码子由atg组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约50%的编码天冬酰胺（asn）氨基酸残基的密码子由aac组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约50%的编码天冬酰胺（asn）氨基酸残基的密码子由aat组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约40%的编码脯氨酸（pro）氨基酸残基的密码子由ccc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约90%的编码谷氨酰胺（gln）氨基酸残基的密码子由cag组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约50%的编码精氨酸（arg）氨基酸残基的密码子由cgg组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约20%的编码arg氨基酸残基的密码子由agg组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约60%的编码丝氨酸（ser）氨基酸残基的密码子由agc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约45%的编码苏氨酸（thr）氨基酸残基的密码子由acc组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约45%的编码thr氨基酸残基的密码子由aca组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约70%的编码缬氨酸（val）氨基酸残基的密码子由gtg组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约90%的编码色氨酸（trp）氨基酸残基的密码子由tgg组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约60%的编码酪氨酸（tyr）氨基酸残基的密码子由tat组成。在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物中至少约30%的编码tyr氨基酸残基的密码子由tat组成。[0189]在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物包含：频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由gcg组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由gca组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.772%的由gct组成的密码子，频率为约3%或更高，任选地约3.861%的由gcc组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0.772%的由tgt或tgc组成的密码子，频率为约0.5%或更高，任选地约0.772%的由tgt或tgc组成的密码子；频率为约0%至约2%，任选地约1.544%的由gat组成的密码子，频率为约3%或更高，任选地约3.089%的由gac组成的密码子；频率为约1%或更高，任选地约1.931%的由gag组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.772%的由gaa组成的密码子；频率为约0%至约2%，任选地约1.544%的由ttt组成的密码子，频率为约2%或更高，任选地约2.317%的由ttc组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0.386%的由ggg组成的密码子，频率为约0%至约4%，任选地约3.861%的由gga组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由ggt组成的密码子，频率为约7%或更高，任选地约7.722%的由ggc组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0.386%的由cat组成的密码子，频率为约1%或更高，任选地约1.931%的由cac组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0%的由ata组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.772%的由att组成的密码子，频率为约3%或更高，任选地约3.861%的由atc组成的密码子；频率为约3%或更高，任选地约3.475%的由aag组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.772%的由aaa组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由ttg组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由tta组成的密码子，频率为约7%或更高，约7.336%的由ctg组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由cta组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由ctt组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由ctc组成的密码子；频率为约1%或更高，任选地约1.158%的由atg组成的密码子；频率为约0%至约2%，任选地约1.158%的由aac或aat组成的密码子，频率为约1%或更高，约1.158%的由aac或aat组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由ccg组成的密码子，频率为约0%至约2%，任选地约1.158%的由cca组成的密码子，频率为约0%至约2%，任选地约1.158%的由cct组成的密码子，频率为约1%或更高，任选地约1.544%的由ccc组成的密码子；频率为约5%或更高，任选地约5.019%的由cag组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.386%的由caa组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0.772%的由agg组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由aga组成的密码子，频率为约1%或更高，任选地约1.544%的由cgg组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.386%的由cga组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由cgt组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.386%的由cgc组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由agt组成的密码子，频率为约6%或更高，约6.178%的由agc组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由tcg组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.386%的由tca组成的密码子，频率为约4%或更高，任选地约4.633%的由tct组成的密码子，频率为约4%或更高，任选地约4.247%的由tcc组成的密码子；频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由acg组成的密码子，频率为约4%或更高，任选地约4.247%的由aca组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.386%的由act组成的密码子，频率为约4%或更高，任选地约4.247%的由acc组成的密码子；频率为约3%或更高，任选地约3.861%的由gtg组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.386%的由gta组成的密码子，频率为约0%至约1%，任选地约0.000%的由gtt组成的密码子，频率为约0%至约2%，任选地约1.158%的由gtc组成的密码子；频率为约2%或更高，任选地约2.703%的由tgg组成的密码子；频率为约2%或更高，任选地约2.703%的由tat组成的密码子，以及频率为约0%至约2%，任选地约1.544%的由tac组成的密码子，或基本上由其组成，或进一步由其组成。[0190]在一些实施方案中，seqidno:1的nt1至nt777的等效物包含下表所公开的密码子频率或密码子使用偏好。[0191]一些实施方案，本文公开的核酸分子包含seqidno:1的nt55至nt777的等效物，或基本上由其组成，或进一步由其组成。[0192]在一些实施方案中，seqidno:1的等效物包含seqidno:1的核苷酸（nt）55至nt408。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物包含seqidno:1的nt454至nt777。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物包含seqidno:1的nt841至nt921。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物包含seqidno:1的nt922至nt1044。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物包含seqidno:1的nt1045至nt1380。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物包含seqidno:1的nt55至nt408和seqidno:1的nt454至nt777。在一些实施方案中，seqidno:1的等效物包含seqidno:1的nt55至nt408、seqidno:1的nt454至nt777、seqidno:1的nt841至nt921、seqidno:1的nt922至nt1044、以及seqidno:1的nt1045至nt1380。在一些实施方案，所述核酸分子包含seqidno:1，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案，seqidno:1的等效物包含含有至少一个被seqidno:1的对齐的nt残基取代的nt残基的seqidno:14的多核苷酸，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在进一步的实施方案中，被取代的nt残基与原来的nt残基不同。[0193]在一方面，提供一种编码car的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含必要的调节序列，例如，用于在细胞中表达的启动子，或者增强子。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含指导car表达的第一调节序列。在进一步的实施方案中，调节序列包含以下一种或多种：启动子、内含子、增强子或多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，启动子是ef1α启动子。在一些实施方案中，启动子是cmv启动子。在一些实施方案中，启动子是mmlv启动子。在进一步的实施方案中，所述核酸分子进一步编码截短的蛋白标记物，其可以被相同的第一调节序列或第二调节序列，如启动子元件调节。在一些实施方案中，第二启动子包含ef1α启动子。对于熟练的技术人员来说，启动子是为宿主表达系统而选择的，并将随宿主和表达载体以及预期用途而变化。在一个实施方案中，任何一个或两个调节序列可以是细胞特异性的或组织特异性的。[0194]本文所述的car能够通过本领域已知的任何手段产生，尽管优选的是使用重组dna技术产生。编码嵌合受体的几个区域的核酸能够通过本领域已知的分子克隆的标准技术（基因组文库筛选、重叠pcr、引物辅助连接、定点突变等）方便地制备并组装成一个完整的编码序列。得到的编码区域优选地被插入到表达载体中，并且被用于转化合适的表达宿主细胞系，优选地t淋巴细胞，最优选地自体t淋巴细胞。[0195]从患者分离的各种t细胞亚群能够用用于car表达的载体进行转导。中央记忆t细胞是一种有用的t细胞亚群。中央记忆t细胞可以通过选择cd45ro+/cd62l+细胞从外周血单核细胞（pbmc）中分离，例如使用clinimacs®设备来免疫磁选表达所需受体的细胞。富含中央记忆t细胞的细胞能够用抗cd3/cd28激活，用例如指导car以及非免疫原性表面标记物表达的慢病毒载体转导，用于体内检测、消融和潜在的体外选择。经激活/遗传修饰的cart细胞可以在体外用il-2/il-15扩增，然后冷冻保存。制备cart细胞的其他方法能够在pct/us2016/043392中找到。[0196]在一些实施方案中，flt3cdr结构域氨基酸序列的进一步非限制性实施例描述于美国专利10,961,312号，wo2020/010284号，美国专利申请us20180346601号的表1-4，美国专利申请us20180037657号的表v，美国专利申请us20170037149号的表10，美国专利申请us20160272716号的表v，美国专利申请us20110091470号的表1-3和美国专利申请us20090297529号的表1-3。flt3重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的非限制性实施例描述于美国专利10,961,312号，wo2020/010284号，美国专利申请us20180346601号的表1和表3，美国专利申请us20180037657号的表x，美国专利申请us20170037149号的表10和美国专利申请us20160272716号的表vii。[0197]在一方面，所述多核苷酸进一步编码跨膜结构域，其包含cd28跨膜结构域或cd8α跨膜结构域，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在另一方面，所述多核苷酸进一步编码细胞内结构域，其包含cd28共刺激信号传导区域或4-1bb共刺激信号传导区域或两者，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在另一方面，所述多核苷酸进一步包含编码cd3ζ信号传导结构域的多核苷酸。[0198]在一些实施方案中，本文公开的car或其细胞质结构域进一步包含il2rβ或其片段。在进一步的实施方案中，il2rβ的片段包含促进免疫细胞的激活的il2rβ的jak-stat激活结构域，或基本上由其组成，或进一步由其组成。[0199]在一些实施方案中，car表达细胞进一步表达且任选地分泌免疫调节分子或细胞因子。在进一步的实施方案中，car表达细胞包含免疫调节分子或细胞因子的较低的表达水平或较低的抑制物的活性。在一个实施方案中，car表达细胞表达il-15，但不表达细胞因子可诱导的含src同源物2的蛋白（cis）。例如，参见daheretal.blood2021feb4;137(5):624-636。[0200]截短的egfr和截短的cd19在一些实施方案中，car表达细胞还可以包含控制car的表达或激活或表达和激活两者的开关（switch）机制。例如，car可以包含细胞外、跨膜和细胞内结构域，或由其组成，或基本上由其组成，其中细胞外结构域包含目标特异性结合元件，其结合对在目标细胞（例如癌细胞）上表达的或由所述目标细胞表达的目标抗原以外的分子具有特异性的标记、结合结构域或标签。在一些实施方案中，这种标记、结合结构域或标签识别并结合在目标细胞上表达或由所述目标细胞表达的目标抗原。在这样的实施方案中，car的特异性是由第二构建体提供的，该构建体包含目标抗原结合结构域和car上被标记、结合结构域或标签识别或结合的结构域，由其组成，或基本上由其组成。参见，例如wo2013/044225、wo2016/000304、wo2015/057834、wo2015/057852、wo2016/070061、us9,233,125、us2016/0129109。用这种方法，表达car的t细胞、nk细胞或其他细胞能够被施用于对象，但其不能结合目标抗原（即flt3），直到施用包含标记、结合结构域或标签（例如flt3特异性结合结构域）的第二组合物。[0201]本公开的car也同样需要多聚化来激活其功能（参见例如us2015/0368342、us2016/0175359、us2015/0368360）和/或外源信号，例如小分子药物（us2016/0166613,yungetal.,science,2015），来引起免疫细胞反应，如t细胞反应或nk细胞反应。[0202]此外，所公开的car表达细胞能够包含“自杀开关（suicideswitch）”，来在治疗后诱导car表达细胞的细胞死亡（buddeeetal.,plosone,2013），或在与目标抗原结合后下调car的表达（wo2016/011210）。一个非限制性的示例性自杀开关或自杀基因是icasp。在一些实施方案中，本文公开的car和/或其细胞质结构域进一步包含自杀基因产物。在进一步的实施方案中，自杀基因产物选自hsv-tk（单纯疱疹病毒胸苷激酶）、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧酸酯酶、细胞色素p450或pnp（嘌呤核苷磷酸化酶）、截短的egfr或可诱导的半胱天冬酶（"icasp"）中的一种或多种。在一些实施方案中，自杀基因产物是本文公开的截短的蛋白标记物。[0203]cd3ζ信号传导结构域可以在核糖体跳跃序列（例如legggegrgslltcgdveenpgpr；seqidno:9）和具有与lvtslllcelphpaflliprkvcngigigefkdslsinatnikhfknctsisgdlhilpvafrgdsfthtppldpqeldilktvkeitgflliqawpenrtdlhafenleiirgrtkqhgqfslavvslnitslglrslkeisdgdviisgnknlcyantinwkklfgtsgqktkiisnrgensckatgqvchalcspegcwgpeprdcvscrnvsrgrecvdkcnllegeprefvenseciqchpeclpqamnitctgrgpdnciqcahyidgphcvktcpagvmgenntlvwkyadaghvchlchpnctygctgpglegcptngpkipsiatgmvgalllllvvalgiglfm（seqidno:10）至少90%、至少95%、至少98%同一性或相同的序列的截短的egfr之后。在一些情况下，与seqidno:10相比，截短的egfr具有1、2、3、4或5个氨基酸变化（优选地保守的）。[0204]替代地，cd3ζ信号传导结构域可以在核糖体跳跃序列（例如legggegrgslltcgdveenpgpr；seqidno:9）和具有与mppprllffllfltpmevrpeeplvvkveegdnavlqclkgtsdgptqqltwsresplkpflklslglpglgihmrplaiwlfifnvsqqmggfylcqpgppsekawqpgwtvnvegsgelfrwnvsdlgglgcglknrssegpsspsgklmspklyvwakdrpeiwegeppcvpprdslnqslsqdltmapgstlwlscgvppdsvsrgplswthvhpkgpksllslelkddrpardmwvmetglllprataqdagkyychrgnltmsfhleitarpvlwhwllrtggwkvsavtlaylifclcslvgilhlqralvlrrkr（seqidno:13）至少90%、至少95%、至少98%同一性或相同的序列的截短的cd19之后。[0205]载体本公开还提供了一种载体，其包含本文公开的多核苷酸中的任何一种或多种，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，多核苷酸或载体进一步包含驱动多核苷酸或car表达的调节元件，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在进一步的实施方案中，所述调节元件包含以下中的一种或多种：启动子、内含子、增强子或多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述载体进一步包含可检测或纯化标记物。[0206]在一些方面，提供的是一种载体，其包含本文公开的核酸分子或其互补核酸分子，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。此外或者替代地，所述载体是表达载体。在一些实施方案中，所述载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，所述载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，在载体中，seqidno:1的核苷酸序列或其等效物的表达受启动子的控制，任选地ef-1α启动子、cmv启动子或mmlv启动子。[0207]在一些实施方案中，所述载体是非病毒载体（例如质粒）。在其他实施方案中，所述载体是病毒载体，这种病毒载体的非限制性实施例选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。在一些实施方案中，本文公开的核酸分子能够被插入载体中，例如表达载体，例如慢病毒载体或逆转录病毒载体（5’和3’ltr之间）或腺病毒载体或任何其他能够表达基因的载体。[0208]在一些实施方案中，所述载体来源于或基于野生型病毒。在进一步的实施方案中，所述载体来源于或基于野生型慢病毒。这样的实施例包括但不限于人类免疫缺陷病毒（hiv）、马传染性贫血病毒（eiav）、visna/maedi病毒（vmv）、山羊关节炎-脑炎病毒（caev）、马传染性贫血病毒（eiav）、猴免疫缺陷病毒（siv）、牛免疫缺陷病毒（biv）和猫免疫缺陷病毒（fiv）。替代地，考虑到其他逆转录病毒能够被用于作为载体骨架的基础，如鼠白血病病毒（mlv）。在一些实施方案中，用于本公开的逆转录病毒载体包括但不限于invitrogen的plenti系列4、6和6.2版本的“virapower”系统。由lentigencorp.制造；phiv-7-gfp，实验室产生并由cityofhoperesearchinstitute使用；“lenti-x”慢病毒载体，plvx，由clontech制造；plko.1-puro，由sigma-aldrich制造；plemir，由openbiosystems制造；以及plv，实验室产生并由charitéꢀmedicalschool,instituteofvirology(cbf),berlin,germany使用。重组慢病毒载体是本领域已知的，例如，参见美国专利6,924,123号、7,056,699号、7,419,829号和7,442,551号，通过引用并入本文。显而易见的是，根据本公开的病毒载体不需要局限于特定病毒的组分。病毒载体可以包含来源于两种或更多种不同病毒的组分，也可以包含合成组分。载体组分可以被操作以获得期望的特性，例如目标细胞特异性。[0209]美国专利6,924,123号公开了某些逆转录病毒序列有助于整合到目标细胞基因组中。该专利教导，每个逆转录病毒基因组包含称为gag、pol和env的基因，这些基因编码病毒蛋白和酶。这些基因两侧的末端为称为长末端重复序列（ltr）的区域。ltr负责前病毒的整合和转录。它们还作为增强子-启动子序列。换句话说，ltr能够控制病毒基因的表达。逆转录病毒rna的衣壳化凭借位于病毒基因组的5’端的psi序列发生。ltr本身是相同的序列，能够被分为三个元件，称为u3、r和u5。u3来源于rna的3’端的特有序列。r来源于rna的两端重复的序列，以及u5来源于rna的5’端的特有序列。三个元件的尺寸在不同的逆转录病毒中会有很大的变化。对于病毒基因组，poly（a）添加（终止）的位点是在右侧ltr中r和u5之间的边界。u3含有前病毒的大部分转录控制元件，其中包括启动子和多个增强子序列，其对细胞和某些情况下病毒转录激活蛋白反应。[0210]关于结构基因gag、pol和env本身，gag编码病毒的内部结构蛋白。gag蛋白经蛋白分解加工成成熟蛋白ma（基质）、ca（衣壳）和nc（核衣壳）。pol基因编码逆转录酶（rt），其含有dna聚合酶、相关的rnaseh和整合酶（in），其介导基因组的复制。[0211]为了产生病毒载体颗粒，载体rna基因组由编码它的dna构建体在宿主细胞中表达。未被载体基因组编码的颗粒的组分由宿主细胞中表达的另外的核酸序列（“包装系统”，通常包括gag/pol中的一个或两个和env基因）反式提供。病毒载体颗粒的产生所需的序列组可以通过瞬时转染引入宿主细胞，或者它们可以被整合到宿主细胞基因组中，或者它们可以以混合方式被提供。所涉及的技术是本领域技术人员已知的。[0212]在一些实施方案中，提供一种用于在细胞中表达本文公开的核酸分子的载体，即表达载体。在一些实施方案中，提供一种用于产生表达载体的载体，即生产载体或包装载体，例如用于复制病毒载体基因组的质粒，这种载体基因组在适当包装到病毒载体后能够转导细胞，导致核酸分子在细胞中的表达。图2和图3示出了两个示例性的生产载体。[0213]分离的核酸能够通过使用包装载体和细胞系被包装到逆转录病毒包装系统中。包装载体包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。包装载体含有促进将遗传物质递送至细胞中的元件和序列。例如，逆转录病毒构建体是包装载体，其包含至少一个来源于反式编码包装复制缺陷型逆转录病毒载体所需的所有病毒蛋白的复制缺陷型逆转录病毒基因组的逆转录病毒辅助dna序列，并用于产生能够以高滴度包装复制缺陷型逆转录病毒载体的病毒蛋白，而无需产生复制缺陷型辅助病毒。逆转录病毒dna序列缺乏编码病毒的病毒5’ꢀltr的天然增强子和/或启动子的区域，以及缺乏负责包装辅助基因组的psi功能序列和3’ꢀltr两者，但编码外源的多腺苷酸化位点（例如sv40多腺苷酸化位点），以及在需要生产病毒的细胞类型中指导高效转录的外源的增强子和/或启动子。所述逆转录病毒是白血病病毒，例如莫洛尼（氏）鼠白血病病毒（mmlv）、人类免疫缺陷病毒（hiv）或长臂猿白血病病毒（galv）。外源的增强子和启动子可以是人类巨细胞病毒（hcmv）即刻早期（ie）增强子和启动子、莫洛尼（氏）鼠白血病病毒（mmsv）的增强子和启动子（u3区域）、rous肉瘤病毒（rsv）的u3区域、脾脏病灶形成病毒（sffv）的u3区域、或者与天然的莫洛尼（氏）鼠白血病病毒（mmlv）启动子连接的hcmvie增强子。逆转录病毒包装载体可以由基于质粒的表达载体编码的两个逆转录病毒辅助dna序列组成，例如，第一个辅助序列含有编码亲嗜性（ecotropic）mmlv或galv的gag和pol蛋白的cdna，以及第二个辅助序列含有编码env蛋白的cdna。决定宿主范围的env基因可以来源于编码嗜异性（xenotropic）、双嗜性、亲嗜性、多变性（水貂病灶形成）或10a1鼠白血病病毒env蛋白，或者长臂猿白血病病毒（galv）env蛋白，人类免疫缺陷病毒env（gp160）蛋白，水泡stomatitus病毒（vsv）g蛋白、人类t细胞白血病（htlv）i型和ii型env基因产物的基因；来源于一个或多个上述env基因的组合的嵌合包膜基因；或者编码细胞质的和跨膜的上述env基因产物和针对所需目标细胞上特定表面分子的单克隆抗体的嵌合包膜基因。[0214]在包装过程中，包装载体和逆转录病毒载体被瞬时共转染到能够产生病毒的哺乳动物细胞的第一群体中，例如人类胚胎肾细胞，例如293细胞（atccno.crl1573，atcc，rockville，md.），以产生含有高滴度重组逆转录病毒的上清液。在本公开的另一种方法中，这种瞬时转染的细胞的第一群体然后与哺乳动物目标细胞（例如人类淋巴细胞）共培养，来以高效率用外源基因转导目标细胞。在本公开的另一种方法中，来自上述瞬时转染的细胞的第一群体的上清液与哺乳动物目标细胞（例如人类淋巴细胞或造血干细胞）孵化，来以高效率用外源基因转导目标细胞。[0215]在另一方面，包装载体在能够产生病毒的哺乳动物细胞的第一群体中稳定表达，例如人类胚胎肾细胞，例如293细胞。逆转录病毒或慢病毒载体通过与可选择标记物共转染或被假型病毒感染而被引入细胞。在这两种情况下，这些载体会整合。替代地，载体可以被引入保持游离的质粒中。含有高滴度重组逆转录病毒的上清液被产生。[0216]显而易见的，当在临床上用于人类患者时，标记物或纯化标签将从构建体中被省略。细胞可以使用本文所述的病毒载体进行转导，或者使用rietetal.(2013)meth.mol.biol.969:187-201，题目为“nonviralrnatransfectiontotransientlymodifytcellwithchimericantigenreceptorsforadoptivetherapy”中描述的技术进行转导。[0217]引入外源核酸的进一步方法是本领域已知的，包括但不限于使用rna电穿孔、纳米技术、睡美人载体（sleepingbeautyvectors）、逆转录病毒和/或腺病毒中的一种或多种进行基因递送。[0218]无论使用何种方法将外源核酸引入宿主细胞，为了确认重组dna序列在宿主细胞中的存在，可以进行各种检测。此类检测包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”检测，例如southern和northern印迹、rt-pcr和pcr；“生物化学”检测，例如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段（elisa和western印迹）或本文所述的检测方法，以确定落入本公开范围的制剂。[0219]细胞在一些方面，提供一种包含本文公开的核酸分子或本文公开的载体的人类t或nk细胞的群体。在一些实施方案中，分离的细胞或人类t或nk细胞的群体包含中心记忆t细胞、nk细胞、初始记忆t细胞、泛t细胞、或者基本上耗尽cd25+细胞和cd14+细胞的pbmc。[0220]在进一步的方面，提供一种分离的细胞，其包含本文公开的核酸分子或本文公开的载体。在一些实施方案中，所述细胞选自以下细胞：免疫细胞、nk细胞、t细胞、干细胞、祖细胞或前体细胞。还提供一种包含所述分离的细胞的细胞群体。[0221]在进一步的实施方案中，提供了一种组合物，其包含本文公开的细胞群体、本文公开的细胞和载体，以及任选的稳定剂、防腐剂或冷冻保存剂，或基本上由其组成，或进一步由其组成。[0222]在一些实施方案中，细胞群体基本上是同质的。在进一步的实施方案中，所述群体包含至少90%（包括但不限于至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%）的相同的至少一种细胞亚型的细胞，例如，至少90%的细胞是t细胞或nk细胞。[0223]本文还提供一种分离的细胞，其包含本文公开的载体、本文公开的car、本文公开的截短的蛋白标记物或本文公开的多核苷酸中的任何一种或多种，或基本上由其组成，或进一步由其组成。[0224]所述细胞可以是原核细胞（例如，细菌细胞）或真核细胞。真核细胞的非限制性实施例包括但不限于：酵母细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、牛细胞、猫细胞、犬细胞、鼠细胞、马细胞或人类细胞。在一些实施方案中，分离的细胞表达car。在进一步的实施方案中，分离的细胞表达截短的蛋白标记物。在一些实施方案中，所述细胞进一步包含可检测的或纯化的标记物。[0225]在一些实施方案中，真核细胞、哺乳动物或人类细胞是免疫细胞，任选地t细胞、b细胞、nk细胞、nkt细胞、树突状细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞、其任何亚群、或者任何其他免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞，任选地选自t细胞、b细胞、nk细胞、nkt细胞、树突状细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞。在某些实施方案中，分离的细胞是t细胞，例如，动物t细胞、哺乳动物t细胞、猫科动物t细胞、犬科动物t细胞或人类t细胞。在某些实施方案中，分离的细胞是nk细胞，例如，动物nk细胞、哺乳动物nk细胞、猫科动物nk细胞、犬科动物nk细胞或人类nk细胞。在某些实施方案中，分离的细胞是nkt细胞，例如，动物nkt细胞、哺乳动物nkt细胞、猫科动物nkt细胞、犬科动物nkt细胞或人类nkt细胞。在某些实施方案中，分离的细胞是b细胞，例如，动物b细胞、哺乳动物b细胞、猫科动物b细胞、犬科动物b细胞或人类b细胞。可以理解的是，每个物种的相同或相似的实施方案适用于所述的树突状细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞、这些的任何亚群或t细胞、nk细胞、nkt细胞和b细胞、或者任何其他免疫细胞。在进一步的实施方案中，所述t细胞是γδt细胞。在一方面，所述细胞是使用基因编辑技术（例如crispr或talen）被修饰以去除cd52表达的t细胞。[0226]在一些实施方案中，所述细胞选自造血干细胞（hsc）、诱导多能干细胞（ipsc）、或者免疫细胞。在进一步的实施方案中，所述免疫细胞来源于造血干细胞（hsc）或诱导多能干细胞（ipsc）。[0227]细胞可以来源于患者、供体或细胞系，例如那些可用的现成的细胞。细胞可以对被治疗对象是自体的或异体的。在一些实施方案中，在对本文公开的细胞进行扩增和遗传修饰之前，可以从对象——例如，在涉及自体治疗的实施方案中——或市售可获得的细胞系或培养物或干细胞（例如诱导多能干细胞（ipsc））获得细胞。[0228]细胞可以从对象的多种来源获得，包括外周血、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。[0229]分离相关细胞的方法是本领域众所周知的，并且能够容易地适用于本技术；下面的实施例中描述了一种示例性的方法。与本公开有关的分离方法包括但不限于lifetechnologiesdynabeads®系统；stemcelltechnologieseasysep™、robosep™、rosettesep™、sepmate™；miltenyibiotecmacs™细胞分离试剂盒，以及其他市售可获得的细胞分离和隔离试剂盒。特定的免疫细胞亚群可以通过使用这种试剂盒中对独特细胞表面标记物有特异性的珠子或其他结合剂来分离。例如，macs™ꢀcd4+andcd8+microbeads可以被用于分离cd4+和cd8+t细胞。可以根据已知技术分离的细胞的其他非限制性实施例包括大体积的（bulked）t细胞、nkt细胞和γδt细胞。[0230]替代地，细胞可以通过市售可获得的细胞培养物获得，包括但不限于：对于t细胞，细胞系bcl2(aaa)jurkat(atcc®ꢀcrl-2902™)、bcl2(s70a)jurkat(atcc®ꢀcrl-2900™)、bcl2(s87a)jurkat(atcc®ꢀcrl-2901™)、bcl2jurkat(atcc®ꢀcrl-2899™)、neojurkat(atcc®ꢀcrl-2898™)；对于b细胞，细胞系ahh-1(atcc®ꢀcrl-8146™)、bc-1(atcc®ꢀcrl-2230™)、bc-2(atcc®ꢀcrl-2231™)、bc-3(atcc®ꢀcrl-2277™)、ca46(atcc®ꢀcrl-1648™)、dg-75[d.g.-75](atcc®ꢀcrl-2625™)、ds-1(atcc®ꢀcrl-11102™)、eb-3[eb3](atcc®ꢀccl-85™)、z-138(atcc#crl-3001)、db(atcccrl-2289)、toledo(atcccrl-2631)、pfiffer(atcccrl-2632)、sr(atcccrl-2262)、jm-1(atcccrl-10421)、nfs-5c-1(atcccrl-1693)；nfs-70c10(atcccrl-1694)、nfs-25c-3(atcccrl-1695)和sup-b15(atcccrl-1929)；以及，对于nk细胞，细胞系nk-92(atcc®ꢀcrl-2407™)、nk-92mi(atcc®ꢀcrl-2408™)。进一步的实施例包括但不限于成熟的t细胞系，例如deglis、ebt-8、hpb-mlp-w、hut78、hut102、karpas384、ki225、my-la、se-ax、skw-3、smz-1和t34；未成熟的t细胞系，例如all-sil、be13、ccrf-cem、cml-t1、dnd-41、du.528、eu-9、hd-mar、hpb-all、h-sb2、ht-1、jk-t1、jurkat、karpas45、ke-37、kopt-k1、k-t1、l-kaw、loucy、mat、molt-1、molt3、molt-4、molt13、molt-16、mt-1、mt-all、p12/ichikawa、peer、per0117、per-255、pf-382、pfi-285、rpmi-8402、st-4、sup-t1至t14、tall-1、tall-101、tall-103/2、tall-104、tall-105、tall-106、tall-107、tall-197、tk-6、tlbr-1、-2、-3和-4、ccrf-hsb-2(ccl-120.1)、j.rt3-t3.5(atcctib-153)、j45.01(atcccrl-1990)、j.cam1.6(atcccrl-2063)、rs4;11(atcccrl-1873)、ccrf-cem(atcccrm-ccl-119)；皮肤t细胞淋巴瘤系，例如hut78(atcccrm-tib-161)、mj[g11](atcccrl-8294)、hut102(atcctib-162)；来源于间变性（anaplastic）和大细胞淋巴瘤的b细胞系，例如del、dl-40、fe-pd、jb6、karpas299、ki-jk、mac-2aply1、sr-786、su-dhl-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10和-16、dohh-2、nu-dhl-1、u-937、granda519、usc-dhl-1、rl；霍奇金氏淋巴瘤，例如dev、hd-70、hdlm-2、hd-myz、hkb-1、km-h2、l428、l540、l1236、sbh-1、sup-hd1和su/rh-hd-l；以及nk细胞系，例如hank1、khyg-1、nkl、nk-ys、noi-90和yt。空（null）白血病细胞系，包括但不限于reh、nall-1、km-3、l92-221，是另一种市售可获得的免疫细胞来源，来源于其他白血病和淋巴瘤的细胞系也是如此，例如k562红细胞白血病、thp-1单核细胞白血病、u937淋巴瘤、hel红细胞白血病、hl60白血病、hmc-1白血病、kg-1白血病、u266骨髓瘤。这种市售可获得的细胞系的非限制性实施例来源包括美国菌种保藏中心或atcc（atcc.org/）和德国微生物菌种保藏中心（dsmz.de/）。[0231]在一些实施方案中，表达公开的car的t细胞可以进一步被修饰以减少或消除内源性tcr的表达。减少或消除内源性tcr可以降低脱靶效应并提高t细胞的有效性。可以用各种方法产生稳定地缺乏功能性tcr表达的t细胞。t细胞内化、分类和降解整个t细胞受体的复合物，其半衰期在静止的t细胞中为约10小时，在受刺激的t细胞中为3小时（vonessen,m.etal.2004.j.immunol.173:384-393）。tcr复合物的正常运作需要组成tcr复合物的蛋白质的适当的化学计量比例。tcr功能还需要两个具有itam基序的起作用的tcrζ蛋白。tcr与其mhc-肽配体接合后的激活需要相同t细胞上的几个tcr的接合，它们都必须发出适当的信号。因此，如果tcr复合物被不能正确结合或不能发出最佳信号的蛋白质破坏了稳定，t细胞将不能充分地被激活以开始细胞反应。[0232]因此，在一些实施方案中，可以使用针对编码原代t细胞中特定tcr（如tcr-α和tcr-β）和/或cd3链的核酸的rna干扰（例如shrna、sirna、mirna等）、crispr或其他方法消除tcr表达。通过阻断这些蛋白质中的一个或多个的表达，t细胞将不再产生tcr复合物的一个或多个关键组分，从而破坏tcr复合物的稳定性，防止细胞表面功能性tcr的表达。当使用rna干扰时，即使一些tcr复合物可以被回收到细胞表面，但rna（例如，shrna、sirna、mirnacytotherapy16(11):1537-44。用肿瘤相关抗原体外刺激能够激活和扩增选择的car表达细胞亚群。替代地，通过与肿瘤相关抗原的相互作用细胞可以在体内被激活。[0240]在某些免疫细胞的情况下，可能需要另外的细胞群体、可溶性配体和/或细胞因子或刺激剂来激活和扩增细胞。相关的试剂是本领域众所周知的，并根据已知的免疫学原理来选择。例如，可溶性cd-40配体可能有助于激活和扩增某些b细胞群体；同样的，在激活和扩增nk细胞的过程中，可以使用经辐照的饲养细胞。[0241]激活相关细胞的方法是本领域众所周知的，并且能够容易地适用于本技术；下面的实施例中描述了一种示例性的方法。与本公开有关的分离方法包括但不限于lifetechnologiesdynabeads®ꢀsystem激活和扩增试剂盒；bdbiosciencesphosflow™激活试剂盒、miltenyibiotecmacs™激活/扩增试剂盒；以及对相关细胞的激活部分有特异性的其他市售可获得的细胞试剂盒。特定的免疫细胞亚群可以通过使用这种试剂盒中的珠子或其他试剂来激活或扩增。例如，α-cd3/α-cd28dynabeads®可以被用于激活和扩增分离的t细胞的群体。[0242]用于flt3特异性car的表达的慢病毒载体flt3特异性car可以使用任何一种载体（包括慢病毒载体和逆转录病毒载体）在t细胞或nk细胞中表达。[0243]phiv7载体，由希望之城（duarteca）的t细胞治疗研究实验室（tctrl）开发，是一种用于car表达的有用载体。该载体使用人类ef1启动子来驱动car的表达。phiv7的结构示意图见图1。简单地说，pv653rsn，含有653bp的gag-pol加上5’和3’长期重复序列（ltr），中间有sl3-新霉素磷酸转移酶基因（neo），被亚克隆到pbluescript中，如下所示：在步骤1中，从5’ꢀltr到rev应答元件（rre）的序列组成了p5’ꢀhiv-151，然后通过去除tata盒上游的序列来修饰5’ltr，以及首先连接至cmv增强子，然后连接至sv40复制原点（p5’hiv-2）。在步骤2中，在将3’ltr克隆到pbluescript中制成p3’hiv-1后，在3’ltr增强子/启动子中进行400bp的缺失，以去除hivu3中的顺式调节元件，形成p3’hiv-2。在步骤3中，将从p5’hiv-3和p3’hiv-2中分离的片段连接起来，制成phiv-3。在第4步中，通过去除额外的上游hiv序列对p3’hiv-2进行进一步修饰以生成p3’hiv-3，并将含有wpre的600bpbamhi-sali片段加入到p3’hiv-3中制成p3’hiv-4。在步骤5中，通过pcr减小phiv-3rre的尺寸，并与来自phiv-3的5’片段（未显示）和p3’hiv-4连接，以制成phiv-6。在步骤6中，含有来自hiv-1pnl4-3的cpptdna侧翼（flap）序列的190bpbglii-bamhi片段从pnl4-3扩增，并被置于phiv6中rre和wpre序列之间，制成phiv-7。这个母体质粒phiv7-gfp（gfp，绿色荧光蛋白）被用来用四质粒系统包装母体载体。[0244]包装信号，psiψ，是将病毒基因组有效包装到载体中所需的。rre和wpre增强rna转录本转运和转基因的表达。侧翼序列，与wpre结合，已被证明可以提高慢病毒载体在哺乳动物细胞中的转导效率。[0245]辅助功能（产生病毒载体所需的）被分成三个独立的质粒，以减少通过重组产生具有复制能力的慢病毒的概率：1）pcgp编码病毒载体组装所需的gag/pol蛋白；2）pcmv-rev2编码rev蛋白，其作用于rre序列来协助病毒基因组的转运以高效包装；以及3）pcmv-g编码水泡stomatitis病毒（vsv）的糖蛋白，其是病毒载体的感染性所需的。[0246]phiv7编码的载体基因组和辅助质粒之间有最小的dna序列同源性。同源的区域包括位于pcgp辅助质粒的gag/pol序列中的大约600个核苷酸的包装信号区域；所有三个辅助质粒中的cmv启动子序列；以及辅助质粒pcgp中的rre序列。由于这些区域的同源性，产生具有复制能力的重组病毒是非常不可能的，因为这需要多个重组事件。此外，任何产生的重组体将缺少慢病毒复制所需的功能性ltr和tat序列。cmv启动子被ef1α-htlv启动子（ef1p）取代。ef1p有563bp，在切除cmv启动子后，用nrui和nhei将其引入ephiv7。慢病毒基因组，不包括gag/pol和re，它们对野生型病毒的致病性是必要的，并且对目标细胞的生产性感染是需要的，已经从该系统中删除。此外，载体结构不含有完整的3’ltr启动子，因此在目标细胞中产生的表达和反转录的dna前病毒基因组将具有非活性的ltr。由于这种设计，没有hiv-i衍生的序列会从前病毒中转录，只有治疗性序列会从它们各自的启动子中表达。在sin载体中去除ltr启动子活性，预计将显著减低无意中激活宿主基因的可能性。[0247]组合物本文进一步提供的组合物包含：载体和本文公开的多核苷酸中的任何一种或多种、本文公开的多肽、本文公开的载体中的任何一种、本文公开的细胞中的任何一种或本文公开的细胞群体，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，所述载体是药学上可接受的载体。[0248]简而言之，本公开的药物组合物包括但不限于本文所述的要求保护的组合物中的任何一种和一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含：缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐（dextran）、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如edta或谷胱甘肽；佐剂（例如氢氧化铝）；以及防腐剂。本公开的组合物可以被配制为局部或全身施用，例如口服、静脉内、颅内、局部、肠内和/或肠外施用。在某些实施方案中，本公开的组合物被配制用于静脉施用。[0249]细胞或组合物的施用可以在整个治疗过程中以一个剂量、连续地或间歇地进行，并提供有效量以达到期望的治疗效果。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并将随着用于治疗的组合物、治疗的目的和被治疗的对象而变化。可以进行单次或多次施用，剂量水平和模式由治疗医生选择。适当的剂量配方和施用药剂的方法是本领域已知的。在进一步的实施方案中，本公开的细胞和组合物进一步包含用于组合治疗的药剂。在另一个实施方案中，本公开的细胞和组合物能够与其他治疗或疗法组合施用。在一方面，在施用所公开的疗法之前，从对象分离样本并检测flt3表达。因此，在一方面，所述方法进一步包含检测从对象分离的样品中flt3表达，所述样品含有癌症或肿瘤细胞。[0250]使用本领域已知的和例如pct/us2011/064191中描述的方法，将细胞和细胞群体施用于宿主和/或对象。当对象是非人类动物时，对公开的细胞或组合物的这种施用可以用于治疗或产生所需疾病、紊乱或病症的动物模型，以用于治疗或组合疗法的实验和筛选检测。[0251]在一些方面，本公开涉及一种分离的复合物，其包含与癌症或肿瘤细胞结合的本文公开的分离的细胞中的任何一种，或基本上由其组成，或进一步由其组成，其中所述癌症或肿瘤细胞通过car表达的抗原或肿瘤靶向抗体的抗原结合结构域与表达car的分离的细胞结合。[0252]使用方法在一些实施方案中，提供一种治疗患有癌症（例如表达flt3的癌症，如急性骨髓性白血病）的人类患者的方法。所述方法包含施用包含本文公开的核酸分子的自体或异体人类细胞的群体，例如免疫细胞、t或nk细胞、干细胞、祖细胞、脐带血细胞、造血干细胞，或基本上由其组成，或进一步由其组成。该疗法能够与其他疗法组合，并且能够作为一线、二线、三线、四线或五线疗法被施用。癌症可以是原发性癌症或转移性或复发性癌症。在一方面，患者在接受治疗之前，已经用药剂治疗来增加癌细胞上的flt3表达。[0253]在一些实施方案中，提供一种治疗有需要的患者的方法。在一方面，所述患者患有表达flt3的癌症或肿瘤。所述方法包含向所述患者施用本文公开的细胞群体，或基本上由其组成，或进一步由其组成。所述细胞，例如免疫细胞、t或nk细胞、干细胞、祖细胞、脐带血细胞、造血干细胞，对被治疗的患者可以是异体的或自体的。所述疗法能够与其他疗法组合，并且能够作为一线、二线、三线、四线或五线疗法被施用。癌症可以是原发性癌症或转移性或复发性癌症。在一方面，患者在接受治疗之前，已经用药剂治疗来增加癌细胞上的flt3表达。[0254]在一些实施方案中，患者携带的肿瘤细胞具有fms样酪氨酸激酶3（flt3）的激活突变。在进一步的实施方案中，患者携带具有flt3-itd突变的肿瘤细胞。[0255]在一些实施方案中，嵌合抗原受体表达细胞被局部或全身地施用。[0256]在一些实施方案中，嵌合抗原受体表达细胞通过单次或重复剂量施用。在一些实施方案中，重复施用为至少一次或至少两次或更多次。[0257]在一些实施方案中，所述细胞群体包含nk细胞，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，nk细胞对患者是异体的。[0258]在一些实施方案中，所述方法进一步包含向患者施用本文公开的第二细胞群体。在进一步的实施方案中，第二细胞群体包含cart细胞。所述细胞对患者是自体的或异体的。在更多的实施方案中，cart细胞对患者是自体的。[0259]在一些实施方案中，所述细胞群体包含t细胞，或基本上由其组成，或进一步由其组成。[0260]在一些实施方案中，所述方法进一步包含施用增加癌细胞上flt3表达的药物。[0261]在一些方面，本公开涉及一种抑制表达flt3的癌细胞或包含所述癌细胞的组织生长的方法。所述方法包含使癌细胞或组织与本文公开的任何表达car和任选地截短的蛋白标记物的细胞接触，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，接触是体外或离体或体内进行。在一些实施方案中，接触是体内进行，并且表达细胞对被治疗的对象是自体的或异体的。在一些实施方案中，接触是体内进行，并且表达细胞对被治疗的对象是异体的。体内接触可以通过将表达细胞施用于需要这种治疗的对象。[0262]在一些方面，本公开提供一种抑制对象中表达flt3的癌细胞或组织生长的方法，其包含通过向对象施用例如有效量的、表达本文所述的car的细胞和任选地组合疗法。[0263]在一些方面，本公开涉及一种治疗有需要的对象的癌症的方法。在一些实施方案中，所述对象包含表达flt3的癌细胞。所述方法包含向对象施用例如有效量的本文公开的表达car的细胞和任选地截短的蛋白标记物，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，表达car的细胞对被治疗的对象是自体的或异体的。在一些实施方案中，表达car的细胞对被治疗的对象是异体的。在一些实施方案中，所述方法进一步包含向对象施用组合疗法。[0264]在一些方面，本文提供一种用于以下一种或多种的方法：在需要的对象中抑制癌症或肿瘤的生长、抑制癌症或肿瘤的转移或治疗癌症或肿瘤。所述方法包含向对象施用表达car的细胞和任选的截短的蛋白标记物，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，表达car的细胞对需要的对象是自体的或异体的。在一些实施方案中，表达car的细胞对需要的对象是异体的。[0265]在一方面，提供一种治疗被选择用于治疗的对象的癌症的方法。所述方法包含向对象施用例如有效量的本文公开的细胞或细胞群体，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，如果对象的癌细胞表达flt3，则选择该对象。在一些实施方案中，flt3表达是通过使对象的样本（例如癌症活检）与体外或体内特异性识别和结合flt3的抗体或抗原结合结构域接触并检测样本与抗体或抗原结合结构域之间的结合来确定。在进一步的实施方案中，抗原结合结构域进一步包含可检测的标记物。在一些实施方案中，分离的或工程化的细胞对需要的对象是自体的。在一些实施方案中，分离的或工程化的细胞对需要的对象是异体的。[0266]在一些方面，本文公开的方法进一步包含施用组合疗法至对象，或基本上由其组成，或进一步由其组成。合适的治疗方案将由治疗的医生或兽医确定。[0267]在一些实施方案中，flt3car细胞可以在这些非限制性示例性组合疗法中的任何一种之前或之后施用，例如，在造血干细胞移植（hsct）之前或在放射疗法或化学疗法之后。在flt3car细胞在造血干细胞移植前使用的实施方案中，flt3car细胞可以被用于在递送造血干细胞前实现缓解（remission）；一般来说，造血干细胞移植在缓解后会更成功。进一步的非限制性实施例包括其他相关的细胞类型，例如未经修饰的免疫细胞、包含表达一种或多种免疫调节分子的载体的经修饰免疫细胞、或者对不同于本文公开的抗原有特异性的car细胞。与本公开的car细胞一样，在一些实施方案中，这些细胞可以是自体的或异体的。[0268]在一些实施方案中，组合疗法选自细胞减灭（cytoreductive）疗法或上调癌细胞中flt3表达的疗法中的一种或两种。在一些实施方案中，细胞减灭疗法包含化学疗法、冷冻疗法、热疗、靶向疗法、免疫疗法或放射疗法中的一种或多种，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在进一步的实施方案中，组合疗法包含对癌细胞或包含癌细胞的组织的物理切除，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在进一步的实施方案中，组合疗法可以在本文公开的flt3特异性car疗法之前、同时或之后使用。在一些实施方案中，上调癌细胞中flt3表达的疗法在本文公开的flt3特异性car疗法之前或同时使用。[0269]在一些实施方案中，免疫疗法是指增强对象对癌症细胞的免疫反应，例如，抗pd-1疗法，或抗pd-l1疗法。市售可用的pd-1抗体的非限制性实施例包括pembrolizumab（merck）、nivolumab（bristol-myerssquibb）、pidilizumab（curetech）、amp-224（gsk）、amp-514（gsk）、pdr001（novartis）和cemiplimab（regeneron和sanofi）。市售可用的pd-l1抗体的非限制性实施例包括atezolizumab（rochegenentech）、avelumab（mercksorenoandpfizer）、durvalumab（astrazeneca）、bms-936559（bristol-myerssuibb）和ck-301（checkpointtherapeutics）。[0270]在一些实施方案中，本文公开的方法被用作一线疗法。在其他实施方案中，本文公开的方法被用作二线疗法或三线疗法。[0271]在某些实施方案中，患者或对象在接受（即被施用）有效量的分离的细胞后，保持或恢复正常的造血功能。正常的造血功能是某些癌症的关键终点，例如但不限于影响血液或骨髓的癌症，例如淋巴瘤或白血病，例如但不限于急性髓系白血病或急性淋巴细胞白血病。确定治疗后“正常的造血功能”的方法是本领域已知的，包括但不限于比较基线血细胞计数与治疗后血细胞计数和/或循环cd34+细胞的类似比较的“针刺（pinprick）”血液测试。进一步的非限制性实施例方法包括骨髓活检以验证移植。未能维持或恢复正常的造血功能（也称为正常的移植）与反复需要输注和/或需要抗生素和/或高发病率和死亡率有关，此外还有一些症状指标，例如但不限于贫血、苍白、直立性低血压、以及由于缺乏血小板恢复而造成的出血和/或挫伤。正常的造血功能和/或移植可以由临床上可接受的阈值定义，例如但不限于持续的粒细胞计数》1.0×109/l、持续的血小板计数》50×109、持续的血红蛋白水平~9或10g/dl和/或没有红细胞输注的需要。在一些实施方案中，正常的造血功能是由缺乏lin-cd34+cd38-cd90+cd45ra-细胞的显著损耗来定义的。在一些实施方案中，充分的长期造血功能或成功的长期造血移植可以与在为干细胞移植进行去髓准备后被输入对象体内的造血产品中足够数量的lin-cd34+cd38-cd90+cd45ra-细胞相关联。[0272]car表达细胞的总剂量可以根据例如上述公开的因素而变化。在一些实施方案中，剂量可在1至1010个细胞之间，例如，每个患者或患者的每公斤（kg）体重至少1个、至少101个、至少102个、至少103个、至少104个、至少105个、至少106个、至少107个、最多108个、最多109个、最多1010个、102个至1010个之间、103个至109个之间、104至108个之间。在一些实施方案中，剂量可以进一步被整系数限制在数量级上，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9，得出根据以下非限制性实施例列出的剂量范围：每个病人或病人每公斤体重5×104个至1×108个之间。[0273]本公开的药物组合物可以以适合于要治疗或预防的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由例如患者的状况、患者疾病的类型和严重程度等因素决定，尽管合适的剂量可以由临床试验确定。在一个实施方案中，它们是通过直接注射或全身性地直接被施用，例如静脉注射。[0274]本公开的各方面提供一种确定患者是否对car疗法可能有反应或不可能有反应的示例性方法。所述方法包含确定从患者分离的肿瘤样本中存在或不存在坏死并对表达癌症或肿瘤抗原的癌症或肿瘤细胞的数量定量，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在某些实施方案中，所述方法进一步包含向被确定可能对car疗法有反应的患者施用有效量的car疗法，或基本上由其组成，或进一步由其组成。car疗法对患者可以是自体的或异体的，所述患者可以是患有癌症对象、动物或人类。[0275]坏死的组织学染色的技术是本领域众所周知的。例如，苏木精和曙红染色（也被称为“h&e染色”）是识别组织中坏死的存在的常用技术，特别是在肿瘤性或癌性生长中。细胞质h&e染色显示嗜酸性粒细胞增加，部分归因于细胞质rna的损失，部分归因于变性的细胞质蛋白。在坏死的组织染色中，由于细胞质细胞器的酶消化，细胞质经常出现“蛀牙（motheaten）”。髓鞘样结构、钙化和吞噬到其他细胞的证据也是坏死组织的标志，可以通过组织学染色检测。坏死的组织在核染色中也有特定的标志，通常表现为细胞死亡后的核溶解、核浓缩和核破裂。使用显微镜和手动或自动定量这种坏死标志，可以确定car治疗的相关性。检测一般肿瘤性或癌性生长或坏死组织的替代手段，包括但不限于基于生物标志物或基于成像的诊断方法，也同样与确定病人是否会对某些类型的car疗法产生反应有关，并可相应地使用。显而易见，car疗法是根据患者样本中的癌症或肿瘤的基因型和/或表现型来选择的，这样抗原结合结构域将靶向并治疗特定的癌症或肿瘤。[0276]试剂盒本文还提供一种试剂盒，其包含本文公开的car、截短的蛋白标记物、多核苷酸、细胞、细胞群体或组合物中的一种或多种，以及任选地用于制备或使用的说明，或基本上由其组成，或进一步由其组成。[0277]在一个特定方面，本公开提供用于执行这些方法的试剂盒以及用于执行本公开的方法的说明，例如收集细胞或组织或两者，进行筛选、转导等，分析结果，或者其任何组合。[0278]在一方面，所述试剂盒包含以下任何一种或多种：本文公开的多肽；本文公开的多核苷酸；本文公开的载体，包括所述核酸的载体；本文公开的细胞，如分离的异源细胞，优选t细胞或nk细胞；本文公开的细胞群体；本文公开的组合物；本文公开的分离复合物；或者任选地关于从患者取得自体细胞的说明，或基本上由其组成，或进一步由其组成。这样的试剂盒还可以包含适合转导、选择、激活或扩增car的培养基和其他试剂，或基本上由其组成，或进一步由其组成。[0279]在一方面，所述试剂盒包含表达car的细胞或其群体，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，该试剂盒的细胞在施用于有需要的对象前可能需要激活或扩增或两者。在进一步的实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含培养基和试剂（例如上述公开的那些），或基本上由其组成，以激活或扩增或同时激活和扩增分离的car表达细胞。在一些实施方案中，所述细胞将被用于car疗法。在进一步的实施方案中，所述试剂盒包含关于向需要car疗法的患者施用分离的细胞的说明。[0280]本公开的试剂盒还可以包含，例如，缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。所述试剂盒还可以包含检测可检测标签所需的组分，例如，酶或底物。所述试剂盒还可以含有可以被检测并与检测样品进行比较的对照样品或一系列对照样品。试剂盒的每个组分可以被封装在单独的容器内，所有的各种容器可以在一个包装内，同时还有解释使用所述试剂盒进行的检测的结果的说明。本公开的试剂盒可以在试剂盒容器上或中含有书面产品。所述书面产品描述如何使用试剂盒中的试剂。[0281]如有可能，这些建议的试剂盒组分可以以本领域技术人员惯常使用的方式包装。例如，这些建议的试剂盒组分可以以溶液或液体分散体等形式提供。[0282]本发明的其他特征和优点将从以下详细描述和附图，以及从权利要求中显而易见。实施例[0283]本发明在以下实施例中进一步被描述，这些实施例并不限制权利要求中描述的发明范围。[0284]实施例1：表达flt3car的载体各种载体和表达系统能够被用于转导t细胞以表达flt3car。图2中描述了一种合适的载体。在该慢病毒载体中，其是基于phiv7载体（chungetal.molther.2014may;22(5):952–963.epub2014feb28.，flt3car表达由ef-1α启动子驱动，并且flt3car与可以被用作标记物的截短的cd19共表达。[0285]图3描述了一种用于flt3car表达的替代载体。这里的表达是由mmlv启动子驱动，并且flt3car与可以被用作标记物的截短的cd19共表达。[0286]实施例2：提高flt3car表达用cd3/cd28珠子激活富含cd4+和cd8+细胞的pbmc。第二天，用表达由改进的编码序列（seqidno:1）编码的flt3特异性car的载体或表达相同的flt3特异性car但由以前使用的编码序列编码的其他同一性的载体转导细胞。这些载体使用phiv7骨架。如本文所述，flt3特异性car与cd19t标签共表达。使用了两个对照：表达gfp的载体和表达cd19t标签的载体。在所有情况下，t细胞以1的moi转染。flt3car-t表达和细胞毒性在第5天进行。[0287]从图4a-4d可以看出，当t细胞用改进的flt3特异性car编码序列转导时，car表达量最高。[0288]实施例3：提高对flt3+肿瘤细胞的杀伤用molm13细胞作为flt3+肿瘤靶标，u937细胞作为阴性对照，在24小时和72小时评估用各种构建体转导的t细胞的细胞毒性。e：t比率为1：5和1：25。结果显示为3个健康供体的平均数据，即肿瘤裂解百分比（%）±sem。从图5a-5b可以看出，用改进的flt3特异性car编码序列转导的t细胞比用早期flt3特异性car编码序列转导的t细胞更有效。[0289]实施例4：提高细胞因子表达从3名患者获得肿瘤细胞，并与用各种构建体转导的t细胞共培养。测量培养上清液中il-2（图6a-6c）和ifn-γ（图7a-7c）的表达。从图4a-4d和图5a-5b可以看出，尽管有一些患者之间的差异，但用改进的flt3特异性car编码序列转导的t细胞要优于用早期flt3特异性car编码序列转导的t细胞。[0290]实施例5：侵袭性人类flt3（+）aml（molm-13）的小鼠模型中的flt3car活性在第0天将表达荧光素酶的1x105个molm-13细胞注射到11周龄的雄性nsg小鼠中。在注射molm-13一小时后，在第0天静脉注射有生存力地（viably）冷冻和解冻的flt3carnk细胞（20x106）和有生存力地冷冻的flt3cart细胞（5x106）细胞。接受flt3carnk细胞的小鼠被分为两组：一组接受每周单次静脉注射flt3carnk细胞，另一组接受每周连续3天（第0、1、2天和7、8、9天等）的3个剂量的flt3car-nk细胞，以及最后一组接受单剂量的flt3cart细胞（第21天出现复发）。[0291]实施方案实施方案1.一种核酸分子，其包括seqidno:1的核苷酸序列。[0292]实施方案2.一种病毒载体或表达载体，其包含实施方案1的核酸分子。[0293]实施方案3.根据实施方案1所述的核酸分子，其进一步包括t2a跳跃序列和编码截短的egfr或截短的cd19的序列。[0294]实施方案4.根据实施方案1所述的核酸分子，其进一步包括t2a跳跃序列和编码截短的egfr的序列。[0295]实施方案5.根据实施方案1所述的核酸分子，其进一步包括t2a跳跃序列和编码截短的cd19的序列。[0296]实施方案6.根据实施方案1所述的核酸分子，其进一步包括t2a跳跃序列和编码截短的egfr的序列。[0297]实施方案7.根据实施方案1所述的核酸分子，其进一步包括t2a跳跃序列和编码截短的cd19的序列。[0298]实施方案8.根据实施方案2所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。[0299]实施方案9.根据实施方案2所述的载体，其中所述载体是逆转录病毒载体。[0300]实施方案10.根据实施方案2所述的载体，其中seqidno:1的核苷酸序列的表达处于ef-1α启动子或mmlv启动子的控制之下。[0301]实施方案11.一种人类t细胞群体，其由包含实施方案1所述的核酸分子的载体转导。[0302]实施方案12.根据实施方案11所述的人类t细胞群体，其中所述人类t细胞群体包括中央记忆t细胞、nk细胞、幼稚记忆t细胞、泛t细胞、或基本上耗尽了cd25+细胞和cd14+细胞的pbmc。[0303]实施方案13.一种治疗患有急性骨髓性白血病的患者的方法，其包括施用由包含实施方案1所述的核酸分子的载体转导的自体或异体人类t细胞群体。[0304]实施方案14.根据实施方案13所述的方法，其中所述患者带有具有fms样酪氨酸激酶3（flt3）的激活突变的肿瘤细胞。[0305]实施方案15.根据实施方案13所述的方法，其中所述患者带有具有flt3-itd突变的肿瘤细胞。[0306]实施方案16.根据实施方案13所述的方法，其中实施方案嵌合抗原受体被局部地或全身地施用。[0307]实施方案17.根据实施方案13所述的方法，其中嵌合抗原受体通过单次或重复剂量施用。[0308]实施方案18.一种制备cart细胞的方法，其包括：提供自体或异体人类t细胞群体，以及通过包含实施方案1所述的核酸分子的载体转导所述t细胞。[0309]序列表seqidno:1：优化的car编码序列，atggggtggtcaagcattattctgtttctggtcgctaccgctacaggcgtccatcaggtccagctgcagcagcccggagccgaactggtgaagcccggcgcctccctgaagctgtcttgcaagagcagcggctacacattcacctcctattggatgcactgggtgcggcagcggcccggccacggcctggagtggatcggcgagatcgacccctctgatagctacaaggactataaccagaagtttaaggataaggccacactgaccgtggaccggtctagcaatacagcctacatgcacctgtcctctctgacctccgacgattctgccgtgtactattgcgccagggccatcaccacaacccctttcgatttttggggccagggcacaaccctgaccgtgagcagcggaggaggaggcagcggaggaggaggctccggcggcggcggctctgacatcgtgctgacccagtccccagccacactgagcgtgacccctggcgactccgtgtctctgagctgtcgggcctcccagtctatcagcaacaatctgcactggtatcagcagaagagccacgagtcccctaggctgctgatcaagtatgcctcccaatctatcagcggcatcccaagccgcttctccggctctggcagcggcacagacttcaccctgtctatcaacagcgtggagacagaggacttcggcgtgtatttttgtcagcagtctaatacatggccatatacattcggaggaggaactaaactggaaatcaaacgactcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccggatcccaaaggtaccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcseqidno:2：flt3car，mgwssiilflvatatgvhqvqlqqpgaelvkpgaslklsckssgytftsywmhwvrqrpghglewigeidpsdsykdynqkfkdkatltvdrssntaymhlssltsddsavyycaraitttpfdfwgqgttltvssggggsggggsggggsdivltqspatlsvtpgdsvslscrasqsisnnlhwyqqkshesprllikyasqsisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvetedfgvyfcqqsntwpytfgggtkleikrlepkscdkthtcppcpdpkgtfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprseqidno:3：信号序列，mgwssiilflvatatgvhseqidno:4：flt3scfv，其中seqidno:4的氨基酸（aa）1至aa118是重链可变区，seqidno:4的aa134至aa241是轻链可变区，seqidno:4的aa119至aa133是肽连接子。[0310]qvqlqqpgaelvkpgaslklsckssgytftsywmhwvrqrpghglewigeidpsdsykdynqkfkdkatltvdrssntaymhlssltsddsavyycaraitttpfdfwgqgttltvssggggsggggsggggsdivltqspatlsvtpgdsvslscrasqsisnnlhwyqqkshesprllikyasqsisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvetedfgvyfcqqsntwpytfgggtkleikrseqidno:5：igg1铰链结构域，lepkscdkthtcppcpdpkgtseqidno:6：cd28跨膜结构域，fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvseqidno:7：cd28共刺激结构域，rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsseqidno:8：cd3ζ细胞内信号传导结构域，rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprseqidno:9：核糖体跳跃序列，legggegrgslltcgdveenpgprseqidno:10：regfr，lvtslllcelphpaflliprkvcngigigefkdslsinatnikhfknctsisgdlhilpvafrgdsfthtppldpqeldilktvkeitgflliqawpenrtdlhafenleiirgrtkqhgqfslavvslnitslglrslkeisdgdviisgnknlcyantinwkklfgtsgqktkiisnrgensckatgqvchalcspegcwgpeprdcvscrnvsrgrecvdkcnllegeprefvenseciqchpeclpqamnitctgrgpdnciqcahyidgphcvktcpagvmgenntlvwkyadaghvchlchpnctygctgpglegcptngpkipsiatgmvgalllllvvalgiglfmseqidno:11：tcd19，mppprllffllfltpmevrpeeplvvkveegdnavlqclkgtsdgptqqltwsresplkpflklslglpglgihmrplaiwlfifnvsqqmggfylcqpgppsekawqpgwtvnvegsgelfrwnvsdlgglgcglknrssegpsspsgklmspklyvwakdrpeiwegeppclpprdslnqslsqdltmapgstlwlscgvppdsvsrgplswthseqidno:12：共有序列，其中小写字母表示任何核苷酸或位于seqidno:1中相应位置的核苷酸，atggggtggtcaagcattattctgtttctggtcgctaccgctacaggcgtccatcaggtccagctgcagcagcccggagccgaactggtgaagcccggcgcctccctgaagctgtcttgcaagagcagcggctacacattcacctcctattggatgcactgggtgcggcagcggcccggccacggcctggagtggatcggcgagatcgacccctctgatagctacaaggactataaccagaagtttaaggataaggccacactgaccgtggaccggtctagcaatacagcctacatgcacctgtcctctctgacctccgacgattctgccgtgtactattgcgccagggccatcaccacaacccctttcgatttttggggccagggcacaaccctgaccgtgagcagcggaggaggaggcagcggaggaggaggctccggcggcggcggctctgacatcgtgctgacccagtccccagccacactgagcgtgacccctggcgactccgtgtctctgagctgtcgggcctcccagtctatcagcaacaatctgcactggtatcagcagaagagccacgagtcccctaggctgctgatcaagtatgcctcccaatctatcagcggcatcccaagccgcttctccggctctggcagcggcacagacttcaccctgtctatcaacagcgtggagacagaggacttcggcgtgtatttttgtcagcagtctaatacatggccatatacattcggaggaggaactaaactggaaatcaaacgactcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccggatcccaaaggtaccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcseqidno:13：tcd19，mppprllffllfltpmevrpeeplvvkveegdnavlqclkgtsdgptqqltwsresplkpflklslglpglgihmrplaiwlfifnvsqqmggfylcqpgppsekawqpgwtvnvegsgelfrwnvsdlgglgcglknrssegpsspsgklmspklyvwakdrpeiwegeppcvpprdslnqslsqdltmapgstlwlscgvppdsvsrgplswthvhpkgpksllslelkddrpardmwvmetglllprataqdagkyychrgnltmsfhleitarpvlwhwllrtggwkvsavtlaylifclcslvgilhlqralvlrrkrseqidno:14：优化前的scfv编码序列atgggatggagctctatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccaccaggtccaactgcagcagcctggggctgagcttgtgaagcctggggcttcattgaagctgtcctgcaagtcttccgggtacaccttcaccagctactggatgcactgggtgaggcagaggcctggacatggccttgagtggatcggagagattgatccttctgacagttataaagactacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactgtggacagatcctccaacacagcctacatgcacctcagcagcctgacatctgatgactctgcggtctattattgtgcaagagcgattacgacgaccccctttgacttctggggccaaggcaccactctcacagtctcctcaggcggtggcggttctggtggcggtggctccggcggtggcggttctgatattgtgctaactcagtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagcgtcagtctttcctgcagggccagccagagtattagcaacaacctacactggtatcaacaaaaatcacatgagtctccaaggcttctcatcaagtatgcttcccagtccatctctgggatcccctccaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcactctcagtatcaacagtgtggagactgaagattttggagtgtatttctgtcaacagagtaacacctggccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacggseqidno:15：cdrl1，rasqsisnnlhseqidno:16：cdrl2，yasqsisseqidno:17：cdrl3，qqsntwpytseqidno:18：cdrh1，sywmhseqidno:19：cdrh2，eidpsdsykdynqkfkdseqidno:20：cdrh3，aitttpfdfseqidno:21：flt3重链可变区，qvqlqqpgaelvkpgaslklsckssgytftsywmhwvrqrpghglewigeidpsdsykdynqkfkdkatltvdrssntaymhlssltsddsavyycaraitttpfdfwgqgttltvssseqidno:22：flt3轻链可变区，divltqspatlsvtpgdsvslscrasqsisnnlhwyqqkshesprllikyasqsisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvetedfgvyfcqqsntwpytfgggtkleikrseqidno:23：ef1α启动子aaggatctgcgatcgctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaacgggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgaagcttcgaggggctcgcatctctccttcacgcgcccgccgccctacctgaggccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctacseqidno:24：mmlv启动子，seqidno:25：flt3同种型1，mpalardggqlpllvvfsamifgtitnqdlpvikcvlinhknndssvgksssypmvsespedlgcalrpqssgtvyeaaavevdvsasitlqvlvdapgnisclwvfkhsslncqphfdlqnrgvvsmvilkmtetqageyllfiqseatnytilftvsirntllytlrrpyfrkmenqdalvcisesvpepivewvlcdsqgesckeespavvkkeekvlhelfgtdirccarnelgrectrlftidlnqtpqttlpqlflkvgeplwirckavhvnhgfgltwelenkaleegnyfemstystnrtmirilfafvssvarndtgyytcssskhpsqsalvtivekgfinatnssedyeidqyeefcfsvrfkaypqirctwtfsrksfpceqkgldngysiskfcnhkhqpgeyifhaenddaqftkmftlnirrkpqvlaeasasqascfsdgyplpswtwkkcsdkspncteeitegvwnrkanrkvfgqwvssstlnmseaikgflvkccaynslgtscetillnspgpfpfiqdnisfyatigvcllfivvltllichkykkqfryesqlqmvqvtgssdneyfyvdfreyeydlkwefprenlefgkvlgsgafgkvmnataygisktgvsiqvavkmlkekadsserealmselkmmtqlgshenivnllgactlsgpiylifeyccygdllnylrskrekfhrtwteifkehnfsfyptfqshpnssmpgsrevqihpdsdqisglhgnsfhsedeieyenqkrleeeedlnvltfedllcfayqvakgmeflefkscvhrdlaarnvlvthgkvvkicdfglardimsdsnyvvrgnarlpvkwmapeslfegiytiksdvwsygillweifslgvnpypgipvdanfykliqngfkmdqpfyateeiyiimqscwafdsrkrpsfpnltsflgcqladaeeamyqnvdgrvsecphtyqnrrpfsremdlgllspqaqvedsseqidno:26：flt3同种型2，mpalardggqlpllvvfsamifgtitnqdlpvikcvlinhknndssvgksssypmvsespedlgcalrpqssgtvyeaaavevdvsasitlqvlvdapgnisclwvfkhsslncqphfdlqnrgvvsmvilkmtetqageyllfiqseatnytilftvsirntllytlrrpyfrkmenqdalvcisesvpepivewvlcdsqgesckeespavvkkeekvlhelfgtdirccarnelgrectrlftidlnqtpqttlpqlflkvgeplwirckavhvnhgfgltwelenkaleegnyfemstystnrtmirilfafvssvarndtgyytcssskhpsqsalvtivekgfinatnssedyeidqyeefcfsvrfkaypqirctwtfsrksfpceqkgldngysiskfcnhkhqpgeyifhaenddaqftkmftlnirrkpqvlaeasasqascfsdgyplpswtwkkcsdkspncteeitegvwnrkanrkvfgqwvssstlnmseaikgflvkccaynslgtscetillnspgpfpfiqdnisfyatigvcllfivvltllichkykkqfryesqlqmvqvtgssdneyfyvdfreyeydlkwefprenlefgkvlgsgafgkvmnataygisktgvsiqvavkmlkekadsserealmselkmmtqlgshenivnllgactlsgpiylifeyccygdllnylrskrekfhrtwteifkehnfsfyptfqshpnssmpgsrevqihpdsdqisglhgnsfhsedeieyenqkrleeeedlnvltfedllcfayqvakgmeflefksarlpvkwmapeslfegiytiksdvwsygillweifslgvnpypgipvdanfykliqngfkmdqpfyateeiyiimqscwafdsrkrpsfpnltsflgcqladaeeamyqnvdgrvsecphtyqnrrpfsremdlgllspqaqvedsseqidno:27：肽连接子，ggggsseqidno:28：tcd19编码序列，atgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctccgtgtctcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctcaccatggcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtccaggggccccctctcctggacccatseqidno:29：2a肽共有基序，d-v/i-e-x-n-p-g-p，其中x是指任何氨基酸seqidno:30：cmv启动子，等效物应当理解，虽然已经结合其详细描述对本发明进行了描述，但上述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围界定。其他方面、优点和修改都在随附权利要求的范围内。为了任何和所有的目的，所有参考文献都在此全部并入本文中。[0311]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本技术所属领域的普通技术人员普遍理解的含义相同。[0312]本文说明性地描述的本技术可以在没有本文未具体披露的任何一个或多个元素、限制或限定的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广义地理解，且没有限制。此外，本文采用的术语和表达方式已被用作描述术语，而不是限制术语，在使用这些术语和表达方式时，并不旨在排除所显示和描述的特征或其部分的任何等效物，但认识到，在请求保护的本技术的范围内，各种修改是可能的。[0313]因此，应该理解这里提供的材料、方法和实例是优选方面的代表，是示范性的，并且不旨在作为对本技术范围的限制。[0314]本文对本技术进行了广义和一般性的描述。属于通用披露范围内的每个狭义的物种和亚属群也构成本技术的一部分。这包括对本技术的一般性描述，其中有将任何主题从该属中删除的但书或否定的限制，无论被切除的材料是否在此具体叙述。[0315]此外，当本技术的特征或方面以马库什组的术语描述时，本领域的技术人员将认识到本技术也因此以马库什组的任何单个成员或子组成员的术语描述。[0316]本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都明确地通过引用全部纳入本文，其程度与每个文献通过引用单独纳入相同。在发生冲突的情况下，以本说明书（包括定义）为准。[0317]其他方面载于随附权利要求中。当前第1页12当前第1页12









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