一种羟氯扎胺基因毒性杂质的检测方法与流程 专利技术说明

测量装置的制造及其应用技术1.本发明涉及的是一种基因毒性杂质检测技术领域，具体是一种羟氯扎胺基因毒性杂质的检测方法。背景技术：2.基因毒性物质特点是在很低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，进而导致基因突变并可能促使肿瘤发生。因其毒性较强，对用药的安全性产生了强烈的威胁，近年来也越来越多的出现因为在已上市药品中发现痕量的基因毒性杂质残留而发生大范围的医疗事故，被fda强行召回的案例，给药厂造成了巨大的经济损失。近年来各国的法规机构如ich、fda、ema等都对基因毒性杂质有了更明确的要求，越来越多的药企在新药研发过程中就着重关注基因毒性杂质的控制和检测。3.羟氯扎胺(oxyclozanide)，又名五氯柳胺、羟氯柳胺和羟氯柳苯胺，该药物是一种新型的水杨酰苯胺类药物，主要用于治疗和控制牛羊等动物的吸虫病，此外对蛔虫和绦虫感染也有较好的防治效果。其合成路线如下：[0004][0005]由于羟氯扎胺原料药的中间体2，4-二氯-6-硝基苯酚(简称：硝化物)和2-氨基-4，6-二氯苯酚(简称：还原物)均含有基因毒性信号结构硝基化合物、芳胺，具体如下：[0006][0007]根据药理毒理数据及日服用最大剂量计算得出，基毒杂质控制标准＜1.67ppm，基杂限度值低，检测困难，目前，还没有一种能够同时准确检测羟氯扎胺中硝化物和还原物含量的方法。[0008]为保证患者用药的安全性，需要对羟氯扎胺中还原物和硝化物进行严控控制和精准的检测，因此，有待开发一种操作简便、分离度好、灵敏度高、检测限低，重复性好、数据准确可靠的羟氯扎胺基因毒性杂质的检测方法。技术实现要素：[0009]本发明的目的在于提供一种操作简便、分离度好、灵敏度高、检测限低，重复性好、数据准确可靠的羟氯扎胺基因毒性杂质的检测方法，具体技术方案如下：[0010]一种羟氯扎胺基因毒性杂质的检测方法，通过高效液相色谱法，利用色谱柱梯度洗脱有效分离、检测羟氯扎胺原料药中的基因毒性杂质硝化物和还原物含量。[0011][0012]其检测条件及参数如下：[0013]检测波长：200-350nm；[0014]流速：0.8-1.5ml/min；[0015]进样量：15-20μl；[0016]柱温：20-40℃；[0017]流动相：流动相a为磷酸水溶液，流动相b为甲醇、乙腈中的任一种。[0018]进一步的，所述检测方法的检测条件及参数如下：[0019]检测波长：250-300nm；[0020]流速：1.2-1.5ml/min；[0021]进样量：15-20μl[0022]柱温：30-40℃；[0023]流动相：流动相a为0.1-0.5％磷酸水溶液，流动相b为甲醇。[0024]检测梯度洗脱梯度程序为：流动相a+流动相b＝100％，0-18min流动相a 保持体积百分比为30-50％；18-19min流动相a的体积百分比由30-50％递减至5-20％；19-43min流动相a保持体积百分比为5-20％；43-44min流动相a的体积百分比由5-20％提升至30-50％；44-60min流动相a的体积百分比保持在 30-50％。[0025]检测用色谱柱型号为xterra rpb(5μm×4.6×250mm)、eclipse xdb c18 (5μm×4.6×150mm)、symmetry c18(5μm×4.6×250mm)、bds hypersilc18(3μm×4.6×100mm)、hypersil ods(5μm×4.6×200mm)、inertsilods-3(5μm×4.6×250mm)、luna c18(5μm×4.6×250mm)、luna c18 (5μm×4.6×150mm)、gemini c18 110a(5μm×4.6mm×250mm)、zorbaxsb-c8(5μm×4.6×150mm)、xterra rpb(3.5μm×4.6×100mm)、athenac18-wp(3μm×2.1×100mm)、xtimate c18(5μm×4.6×250mm)、kromasilc18(5μm×4.6×250mm)中的任一种。[0026]具体的检测方法包括以下步骤：[0027](1)溶液配制[0028]供试品溶液(40mg/ml)：精密称取400mg样品于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀；[0029]对照品溶液1(0.0656μg/ml)：精密称取还原物、硝化物对照品各10.5mg 于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容；精密移取1ml至20ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；再精密移取1ml于20ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；再精密移取5ml至20ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；[0030]对照品溶液2(0.0656μg/ml)：精密称取还原物、硝化物对照品各10.5mg 于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容；精密移取1ml至20ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；再精密移取1ml于20ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；再精密移取5ml至20ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；[0031](2)进样操作步骤[0032]a、按要求设定色谱条件，并用流动相平衡色谱柱至基线平衡；b、进空白溶液：1针；c、进对照品溶液1：1针；d、进对照品溶液2：1针；对照品溶液 2回收率应在80-120％范围内；e、进供试品溶液：1针；f、进空白溶液：1针； g、进对照品溶液1：1针；所有样品溶液运行完成或每进12针样品溶液后，需进一针对照品溶液1，对照品溶液1回收率应在80-120％范围内；[0033](3)计算[0034]1)对照品溶液2回收率＝(ac,r2/w2)/(ac,r1/w1)×100％[0035]其中，ac,r1＝对照品溶液1中还原物(或硝化物)峰面积；[0036]w1＝对照品溶液1中还原物(或硝化物)称样量；[0037]ac,r2＝对照品溶液2中还原物(或硝化物)峰面积；[0038]w2＝对照品溶液2中还原物(或硝化物)称样量；[0039]2)对照品溶液1回收率＝ac,r3/ac,r1×100％[0040]其中，ac,r3＝回收对照品溶液1中还原物(或硝化物)峰面积；[0041]ac,r1＝对照品溶液1中还原物(或硝化物)峰面积；[0042]3)[0043]其中：ac,s＝供试品溶液中还原物(或硝化物)峰面积；[0044]ac,r＝对照品溶液1中还原物(或硝化物)峰面积；[0045]cc,s＝供试品溶液的浓度；[0046]cc,r＝对照品溶液1中还原物(或硝化物)的浓度；[0047]p＝还原物(或硝化物)对照品的纯度因子。[0048]根据上述检测方法，检测方法基毒杂质还原物的检测范围为 1.3100-3.2313ppm，定量限为0.05239μg/ml；基毒杂质硝化物的检测范围为1.3125-3.2825ppm，定量限为0.05252μg/ml。[0049]本发明的有益效果在于：[0050]1)本发明提供了一种羟氯扎胺基因毒性杂质的检测方法，通过高效液相色谱法，利用色谱柱梯度洗脱有效分离、检测羟氯扎胺原料药中的基因毒性杂质硝化物和还原物。[0051]2)本发明提供的方法基毒杂质还原物的检测范围为1.3100-3.2313ppm，定量限为0.05239μg/ml；基毒杂质硝化物的检测范围为1.3125-3.2825ppm，定量限为0.05252μg/ml。[0052]3)本发明提供的方法具有操作简便、分离度好、灵敏度高、检测限低，重复性好、数据准确可靠等优点。附图说明[0053]图1为羟氯扎胺基毒杂质专属性试验高效液相色谱图具体实施方式[0054]下述通过具体的实施例，对本发明做详细的描述，以下实施例用于解释本发明，而不是对本发明的限制。[0055]方法验证进行了专属性、线性及范围、精密度测定、检测限、定量限、准确度试验。[0056]实施例1[0057]1、测定条件及参数：[0058]检测波长：256nm；[0059]流速：1.5ml/min；[0060]进样量：20μl[0061]柱温：40℃；[0062]色谱柱型号：eclipse xdb c18(5μm×4.6×150mm)[0063]流动相：[0064]流动相a：0.2％磷酸水溶液[0065]流动相b：甲醇[0066]所述的梯度洗脱梯度程序为：[0067]时间(min)a％b％03070183070191090431090443070603070[0068]2、专属性试验[0069](1)溶液配制[0070]①还原物储备液1：精密称取还原物对照品10.5mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容。精密移取1ml至20ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀。精密移取1ml至20ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀。[0071]②还原物对照溶液：精密移取5ml还原物储备液1至20ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀。[0072]③硝化物储备液1：精密称取硝化物对照品10.5mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容。精密移取1ml至20ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密移取1ml至20ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀。[0073]④硝化物对照溶液：精密移取5ml硝化物储备液1至20ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀。[0074]⑤专属性溶液：精密称取羟氯扎胺样品400mg至10ml容量瓶中，加入适量甲醇使样品溶解，分别移取还原物储备液1、硝化物储备液1各2.5ml加入该容量瓶中，用甲醇定容，摇匀。[0075](2)操作步骤[0076]·按要求设定色谱条件[0077]·用初始流动相平衡色谱柱至基线平衡[0078]·空白：一针；[0079]·还原物对照品溶液：一针；[0080]·硝化物对照品溶液：一针；[0081]·专属性溶液：一针。[0082]对应图谱详见附图1[0083]名称保留时间(rt)还原物5.334硝化物13.597[0084]3、线性及范围[0085](1)溶液配制：[0086]杂质储备液：精密称取还原物、硝化物对照品各10.5mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容。精密移取1ml至20ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。再精密移取5ml于20ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。[0087]1.31ppm对照品溶液：精密移取杂质储备液1ml至25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。[0088]1.64ppm对照品溶液：精密移取杂质储备液1ml至20ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。[0089]1.97ppm对照品溶液：精密移取杂质储备液3ml至50ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。[0090]2.63ppm对照品溶液：精密移取杂质储备液2ml至25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。[0091]3.28ppm对照品溶液：精密移取杂质储备液1ml至10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。[0092]备注：可调节称样量、容量瓶体积及稀释步骤，保持浓度不变。[0093](2)操作步骤：[0094]·按要求设定色谱条件，并用流动相平衡色谱柱至基线平衡。[0095]·空白溶液(流动相)：一针；[0096]·1.31ppm对照品溶液：一针；[0097]·1.64ppm对照品溶液：一针；[0098]·1.97ppm对照品溶液：一针；[0099]·2.63ppm对照品溶液：一针；[0100]·3.28ppm对照品溶液：一针；[0101](3)检测结果如下：[0102]a.还原物[0103][0104]b.硝化物[0105][0106][0107]4、定量限[0108](1)操作[0109]配制一系列浓度的还原物、硝化物溶液，找到合适的浓度后，配制相应的定量限溶液(即10倍基线噪音的浓度)，进样5针。[0110](2)结果[0111][0112]用上面计算而得的信噪比来评估定量限浓度(μg/ml)：定量限＝浓度×10/ 信噪比。[0113][0114]5、检测限[0115](1)操作[0116]配制一系列浓度的还原物、硝化物溶液，找到合适的浓度后，配制相应的检测限溶液(即3倍基线噪音的浓度)，进样5针。[0117](2)结果[0118][0119]用上面计算而得的信噪比来评估定量限浓度(μg/ml)：检测限＝浓度×3/ 信噪比。[0120][0121]6、精密度[0122]取一批均匀的羟氯扎胺样品，由同一名化验员，在间隔较短的时间里配制6 份样品(加1.64ppm杂质)溶液，并且在同一天，用同一台仪器对这六份样品 (加1.64ppm杂质)溶液进行检测。[0123]试验数据如下：[0124][0125][0126]7、准确度[0127]选择一批羟氯扎胺样品，添加还原物和硝化物，在三个水平(1.31ppm， 1.64ppm，3.28ppm)下进行还原物和硝化物回收率测定。[0128]试验数据如下：[0129]a.还原物[0130][0131]b.硝化物[0132][0133][0134]综合准确性、精密度和线性测试，本方法的检测范围如下：[0135]名称硝化物还原物范围(ppm)1.3125-3.28251.3100-3.2313[0136]8、羟氯扎胺中基毒杂质检测[0137][0138]实施例2[0139]1、测定条件及参数：[0140]检测波长：220nm；[0141]流速：1.3ml/min；[0142]进样量：20μl[0143]柱温：30℃；[0144]色谱柱型号：symmetry c18(5μm×4.6×250mm)[0145]流动相：[0146]流动相a：0.3％磷酸水溶液[0147]流动相b：甲醇[0148]所述的梯度洗脱梯度程序为：[0149]时间(min)a％b％04060184060191585431585444060604060[0150]2、专属性试验、线性及范围试验、精密度测定试验、检测限试验、定量限试验、准确度试验、羟氯扎胺中基毒杂质检测同实施例1[0151]实施例3[0152]1、测定条件及参数：[0153]检测波长：295nm；[0154]流速：0.8ml/min；[0155]进样量：20μl[0156]柱温：25℃；[0157]色谱柱型号：luna c18(5μm×4.6×150mm)[0158]流动相：[0159]流动相a：0.5％磷酸水溶液[0160]流动相b：甲醇[0161]所述的梯度洗脱梯度程序为：[0162][0163][0164]2、专属性试验、线性及范围试验、精密度测定试验、检测限试验、定量限试验、准确度试验、羟氯扎胺中基毒杂质检测同实施例1。[0165]本发明不限于上述实施例，凡依据本发明的技术实质对上述实施例作的任何简单、等同变化或修饰，均属于本发明技术范围内。









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