硼替佐米与青蒿琥酯的药物组合物、方法以及应用 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及医药技术领域，特别涉及硼替佐米与青蒿琥酯的药物组合物、方法以及应用。背景技术：2.多发性骨髓瘤是一组发生于b淋巴细胞的的恶性浆细胞克隆性肿瘤，占血液系统恶性肿瘤的第二位，恶性程度高，侵袭性高。近年来，多发性骨髓瘤的治疗得到了迅速发展，蛋白酶体抑制剂、免疫抑制剂和自体干细胞移植等手段的加入使得mm患者的完全缓解率有所提高，但是其中80-90％的患者仍有复发并且产生严重的耐药，影响患者生存质量。目前对多发性骨髓瘤患者的治疗多为传统化疗手段，而化疗药物对肿瘤组织亲和力较差，靶向性低，常规治疗剂量即对其他正常组织器官产生显著的毒副作用。因此，提高化疗药物对多发性骨髓瘤的靶向性，增加其在靶向部位的蓄积，达到高效低毒的效果，是提高多发性骨髓瘤治疗疗效及降低耐药性的关键。近年来，随着药物科学、材料科学和生物医学等相关领域的进展，载药技术的研究取得了重大进展。3.目前，以脂质体为纳米材料包裹药物到达内，以减轻药物本身的不良反应并增加药物治疗的靶向性为主的研究逐渐增多，而两个及以上药物结合并包裹进同一个脂质体中的研究并未受到相同的关注。但是，在两个药物本身协同作用下对其进行包裹可以促使肿瘤治疗更进一步的发展。技术实现要素：4.第一方面，本发明目的是通过硼替佐米与青蒿琥酯的药物组合物，保留青蒿琥酯、硼替佐米本身的抗肿瘤效应外，借助两者的协同作用，以及脂质体纳米材料本身的靶向性增强抗肿瘤作用并减少全身反应。5.技术方案：6.硼替佐米与青蒿琥酯的药物组合物，所述药物组合物包含用于同时、依次或分别使用的青蒿琥酯-硼替佐米脂质体，青蒿琥酯-硼替佐米脂质体包括：血小板膜包裹硼替佐米与青蒿琥酯药物分子。7.以纳米材料脂质体直接包裹青蒿琥酯及硼替佐米，无其他化合物粒子的中间作用，脂质体可作为包含于水相或脂质双层中的治疗和诊断剂的递送载体。以脂质体包封形式递送药物降低药物毒性、改变药代动力学或提高药物溶解度。8.在一些公开中，所述血小板膜来源于生物体内的血小板细胞。9.在一些公开中，上述药物组合物在治疗骨髓瘤的药物中的应用。10.在一些公开中，上述药物组合物在促骨髓瘤细胞凋亡的药物中的应用。11.在一些公开中，上述药物组合物在抗骨髓瘤增殖的药物中的应用。12.第二方面，本发明目的是通过一种作用多发性骨髓瘤的方法，保留青蒿琥酯、硼替佐米本身的抗肿瘤效应外，借助两者的协同作用，以及脂质体纳米材料本身的靶向性增强抗肿瘤作用并减少全身反应。13.一种作用多发性骨髓瘤的方法，所述方法用于非治疗作为目的，所述方法包括同时、依次或分别使用的青蒿琥酯-硼替佐米脂质体，青蒿琥酯-硼替佐米脂质体作用多发性骨髓瘤；青蒿琥酯-硼替佐米脂质体包括：血小板膜包裹硼替佐米药物分子。14.第三方面，本发明目的是通过一种抗肿瘤的方法，保留青蒿琥酯、硼替佐米本身的抗肿瘤效应外，借助两者的协同作用，以及脂质体纳米材料本身的靶向性增强抗肿瘤作用并减少全身反应。15.一种抗肿瘤的方法，所述方法用于非治疗作为目的，同时、依次或分别使用血小板载硼替佐米靶向载药，血小板载硼替佐米靶向载药包括：血小板膜包裹硼替佐米药物分子；青蒿琥酯-硼替佐米脂质体作用于肿瘤。16.在一些公开中，所述肿瘤为多发性骨髓瘤。17.在一些公开中，针对于第一方面的药物组合物中血小板膜包裹硼替佐米与青蒿琥酯药物分子的方法，包括：18.以氢化大豆卵磷脂、胆固醇和二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为原料，制备脂质体，将脂质体溶于65℃的无水乙醇中，在65℃下制成10％(v/v)的混合物，将混合物注入65℃的水相，形成乳白色悬浮液的粗制脂质体制剂，水相为150mm醋酸和150mm甘露醇的混合体；将粗制脂质体制剂减小脂质体粒径后，去除乙醇、脂外乙酸和甘露醇，获得产物；氢化大豆卵磷脂、胆固醇和二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的摩尔比为55：40：5；19.制备脂质体，包括：氢化大豆卵磷脂、胆固醇和二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇加入乙醇中，充分搅拌至混合均匀得到混合液a；将混合液a注入已加热至45-55℃的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌至乙醇除尽为止，得到脂质体；磷酸盐缓冲溶液中磷酸盐浓度为10mmol/l；20.将粗制脂质体制剂减小脂质体粒径至100nm及其以下；21.以去除乙醇、脂外乙酸和甘露醇，包括：用12kda mwco透析膜用10mm pbs，ph 7.0环境下，透析减小脂质体粒径后的粗制脂质体制剂。22.所述脂质体制剂与青蒿琥酯、硼替佐米孵育，进行将青蒿琥酯和硼替佐米装载至脂质体制剂内；所述青蒿琥酯硼替佐米脂质体制剂与青蒿琥酯、硼替佐米孵育的摩尔比为：2:1:1。23.有益效果：本发明保持青蒿琥酯、硼替佐米本身的抗肿瘤效应，同时构建青蒿琥酯-硼替佐米脂质体纳米材料，在体外细胞水平实现更强的抑制肿瘤增殖和促进凋亡的效果；本发明实现了：体外环境下青蒿琥酯-硼替佐米脂质体良好的抗多发性骨髓瘤治疗效应。附图说明24.图1是本发明青蒿琥酯-硼替佐米脂质体粒径检测结果；25.图2是本发明青蒿琥酯-硼替佐米脂质体中硼替佐米含量测定曲线；26.图3为不同时间点(24h、48h)不同处理组(青蒿琥酯脂质体组、硼替佐米脂质体组和青蒿琥酯-硼替佐米脂质体组)对u266细胞的增殖抑制率；27.图4为不同处理组u266细胞的凋亡情况。具体实施方式28.实施例一：29.本实施例的方法包括如下步骤：30.(1)将脂质体制剂在圆底烧瓶中以所需量混合溶于乙醇；31.(2)脂质体制剂包括：以氢化大豆卵磷脂、胆固醇和二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为原料，氢化大豆卵磷脂/胆固醇/二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(55：40：5)；32.(3)然后将此溶剂经注射器缓缓注入已加热至50℃的磷酸盐缓冲溶液中，并不断磁力搅拌至乙醇除尽为止；33.即氢化大豆卵磷脂、胆固醇和二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇加入乙醇中，充分搅拌至混合均匀得到混合液a；将混合液a注入已加热至45-55℃的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌至乙醇除尽为止，得到脂质体；磷酸盐缓冲溶液中磷酸盐浓度为10mmol/l。34.(4)然后将脂质体通过100nm聚碳酸酯薄膜滤膜挤出，反复10次；35.(5)用12kda mwco透析膜在25℃下用10mm pbs(ph 7.0)透析48h以去除乙醇、脂外乙酸和甘露醇；36.(6)通过将脂质体制剂与青蒿琥酯20mg、硼替佐米2mg孵育过夜，将两者远程装载在脂质体中；37.(7)然后，在室温下，用10mm pbs(ph 7.0)透析1次，用蔗糖/磷酸盐缓冲液(蔗糖9.5％，磷酸盐10mm；ph 7.0)透析3次，除去游离的硼替佐米；38.(8)0.45μm滤膜过滤；生成包载有蒿琥酯和硼替佐米的复合物，即青蒿琥酯-硼替佐米脂质体。39.实施例二：40.nano-zs激光粒度仪用来测定青蒿琥酯-硼替佐米脂质体的平均粒径和粒径分布；本发明中的粒径大小为115.65nm，相比以往的大多数btz脂质体制剂的粒径范围163-179nm,明显较小。41.实施例三：针对于青蒿琥酯-硼替佐米脂质体中硼替佐米的载药量42.利用高效液相色谱(hplc)用来测定硼替佐米的载药量，检测波长为237nm；43.利用色谱柱为c18柱，流动相a)水：乙腈-甲酸(70：30：1v/v)，b)甲醇-甲酸(200：800：1v/v)，35℃，进样量20min，流速1ml/min。44.硼替佐米包封率(％)＝(透析后硼替佐米浓度/透析前硼替佐米浓度)×100＝315.67ug/ml/400ug/ml*100％＝78.92％45.实施例四：cck8探究青蒿琥酯-硼替佐米脂质体的细胞毒性：46.(1)将u266细胞接种于96孔板，每孔100μl；47.(2)加入固定浓度的青蒿琥酯脂质体、硼替佐米脂质体和青蒿琥酯-硼替佐米脂质体，设置对照组，每孔10μl；48.(3)置于37℃，5％co2的细胞培养箱中，孵育24或48h后每孔中各加入10μl cck8应液，置于细胞培养箱中继续孵育2～4h；49.(4)酶标仪在450nm激发波长下，检测96孔板各孔的吸光度，根据od值按公式计算细胞增殖抑制率，公式如下：[0050][0051]增殖抑制率(％)＝(1-细胞生存率)×100[0052]图3为不同时间点(24h、48h)不同处理组(青蒿琥酯脂质体组、硼替佐米脂质体组和青蒿琥酯-硼替佐米脂质体组)对u266细胞的增殖抑制率，青蒿琥酯-硼替佐米脂质体组的增殖抑制作用更显著；[0053]实施例五：流式细胞分析术研究细胞凋亡：[0054](1)将u266细胞接种于六孔板，每孔1ml；[0055](2)设置空白对照组和血小板对照组，每孔1ml；37℃，5％co2细胞培养箱中孵育12h；[0056](3)收集各组细胞，20℃，1000rpm离心5min，弃上清；用预冷的pbs洗涤，4℃，1000rpm离心5min，弃上清；洗涤，4℃，3000rpm离心10min，弃上清，重悬于1ml 1×binding buffer。[0057](4)各组取100μl，加入5μlannexin v-fitc混匀，室温避光反应15min，再加入5μlpi混匀，室温避光反应5min。[0058](5)加入300μl pbs稀释体系，于1h内上fcm检测。[0059]图4为不同处理组u266细胞的凋亡情况，青蒿琥酯-硼替佐米脂质体组诱导u266的凋亡效应高于单药脂质体组。[0060]本发明中青蒿琥酯-硼替佐米脂质体组的肿瘤杀伤效果更强，cck-8和流式实验证实青蒿琥酯-硼替佐米脂质体组抑制肿瘤生长和促进肿瘤细胞凋亡的效果更显著。在与对照组的比较中，青蒿琥酯-硼替佐米脂质体较单药脂质体对肿瘤细胞的增殖抑制作用和凋亡促进作用更显著，这得益于脂质体在包裹两个协同作用药物后对肿瘤细胞的作用的加大优势，使得药物在肿瘤细胞蓄积并有效释放。[0061]青蒿琥酯-硼替佐米脂质体，保留青蒿琥酯、硼替佐米本身的抗肿瘤效应，靶向肿瘤细胞，减轻药物毒副作用从而增强硼替佐米的抗多发性骨髓瘤疗效，是一种可发展为实际临床应用的纳米技术。









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