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一种多级结构的氧化铈微纳颗粒的制备方法及其在小分子代谢物检测与鉴定中的应用 专利技术说明

作者:admin      2022-11-23 13:40:06     345

测量装置的制造及其应用技术1.本发明涉及材料合成和分析检测技术领域,尤其涉及一种多级结构的氧化铈微纳颗粒的制备方法及其在小分子代谢物检测与鉴定中的应用。背景技术:2.代谢分析技术,特别是质谱技术,在临床应用中发挥着不可替代的作用,包括但不限于诊断和预后。值得注意的是,传统的质谱技术方法需要通过复杂的样本预处理过程(例如,去盐、去除高丰度蛋白、色谱方法)对样品进行严格的处理才能实现代谢产物的高效分析。激光解吸电离质谱提供了一种很有前景的解决方案,具有高通量和低成本的特点。在这种解决方案中,作为纳米反应器的定制基质材料对于实现有效的激光解吸电离过程至关重要,以实现代谢分析和生物医学用途。目前,为了实现最先进的代谢分析,研究人员一直在努力构建多功能无机纳米粒子纳米反应器。例如,wu等开发了多功能免疫磁性材料,以结合循环肿瘤细胞分离中的稀有细胞捕获和基于激光解吸电离质谱的代谢分析。此外,据报道,多功能铂纳米反应器用于视觉生物标志物检测和基于激光解吸电离质谱的代谢指纹识别。然而,由于目前缺乏先进的激光解吸电离质谱平台,完成多场景临床问题的解决仍然是该领域的一个挑战,特别是在预后预测和生物标志物筛选方面。技术实现要素:3.有鉴于现有技术的上述缺陷,本发明所要解决的技术问题是提供一种多级结构的氧化铈微纳颗粒的制备方法及其在小分子代谢物检测与鉴定中的应用。4.为实现上述目的,本发明提供了一种多级结构的氧化铈微纳颗粒的制备方法,包括如下步骤:5.步骤1、模板3-氨基苯酚-甲醛球的制备;扩展的方法适用于制备粒径均匀的球形apf树脂:6.在氨水溶液、去离子水和乙醇的混合溶液中加入3-氨基苯酚和甲醛,搅拌得到混合物;然后,将所述混合物转移到高压反应釜中,进行水热反应;自然冷却至室温后,通过离心获得所述球形apf树脂,分别用水和乙醇洗涤,在烘箱中干燥备用;7.步骤2、氧化铈在apf上生长得到apf-ceo2:8.将合成的所述球形apf树脂分散在乙醇中,超声分散,以获得分散良好的apf溶液;将六水合硝酸铈和六亚甲基四胺溶解在去离子水中,然后与所述apf溶液混合;将混合溶液搅拌;通过离心终止反应并用乙醇和水分别洗涤后,在烘箱中干燥获得所述apf-ceo2备用;9.步骤3、去除apf模板获得多级结构的氧化铈微纳颗粒:10.制备的所述apf-ceo2在马弗炉中加热,获得所述氧化铈微纳颗粒。11.进一步地,所述氧化铈微纳颗粒为多级结构,且表面褶皱的空心结构,直径约为350纳米。12.进一步地,步骤2中,将所述混合溶液在室温下搅拌2小时,然后在75下℃再搅拌4小时。13.本发明提供上述的氧化铈微纳颗粒在小分子代谢物检测中的应用,包括如下步骤:14.步骤a、尿液样本用去离子水稀释后,点涂在靶板上,自然干燥;15.步骤b、将所述氧化铈微纳颗粒分散在去离子水中形成基质溶液,覆盖点涂于步骤a中点涂所述尿液样本的靶板上,制得待检测样本;16.步骤c、对所述待检测样本的指纹图谱进行maldi质谱检测;17.步骤d、对所述maldi质谱检测结果进行分析,得出结论。18.进一步地,所述尿液样本中的生物小分子包括糖类、氨基酸。19.进一步地,步骤c中,所述maldi质谱检测采用反射模式,正离子检测,检测范围设为100-400da。20.进一步地,步骤a中,所述尿液样本需用所述去离子水稀释5倍,取1微升点涂在所述靶板上。21.进一步地,步骤b中所述基质溶液的浓度为1mg/ml。22.本发明还提供上述的氧化铈微纳颗粒在小分子代谢物鉴定中的应用,包括如下步骤:23.步骤a、将1mg/ml半胱氨酸与对苯二酚等摩尔比混合;24.步骤b、将所述氧化铈微纳颗粒分散在去离子水中形成浓度为1mg/ml的基质溶液;25.步骤c、样本制备采用三明治点样,点涂1微升1mg/ml所述基质溶液后自然干燥;覆盖点涂1微升步骤a中混合样本后自然干燥;最后再覆盖点涂1微升1mg/ml所述基质溶液后自然干燥,即为待源内鉴定样本;26.步骤d、对所述待源内鉴定样本的指纹图谱进行maldi质谱检测;27.步骤e、对所述maldi质谱检测结果进行分析,得出结论。28.进一步地,步骤d中,所述maldi质谱检测采用反射模式,正离子检测,检测范围设为100-400da。29.与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:30.本发明合成的氧化铈微纳颗粒基质制备成本低,合成步骤简单,将该微纳颗粒作为质谱中的基质材料,可以解决传统有机基质存在的问题,例如小分子区段的背景干扰和热点效应。此外,本发明中,尿液样本仅需要稀释,无需复杂的样本预处理过程,本发明的检测方法无创、检测通量高、灵敏度高、成本低,满足了临床上对代谢指纹图谱的获取需求,实现诊断、预后、生物标志物筛选等临床应用,并且在对生物体生长发育以及致病机理等过程进行代谢组学水平的深入解读方面具有重大应用潜力。31.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。附图说明32.图1是本发明制备得到的氧化铈微纳颗粒的sem表征图片;33.图2是本发明用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测尿液小分子量端的质谱图;34.图3是本发明用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱实现髓母细胞瘤患者临床预后预测的结果示意图;35.图4是本发明用于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测实现含巯基小分子的筛选鉴定示意图。具体实施方式36.以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例,使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现,本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。37.实施例一氧化铈微纳颗粒基质的制备38.氧化铈微纳颗粒基质的制备方法包括如下步骤:39.步骤1、模板3-氨基苯酚-甲醛(apf)球的制备;扩展的方法适用于制备粒径均匀的球形apf树脂:40.具体地,在氨水溶液(0.5ml)、去离子水(100ml)和乙醇(40ml)的混合溶液中加入3-氨基苯酚(2g)和甲醛(2.8ml),在30℃下搅拌24小时;然后,将混合物转移到高压反应釜中,水热温度为100℃,反应24小时;自然冷却至室温后,通过离心获得所需apf,分别用水和乙醇洗涤3次,60℃烘箱干燥备用。41.步骤2、氧化铈在apf上的生长(apf-ceo2):42.将200mg步骤1.1中合成的apf树脂球分散在30ml乙醇中,超声分散至少30分钟,以获得分散良好的apf溶液;将0.065g六水合硝酸铈和0.065g六亚甲基四胺(hmt)溶解在30ml去离子水中,然后与apf溶液混合;将混合溶液在室温下进一步搅拌2小时,然后在75℃下再搅拌4小时;通过离心终止反应并用乙醇和水分别洗涤3次后,通过在80℃烘箱中干燥获得apf-ceo2样本备用;43.步骤3、去除apf模板获得多级结构的氧化铈微纳颗粒:44.制备的apf-ceo2样本在马弗炉中使用5℃/min的加热速率加热至450℃,并在450℃下放置2小时,获得多级结构的氧化铈微纳颗粒。45.对制备得到的氧化铈微纳颗粒基质,采用nercn-tc-006场发射扫描电子显微镜获取扫描电镜结果,如图1所示。46.由图1可知,所制备的氧化铈微纳颗粒直径在350纳米左右,从图1的扫描电镜结果中可以看到合成的氧化铈微纳颗粒基质大小均匀,表面粗糙。47.实施例二:基于多级结构的氧化铈微纳颗粒的尿液中小分子代谢物的检测48.基于多级结构的氧化铈微纳颗粒尿液中小分子代谢物的检测步骤如下:49.步骤a、尿液样本需用去离子水稀释5倍,取1微升点涂在靶板上,自然干燥;50.步骤b、将氧化铈微纳颗粒分散在去离子水中形成浓度为1mg/ml的基质溶液,覆盖点涂,制得待检测样本;51.步骤c、对待检测样品进行基于激光解吸电离质谱的代谢指纹图谱检测;其中质谱检测采用反射模式,正离子检测,检测范围设为100-400da,具体参数为:激光波长355nm,激光频率2khz;加速电压为20kv,延迟提取的重复率为1khz;延迟时间为150ns;每次分析叠加2000次的激光照射。52.步骤d、对质谱检测结果进行分析,得出结论,其检测结果如图2所示。53.从图2可知,本发明可高效、快速的检测分析尿液样本中的小分子物质,这种检测方法完全无创、灵敏度高、成本低、检测通量高,满足了临床中对代谢组小分子物质进行高通量指纹图谱的获取需求。54.实施例三:基于多级结构的氧化铈微纳颗粒的髓母细胞瘤患者的预后预测分析55.基于多级结构的氧化铈微纳颗粒的髓母细胞瘤患者的预后预测分析步骤如下:56.步骤a)、依据实施例二中步骤采集待分析病人尿液样本的代谢指纹;57.步骤b)、将病人分为训练集和验证集;58.步骤c)、在spss上使用比例风险回归模型在训练集上对代谢指纹信号进行多因素回归分析,并设置参数p值的阈值为0.05,得到所有代谢特征对应系数,由每个特征与系数乘积加和构成代谢预后评分,作为每个样本的代谢风险评分;59.步骤d)、以训练集样本的代谢预后评分中位数为阈值,将所有样本分为高风险组和低风险组;60.步骤e)、在orange 3.25.0软件上进行生存分析,研究训练集和验证集高风险组和低风险组之间的无进展生存差异情况,其分析结果如图3所示。61.由图3可知,我们发明的基于多级结构的氧化铈微纳颗粒可以实现基于激光解吸电离质谱的尿液代谢指纹分析并且可以根据代谢特征实现对髓母细胞瘤患者预后预测的分析,有助于对病人实现代谢危险分层,指导个性化医疗。62.实施例四:基于多级结构的氧化铈微纳颗粒的含巯基小分子代谢物鉴定中的应用63.步骤a、将1mg/ml的半胱氨酸与对苯二酚等摩尔比混合;64.步骤b、将氧化铈微纳颗粒分散在去离子水中形成浓度为1mg/ml的基质溶液;65.步骤c、样本制备采用三明治点样,点涂1微升1mg/ml基质溶液后自然干燥;覆盖点涂1微升步骤a中混合样本后自然干燥;最后再覆盖点涂1微升1mg/ml基质溶液后自然干燥,即为待源内鉴定样本;66.步骤d、对待源内鉴定样本进行基于激光解吸电离质谱的代谢指纹图谱检测;其中质谱检测采用反射模式,正离子检测,检测范围设为100-400da,具体参数为:激光波长355nm,激光频率2khz;加速电压为20kv,延迟提取的重复率为1khz;延迟时间为150ns;每次分析叠加2000次的激光照射;67.步骤e、对质谱检测结果进行分析,得出结论,其检测结果如图4所示。68.由图4可知,该发明可以通过源内加成反应实现对巯基小分子的特异性识别鉴定,巯基小分子的特异性迁移峰的存在,可以实现复杂样本中巯基小分子的指认,对代谢小分子的精准鉴定至关重要。69.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

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