一种头孢曲松钠蛋白结合率的检测方法与流程 专利技术说明

测量装置的制造及其应用技术1.本发明属于药物蛋白结合率的检测技术领域，具体涉及一种头孢曲松钠蛋白结合率的检测方法。背景技术：2.头孢曲松钠是第三代头孢菌素类抗生素，国家基本药物，其注射用粉针剂在临床上被广泛应用，目前部分厂家的注射用头孢曲松钠存在起效时间晚的问题。3.本领域公知，药物与人血浆内蛋白的结合率影响药物的吸收和分布，蛋白结合率高的药物其起效时间慢，进而影响药物的药效学行为，因此，不同厂家头孢曲松钠血浆蛋白结合率的差异可能是导致起效差异的主要原因之一。因此，头孢曲松与蛋白的结合率可以作为治疗药物检测及保证药品起效时间一致性的重要参数。4.cn112684075a中公开了一种液质联用结合超滤法测定美罗培南或亚胺培南的血浆蛋白结合率，将液相色谱串联质谱检测技术与超滤法相结合，分别测定血浆中美罗培南或亚胺培南的总浓度，以及超滤液中药物的游离浓度。在处理样本时加入了mops稳定剂，解决了药物稳定性差的问题，进而使测定结果更加准确。可快速、高通量测定药物的蛋白结合率，尤其适用于不稳定的药物分子。但其缺陷在于：一是没有考虑超滤管对药物的吸附作用；二是测定游离药物浓度时，离心时间过长，造成在离心过程中游离药物被过滤后，药物与蛋白结合的平衡被打破，在离心过程中会有一部分已结合的药物再解离成游离药物。技术实现要素：5.为实现对头孢曲松钠蛋白结合率进行检测的目的，本发明的发明人基于对本领域的研究，并经过大量的实验摸索，提供了一种头孢曲松钠蛋白结合率的检测方法，该方法易于操作，可将不同蛋白结合率的药品进行有效区分。6.具体来说，本发明提供了如下技术方案：7.一种头孢曲松钠蛋白结合率的检测方法，包括以下步骤：8.(1)取头孢曲松钠原料药配制头孢曲松钠储备液；取人血清白蛋白配制人血清白蛋白储备液；9.(2)取一定量的头孢曲松钠储备液和一定量的人血清白蛋白储备液进行混合，在34～40℃下孵育一定时间，然后用离心式过滤器超滤，收集滤过液作为供试品溶液。10.首先，本发明采用体外测定方法预测结合率，选取血浆中含量最高的人血清白蛋白(hsa)代表体内血浆蛋白进行结合率的研究，hsa的浓度采用近似人体内浓度(5×10-4mol·l-1)。11.其次，由于分子型药物血浆蛋白结合率高于离子型药物，故不同成盐率的头孢曲松因其药物的存在形式存在差异会导致药物蛋白结合率的不同，为了避免分离与hsa结合的头孢曲松和游离态的头孢曲松的过程中，ph值等因素的变化导致头孢曲松钠成盐率改变，从而蛋白结合率的检测结果与真实结果出现偏差。本发明采用离心式过滤器超滤将与hsa结合的头孢曲松和游离态的头孢曲松在较短的时间内分离，本发明发现，该分离的过程由于不受ph值等因素的干扰，从而保证了在整个实验过程中不同成盐率的样品仍可保持其自身的成盐状态。12.作为优选，步骤(1)中，采用去离子水作为溶剂配制头孢曲松钠储备液和人血清白蛋白储备液。13.作为优选，步骤(2)中，所述离心式过滤器的截留分子量为30000。本发明发现，用上述分子量范围截断的离心式过滤器超滤，可明显减小离心过滤器对头孢曲松钠的吸附，提高检测结果的准确性。14.作为优选，步骤(2)中，所述离心式过滤器为merck公司的merck ultracel。15.作为优选，步骤(2)中，所述离心式过滤器的转速为25000rpm，离心时间为90s。本发明发现，转速过低或离心时间过低，会导致样品溶液无法完全滤过，影响实验结果，在上述条件下，可保证在短时间内将溶液全部滤过，检测结果更加准确。16.作为优选，步骤(2)中，按头孢曲松钠和人血清白蛋白的摩尔比为1:1，取一定量的所述头孢曲松钠储备液和一定量的所述人血清白蛋白储备液进行混合。本发明发现，在上述摩尔比下，可以准确比较不同厂家注射用头孢曲松钠结合率的差异，如果头孢曲松钠：人血清白蛋白为2:1，则头孢曲松钠未完全结合，如果头孢曲松钠：人血清白蛋白为1:2，则结合率过高，不易于比较差异。17.作为优选，步骤(2)中，在37℃下进行所述孵育，从而保证实验的重现性好。18.作为优选，还包括以下步骤：19.(3)取与步骤(2)等量的头孢曲松钠储备液，用离心式过滤器超滤，收集滤过液作为对照品溶液，备用；20.(4)将所述供试品溶液和所述对照品溶液在预设的液相色谱条件下分别进行，再根据以下公式计算头孢曲松钠蛋白结合率：[0021][0022]其中，a供试品为供试品溶液中头孢曲松峰面积，a对照品为对照品溶液中头孢曲松峰面积。[0023]进一步优选的，步骤(3)中，采用与步骤(2)中相同的方法进行离心式过滤器超滤，从而避免外在条件影响结合率的准确度。[0024]在一种具体的实施方式中，步骤(4)中，所述预设的液相色谱条件中，[0025]色谱柱：capcell pak c18 mgⅱ，规格为150mm×4.6mm，5μm；[0026]流动相：体积比为73:27的流动相a和流动相b构成的混合溶液，所述流动相a为0.01～0.03％的正辛胺溶液，用磷酸溶液调节ph值至6.5，所述流动相b为乙腈；[0027]流速：1.0ml/min。[0028]直接以峰面积进行检测的过程中会因仪器、检测条件的变化等峰面积发生较大的变化，供试品溶液和对照品溶液在同一仪器、同一条件下进行进样，有利于准确地进行检测。[0029]本发明具有如下有益效果：[0030]1)本发明的提供的一种头孢曲松钠蛋白结合率的检测方法，步骤简单、易于操作，可将不同蛋白结合率的药品进行有效区分；[0031]2)本发明的提供的一种头孢曲松钠蛋白结合率的检测方法，可以用于比较不同生产厂家的产品的蛋白结合率，准确性高、重现性好。附图说明[0032]图1为头孢曲松钠在37℃下水浴不同时间后的色谱图；其中，纵坐标为响应值(单位au)，横坐标为时间(单位分钟)，出峰时间为16.486。[0033]图2为头孢曲松-hsa混合溶液经离心式过滤器超滤前后的色谱图对比；其中，纵坐标为响应值(单位au)，横坐标为时间(单位分钟)，上色谱图为未经离心式过滤器超滤的溶液色谱图，下色谱图为经离心式过滤器超滤后的滤液色谱图。[0034]图3为样品经部分离心过滤器超滤后存在未知峰的色谱图；其中，纵坐标为响应值(单位mau)，横坐标为时间(单位分钟)。具体实施方式[0035]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。[0036]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中，加入的各原料除特别说明外，均为市售常规原料。[0037]实施例1[0038]本实施例涉及一种头孢曲松钠蛋白结合率的检测方法，[0039]1、仪器：[0040]uplc，waters acquity[0041]hplc-pda，waters2695-2996[0042]ultra超滤离心管，merck，配有ultracel-30滤膜的amicon ultra-0.5离心式过滤器。[0043]2、试剂：[0044]人血清白蛋白(hsa)：albumin human≥96％，sigma，lot:slbt3708；[0045]超纯水，乙腈(色谱级)fisher chemical，99.99％，lot 190262[0046]正辛胺:(octylamine)aldrich o05802-100g，99％，lot#stbf6957v。[0047]3、具体操作步骤：[0048](1)称取hsa约660mg于10ml容量瓶中，加水使溶解后稀释至刻度，作为hsa储备液；称取16.3mg头孢曲松钠于25ml容量瓶中，加水使溶解后稀释至刻度作为头孢曲松钠储备液；[0049](2)精密量取上述储备液各1.0ml于同一10ml顶空瓶中混合，37℃水浴10min，精密量取250μl至离心式过滤器merck ultracel-30k中，25000rpm下离心90s，收集滤过液作为供试品溶液；[0050](3)精密量取头孢曲松钠储备液1.0ml于10ml顶空瓶中，加1.0ml水，同步骤(2)方法进行离心式过滤器超滤，收集滤过液作为头孢曲松对照溶液；[0051](4)将所述供试品溶液和所述对照品溶液分别精密量取150μl于进样小瓶中，在预设的液相色谱条件下分别进样，再根据以下公式计算头孢曲松钠蛋白结合率：[0052][0053]其中，a供试品为供试品溶液中头孢曲松峰面积，a对照品为对照品溶液中头孢曲松峰面积。[0054]其中，所述预设的液相色谱条件中，[0055]色谱柱：capcell pak c18 mgⅱ，规格为150mm×4.6mm，5μm；[0056]流动相：体积比为73:27的流动相a和流动相b构成的混合溶液，所述流动相a为0.02％的正辛胺溶液，用磷酸溶液调节ph值至6.5，所述流动相b为乙腈；[0057]流速：1.0ml/min；[0058]进样量：10μl；[0059]检测波长：254nm。[0060]试验例方法验证[0061]1、头孢曲松钠加热稳定性[0062]配制2×10-5mol·l-1头孢曲松钠水溶液，分别于37℃水浴30min和50min，采用实施例1的hplc方法，进样量70μl，测定其峰面积，检测结果见图1(图1是水浴不同时间点的图谱横坐标错开一些的比较，可以看得更清楚，实际出峰时间是一致的)，峰面积大小如表1，说明头孢曲松在37℃水浴中较为稳定。[0063]表1水浴不同时间点头孢曲松峰面积[0064][0065]2、离心过滤方法的确认[0066]采用超高效液相色谱(uplc)方法，对未经离心式过滤器超滤的头孢曲松-hsa混合溶液及离心式过滤器超滤后的供试品溶液过分别进行分析。uplc方法：色谱柱为acquity uplc protein beh sec 1.7μm,(4.6×150mm)；流动相为0.1mol·l-1ph 7.0磷酸盐缓冲液；流速为0.5ml·min-1；进样量50μl；检测波长220nm。离心条件：转速15000rpm、保持10s，离心及未离心样品色谱图如图2所示，图中可以看出，在此离心条件下，滤液中已无白蛋白。故可认为在15000rpm转速以上均可使白蛋白完全去除(在此转速条件下可保证足够短的离心时间，从而不易发生结合药物的解离)。[0067]因离心过滤器为500μl规格，故加入的溶液的量不宜过多，实验中发现300μl及以上体积的溶液经离心后在滤液中仍有白蛋白，原因可能是溶液过多在离心的过程中从过滤器外部流入下层过滤管中。故在实验中，本发明将离心过滤体积确定为250μl。[0068]3、离心过滤器的选择[0069]比较0.5ml不同品牌的离心过滤器的过滤结果，包括pall nanosep 30k omega、sartorius 2000mwco hy、merck ultracel-30k。结果除merck ultracel-30k外，其余两个品牌的离心过滤器，样品过滤后，经hplc分析时，在头孢曲松主峰后均会出现一未知峰，不同离心过滤器，所出的未知峰峰面积大小不一，如图1所示，这可能是由于离心过滤器中某种小分子物质在离心过滤的过程中，被溶液洗脱下来造成的，故优选没有未知峰的merck ultracel品牌作为实验用离心过滤器，实验结果更准确。[0070]进一步的，比较了merck ultracel-3k，merck ultracel-10k，merck ultracel-30k三种不同过滤分子量的离心过滤器，比较对同一批样品的过滤效果，供试品溶液及对照品溶液中头孢曲松峰面积、结合率结果见表2，由表2可知，不同过滤分子量的离心过滤器对结合率结果影响并不明显，但从样品溶液和对照溶液过滤后峰面积可看出(表2)，分子量越小的离心过滤器对头孢曲松钠的吸附越大，为保证结果的准确性，优选30k的离心过滤器。[0071]表2不同分子量离心过滤器过滤结果[0072][0073]4、离心转速及时间的考察[0074]考察不同离心转速(15000、18000、23000及25000rpm)和离心时间对溶液过滤的影响，发现在25000rpm转速以下的样品溶液均无法完全滤过，在上层滤管中会有部分溶液残留，这会对实验的重复性产生影响，为了在短时间内将溶液全部滤过，经过实验发现，离心转速为25000rpm，离心时间为90s的条件下，可保证全部溶液滤过。[0075]5、重复性考察[0076]5.1头孢曲松钠离心的重复性[0077]配制5×10-4mol·l-1头孢曲松钠水溶液，分别精密量取250μl置于5个离心式过滤器中，25000rpm下离心90s，比较5份的峰面积差异，同时测定未离心的头孢曲松峰面积，结果见表3，由结果可知，本发明方法重复性较好。离心和未离心头孢曲松色谱峰面积存在较小差异，说明过滤器中滤膜虽对头孢曲松钠有吸附(吸附率0.40％)，但吸附的量极小，在实验中对单独的头孢曲松钠也进行同法离心过滤操作作为对照可增加准确性。[0078]表3头孢曲松钠离心重复性[0079][0080]5.2头孢曲松、hsa混合溶液结合反应、过滤操作的重复性[0081]称取hsa约660mg于10ml容量瓶中，加水使溶解后稀释至刻度，作为hsa储备液，称取16.3mg头孢曲松钠于25ml容量瓶中，加水使溶解后稀释至刻度作为头孢曲松钠储备液，精密量取上述溶液各1.0ml于10ml顶空瓶中，37℃水浴10min，精密量取250μl至30k离心式过滤器中，25000rpm，离心90s，精密量取滤过液150μl于进样小瓶中。平行制备5份样品，进样，考察峰面积差异。另精密量取头孢曲松钠储备液1.0ml于10ml顶空瓶中，加1.0ml水，同法离心，作为对照品溶液，取10μl进样。结果见下表4，由结果可知，本发明提供的检测方法重复性好。[0082]表4方法的重复性[0083][0084]5.3日间精密度[0085]采用实施例1的检测方法一日分3个不同时间分别进行，考察重复性，结果见下表：[0086]表5日间精密度[0087][0088]6、线性[0089]配制不同浓度的头孢曲松钠溶液，经离心超滤后色谱检测，考察线性，结果见下表，线性方程r2为0.999995，说明线性关系良好。[0090]表6线性[0091][0092]7、不同浓度比的头孢曲松-hsa结合率的差异比较(hplc法)[0093]称取hsa约660mg于10ml容量瓶中，加水使溶解后稀释至刻度，作为hsa储备液，称取16.3mg头孢曲松钠于25ml容量瓶中，加水使溶解后稀释至刻度作为头孢曲松钠储备液。量取hsa储备液1.0ml，头孢曲松钠储备液0.5ml，水0.5ml于10ml顶空瓶中，作为hsa：头孢曲松2：1的溶液；量取hsa储备液1.0ml，头孢曲松钠储备液1.0ml于10ml顶空瓶中，作为hsa：头孢曲松1：1的溶液；称取32.6mg头孢曲松钠于25ml容量瓶中，加水使溶解后稀释至刻度作为头孢曲松钠储备液1，量取hsa储备液1.0ml，头孢曲松钠储备液1 1.0ml于10ml顶空瓶中，作为hsa：头孢曲松1：2的溶液，每种比例溶液各配制2份，37℃水浴后离心过滤，计算结合率。结果见表7，由结果可知，不同比例的头孢曲松和hsa，其结合率也不相同，hsa越多，结合率越高。故需要在固定蛋白与药物的比例下比较药物的结合率。在本实验中，比较的是白蛋白与头孢曲松钠摩尔比为1:1条件下的结合率。[0094]表7不同摩尔比hsa和头孢曲松结合率结果[0095][0096]8、不同ph值的影响[0097]分别采用不同ph值的缓冲液(磷酸盐缓冲液：ph6.5、7.0和7.6)溶解注射用头孢曲松钠得到头孢曲松钠储备液，再以该头孢曲松钠储备液分别制备供试品溶液及对照品溶液，每个ph条件下平行做2份，进行结合率的测定，结果见表8，不同ph条件下，所得样品的结合率略有不同，佐证了头孢曲松钠在不同ph值的溶液中成盐形式不同，造成结合率改变，故本发明中采用纯化水作为溶剂，保证溶液ph的稳定，保持了样品本身的酸碱性。[0098]表8不同ph值溶液结合率结果[0099][0100]9、不同反应时间的影响(hplc法)[0101]考察37℃下不同水浴时间对蛋白结合率的影响，水浴时间分别为0、10、20、30和60分钟，取两份样品进行实验。[0102]未水浴及不同水浴时间的蛋白结合率如表9所示，由结果可知，不同水浴时间得到的蛋白结合率没有明显差异，为保证实验条件的稳定，本发明将水浴时间定为10min。[0103]表9不同水浴时间结合率结果[0104][0105]10、不同药物结合率差异[0106]采用实施例1的检测方法对2批不同厂家的注射用头孢唑林钠的蛋白结合率进行测定，结合率结果见下表，由表中数据可知，注射用头孢唑林钠结合率约为20％，小于注射用头孢曲松钠，这与文献报道的结果一致，说明此方法可将不同结合率的药品进行准确区分。[0107]表10注射用头孢唑林钠结合率结果[0108][0109]11、对不同厂家注射用头孢曲松钠样品检验结果[0110]表11样品检验结果[0111][0112]虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。









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