EPCAM抗体与CAR-T细胞的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术epcam抗体与car-t细胞1.参考序列表、表格或计算机程序2.序列表作为ascii格式的文本文件通过efs-web与本说明书同时提交，文件名为sequence listing.txt，创建日期为2021年4月12日并且大小为11.5千字节。通过efs-web提交的序列表是说明书的一部分，并且据此通过引用整体并入本文。技术领域3.本发明涉及可用于肿瘤的过继性免疫基因疗法领域的epcam抗体和epcam-car-t细胞。本发明具体地涉及包括epcam单链可变片段的嵌合抗原受体，所述epcam单链可变片段对epcam具有足够的功能但亲和力低，这减轻了对正常组织的细胞毒性。背景技术：4.免疫疗法正在成为非常有前景的癌症治疗方法。5.用car对t细胞进行基因修饰是设计肿瘤特异性t细胞的常用方法。可以将靶向肿瘤相关抗原的car(嵌合抗原受体)-t细胞输注到患者体内(过继性细胞转移或act)，这代表高效的免疫疗法方法。与化疗或抗体相比，car-t技术的优势在于，重新编程的工程化t细胞可以在患者体内增殖并持续存在并像活性药物一样发挥作用。6.car分子由合成结合部分组成，所述合成结合部分通常是与由tcrζ链和如cd28和/或4-1bb1,2等共刺激分子组成的细胞内信号传导结构域融合的源自抗体的单链片段可变(scfv)或任何天然抗原感应元件。car介导靶向的优势包含：1)与自然的非整合型tcr和共刺激信号传导相比，通过单个结合事件提供激活、增殖和顺式存活信号；2)通过非mhc依赖性抗原识别绕过肿瘤细胞对mhc的下调的能力；以及3)通过car与抗原3,4之间的高亲和力相互作用降低了激活阈值并能够识别低抗原密度的肿瘤细胞。7.理想的car靶抗原应该是天然的表面暴露的肿瘤新抗原，所述肿瘤新抗原在肿瘤组织中高度表达并且在健康组织中不可检测。然而，由于此类抗原的隐式稀有性，许多通常靶向的实体肿瘤抗原也由非肿瘤组织表达，尽管水平较低。对此类抗原具有高亲和力的car分子可能导致健康组织的侧枝靶向，从而导致在靶脱肿瘤(on-target,off-tumor)毒性，这是迄今为止car t细胞疗法进展的主要限制因素。8.常规car是使用单链抗体形式构建的，并被选择性地工程化成对靶抗原具有亚纳摩尔至低纳摩尔的亲和力。然而，只有当靶向真正的肿瘤抗原或那些具有最高水平限制的肿瘤抗原时，增加的car t细胞敏感度才可能是优势。否则，增加的敏感度是以在很大程度上对抗原密度不敏感的方式裂解表达靶标的细胞的选择性降低为代价的。9.epcam(上皮细胞粘附分子)(cd326)抗原是由epcam基因编码的39-40kda细胞表面糖蛋白。epcam在细胞粘附、生长、增殖、炎症、癌症和转移中起关键作用。epcam在如乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌和结直肠癌等许多类型的肿瘤中高度过表达。epcam也在许多正常组织中表达，但其在肿瘤组织中的表达显著更高。10.使用t细胞对抗癌症取决于最佳激活的t细胞，无论所述最佳激活的t细胞是内源性的还是基因工程化的。t细胞持续暴露于抗原导致其衰竭，这是以细胞功能恶化为特征的状态。耗尽的t细胞表现出效应子功能的丧失，开始表达多种抑制蛋白并由改变的转录库定义。11.高亲和力epcam car-t细胞识别表达上皮细胞粘附分子的细胞：epcam水平低的正常上皮组织和以相当高水平表达所述epcam的癌。正常细胞、非靶细胞以及癌细胞上的抗原识别可能会导致不需要的毒性和t细胞衰竭。12.需要具有改善的治疗指数的car，即，可以杀伤肿瘤同时使全身毒性最小化的car。附图说明13.图1a示出了ubs-54humab的重链可变区(vh，seq id no:1)。图1a还示出了ubs-54(seq id no:2)的cdr-h3和在cdr-h3中具有丙氨酸取代的四个变体的cdr-h3。d1a：seq id no:3。f3a：seq id no:4。l4a：seq id no:5，y6a：seq id no:6。14.图1b示出了epcam靶向car构建体的示意图。scfv组分是来自ubs-54humab或丙氨酸取代变体(d1a、f3a、l4a和y6a)之一的序列。ltr＝长末端重复；ss＝信号序列；scfv＝单链可变片段；tmcyto＝跨膜和胞质结构域。15.图1c示出了与在hek293t细胞中表达的myc标记的car结合的重组epcam。x轴：alexa fluor 647标记的重组epcam的结合。y轴：抗myc抗体的结合。16.图1d示出了用于测量用不同的epcam靶向car转导的原代t细胞对靶标的杀伤的效应子与靶标(e:t)测定。每个靶标分别与不同的car t细胞或未经转导的t(nt)细胞以2.5:1的e:t比率温育。活力百分比相对于仅来自靶细胞的发光归一化。17.图2a示出了ubs-54cdr-h3中的氨基酸取代的设计，用于微调epcam靶向car的亲和力。18.图2b示出了与在hek293t细胞中表达的myc标记的car结合的重组epcam。x轴：alexa fluor 647标记的重组epcam的结合。y轴：抗myc抗体的结合。19.图2c示出了用于测量用不同的epcam靶向car转导的原代t细胞对靶标的杀伤的效应子与靶标(e:t)测定。每个靶标分别与不同的car t细胞或未经转导的t(nt)细胞以1:1的e:t比率温育。细胞溶解百分比相对于仅来自靶细胞的发光归一化。20.图2d使用实时细胞分析仪(rtca)来测量epcam靶向car t对原代上皮细胞的杀伤。每个原代上皮细胞靶标分别与car t细胞或nt细胞以1:1的e:t比率温育。细胞溶解百分比相对于仅靶细胞归一化。x轴：时间，y轴：细胞溶解百分比21.图2e示出了在以e:t＝1:1与不同靶细胞共温育24小时之后通过elisa测量的每个car t变体的ifn-γ释放。22.图2f示出了在以e:t＝1:1与不同靶细胞共温育24小时之后通过elisa测量的每个car t变体的il-2释放。具体实施方式23.定义24.如本文所使用的，“约”是指±所述值的10％。25.如本文所使用的，“过继性t细胞疗法”涉及肿瘤特异性t细胞的分离和离体扩增以实现比单独接种疫苗所能获得的t细胞数量更多的t细胞。然后将肿瘤特异性t细胞输注到癌症患者体内，试图通过可以攻击并杀伤癌症的t细胞赋予所述癌症患者免疫系统压倒剩余肿瘤的能力。26.如本文所使用的，“亲和力”是抗体(例如，epcam抗体)与其抗原(例如，epcam)的结合强度。亲和力通常由平衡解离常数(kd或kd)测量和报告，所述平衡解离常数用于评估和排序双分子相互作用的有序强度。27.如本文所使用的，“嵌合抗原受体(car)”是指包括能够与抗原结合的细胞外结构域、铰链结构域、跨膜结构域和至少一个细胞内结构域的融合蛋白。受体是嵌合的，因为所述受体将抗原结合功能和t细胞激活功能组合到单个受体中。“能够与抗原结合的细胞外结构域”是指能够与某种抗原结合的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”是指已知充当传递信号以引起细胞中生物学过程的激活或抑制的结构域的任何寡肽或多肽。28.如本文所使用的，“结构域”是指多肽中独立于其它区折叠成特定结构的一个区。29.如本文所使用的，“单链可变片段(scfv)”是指源自保留与抗原结合的能力的抗体的单链多肽。scfv的实例包含通过重组dna技术形成的抗体多肽并且在所述重组dna技术中，免疫球蛋白重链片段(vh结构域)和轻链片段(vl结构域)的fv区通过间隔子序列连接。用于工程化scfv的各种方法是本领域技术人员已知的。scfv可以是呈vh-连接子-vl或vl-连接子-vh的形式。连接子可以是2-30个氨基酸，优选第5-20个氨基酸。30.如本文所使用的，“肿瘤抗原”是指存在于肿瘤中并具有抗原性的生物分子。31.描述32.嵌合抗原受体(car)-t细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中表现出强大的抗癌反应。然而，car-t细胞治疗方法在实体肿瘤中的应用受到多种挑战的阻碍，所述多种挑战之一是对正常组织的在靶/脱肿瘤细胞毒性。仅存在于肿瘤细胞上的肿瘤特异性抗原是罕见的。大多数car-t细胞被设计成靶向在肿瘤细胞上以高水平表达的肿瘤相关抗原(taa)。然而，正常组织也表达这些抗原，尽管密度低得多。33.上皮细胞粘附分子(epcam)在上皮细胞中高度表达并且在多种上皮癌中的肿瘤细胞中过表达。高亲和力(nm范围)epcam靶向car-t细胞在体外杀伤正常人上皮细胞和高epcam肿瘤细胞。为了减轻在靶/脱肿瘤细胞毒性，发明人开发了用于微调car选择性地靶向肿瘤细胞的亲和力的策略。34.huls等人(《自然生物技术(nat biotechnol.)》17,276-281(1999))分离出对亲和力为5nm的epcam具有特异性的humab ubs-54(ubs-54)。美国专利第7,777,010号中示出了ubs-54的vh序列和vl序列，并且所述美国专利通过引用并入本文。发明人选择ubs-54的cdr3-vh用于工程化对epcam具有不同亲和力的抗体，因为vh的cdr3占据抗原结合表面的中心位置并且具有最大的多样性。35.本发明提供了对epcam具有不同亲和力的抗epcam抗体。因为重链可变cdr3区(cdr-h3)占据抗原结合表面的中心位置并且具有最大的多样性2，所以发明人已经将cdr-h3工程化用于亲和力微调。36.本发明涉及与epcam结合的抗体或其抗原结合片段，其中cdr-h3具有氨基酸序列dpflha(seq id no:6)、dpflhl(seq id no:7)、dpflhv(seq id no:8)、apflhy(seq id no:3)、dpfahy(seq id no:5)或dpflhf(seq id no:9)。37.在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段的重链可变cdr1具有ggtfssy的序列(seq id no:10)并且重链可变cdr2具有ipifgt的序列(seq id no:11)。38.在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段的轻链可变cdr1具有rssqsllhsngynyld的序列(seq id no:12)并且轻链可变cdr2具有lgsnras的序列(seq id no:13)，并且轻链可变cdr3具有mqalqtft的序列(seq id no:14)。39.在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段的轻链可变结构域(vl)具有seq id no:15或16的氨基酸序列。40.在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段具有与ubs-54的vh框相同的vh框(参见图1)。41.在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段具有与ubs-54的vl框相同的vl框(seq idno:15)。42.在一个优选实施例中，抗体或其抗原结合片段具有与ubs-54的vh框和vl框相同的vh框和vl框。43.在一个优选实施例中，除了cdr-h3具有一个氨基酸变异并且具有dpflha的氨基酸序列之外，抗体或其抗原结合片段具有与ubs-54的vh序列相同的vh序列，即，vh具有seq id no:17的氨基酸序列。44.在一个优选实施例中，除了cdr-h3具有一个氨基酸变异并且具有dpflhl的氨基酸序列之外，抗体或其抗原结合片段具有与ubs-54的vh序列相同的vh序列，即，vh具有seq id no:18的氨基酸序列。45.在一个优选实施例中，除了cdr-h3具有一个氨基酸变异并且具有dpflhv的氨基酸序列之外，抗体或其抗原结合片段具有与ubs-54的vh序列相同的vh序列，即，vh具有seq id no:19的氨基酸序列。46.在一个优选实施例中，除了cdr-h3具有一个氨基酸变异并且具有apflhy的氨基酸序列之外，抗体或其抗原结合片段具有与ubs-54的vh序列相同的vh序列，即，vh具有seq id no:20的氨基酸序列。47.在一个优选实施例中，除了cdr-h3具有一个氨基酸变异并且具有dpfahy的氨基酸序列之外，抗体或其抗原结合片段具有与ubs-54的vh序列相同的vh序列，即，vh具有seq id no:21的氨基酸序列。48.在一个优选实施例中，除了cdr-h3具有一个氨基酸变异并且具有dpflhf的氨基酸序列之外，抗体或其抗原结合片段具有与ubs-54的vh序列和vl序列相同的vh序列和vl序列，即，vh具有seq id no:22的氨基酸序列。49.本发明使用经亲和力微调的抗epcam抗体提供靶向epcam的嵌合抗原受体。发明人已经构建了一组包括经亲和力微调的人抗epcam scfv的亲和力变体car。与常规car相比，包括具有靶向epcam的微摩尔亲和力的抗epcam scfv的car t细胞具有改善的功效和安全性，因为所述car t细胞能够裂解过表达靶抗原的细胞，同时保留密度低得多的正常细胞。50.本发明涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白(car)，其从n末端到c末端包括：(i)低亲和力抗epcam scfv，(ii)铰链结构域；(iii)跨膜结构域，(iv)至少一个共刺激结构域，以及(v)激活结构域。51.在一个实施例中，car包括低亲和力抗epcam scfv，所述低亲和力抗epcam scfv包括具有氨基酸序列dpflha、dpflhl或dpflhv的重链可变cdr3区。52.scfv可以进一步包括ggtfssy的氨基酸序列的重链可变cdr1和ipifgt的氨基酸序列的重链可变cdr2。scfv可以进一步包括rssqsllhsngynyld的氨基酸序列的轻链可变cdr1、lgsnras的氨基酸序列的轻链可变cdr2和mqalqtft的氨基酸序列的轻链可变cdr3。53.在一个实施例中，除了cdr-h3具有dpflha、dpflhl或dpflhv的氨基酸序列之外，低亲和力抗epcam scfv与ubs-54的抗epcam scfv相同。54.本发明的car包括作为铰链的间隔子序列以将scfv与跨膜结构域连接并在空间上将抗原结合结构域与内结构域分离。柔性间隔子允许结合结构域以不同方向定向以使其能够与肿瘤抗原结合。例如，间隔子序列可以包括igg1 fc区、igg1铰链或cd8茎或其组合。人cd28或cd8茎是优选的。55.本发明的car包括跨越膜的跨膜结构域。跨膜结构域可以源自自然多肽，或者可以是人工设计的。源自自然多肽的跨膜结构域可以从任何膜结合蛋白或跨膜蛋白获得。例如，可以使用t细胞受体α或β链、cd3ζ链、cd28、cd3-ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、icos、cd154或gitr的跨膜结构域。人工设计的跨膜结构域是主要包括如亮氨酸和缬氨酸等疏水残基的多肽。在优选实施例中，跨膜结构域源自提供良好的受体稳定性的cd28或cd8。56.本发明的car包括选自由以下组成的组的一个或多个共刺激结构域：人cd28、4-1bb(cd137)、icos-1、cd27、ox 40(cd137)、dap10和gitr(aitr)。在一个实施例中，car包括cd28的一个共刺激结构域。57.内结构域(激活结构域)是car的信号传递部分。在抗原识别之后，受体簇和信号传递到细胞。最常用的内结构域组分是cd3-zeta(cd3 z或cd3ζ)的内结构域组分，所述cd3ζ的内结构域组分含有3个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)。这在抗原结合之后将激活信号传递给t细胞。cd3-ζ可能不能提供完全有效的激活信号并且可能需要附加共刺激信号传导。例如，一个或多个共刺激结构域可以与cd3-ζ一起使用以传递增殖/存活信号。58.本发明的car可以包括到epcam scfv的信号肽n末端，使得当car在如t细胞等细胞内表达时，新生蛋白被导向内质网并且随后被导向细胞表面，所述新生蛋白在所述细胞表面表达。信号肽的核心可以含有倾向于形成单个α-螺旋的一长段疏水氨基酸。信号肽可以以一小段带正电荷的氨基酸开始，这有助于在易位期间加强多肽的适当拓扑结构。在信号肽的末端，通常有一段被信号肽酶识别并切割的氨基酸。信号肽酶可以在易位期间或易位完成之后切割以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后游离信号肽被特定蛋白酶消化。作为实例，信号肽可以源自人cd8或gm-csf，或其具有1或2个氨基酸突变的变体，只要信号肽仍用于引起car的细胞表面表达。59.本发明提供了编码上文所描述的car的核酸。编码car的核酸可以通过常规方法由特定car的氨基酸序列制备。对于每个结构域的氨基酸序列，编码氨基酸序列的碱基序列可以从上述ncbi refseq id或genbenk的登录号获得，并且本发明的核酸可以使用标准分子生物学和/或化学程序制备。例如，基于碱基序列，可以合成核酸，并且本发明的核酸可以通过使用聚合酶链式反应(pcr)组合从cdna文库获得的dna片段来制备。60.可以将编码本发明car的核酸插入到载体中，并且可以将载体引入到细胞中。例如，可以使用如逆转录病毒载体(包含致癌逆转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、猿猴病毒载体、牛痘病毒载体或仙台病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)载体和hsv载体等病毒载体。作为病毒载体，优选使用缺乏复制能力从而不能在感染细胞中自我复制的病毒载体。61.例如，当使用逆转录病毒载体时，本发明的方法可以通过基于ltr序列和载体所具有的包装信号序列选择合适的包装细胞并使用包装细胞制备逆转录病毒颗粒来进行。包装细胞的实例包含pg13(atcc crl-10686)、pa317(atcc crl-9078)、gp+e-86和gp+envam-12以及psi-crip。也可以使用具有高转染效率的293细胞或293t细胞制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒生产的多种逆转录病毒载体和可以用于包装逆转录病毒载体的包装细胞可从许多公司广泛商购获得。62.本发明提供了经修饰以表达如上文所描述的car的t细胞或自然杀伤细胞(nk细胞)。本发明的car-t细胞或car-nk细胞通过car的抗epcam scfv与epcam结合，从而将信号传递到细胞中，并且因此激活细胞。表达car的细胞的激活根据宿主细胞的种类和car的细胞内结构域而变化，并且可以基于例如细胞因子的释放、细胞增殖速率的提高、细胞表面分子的变化、杀伤靶细胞等作为指数来确认。63.经修饰以表达epcam-car的t细胞或nk细胞可以用作疾病的治疗剂。治疗剂包括表达epcam-car的t细胞作为活性成分，并且可以进一步包括合适的赋形剂。赋形剂的实例包含本领域技术人员已知的药学上可接受的赋形剂。64.本发明进一步提供了一种用于治疗癌症的过继性细胞疗法方法。所述方法包括以下步骤：向患有癌症的受试者施用本发明的car-t细胞或car-nk细胞，其中受试者的癌细胞过表达epcam，并且car-t细胞或car-nk细胞与癌细胞结合以杀伤癌细胞。如本文所使用的“过表达”是指癌细胞的epcam表面表达显著高于正常细胞的epcam表面表达。适用于本发明治疗的癌症包含但不限于结肠癌、肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、胆囊癌、鼻咽癌、结直肠癌、卵巢癌和肺癌。65.本发明表明，表达针对epcam的经亲和力微调的car变体的t细胞保留表达适量epcam的正常组织，同时在体外有效消除富含epcam的癌细胞系，并在体内异种移植小鼠模型中有效消退肿瘤并延长存活。当与表达不同水平epcam的靶细胞共培养时，配备有低亲和力scfv的car t细胞显示出抗原依赖性激活、增殖和th1样细胞因子分泌。66.与亲和力更高的car相比，亲和力范围为50nm至50μm的低亲和力抗epcam抗体(呈scfv形式)的car使针对正常组织中基础表达的抗原的脱肿瘤毒性最小化，并且还提高了治疗指数。靶标亲和力范围为微摩尔的car t细胞可以避免靶向具有基础抗原表达的健康组织，同时对具有高靶标表达的肿瘤组织表现出相当的效力和长期功效。微摩尔亲和car使得t细胞能够忽略具有低epcam表达的正常组织。纳摩尔亲和力epcam-car的高亲和力和亲合力相互作用可以降低t细胞的连续杀伤倾向，潜在地导致衰竭或增加对激活诱导的细胞死亡的易感性。67.以下实施例进一步说明了本发明。这些实例仅旨在说明本发明并且不应被解释为限制本发明。68.实例69.材料和方法70.实例1.制备具有vh的不同cdr3的epcam抗体。71.美国专利第7,777,010号中示出了ubs-54的vh序列和vl序列。ggggs ggggs ggggs(seq id no:23)的寡肽连接子用于连接两个序列以产生vh-连接子-vl取向的完整scfv序列。ubs-54scfv的dna序列通过反向翻译源自氨基酸序列。合成编码ubs-54scfv的dna片段并将其克隆到基于pcdna3.1的scfv-fc重组蛋白表达质粒中。为了产生重组scfv-fc蛋白，使用293fectintm用表达质粒转染hek293t细胞。在72小时之后收集上清液并通过离心和过滤进行澄清。通过蛋白a亲和色谱法从上清液中纯化scfv-fc蛋白。通过基因工程化和分子克隆产生epcam scfv变体的蛋白表达质粒。ubs-54表达质粒的blpi和sbfi片段被编码每个cdr-h3变体的dna片段替换以产生对应的scfv-fc表达质粒。如先前所提及的纯化epcam scfv-fc蛋白。72.实例2.细胞系和原代人淋巴细胞73.在含有10％ fbs(吉博科公司(gibco))的mccoy's 5a(吉博科公司)中培养人结直肠腺癌ht-29细胞(atcc)。在含有10％ fbs(吉博科公司)的rpmi-1640(吉博科公司)中培养人胃癌mkn-28细胞和人胰腺癌capan2细胞(atcc)。在高葡萄糖的dmem和含有10％fbs(吉博科公司)的glutamax(吉博科公司)中培养人乳腺癌mda-mb-231细胞(atcc)和人胚胎肾hek293t细胞(atcc)。在完整的人上皮细胞培养基试剂盒(细胞生物制剂公司(cell biologics inc.))中培养人正常原代上皮细胞(细胞生物制剂公司)。ht-29、mkn-28、capan-2、mda-mb-231和hek293t细胞用编码萤火虫荧光素酶-f2a-gfp的慢病毒(biosettia公司)转导，用于基于发光的效应子与靶标测定。将所有细胞均在37℃下在5％ co2加湿温育箱中温育。74.使用cd4&cd8微珠(美天旎生物技术公司(miltenyi biotec))从leukopak(澳赛尔斯生物技术有限公司(allcells inc.))中分选人原代t淋巴细胞并将其在补充有5％人ab血清(西格玛公司(sigma))、12.5ng/ml il-7和12.5ng/ml il-15(美天旎生物技术公司)的texmacs(美天旎生物技术公司)中培养。将t细胞在37℃下在5％ co2加湿温育箱中温育。75.实例3.epcam靶向car构建体的构建76.ubs-54scfv由来自ubs-54humab(美国专利第7,777,010号)的vh序列和vl序列组成。seq id no:22的15氨基酸连接子用于连接两个序列。cdr-h3序列被修饰以产生scfv变体。合成scfv序列并将其克隆到慢病毒主链(金斯瑞公司(genscript))中。ubs-54scfv和变体在c末端处直接融合到cd8铰链、cd28跨膜和胞质结构域以及cd3z胞质结构域。car t细胞图像的报告基因sstr2使用‘核糖体跳跃’猪捷申病毒-1 2a(p2a)序列在c末端处与car连接。epcam car构建体在图1b中示出。然后将完整的car插入片段亚克隆到plenti主链中(vedvyas y等人,《临床调查洞察(jci insight)》1,e90064)(2016)。77.实例4.t细胞的慢病毒产生和转导78.通过使用lipofectamine 2000(英杰公司(invitrogen))瞬时转染hek293t细胞产生慢病毒。简而言之，前一天，将9μg转移质粒、13.5μg lv-max慢病毒包装混合物(吉博科公司)和50ul lipofectamine 2000用于接种600万个hek293t细胞的每100mm平板。第二天早上用10ml optimem替换转染培养基。转染后48小时收获含有慢病毒的培养基，通过0.45μm过滤器过滤，并通过amicon过滤器(西格玛公司)在4℃下浓缩。然后将慢病毒在-80℃下冷冻。在用抗cd3/cd28磁珠(英杰公司)激活后24小时，通过与慢病毒温育过夜来转导人t细胞。在首次转导之后16小时再次转导t细胞。转导之后，培养t细胞并再扩增8至10天。79.实例5.体外靶细胞杀伤测定80.将5×103个经稳定转导以表达gfp和萤火虫荧光素酶的靶细胞与未经转导的或epcam靶向car t细胞以不同的效应子与靶标比率(e:t)共培养。在含有150μg/ml d-荧光素(金生物技术公司(gold biotechnology))且无细胞因子补充的t细胞培养基中进行共培养。使用读板仪(伯腾公司(biotek))测量发光，每个e:t条件下的读数相对于仅靶向对照归一化。81.实时细胞分析仪(艾森生物公司(acea bio))用于测量car t变体对原代上皮细胞的杀伤。将5×103个靶细胞与未经转导的或epcam靶向car t细胞共培养。在没有细胞因子补充的t细胞培养基中进行共培养。82.实例6.epcam结合和car表达定量83.使用推荐浓度的抗c-myc-fitc(美天旎公司(miltenyi))检测hek293t细胞上的car表达。使用重组epcam(r&d系统公司(r&d systems))在360nm处检测epcam与表达car的hek293t细胞的结合。先前使用alexa fluor 647微量蛋白标记试剂盒(英杰公司)将重组epcam与af647缀合。然后，在流式细胞术分析之前，洗涤并重新悬浮细胞。84.实例7.ifn-γ和il-2的体外测量结果85.在24小时后从e:t测定收集上清液并将其在-80℃下冷冻。elisa max deluxe试剂盒(百进生物公司(biolegend))用于确定上清液中的ifn-γ和il-2水平。按照百进生物公司的手册对细胞因子水平进行定量。86.结果87.实例8.用于亲和力微调的epcam靶向car中的关键残基的鉴定88.ubs-54scfv是基于ubs-54humab(美国专利第7,777,010b2号)的vh序列和vl序列设计的，所述序列通过连接子(seq id no:22)连接。89.ubs-54scfv的cdr-h3序列是dpflhy。为了测试哪个氨基酸残基对亲和力是重要的，将4个残基分别改变为丙氨酸(a)以产生4个不同的变体：d1a、f3a、l4a和y6a(图1a)。90.合成并克隆scfv序列以在慢病毒主链中产生第2代car构建体(图1b)。91.为了测试丙氨酸取代是否改变ubs-54scfv的亲和力，用编码含有ubs-54、d1a、f3a、l4a或y6a scfv的car的质粒转染hek293t，并通过流式细胞仪测定epcam抗原结合(图1c)。将myc标签附加到每个scfv变体的n末端以帮助通过抗myc-fitc抗体测量car表达。先前将重组epcam蛋白与alexa fluor 647(af647)缀合。平均荧光强度(mfi)值越高，指示myc抗体或epcam抗原的结合越好。使用来自表达car的细胞的af647信号强度与fitc信号强度的比率(mfiaf647/mfifitc)来估计每个car的相对亲和力。scfv变体按从高到低的顺序排序(图1c)：l4a(mfiaf647/mfifitc＝0.302)》ubs-54(mfiaf647/mfifitc＝0.289)》d1a(mfiaf647/mfifitc＝0.246)》y6a(mfiaf647/mfifitc＝0.018)》f3a(mfiaf647/mfifitc＝0.016)。92.l4a的亲和力比ubs-54的亲和力高或相近。l4a是有用的抗体，但不适合用作经亲和力微调的抗体来降低car对正常组织的细胞毒性。93.通过可溶性抗原结合测定，f3a的亲和力和特异性过低，不去因此没有用。94.对d1a和y6a car进行进一步的功能分析，因为其具有比ubs-54car的亲和力更低的亲和力，但仍具有足够的亲和力来与epcam抗原结合。95.然后在体外检查低亲和力epcam靶向car对原代t细胞激活和细胞毒性的影响。用ubs-54、d1a和y6a car转导原代t细胞，并将其添加到各种靶细胞中以确定其体外细胞毒性功效。总体而言，在所有car t细胞中，靶细胞裂解与epcam表达之间存在正相关(ht-29》capan2》mda-mb-231》hek293t)(图1d)。当t细胞表达对epcam具有较高亲和力的car时，杀伤率也较快(ubs-54》d1a》y6a)。96.实例9.y6残基上的氨基酸取代用于epcam靶向car的亲和力微调97.为了鉴定可能在d1a与y6a之间具有亲和力的car变体，通过将cdr-h3的酪氨酸(y)残基改变为具有不同大小的疏水侧链的残基产生附加3个变体(y6v、y6l和y6f)(图2a)。通过epcam结合再次测量这些car变体的相对亲和力(图2b)，如实例6所描述的。基于mfiaf647/mfifitc的比率，按从高到低的顺序对car变体的亲和力进行排序：ubs-54(mfiaf647/mfifitc＝0.289)》y6f(mfiaf647/mfifitc＝0.239)》y6l(mfiaf647/mfifitc＝0.031)》y6v(mfiaf647/mfifitc＝0.026)》y6a(mfiaf647/mfifitc＝0.018)。98.然后在体外检查低亲和力epcam靶向car对原代t细胞激活和细胞毒性的影响。用ubs-54、y6f、y6l、y6v和y6a car转导原代t细胞，并将其添加到各种靶细胞中以确定其体外细胞毒性功效。所有这些car t都杀伤epcam高癌细胞(ht-29和mkn-28)(图2c)。99.实例10.低亲和力car t细胞在细胞毒性测定中保留正常原代上皮细胞100.上皮细胞粘附分子(epcam)在上皮细胞中高度表达并且在多种上皮癌中的肿瘤细胞中过表达。试图通过微调亲和力来减轻car t细胞的在靶/脱肿瘤细胞毒性。检测epcam靶向car t变体对正常原代上皮细胞的细胞毒性。实时细胞分析仪(rtca)允许以无标记和实时的方式监测细胞活力。将epcam靶向car t细胞添加到三个原代上皮细胞靶标中。高亲和力ubs-54和y6f car t细胞杀伤原代上皮细胞(图2d)。低亲和力y6a、y6l和y6v car t细胞不杀伤原代上皮细胞(图2d)，尽管如先前所提及的其都高效地杀伤epcam高癌细胞(图2c)。101.car t细胞的ifn-γ释放(图2e)和il-2释放(图2f)与car的亲和力和靶抗原密度紧密对齐，其中在含有更高亲和力car t细胞和具有更高epcam水平的靶细胞的共培养物中发现增加的水平。与y6a、y6l和y6l不杀伤原代上皮细胞的观察一致，ifn-γ和il-2的释放水平也处于与未经转导的t细胞相当的水平。102.这些结果指示，鉴定了三个(y6a、y6l和y6v)epcam靶向car t变体对正常原代上皮细胞的反应最小，同时在体外有效地消除癌细胞。103.实例11.检查经亲和力微调的epcam car t活性的临床前研究104.小鼠腹膜内胃癌模型105.4至6周龄的雄性nsg小鼠购自杰克逊实验室(jackson laboratory)。通过将0.5×106萤火虫荧光素酶(fluc)表达snu-638胃癌细胞系注射到腹膜腔中来建立腹膜胃癌模型。在7天之后，腹膜内注射本发明的未经转导的对照t细胞nt和抗epcam car t细胞(10×106/小鼠)。106.全身性胃癌模型107.通过尾静脉注射胃癌细胞系mkn-45-fluc+肿瘤细胞(0.5×106/小鼠)和t细胞(10×106/小鼠)。在肿瘤接种后5天施用t细胞。108.原位癌症模型109.以25μl的mccoy's 5a与matrigel(康宁公司(corning))的1:1混合物中含0.1×106个细胞的密度通过外科手术将癌细胞系植入到胃中来建立人肿瘤的原位异种移植。在十五天之后，通过尾静脉静脉内注射t细胞(10×106/小鼠)。110.患者源性异种移植(pdx)模型111.使用不超过3次小鼠传代。在肿瘤接种七天之后，通过尾静脉用10×106个t细胞处理小鼠。每周用卡尺测量肿瘤体积(v)，并使用公式v＝[长度×(宽度)2]/2计算。[0112]皮下肿瘤模型[0113]为了模拟异源抗原表达，将snu-638(90％野生型，10％ epcam敲除)或mkn-45(90％野生型，10％ epcam敲除)肿瘤细胞的混合物(1×106/小鼠)皮下植入到nsg小鼠的左上胁腹。在五天或七天之后，通过静脉内注射用10×106个不同的t细胞处理小鼠。收获小鼠血浆并将其储存在-80℃下用于细胞因子分析。在指定的时间点收集肿瘤以通过流式细胞术测量epcam和icam-1表达。[0114]监测肿瘤生长、杀伤和car t细胞分布[0115]所有t细胞均冷冻保存并在解冻之后新鲜用于注射。使用spectrum体内成像系统(珀金埃尔默公司(perkinelmer))每周监测肿瘤生长。在腹膜内注射200μl 15mg/ml d-荧光素(金生物科技公司(goldbio))之后15分钟采集生物发光图像。对于腹膜snu-638肿瘤模型，皮下注射d-荧光素。使用全身生物发光通量来估计肿瘤负荷。在静脉内注射18f-nota-oct示踪剂(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸-奥曲肽)之后2小时，使用微pet/ct扫描仪(inveon，西门子(siemens))进行pet/ct成像以追踪t细胞生物分布。[0116]本发明和制备和使用它的方式和方法现描述于这些完全、清楚、简洁和精确术语中，以便使它涉及的本领域的技术人员制备并且使用其。应了解，前文描述本发明的优选实施例并且可在不脱离如申请专利范围中所阐述的本发明的范围的情况下在其中进行修改。为特别指出并且清楚地要求视为本发明的主题，以下申请专利范围总结本说明书。









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