邻近测定的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术邻近测定1.相关申请交叉引用2.本技术是于2021年1月15日提交的国际申请第pct/us2021/013734号的部分继续申请，并且要求于2020年2月11日提交的美国临时申请第62/975,152号的权益，这两个申请以全文引用的方式并入本文。技术领域3.本发明属于分子生物学和生物技术制造的一般技术领域。更具体地，本发明属于用于定量样品中的分析物的生物技术测定的技术领域。背景技术：4.如治疗性蛋白或免疫原性化合物等生物材料的生物技术制造(或“生物制造”)需要对这些材料进行定量，即使在存在其它细胞组分的复杂混合物的情况下也是如此。许多检测生物组合物或样品中的分析物的存在的测定需要昂贵的试剂和/或不适于对宿主细胞系或其它生物制造组分或过程进行快速、高通量筛选。5.另外，许多通过生物制造产生的生物材料是复杂的，需要多个组分的正确缔合和/或组分的适当折叠以实现功能结构。许多测定仅检测分析物的存在并且不能区分正确折叠的分析物与不正确折叠的分析物或者活性分析物与非活性分析物。6.显然需要能够对分析物并且特别是活性分析物进行高通量检测和定量的经改进的测定。技术实现要素：7.本公开提供了用于检测和定量分析物(如样品中的活性分析物)的测定方法。8.在一些实施例中，所述方法包含：选择具有遗传多样性的宿主细胞群体，所述遗传多样性包含多个遗传变体，其中所述宿主细胞群体中的至少一些宿主细胞包含编码所述分析物的多核苷酸；将包含宿主细胞群体的样品、包含信号供体和第一分析物缔合部分的第一复合物以及包含可激活化合物和第二分析物缔合部分的第二复合物组合，所述宿主细胞群体包含来自所选宿主细胞群体的单个遗传变体，并且其中所述宿主细胞群体表达所述分析物；其中所述样品包括呈所述分析物的活性形式的活性分析物和不呈所述分析物的活性形式的非活性分析物；并且其中所述活性分析物与所述第一复合物和所述第二复合物两者缔合，并且所述非活性分析物不与所述第一复合物和所述第二复合物两者缔合；启动信号从所述第一复合物中的所述信号供体的转移，其中所述信号被所述第二复合物中的所述可激活化合物接收，所述可激活化合物与活性分析物缔合，所述活性分析物与所述第一复合物和所述第二复合物两者缔合；以及检测来自所述可激活化合物的输出。9.在其它实施例中，所述方法包含：选择具有遗传多样性的宿主细胞群体，所述遗传多样性包含多个遗传变体，其中所述宿主细胞群体中的至少一些宿主细胞包含编码所述分析物的多核苷酸；将包含宿主细胞群体的样品与包含信号供体和第一分析物缔合部分的第一复合物以及包含可激活化合物和第二分析物缔合部分的第二复合物组合，所述宿主细胞群体包含来自所选宿主细胞群体的单个遗传变体，并且其中所述宿主细胞群体表达所述分析物；启动信号从所述信号供体到所述可激活化合物的转移，其中所述信号使所述可激活化合物产生可检测输出；以及检测来自所述可激活化合物的所述输出。在一些实例中，所述样品包含呈所述分析物的活性形式的活性分析物和不呈所述分析物的活性形式的非活性分析物，其中所述活性分析物与所述第一复合物和所述第二复合物两者缔合，并且所述非活性分析物不与所述第一复合物和所述第二复合物两者缔合。10.在另外的实施例中，所述方法进一步包含：使所述样品与包括第二可激活化合物和第三分析物缔合部分的第三复合物接触；其中所述信号从所述信号供体到所述第二可激活化合物的所述转移使所述第二可激活化合物产生可检测输出；以及检测来自所述第二可激活化合物的所述输出。11.在其它实施例中，所述方法包含：选择具有遗传多样性的宿主细胞群体，所述遗传多样性包含多个遗传变体，其中所述宿主细胞群体中的至少一些宿主细胞包含编码所述分析物的多核苷酸；提供共价标记的分析物，所述共价标记的分析物包含通过共价键与第一检测试剂连接的所述分析物，所述第一检测试剂选自由信号供体和可激活化合物组成的组；使包含宿主细胞群体的样品与所述共价标记的分析物以及与第二检测试剂连接的分析物缔合部分接触，所述宿主细胞群体包含来自所选宿主细胞群体的单个遗传变体，并且其中所述宿主细胞群体表达所述分析物，所述第二检测试剂选自由信号供体和可激活化合物组成的组，其中所述第一检测试剂不是所述第二检测试剂；启动信号从所述信号供体到所述可激活化合物的转移，其中所述信号使所述可激活化合物产生可检测输出；以及检测来自所述可激活化合物的所述输出。在一些实例中，所述样品包含呈所述分析物的活性形式的活性分析物和不呈所述分析物的活性形式的非活性分析物，其中所述活性分析物与所述第一复合物和所述第二复合物两者缔合，并且所述非活性分析物不与所述第一复合物和所述第二复合物两者缔合。12.在所公开方法的一些实施例中，选择具有遗传多样性并编码所述分析物的所述宿主细胞群体包含：培养宿主细胞群体，由此所述分析物通过所述群体中的所述宿主细胞的亚群表达，所述亚群由此包含表达的宿主细胞；标记所述亚群中的所述表达的宿主细胞中的至少一些表达的宿主细胞，其中所述标记包含使所关注的基因产物与可检测部分缔合，由此产生经标记的表达的宿主细胞；以及选择经标记的表达的宿主细胞的子集，其中所述选择包含通过细胞分选设备检测所述可检测部分。13.在一些实施例中，所述分析物包含多肽、蛋白质、糖蛋白、磷蛋白、蛋白脂质、抗体、包括前述任一项中的一个或多个结构域或片段的多肽以及核酸。在一些实例中，所述分析物是同源多聚体和/或所述分析物具有适当形成的二硫键。在特定实例中，所述分析物是同源多聚体，并且所述第一复合物的所述分析物缔合部分与所述第二复合物的所述分析物缔合部分相同。14.在一些实施例中，所述方法进一步包含使测定组分与第一抗体接触，所述第一抗体与所述测定组分特异性地结合，其中所述测定组分选自由所述分析物和所述分析物缔合部分组成的组。在另外的实施例中，所述方法进一步包含使所述第一抗体与第二抗体接触，所述第二抗体与所述第一抗体特异性地结合。15.在另外的实施例中，所述分析物缔合部分是可在所述分析物上的多个位点处与所述分析物相互作用的多聚体。16.在一些实施例中，所述分析物缔合部分与检测试剂连接，所述检测试剂选自由信号供体和可激活复合物组成的组。在实例中，所述分析物缔合部分通过接头(connector)(如多肽连接子(linker)和/或结合对)与所述检测试剂连接。17.在另外的实施例中，所述信号供体通过酶激活和/或所述信号供体通过照射激活。在一些实例中，所述信号供体产生荧光共振转移信号和/或所述信号供体产生化学信号。在一个实例中，所述化学信号是反应性氧物种。在其它实施例中，所述信号供体是敏化剂，如卤代过氧化物酶或光敏剂。在另外的实施例中，所述可激活化合物是可光激活化合物。在一些实例中，可光激活化合物通过荧光发射光。在其它实例中，所述可光激活化合物与单线态氧发生化学反应。18.在一些实施例中，所述方法进一步包含测量所述样品的光密度。在其它实施例中，所述方法进一步包含：将与核酸相互作用的化合物添加到所述样品中；照射所述样品以激发与核酸相互作用的所述化合物；以及测量由所激发的化合物发射的所述光。19.在另外的实施例中，至少一种选自由以下组成的组的测定组分与固相载体连接：所述分析物、分析物缔合部分、所述信号供体和所述可激活化合物。在一些实施例中，所述固相载体呈珠的形式。20.在一些实施例中，对所述样品进行另外的测定，并且所述测定选自由以下组成的组：生物层干涉、dna测序、酶联免疫吸附测定(elisa)、免疫荧光染色、亲和色谱法、高效液相色谱法(hp-lc)、液相色谱质谱法(lc-ms)、尺寸排阻色谱法、固相萃取质谱法(spe-ms)和表面等离子体共振。21.本公开的前述特征和其它特征将根据以下参考附图进行的详细描述而变得更加明显。附图说明22.图1是示出与两个分析物缔合部分‘a’和‘b’接触的分析物的示意图，所述分析物缔合部分分别与信号供体和可激活化合物连接。每个分析物缔合部分可以任选地通过‘接头’分子或分子复合物与信号供体或可激活化合物连接。在某些实施例中，信号供体需要启动事件以产生信号。信号供体产生能够激活可激活化合物的信号；如果可激活化合物与信号供体足够邻近以接收信号，那么可激活化合物被激活以产生可以检测到的输出。23.图2是示出与图1中的测定组分配置相同的测定组分配置的示意图，除了在此情况下分析物是抗体之外。对于其中抗原结合结构域识别相同抗原的同源二聚体抗体，分析物缔合部分‘a’和‘b’两者都可以是所述抗原。对于双特异性抗体，分析物缔合部分‘a’和‘b’可以是被抗体识别的不同抗原。24.图3是本发明的替代性测定方法的示意图。在使用仅一个分析物缔合部分与分析物接触的情况下，可以使用竞争性结合测定来检测和定量样品中的分析物。分析物与可激活化合物连接(如所示出的)，或者可替代地与信号供体连接，并且分析物缔合部分分别与信号供体连接(如所示出的)或与可激活化合物连接。分析物通过由阴影条表示的共价连接与可激活化合物(或信号供体)连接，在所展示的实施例中，所述共价连接将任选的接头与分析物共价连接以形成共价标记的分析物。当允许共价标记的分析物和分析物缔合部分缔合时，产生可检测输出，如图1和图2中所描述的。当通过添加共价标记的分析物和其它检测试剂来测定样品中的未标记的分析物时，共价标记的分析物的共价标记将共价标记的分析物与未标记的分析物之间的竞争限制为竞争与分析物缔合部分相互作用，如大阴影箭头所表示的。通过可检测输出的水平的降低来检测样品中的未标记的分析物的存在，所述降低是由未标记的分析物与分析物缔合部分的竞争性缔合引起的，从而使共价标记的分析物解离并且中断由可激活化合物接收信号。25.图4a是方法的特定实施例的示意图，其中抗体用于扩增测定的可检测输出。标记为‘a’和‘b’的小圆圈是分析物缔合部分，每个都通过任选的接头(粗阴影线)与‘a’分析物缔合部分的信号供体(大阴影圆圈)连接，或者与‘b’分析物缔合部分的可激活化合物(大开放圆圈)连接。这是图1和图2中示出的分析物缔合部分、任选的接头、信号供体和可激活化合物的布置的简化版本；此版本没有描绘任何表示从所述信号供体中的每个信号供体传输到可激活化合物的信号的箭头。标记为‘c’的抗体表示分析物。标记为‘d’的抗体是对抗体‘c’具有特异性的抗体，并且标记为‘e’的抗体是对‘d’抗体具有特异性的抗体。通过这些抗体聚集分析物使另外的信号供体和可激活化合物通过其与分析物的缔合而彼此邻近，从而允许多个信号供体传输可以被多种可激活化合物接收的信号，从而导致可检测输出(指向外部的闪电球)的潜在的指数增加。这对于碰巧与仅与信号供体或仅与可激活化合物连接的分析物缔合部分相互作用的同源二聚体分析物特别有用，如此图最右侧部分所示；在这种情况下，分析物的聚集将允许由可激活化合物从近侧信号供体接收信号。26.图4b是方法的具体实施例的示意图，其中通过使分析物(例如，如图4a所示)和分析物缔合部分(在此情况下为抗原)两者多聚化来获得信号增强。这是由于亲合力原理引起的：表观解离常数由于表观解离速率不再基于单个分析物-分析物缔合部分相互作用而降低。图4示出了每个信号供体和可激活化合物与多个分析物缔合部分(分别为‘a’和‘b’)连接。在此情况下，给定分析物缔合部分的表观解离速率现在是多个解离速率的乘积。信号增强来自信号供体邻近可激活化合物的可能性增加。在实际实践中，信号供体和可激活化合物两者都被分析物缔合部分的许多分子包被。27.图5是示出与两个分析物缔合部分‘a’和‘b’接触的分析物的实施例的示意图，所述分析物缔合部分分别与信号供体和第一可激活化合物(可激活化合物1)连接。分析物还与第三分析物缔合部分‘c’接触，所述第三分析物缔合部分与第二可激活化合物(可激活化合物2)连接，所述第二可激活化合物与可激活化合物1不同，但也与信号供体相容。每个分析物缔合部分可以任选地通过‘接头’分子或分子复合物与信号供体或可激活化合物连接。在某些实施例中，信号供体需要启动事件以产生信号。信号供体产生能够激活所述可激活化合物中的每种可激活化合物的信号；如果可激活化合物与信号供体足够邻近以接收信号，那么可激活化合物被激活以产生可以检测到的输出。如果可激活化合物1和可激活化合物2两者都与信号供体足够邻近，那么会产生两个不同的输出。28.图6是示出具有高遗传多样性的宿主细胞群体的示例性工作流的示意图，所述宿主细胞群体用活性特异性细胞富集测定进行筛选，从而产生具有较低遗传多样性的宿主细胞群体。具有较低遗传多样性的宿主细胞群体富集所关注的分析物或所关注的活性。选择具有较低遗传多样性的宿主细胞群体并用本文所公开的邻近测定进行筛选，从而产生具有低遗传多样性的宿主细胞群体，所述宿主细胞群体进一步富集所关注的分析物或活性。进行分析和发酵优化并且鉴定最终“经优化的”品系。29.图7是示出通过本公开的邻近测定定量活性曲妥珠单抗(trastuzumab)(x轴)与在通过蛋白a(proa)(‘proa/sec’，y轴)纯化后通过尺寸排阻色谱法(sec)定量活性曲妥珠单抗之间的相关性的图。曲妥珠单抗是由宿主细胞在一系列使用不同的表达载体、细胞生长条件和诱导条件的实验中产生的。对于这些实验中的每个实验，邻近测定和proa sec用于相同样品上以确定由宿主细胞产生的曲妥珠单抗的量，以克每升发酵培养物(g/l)为单位。图上由三角形标记的点表示总共56个数据点中的三个离群点。当忽略离群点并在剩余点的基础上绘制一条线时，定量方法之间的相关性系数(r)为0.939457。30.序列表31.使用核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写示出本文或随附序列表中所列出的任何核酸和氨基酸序列，如37c.f.r.§1.822中所限定。在至少一些情况下，每个核酸序列只示出了一条链，但是通过对所显示的链的任何参考，互补链被理解为包含在内。32.seqidno:长度：类型：生物体：描述；‘其它信息’1451prt人工序列曲妥珠单抗重链2215prt人工序列曲妥珠单抗轻链315prt人工序列用于共价连接生物素的avitagtm肽具体实施方式33.通过提供本文所描述的测定方法来解决检测和定量生物样品或混合物中的分析物的问题。测定方法包括使用以允许如图1-5图示的检测分析物并且特别是检测活性或完整(例如，完全组装的)分析物的方式与分析物结合的测定组分。在某些实施例中，可以通过与包括已知量的分析物的组合物进行比较来定量分析物。测定组分(也称为检测试剂)包含分析物、一个或多个分析物缔合部分、信号供体、可激活化合物、将一个或多个分析物缔合部分与信号供体或可激活化合物连接的任何接头以及任何另外的组分，如添加以增强测定能力的dna染料。“连接”意指分子之间的非瞬态相互作用，所述非瞬态相互作用可以通过共价键或通过非共价缔合进行。34.在下面的部分i-iv中描述了分析物和测定组分，并且在下面的部分v和vi中描述了测定方法的另外的方面。35.i.分析物36.本发明的测定方法适用于检测能够被一个或多个分析物缔合部分结合的任何类型的分子或分子复合物。分析物的实例包含但不限于肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、核酸、磷蛋白、蛋白脂质、黏附素、抗体、抗原、细胞因子、酶、生长因子、配体、受体、结构蛋白、转录因子、转运蛋白、如肽(肽毒素)等毒素和充当毒素(蛋白毒素)的蛋白质以及其结构域和片段。37.活性分析物能够展示一种或多种活性，如酶活性和/或结合活性(与结合配偶体结合)和/或涉及特定构象变化的活性。分析物的活性形式是通过其组分的正确缔合(如果其不是单一分子)以及其组分的适当折叠来实现的。检测到呈其适当折叠形式的分析物表明所述分析物是活性的。确定分析物是否适当折叠可能涉及使用与适当折叠和活性分析物特异性地结合的抗体：此类抗体与分析物的结合表明分析物是活性的。对于包括一个或多个二硫键的分析物，分析物活性的另一个指示是在正确位置存在适当数量的二硫键，这可以如实例3中所描述的进行确定。对于为酶的分析物，与酶底物或其类似物结合的能力表明分析物具有酶活性。对于为抗体或抗体片段的分析物，与抗原结合的能力表明分析物具有抗原结合活性。38.本发明的某些有利的实施例涉及用于检测和定量分析物的方法，所述分析物是同源多聚体，如同源二聚体、同源三聚体、同源四聚体和更高阶的同源多聚体。对于为同源多聚体的分析物，如在其抗原结合位点中的每个抗原结合位点处与相同抗原结合的同源二聚体抗体，只需要使用一种类型的分析物缔合部分来使信号供体邻近可激活化合物(参见图2)。39.ii.分析物缔合部分40.在本文公开的某些方法中，分析物与两个或更多个分析物缔合部分接触，所述分析物缔合部分中的每个分析物缔合部分与分析物在功能不同的位点处缔合。当分析物为如上文所描述的同源多聚体时，对于分析物缔合部分的多个相同的潜在结合位点，优选地仅使用一种类型的分析物缔合部分与分析物接触。41.在分析物不是同源多聚体并且只有一个分析物缔合部分可用于特定分析物的情况下，可以通过使未标记的分析物与共价标记的分析物竞争并测量来自测定组分的信号的所产生的减少来检测样品中的未标记的分析物的存在，如图3中示意性地示出的。42.优选地，在所提供的方法中使用的每个分析物缔合部分以高度特异性方式与分析物相互作用。在某些方法中，还优选的是，用于与分析物接触的分析物缔合部分中的至少一个分析物缔合部分对分析物的适当折叠具有特异性，并且因此推定分析物的活性形式。非活性分析物可能与分析物的活性形式存在结构差异，并且这些结构差异可以阻止非活性分析物与一种或多种分析物缔合部分之间的缔合，从而使信号可被可激活化合物接收并且不生成可检测输出。对分析物的活性形式具有特异性的分析物缔合部分的实例是抗体和抗体片段分析物的抗原、酶分析物的底物和底物类似物、受体的配体和配体类似物以及对任何分析物的适当折叠形式具有特异性的抗体。例如，对于包括抗原结合位点的分析物，抗原(分析物缔合部分)与分析物的结合需要通过分析物内区(例如，重链可变区和轻链可变区)的适当相互作用形成的抗原结合位点。分析物缔合部分(抗原)与分析物(包括抗原结合位点)之间的成功相互作用可以表明分析物是活性的。进一步地，优选的是，分析物缔合部分以高亲和力和/或亲合力与分析物相互作用，特别是在分析物要在如细胞裂解物等复杂混合物中检测的测定方法中。例如，分析物缔合部分与分析物之间的相互作用应承受与复杂混合物中的其它分子的竞争。43.为了增加由弱结合分析物缔合部分产生的可检测输出，这些部分可以与多于一种接头分子(如生物素)连接，任选地通过如多肽等连接子分子，从而使多于一种信号供体或可激活化合物与弱结合分析物缔合部分连接，所述连接使通过与确实存在的分析物相互作用产生的可检测输出扩增。图4a中示出了使可检测输出扩增的方法的另一个实例，其中抗体用于聚集分析物。此实例具有作为分析物的抗体(图4a中标记为‘c’)，但其适用于任何可以被抗体结合而不会实质上干扰分析物与一个或多个分析物缔合部分之间的相互作用的分析物或分析物缔合部分。对在不同宿主物种中产生的抗体具有特异性的抗体(‘抗物种抗体’)在本发明的此实施例中特别有用。例如，如果抗体‘c’是人抗体或人源化抗体，则抗体‘d’可以是山羊抗人抗体，而抗体‘e’可以是兔抗山羊抗体。只要可以找到合适的抗体，就可以继续使用抗物种抗体来聚集分析物以进行另外的聚集轮次，例如直到获得足够水平的信号为止。然而，可以使分析物或分析物缔合部分多聚化的任何药剂都可以产生亲合力效应。例如，在图4a和4b中，抗体‘d’和抗体‘e’可以被具有适当特异性多聚化特性的非抗体试剂替代。44.对于以低亲和力与分析物相互作用的分析物缔合部分，可以提高检测反应的整体亲合力。亲合力是两个多价结合配偶体之间相互作用的函数，其中在多个结合位点处结合的能力增加了结合相互作用的整体强度。如果一个结合配偶体不是多价的，但可以通过多聚化有效地变成多价的，那么这可能导致结合配偶体之间的相互作用的亲合力显著高于与所述结合配偶体的单体形式相互作用的亲和力。作为实例，分析物缔合部分与足够多价的分析物发生弱相互作用，以具有超出与信号供体连接的分析物缔合部分和可激活化合物连接的分析物缔合部分两者相互作用所需的另外的相互作用位点。在此实例中，弱相互作用分析物缔合部分(任选地包含多聚体的亚基之间的连接子分子)的多聚化可以使分析物缔合部分在分析物上的多个位点处相互作用以获得更强的整体相互作用，如图4b中所示。这种通过多聚化增加分析物缔合部分的结合强度的方法可以与用于扩增测定的可检测输出的方法组合，如图4a中示出的。45.在另外的实施例中，所述方法包含第二可激活化合物和至少一种与图1、图2和图4中所示的实施例中描述的分析物缔合部分‘a’和‘b’不同的另外的分析物缔合部分(如第三分析物缔合部分)。在添加第三分析物缔合部分(图5中的分析物缔合部分‘c’)的情况下，可以检测分析物上的另外的结合位点的存在。因此，在一些实例中，此方法可以用于检测完整的分析物，如完全组装的多聚体分析物。与分析物缔合部分缔合的可激活化合物由相同的信号供体激活，但具有可区分输出。因此，可以通过检测来自与分析物缔合部分‘b’和‘c’缔合的可激活化合物中的两种可激活化合物的输出的存在来鉴定与分析物缔合部分‘a’的结合位点非常邻近的分析物缔合部分‘b’和‘c’的结合位点中的两个结合位点的存在。在一个非限制性实例中，分析物是抗体，并且在此情况下，分析物缔合部分‘a’和‘b’与抗原结合位点结合，并且分析物缔合部分‘c’与fc结构域结合。46.iii.接头47.在本文提供的测定方法中，每个分析物缔合部分与信号供体或可激活化合物连接，使得分析物缔合部分与分析物的缔合将使信号供体和可激活化合物邻近，从而产生可检测输出。分析物缔合部分与信号供体或可激活化合物之间的连接可以是直接共价连接。在一些情况下，分析物缔合部分(即抗原、配体、底物、底物类似物、抗体等)作为具有信号供体或可激活化合物的缀合物可商购获得。48.通常有必要或期望通过一些类型的‘接头’将分析物缔合部分与信号供体或可激活化合物连接，例如，如图1和图2中示意性地示出的。优选的是，每个接头分子的大小与信号供体和与分析物邻近的可激活化合物相容。作为一种类型的接头的实例，分析物缔合部分和信号供体或可激活化合物可以通过连接子分子共价连接。连接子分子的实例是用于连接两个其它多肽的多肽。49.作为另一个实例，分析物缔合部分可以通过分析物缔合部分与结合对中的一个成员的共价连接以及信号供体和可激活化合物与结合对中的另一个成员的共价连接与信号供体或可激活化合物连接。优选地，结合对彼此特异性地相互作用，并且优选地具有高亲和力和/或亲合力。结合对的实例包含生物素和链霉亲和素或亲和素、聚组氨酸和镍离子(特别是ni2+)或钴离子(特别是co2+)、抗原结合结构域和其抗原、以及配体和其受体结构域。结合对的另一个实例是spytag-spycatcher对。spytag是由13个氨基酸构成的肽，所述肽通过12.3kda spycatcher蛋白结合，从而产生共价分子间异肽键。50.使用结合对将分析物缔合部分与信号供体或可激活化合物连接是方便的，因为其允许与结合对中的一个成员共价连接的信号供体或可激活化合物与和结合对中的另一个成员共价连接的任何分析物缔合部分连接。在一些情况下，分析物缔合部分作为具有结合对中的成员(如生物素)的缀合物可商购获得。在此类缀合物不可商购获得的情况下，可以将结合对中的成员(如生物素)与分析物缔合部分缀合；可从赛默飞世尔科技公司(thermofisher scientific)(马萨诸塞州沃尔瑟姆)获得生物素化试剂盒(如ez-linktm磺基-nhs-生物素化试剂盒)和方案。可替代地，分析物缔合部分可以以在其结构中包含结合对中的成员的方式产生，例如通过包含avitagtm肽(seq id no:3；科罗拉多州奥罗拉亲合力公司(avidity,aurora,colorado))，当在宿主细胞中表达时，所述肽是通过分析物缔合部分的多肽序列中的生物素连接酶或聚组氨酸序列或spytag氨基酸序列生物素化的靶标。51.iv.信号供体和可激活化合物52.a.信号供体：信号供体是能够向可激活化合物提供信号的化合物。信号供体包含产生如反应性氧物种等化学信号、或荧光共振转移信号或可以被可激活化合物接收以触发可激活化合物激活的任何其它信号的化合物。53.在某些实施例中，信号供体需要启动事件以产生信号，例如，如图1-3所示。其它实施例包含可以在没有启动事件(例如，来自放射性材料的颗粒和/或光子的自发辐射)的情况下生成信号的信号供体。启动事件可以是信号供体的酶促激活，如荧光素酶对荧光素的激活或以某些波长照射信号供体，所述照射使信号供体产生信号。当启动事件使信号供体转变到能量更高的激发态时，启动事件被称为‘激发’。54.可以用于邻近测定的某些信号供体是敏化剂，即可以产生反应性氧物种，优选地单线态氧的分子。敏化剂的实例包含酶和光敏剂。作为敏化剂起作用的酶包含卤代过氧化物酶，所述卤代过氧化物酶通过催化如卤化钠等卤化物化合物与过氧化氢的反应形成单线态氧。光敏剂是可以被激发到亚稳态(通常是三线态)的分子，所述分子在分子氧附近可以直接或间接地将其能量转移到氧分子上，同时将氧激发到通常称为单线态氧的高度反应性的激发态。单线态氧，也称为双氧(单线态)和二氧化烯(dioxidene)，是一种气态无机化学物质，分子式为o＝o；在其4微秒的半衰期内，单线态氧可以在溶液中扩散大约200nm，从而充当由敏化剂信号供体产生的化学信号。55.光敏剂通常将通过吸收光或通过来自合适供体的激发态的能量转移来激发，但也可以通过化学激发、电化学激活或通过其它方式激发。光敏剂的激发通常用来自外部来源的光照射引起。合适的光敏剂通常将在250-1100nm，优选地300-1000nm并且更优选地450-950nm的波长范围内具有最大吸光度，其中在其最大吸光度下的消光系数在500m-1cm-1至100,000m-1cm-1的范围内、或大于500m-1cm-1，优选地至少5,000m-1cm-1并且更优选地至少50,000m-1cm-1。由光敏剂吸收光后产生的激发态(通常是三线态)的寿命在没有氧气的情况下将通常为至少100纳秒，并且优选地为至少1微秒。通常，寿命必须足够长，以允许能量转移到氧气，所述氧气通常以在0.01mm至10mm的范围的浓度存在(取决于介质)。光敏剂的激发态通常将具有与其基态不同的自旋量子数(s)，并且将通常呈三线态(s＝1)，而在通常情况下，基态是单线态(s＝0)。优选地，光敏剂的激发将产生具有至少10％，期望地至少40％并且优选地大于80％的效率的长寿命状态(通常是三线态)。光敏剂在测定条件下通常至多是弱荧光的(量子产率通常小于0.5，优选地小于0.1)。56.光敏剂是相对光稳定的并且不会与如此产生的单线态分子氧有效地反应。在大多数有用的光敏剂中存在若干种结构特征，所述结构特征往往具有至少一个且通常三个或更多个缀合的双键或三键，所述缀合的双键或三键保持处于刚性，通常为芳香族结构。它们通常将含有至少一个基团，如羰基或亚胺基或选自周期表第3-6行的重原子，尤其是碘或溴，或者它们通常将具有聚芳香族结构。典型光敏剂包含：酮类，如二苯甲酮和9-噻吨酮；呫吨，如伊红和玫瑰红；聚芳香族化合物，如巴克敏斯特富勒烯(buckminsterfuller-ene)和9,10-二溴蒽；卟啉，包含如血卟啉和叶绿素等金属卟啉；噁嗪；方酸染料；花菁，如酞菁、萘酞菁和部花青；噻嗪，如亚甲蓝等，并且这些化合物的衍生物被有机基团取代，以使此类化合物更亲脂或更亲水和/或作为连接基团以例如与多核苷酸连接。可以用于本发明的其它光敏剂的实例是那些具有上述特性并在n.j.turro,“分子光化学(molecular photochemistry)”,第132页,纽约w.a.本杰明出版公司(w.a.benjamin inc.,n.y.)1965中枚举的光敏剂。57.b.信号：由信号供体产生的信号优选地直接被可激活化合物接收，但信号也可以通过中间分子或化合物传输到可激活化合物。然而，由可激活化合物对信号的接收应是信号供体和可激活化合物物理邻近的可靠指标，因此使用中间分子或化合物传输信号不应将信号的范围扩展到不与产生信号的信号供体相同的分析物缔合的可激活化合物。由信号供体产生的信号也应很可能在信号产生开始和可激活化合物输出的检测发生的时间帧内仅到达与同一分析物缔合的可激活化合物。如果期望使用产生更广泛分散信号的信号供体，则可以使用测定介质，或者将一种或多种测定组分置于或嵌入在固体介质上或如凝胶等胶体中，其中介质充当信号的部分‘阱(sink)’，从而减少其有效范围。由可激活化合物对信号的接收也优选地对信号供体和可激活化合物的相对朝向不敏感。58.c.可激活化合物：可激活化合物是指在由来自信号供体的信号直接或敏化激发下经历化学、荧光或其它反应的物质。术语“可激活”包含可光激活的、可光化学激活的和可化学激活的。59.可光激活化合物是在激发后发射光的分子，例如通过磷光或更优选地通过荧光。荧光是在通过任何合适的方式激发后的光发射，所述方式包含吸收光、吸收x射线、电化学激发和化学激发。优选地，发射量子产率将是高的，如在0.05至1.0的范围内，并且通常为至少0.1，优选地为至少0.4，更优选地大于0.7，并且最大吸光度的消光系数通常将大于5000m-1cm-1。可光激活化合物通常是如荧光增白剂等荧光化合物，所述荧光化合物通常吸收介于300纳米与600纳米之间的光并发射介于400纳米与800纳米之间的光；如罗丹明和荧光素等呫吨；比曼(bimane)；如伞形酮等香豆素；如丹酰等芳香族胺；方酸染料；苯并呋喃；花菁，包含部花青和酞菁；稀土螯合物；卟啉；如芘、蒽、苊等聚芳香族化合物；以及色烯。60.可激活化合物的实例是单线态氧可激活化学发光化合物(sacc)，所述sacc是一种可光激活物质，所述可光激活物质与单线态氧发生化学反应以形成亚稳反应产物，所述亚稳反应产物能够分解并同时或随后发射光，通常在250nm至1200nm的波长范围内，并且优选地在600nm至800nm的范围内。此类型的可激活化合物通常可以是富电子有机分子，如烯醇醚、烯胺、9-亚烷基-n-烷基吖啶、芳基乙烯基醚、二噁烷、芳基咪唑、9-亚烷基-氧杂蒽酮和光泽精。这些化合物可以与单线态氧反应以形成二氧杂环丁烷(dioxetane)或二氧杂环丁酮中间体，所述中间体会发生重排，从而释放出co2分子和光。可激活化合物的其它实例包含鲁米诺和其它邻苯二甲酰肼以及化学发光化合物，所述化学发光化合物由于受到光化学不稳定保护基团的保护而不会发生化学发光反应，此类化合物包含例如萤火虫荧光素、水通道蛋白、鲁米诺等。61.在特定实施例中，可激活化合物在激活时发射可检测信号，如可以被适当检测器检测到的光。在某些实施例中，可激活化合物将优选地以高于300纳米，优选地高于500纳米并且更优选地高于550nm的波长发射。以分析物样品的内含物对光吸收有显著贡献的区之外的波长吸收和发射光的化合物是特别有用的。血清的吸光度在500nm以上迅速下降，并且在600nm以上变得微不足道；因此，发射600nm以上光的可激活化合物特别受关注。然而，当样品的干涉吸收不存在时，在较短波长下吸收的可激活化合物是有用的。62.d.测量可激活化合物的输出：任何合适的检测方法都可以用于测量由信号供体生成的信号激活后由可激活化合物产生的输出。对于发射光的可激活化合物，例如以荧光的形式，测量由可激活化合物产生的输出是指检测和计算从激发的可激活化合物直接或间接发射的光的量。可激活化合物的输出通常可以通过检测从可激活化合物发射的光(如荧光)来测量，与由信号供体开始产生信号同时或紧随其后进行，无论发射是否来自激发单线态或更高多重性的状态。63.在一些实施例中，在样品的系列稀释(如1个、2个、3个、4个或更多个系列稀释)中检测到由可激活化合物产生的输出，并且测量或计算输出的一个或多个参数。选择稀释系列(如稀释数量和/或稀释倍数)以提供线性应答，例如其中检测到的信号与分析物的浓度成比例。因此，含有较高量的分析物的样品可能需要较大的稀释倍数以提供线性应答，而含有较低量的分析物的样品可能需要较小的稀释倍数，或者甚至可能需要浓缩以提供线性应答。在特定实例中，稀释系列是根据经验确定的。实例2中描述了示例性稀释系列。64.在一个实例中，确定来自稀释系列的信号的最大斜率。样品中的分析物的浓度与最大斜率成比例，随着分析物的量的增加，所述最大斜率向左偏移(例如，与对照相比)，或者随着分析物的量的减少，所述最大斜率向右偏移(例如，与对照相比)。在一些实例中，与对照相比，最大斜率的变化(例如，增加或减少)为约10％或更多(如至少10％、至少15％或至少20％)。在另外的实例中，样品中的分析物的量进一步利用例如由含有已知量的分析物的样品生成的标准曲线或参考来确定。65.在其它实例中，确定来自稀释系列的最大或峰值信号。最大信号与分析物和分析物缔合部分之间的结合亲和力(kd)成比例。最大信号的增加(例如，与对照相比)反映了更高的亲和力，而最大信号的减少(例如，与对照相比)反映了更低的亲和力。在一些实例中，与对照相比，最大信号的变化(例如，增加或减少)为约10％或更多。66.在仍另外的实施例中，如果输出包含来自两种或更多种不同的可激活化合物的信号，则确定信号的比率。在一个实例中，来自两种不同的可激活化合物的信号的比率用于确定分析物是否完整或分析物是否具有多个亚基，即所述亚基被组装。比率的变化(例如，与对照相比)表明分析物不完整或被切割。在一些实例中，与对照相比，所述比率可以增大或减小。67.在某些实施例中，对照是具有已知特性，如已知浓度、结合亲和力或结构(如完整或完全组装的分析物)的分析物的样品或参考。在一些实例中，对照或参考分析物是“野生型的”。然而，对照或参考分析物可以是期望与待测试的样品进行比较的任何分析物。在一些实例中，对照是分析物的先前版本。例如，可以使用本文所描述的方法鉴定分析物的变体，并且然后进行另一轮筛选和选择。因此，在第一轮中选择的变体可以用作第二轮中的对照。在其它实例中，例如出于评估分析物以及其生产的稳定性或一致性的目的，对照可以是先前批次的相同材料。68.v.测量dna以评估宿主细胞生产力69.如本文所描述的，邻近测定可以用于确定样品中的分析物的量，并且在某些实施例中，可以确定活性分析物的量。如果可以确定培养物的体积中宿主细胞的相对数量，则可以计算例如由宿主细胞培养物产生的分析物的量作为每个细胞产生的分析物的量的量度。为此，一种方法是通过测量特定波长处的吸光度，例如600nm(od600)来确定宿主细胞培养物的光密度(od)。然而，使用od600作为细胞数量的指示将需要增加邻近测定的处理步骤的单独测量，或者使用专门的设备，如配备用于测量光散射的读板器。然而，即使使用专门的设备，在邻近测定中使用的检测试剂也可能会干扰在大约600nm处作为od600吸光度测定的替代的光散射测量，并且光散射的测量不如dna染料的荧光检测敏感，如下文所描述的。70.另一种用于确定样品中细胞(完整或裂解细胞)的相对数量的方法是测量样品的核酸含量(例如，dna含量)。样品的od600与dna含量之间存在很强的线性相关性(数据未示出)，并且测量dna含量的优势在于可通过执行邻近测定检测的相同读板设备在同一孔中进行测量。实例2提供了测量宿主细胞dna含量的实例。可以使用picogreentm染料(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)检测宿主细胞裂解物样品和dna标准样品中的dna，所述染料可以用于使用αlisa供体和受体珠(马萨诸塞州沃尔瑟姆珀金埃尔默公司(perkinelmer,waltham,massachusetts))的测定，因为picogreentm染料的激发(480nm)和发射(520nm)谱不会干扰用于αlisa供体和受体珠的激发波长和发射波长。可以用于检测样品中的dna的其它化合物是碘化丙啶、hoechst 33342、7-氨基放线菌素-d(7-aad)和4'6'-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)。71.vi.邻近测定的另外的方面72.a.宿主细胞群体遗传多样性：所提供的方法有利地用于从宿主细胞的遗传多样性群体中选择高性能宿主细胞(例如，表达活性分析物、适当折叠的分析物和/或高表达水平的分析物的宿主细胞)，其中宿主细胞群体内的多样性或变化可能例如由宿主细胞基因组之间的差异或由宿主细胞构成的表达构建体之间的差异产生。宿主细胞群体遗传多样性可以通过如突变的方法随机地产生，或者通过在宿主细胞基因组或表达构建体中作出改变的靶向方法特异性地引入，然后将所述宿主细胞群体遗传多样性引入到宿主细胞品系中。73.宿主细胞群体包括多个遗传变体。在许多实施例中，所公开的方法的一个方面包括基于宿主细胞的预定特性对宿主细胞群体进行分选，所述预定特性基于宿主细胞群体内的遗传变体而变化。在许多实施例中，宿主细胞的预定特性包含所关注的活性基因产物的表达水平、所关注的基因产物的适当折叠、适当折叠的或完整蛋白质的表达水平、细胞活力和/或生物质。因此，宿主细胞群体的遗传多样性包括多个遗传变体，所述遗传变体足够多以提供遗传多样性群体内的一个或多个预定特性的变化。在一些实施例中，能够基本上表达所关注的基因产物的遗传变体的数量可能很少，这可能需要增加遗传多样性。因此，在一些实例中，起始宿主细胞群体的遗传多样性可以增加，直到实现合适的遗传多样性。74.在所公开的方法的实施例中，宿主细胞群体的遗传多样性被定义为存在于宿主细胞群体中的不同遗传变体的数量、相对于阴性对照的不同遗传变体的数量和/或相对于参考细胞品系的不同遗传变体的数量。遗传变体的数量可以是宿主细胞群体中的变体的实际数量或计算的(“靶标”)遗传变体的数量。这些变体可以是宿主细胞基因组在细胞之间的一种或多种遗传(例如，核酸序列)差异、一种或多种表达构建体在宿主细胞之间的一种或多种遗传(例如，核酸序列)差异或其组合的结果。在一些实例中，遗传差异包含序列的一个或多个核苷酸的改变、缺失或插入或一个或多个元素(如一个或多个标签、结构域、表达对照序列和/或相关联的蛋白质序列)的插入或缺失。75.在一些实施例中，在所公开的邻近测定中筛选的宿主细胞群体的遗传多样性为至少100、至少500、至少1000、至少1500、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000或至少10,000。在其它实例中，遗传多样性为约100-10,000，如约100-500、约250-1000、约750-2000、约1500-3000、约2500-4000、约3500-5000、约4500-7500、约6000-8000或约7000-10,000。76.可以使用本文所提供的方法探测任何类型的遗传多样性。在一些实施例中，遗传多样性包含所关注的基因产物(包含但不限于编码序列变体和密码子优化)、启动子(包含组成型启动子和/或诱导型启动子)、分子伴侣、核糖体结合序列、标签、核定位信号、信号肽、一个或多个基因的敲除或敲入、一个或多个(如1个、2个、3个或更多个)质粒的存在或其任何组合之间的差异(包含改变或存在或不存在)中的一个或多个。在一些实例中，遗传多样性通过标准指导的基因修饰技术产生。在其它实例中，遗传多样性通过随机诱变、容易出错的pcr诱变或转座子诱变(例如，tn5)产生。技术的组合还可以用于产生另外水平的遗传多样性。77.本领域已知存在许多用于改变宿主细胞基因组或表达构建体以便改变核苷酸序列和/或消除、减少或改变基因功能的方法。已经描述了在宿主细胞如大肠杆菌(e.coli)和其它原核生物中进行基因的靶向断裂的方法(muyrers等人,“通过et重组快速修饰细菌人工染色体(rapidmodification ofbacterial artificial chromosomes by et-recombination)”,《核酸研究(nucleic acids res)》1999年3月15日；27(6):1555-1557；datsenko和wanner,“使用pcr产物对大肠杆菌k-12中的染色体基因进行一步灭活(one-step inactivation of chromosomal genes in escherichia coli k-12using pcr products)”,《美国国家科学院院刊(proc natl acad sci u s a)》2000年6月6日；97(12):6640-6645)，以及用于使用类似的red/et重组方法的试剂盒可商购获得(例如，德国海德堡基因桥gmbh公司(gene bridges gmbh,heidelberg,germany)的快速简易大肠杆菌基因缺失试剂盒)。red/et重组方法还可以用于将启动子序列替换为不同的启动子的序列，如组成型启动子，或预测促进一定水平转录的人工启动子(de mey等人,“启动子敲入：用于基因微调的新合理方法(promoterknock-in:a novel rational method for the fine tuning of genes”,《bmc生物技术(bmc biotechnol)》2010年3月24日；10:26)。宿主细胞基因组或表达构建体的功能还可以通过rna沉默方法消除或减少(man等人,“人工反式编码的小非编码rna特异性地沉默细菌中选定的基因表达(artificial trans-encoded small non-coding rnas specifically silence the selected gene expression inbacteria)”,《核酸研究》2011年4月；39(8):e50,电子版2011年2月3日)。gibson组装方法(gibson,“重叠dna片段的酶效应组装(enzymatic assembly ofoverlapping dna fragments)”,《酶学方法(methods enzymol)》2011；498:349-361；doi:10.1016/b978-0-12-385120-8.00015-2)还可以用于在宿主细胞基因组或表达构建体中进行靶向改变，如插入、缺失和点突变。用于在宿主细胞基因组或表达构建体中进行定向改变的另一种方法利用crispr(聚集的规则间隔的短回文重复)核苷酸序列和cas9(crispr相关蛋白9)，其识别并裂解与crispr序列互补的核苷酸序列。进一步地，可以通过传统遗传方法引入对宿主细胞基因组的改变。78.在一些实施例中，先前已经筛选了宿主细胞的遗传多样性群体(例如，通过另一种方法)以降低来自初始宿主细胞群体的遗传多样性水平。在一个实施例中，用于本文所描述的方法的宿主细胞群体从通过国际申请第pct/us2021/013734号(以全文引用的方式并入本文)中描述的活性特异性细胞富集测定分选的细胞中获得，或者包含来自通过活性特异性细胞富集测定分选的细胞的特异性遗传特征。79.图6中展示了活性特异性细胞富集测定的实施例。简而言之，在一些实例中，在本文公开的方法之前，提供了宿主细胞群体，所述宿主细胞群体具有包括多个遗传变体的遗传多样性，其中所述宿主细胞中的至少一些宿主细胞包括编码所关注的基因产物(如本公开的分析物)的多核苷酸序列。在一些实例中，所述方法包含：培养所述宿主细胞群体，由此所述所关注的基因产物通过所述群体中的所述宿主细胞的亚群表达，所述亚群由此包括表达的宿主细胞，其中表达的宿主细胞的预定特性基于所述遗传变体而变化；标记所述亚群中的表达的宿主细胞中的至少一些表达的宿主细胞，其中所述标记包括将所关注的基因产物与可检测部分缔合，其中标记的量与表达的宿主细胞中所关注的基因产物的预定特性成比例，由此产生经标记的表达的宿主细胞；以及选择经标记的表达的宿主细胞的子集，其中所述选择包括检测通过细胞分选设备预定的可检测部分。在所述方法的实施例中，所述选择是荧光激活的细胞分选。在一些实例中，所述可检测部分是荧光部分，并且所述选择包括选择具有最高荧光发射的0.01％-5％的细胞。在特定非限制性实例中，所述选择包括选择具有最高荧光发射的0.5％的细胞。在特定实例中，所述表达的宿主细胞的所述预定特性包括所关注的活性基因产物的表达水平、所述所关注的基因产物的表达水平、所述所关注的基因产物的适当蛋白质折叠、所述所关注的基因产物的适当折叠的蛋白质的表达水平、细胞活力和/或生物质的量。在另外的实例中，通过测量每种遗传变体的所述所关注的基因产物的相对表达水平来确定表达的宿主细胞。然后在本文提供的方法中使用仍包含遗传多样性的宿主细胞的选定子集。80.b.宿主细胞：81.在所公开的方法中使用的宿主细胞能够在发酵培养物中以高细胞密度生长，并且可以通过高度控制的诱导型基因表达在氧化性宿主细胞质中产生基因产物。通过组合具有以下特征中的一些特征或全部特征来产生具有这些质量的宿主细胞。(1)通过增加细胞质中的氧化性多肽的表达或功能，和/或通过减少细胞质中的还原性多肽的表达或功能，将宿主细胞基因修饰以具有氧化性细胞质。通常全部转运到周质中的半胱氨酸氧化酶dsba、二硫键异构体酶dsbc或dsb蛋白的组合的表达增加已经用于需要二硫键的异源蛋白的表达(makino等人,“(用于改进细菌中重组蛋白表达的品系工程(strain engineering for improved expression of recombinantproteins inbacteria)”,《微生物细胞杂志(microb cell fact)》2011年5月14日；10:32)。还可能表达这些dsb蛋白的细胞质形式，如dsbc(‘cdsbc’)的细胞质版本，例如具有二十个氨基酸的n末端截短，其缺乏信号肽并且因此不转运到周质中。细胞质dsb蛋白，如cdsbc可用于使宿主细胞的细胞质更具氧化性，并且因此更有利于在细胞质中产生的异源蛋白中形成二硫键。通过直接改变硫氧还蛋白和谷氧还蛋白/谷胱甘肽酶系统来使宿主细胞质更具氧化性：谷胱甘肽还原酶(gor)或谷胱甘肽合成酶(gshb)中有缺陷的突变品系，连同硫氧还蛋白还原酶(trxb)一起使细胞质具有氧化性。这些品系不能减少核糖核苷酸并且因此不能在不存在外源还原剂如二硫苏糖醇(dtt)的情况下生长。编码过氧化物酶ahpc的基因ahpc中的抑制突变(ahpc*或ahpcδ)，将其转化为产生还原型谷胱甘肽的二硫还原酶，从而允许将电子引导到酶核糖核苷酸还原酶上，并且使gor和trxb中有缺陷的细胞，或gshb和trxb中有缺陷的细胞在不存在dtt的情况下生长。不同类型的ahpc的突变形式可以允许在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(gsha)的活性中有缺陷和在trxb中有缺陷的品系在不存在dtt的情况下生长；这些包含ahpc v164g、ahpc s71f、ahpc e173/s71f、ahpc e171ter和ahpc dup162–169(faulkner等人,“过氧化物酶的功能可塑性允许多种二硫化物还原通路的进化(functional plasticity of a peroxidase allows evolution of diverse disulfide-reducing pathways)”《美国国家科学院院刊》2008年5月6日；105(18):6735-6740,电子版2008年5月2日)。(2)任选地，宿主细胞还可以经基因修饰以表达有助于产生期望基因产物的伴侣和/或辅因子和/或糖基化多肽基因产物。(3)宿主细胞含有另外的基因修饰，所述基因修饰被设计成改善来自表达构建体的基因产物表达的某些方面。在特定实施例中，宿主细胞(a)具有编码至少一个诱导型启动子的诱导物的转运蛋白的至少一个基因的基因功能的改变，并且作为另一实例，其中编码所述转运蛋白的基因选自由以下组成的组：arae、araf、arag、arah、rhat、xylf、xylg和xylh，或特别是arae，或其中基因功能的改变更具体地是来自组成型启动子的arae的表达；和/或(b)具有编码代谢至少一个诱导型启动子的诱导物的蛋白质的至少一个基因的降低水平的基因功能，并且作为另外的实例，其中编码代谢至少一个诱导型启动子的诱导物的蛋白质的基因选自由以下组成的组：araa、arab、arad、prpb、prpd、rhaa、rhab、rhad、xyla和xylb；和/或(c)具有编码涉及至少一个诱导型启动子的诱导物的生物合成的蛋白质的至少一个基因的降低水平的基因功能，在另外的实施例中，所述基因选自由以下组成的组：scpa/sbm、argk/ygfd、scpb/ygfg、scpc/ygfh、rmla、rmlb、rmlc和rmld。82.在某些实施例中，宿主细胞是微生物细胞，如酵母(酵母属(saccharomyces)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)等)或细菌细胞，或者是革兰式阳性细菌(gram-positive bacteria)或革兰式阴性细菌(gram-negative bacteria)，或者是大肠杆菌(e.coli)，或者是大肠杆菌b品系，或者是大肠杆菌b品系521细胞，或者是大肠杆菌b品系522细胞。大肠杆菌521和522细胞具有以下基因型：83.大肠杆菌521：δarabad fhua2[lon]ompt ahpcδgalλatt::pneb3-r1-cdsbc(spec,laci)δtrxb sula11 r(mcr-73::minitn10‑‑tets)2[dcm]r(zgb-210::tn10‑‑tets)δaraep::j23104δscpa-argk-scpbcenda1rpsl-arg43δgorδ(mcrc-mrr)114::is10[0084]大肠杆菌522：δarabad fhua2 prpd[lon]ompt ahpcδgalλatt::pneb3-r1-cdsbc(spec,laci)δtrxb sula11 r(mcr-73::minitn10‑‑tets)2[dcm]r(zgb-210::tn10‑‑tets)δaraep::j23104δscpa-argk-scpbcenda1rpsl-arg43δgorδ(mcrc-mrr)114::is10[0085]在具有氧化性细胞质的大肠杆菌宿主细胞的生长实验中，我们已确定具有氧化性细胞质的大肠杆菌b品系能够生长到比对应的大肠杆菌k品系高得多的细胞密度。其它合适的品系包含大肠杆菌b品系表达(neb目录号c3028h)和t7表达(neb目录号c3029h)和大肠杆菌k品系t7(neb目录号c3026h)。[0086]在一些实施例中，宿主细胞是原核宿主细胞。原核宿主细胞可以包含古菌(archaea)(如盐富饶菌(haloferax volcanii)、硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus))、革兰氏阳性菌(如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、桥石短芽孢杆菌(brevibacillus choshinensis)、短乳杆菌(lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)和变铅青链霉菌(streptomyces lividans))或革兰氏阴性菌细菌，包含变形杆菌纲(alphaproteobacteria)(根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)、新月柄杆菌(caulobactercrescentus)、类球红杆菌(rhodobactersphaeroides)和苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti))、β-变形菌(betaproteobacteria)(真养产碱杆菌(alcaligenes eutrophus)和丙型变形细菌纲(gammaproteobacteria)(酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)、固氮菌(azotobacter)、棕色固氮菌(vinelandii)、大肠杆菌、铜绿假单胞菌(pseudo-monas aeruginosa)和恶臭假单胞菌(pseudomonas putida))。优选的宿主细胞包含家族肠杆菌科的γ-变形杆菌(gammaproteobacteria)，如肠杆菌(enterobacter)、欧文氏菌(erwinia)、埃希氏菌属(escherichia)(包含大肠杆菌)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙门氏菌(salmonella)(包含鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(serratia)(包含粘质沙雷氏菌(serratia marcescans))和志贺氏杆菌(shigella)。[0087]许多另外类型的宿主细胞可以用于本文所提供的方法中，包含真核细胞，如酵母(休哈塔假丝酵母(candida shehatae)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维氏酵母(kluyveromycesfragilis)、其它克鲁维酵母菌属(kluyveromyces species)、毕赤酵母(pichiapastoris)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、巴氏酵母(saccharomycespastorianus)也称为卡尔斯伯酵母(saccharomyces carlsbergensis)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、德克酵母属/酒香酵母属(dekkera/brettanomyces)和解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica))；其它真菌(构巢曲霉(aspergillus nidulans)、黑曲霉(aspergillus niger)、粗糙脉孢菌(neurospora crassa)、青霉菌(penicillium)、弯颈霉属(tolypocladium)、木霉属(trichoderma reesia))；昆虫细胞系(黑腹果蝇施耐德(drosophila melanogaster schneider)2细胞和草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)sf9细胞)；以及哺乳动物细胞系，包含无限增殖化细胞系(中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人胚肾(hek、293或hek-293)细胞)和人肝癌细胞(hep g2))。上述宿主细胞可从美国型培养物保藏中心(american type culture collection)获得。[0088]c.固相载体：邻近测定的任何组分(分析物、一个或多个分析物缔合部分、信号供体、可激活化合物、接头等)都可以与固相载体(如珠、树脂或基质)连接，只要所述连接不消除测定组分的功能，包含其与其它测定组分相互作用的能力。[0089]固相载体或固体表面是由多孔或非多孔水不溶性材料构成的表面。表面可以具有多种形状中的任何一种，如条、棒、颗粒、珠等。表面可以是亲水性的或能够变为亲水性的并且包含无机粉末，如二氧化硅、硫酸镁和氧化铝；天然聚合材料，特别是纤维素材料和源自纤维素的材料，如含有纤维的纸(滤纸、色谱纸等)；合成或改性的天然存在的聚合物，如硝酸纤维素、乙酸纤维素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二酯)、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)等；任一种可以单独使用或与如金属或玻璃等其它材料(例如，如磷硅酸钙钠等生物玻璃和陶瓷)结合使用。也可以使用天然或合成的组合件，如脂质体、脂质囊泡和细胞。优选地，固相载体是可以悬浮在液体中的颗粒，更优选地是由合成乳胶构成的珠。[0090]合适的珠可以由颗粒状的水不溶性聚合物材料形成，所述聚合物材料能够悬浮在液体中，通常具有20nm至40mm的颗粒尺寸，并且更优选地直径为100nm至1000nm。在某些实施例中，珠是合成乳胶，如经取代的聚乙烯，所述合成乳胶的实例包含聚苯乙烯-丁二烯、聚丙烯酰胺聚苯乙烯、具有氨基的聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、丙烯腈-丁二烯、苯乙烯共聚物、聚乙酸乙烯酯-丙烯酸酯、聚乙烯基吡啶和氯乙烯丙烯酸酯共聚物。用于本发明的邻近测定的珠也可以由苯乙烯和羧化苯乙烯的非交联聚合物制成，或由用其它活性基团(如氨基、羟基、卤基等)官能化的苯乙烯制成；也可以使用经取代的苯乙烯与如丁二烯等二烯的共聚物。在某些实施例中，珠用作用于连接信号供体的许多分子的固相载体，并且单独的珠类似地用于连接可激活化合物的许多分子。在其相应的珠上包含相对大量的信号供体和可激活化合物可以从单个分析物分子生成更大的信号，所述信号使信号供体珠和可激活化合物珠邻近。[0091]分析物、一个或多个分析物缔合部分、信号供体、可激活化合物和/或其它测定组分与载体或表面的结合可以通过文献中常见的众所周知的技术来完成(chibata,“固定化酶：研究与开发(immobilized enzymes:research and development”,纽约威利出版社(wiley newyork)1978；以及cuatrecasas,“通过亲和色谱法纯化蛋白质：琼脂糖和聚丙烯酰胺珠的衍生化(protein purification by affinity chromatography:derivatizations of agarose and polyacrylamide beads,”《生物化学杂志(j biol chem)》1970年6月；245(12):3059-3065)。表面通常将是多官能的或能够被多官能化或能够通过特异性或非特异性共价或非共价相互作用与配体、信号供体和可激活化合物结合。各种各样的官能团和/或连接基团是可用的或可以并入。官能团包含羧酸、醛、氨基、氰基、亚乙基、羟基和巯基。连接基团的长度可以广泛变化，这取决于被连接的化合物的性质以及被连接的化合物与表面之间的距离对特异性结合特性的影响。[0092]d.高通量能力：在所公开的方法中的样品的等分和处理可以以本领域普通技术人员已知的多种方式自动化。例如，使用多孔板、机器人分配和自动采样装置以及读板器创建了高通量过程，每个测定循环能够处理10,000个或更多个样品。适用于所提供的测定的机构包含精确分配体积小到0.001ml或更低(例如，体积小到25nl)的机构，包含含有固相载体珠悬浮液的液体，以及容纳多孔板(如具有6个、12个、24个、48个、96个、384个、1536个、3456个或9600个孔的板)的机构。测定可以在微流体装置中进行；包含宿主细胞和固相载体珠在内的所有测定组分的直径都可以在100nm至0.5mm的微流体装置通道尺寸范围内。[0093]在一些实施例中，所公开的测定可以用于快速筛选大量样品，如具有高水平遗传多样性的宿主细胞群体。在一些实例中，测定可以用于快速筛选约96个样品、约384个样品、约1536个样品、约3456个样品、约9600个样品或更多个样品。例如，所公开的测定可以用于筛选每天约4800个样品、每天约9600个样品、每天约14,400个样品、每天约19,200个样品或更多个样品。在其它实例中，所公开的测定能够以每个样品约1-3秒的速率筛选样品。样品可以是单个宿主细胞样品、宿主细胞样品的复制品、宿主细胞样品的系列稀释液或其组合。[0094]e.邻近测定与其它测定的使用：出于表征分析物的目的，本文所描述的邻近测定可以与其它测定和/或某些纯化程序结合使用。例如，邻近测定可以是鉴定样品以通过固相萃取质谱法(spe-ms)或实例3中描述的其它方法进行进一步测试的方法。在其它情况下，可能期望在进行邻近测定之前将分析物纯化到某种程度，尽管如实例1和2中所示，此类纯化通常不是必需的。可以对分析物进行的其它测定和程序的实例包含生物层干涉、dna测序、酶联免疫吸附测定(elisa)、凝胶电泳、免疫荧光染色、表面等离子体共振和液相色谱法(lc)，包含亲和色谱法和高效液相色谱法(hplc)。[0095]实例[0096]提供以下实例以展示某些特定特征和/或实施例。这些实例不应被解释为将本公开限制于所描述的特定特征或实施例。[0097]实例1[0098]使用邻近测定检测活性曲妥珠单抗[0099]a.曲妥珠单抗的产生、邻近测定方案和结果[0100]曲妥珠单抗，其商品名也称为是一种全长人源化igg1单克隆抗体，所述单克隆抗体识别her2抗原，也称为erbb2。曲妥珠单抗的重链和轻链的氨基酸序列分别提供为seq id no:1和2。这些氨基酸序列缺乏信号肽，并且旨在在宿主细胞质中表达。[0101]制备了包括曲妥珠单抗的重链和轻链的编码序列的双启动子表达载体，其中曲妥珠单抗的重链由l-阿拉伯糖诱导型启动子表达，并且曲妥珠单抗的轻链由丙酸酯诱导型启动子表达。将此表达载体转化到大肠杆菌宿主细胞系中。宿主细胞在150ml发酵培养物中生长，并且曲妥珠单抗重链和轻链的表达分别用不同量的l-阿拉伯糖和丙酸酯诱导，如表1所示。在诱导时间段之后，采集宿主细胞，并且保存沉淀物以进行分析，以便确定由宿主细胞产生的曲妥珠单抗的量。为之后实验保存的宿主细胞沉淀物对应于0.005ml的培养体积，并且宿主细胞以在600nm(od600)下的光密度存在，所述光密度可以在约70与约205之间变化。如表1所示，所述样品中的每个样品在采集时的od600都介于80与85之间。将宿主细胞沉淀物在-80℃下储存。[0102]为了确定由宿主细胞产生的完全组装和活性的曲妥珠单抗的量，裂解宿主细胞，并且使存在于裂解物中的曲妥珠单抗与检测试剂接触。建议不要将亲电蛋白酶抑制剂添加到宿主细胞裂解物中，因为已发现裂解物中存在亲电蛋白酶抑制剂会抑制检测试剂与曲妥珠单抗的抗原结合位点的结合，这可能是由于蛋白酶抑制剂对曲妥珠单抗互补决定区(cdr)的亲核丝氨酸残基的影响而引起的。检测试剂包括生物素化her2蛋白、包被链霉亲和素的信号供体(或“供体”)珠和包被链霉亲和素的可激活化合物(或“受体”)珠。当此检测系统中的her2蛋白与曲妥珠单抗抗原结合位点结合时，其可以通过与her2共价连接的生物素分子和与珠连接的链霉亲和素分子的相互作用与供体珠或受体珠连接。在此测定中，只有当受体珠通过her2与一个抗原结合位点结合时，所述受体珠才会产生可检测输出，并且供体珠通过her2与完全组装的和活性曲妥珠单抗抗体的另一个抗原结合位点结合，从而在供体珠与受体珠之间产生所需的邻近(参见图2)。[0103]用于测量曲妥珠单抗的特定邻近测定方案如下。将冷冻的宿主细胞沉淀物在冰上解冻持续五分钟，然后将0.1ml的glb完全裂解缓冲液添加到每种沉淀物中。glb完全裂解缓冲液为每100ml 50mm tris ph 7.4、200mm nacl、216ubenzonase、1％辛基葡糖苷和240ku rlysozyme。尽管辛基葡糖苷的存在可以抑制由αlisa检测试剂产生的可检测输出，但一旦裂解物被稀释至少20倍，这种洗涤剂的抑制作用就会很小(数据未示出)。通过涡旋和/或移液30秒将沉淀物和裂解缓冲液混合，并将混合物在冰上温育10分钟至30分钟。系列稀释液由96孔板中的所得裂解物制成。在板的第1列中，分配0.2ml免疫测定缓冲液(25mm hepes ph 7.4，0.1％酪蛋白，1mg/ml葡聚糖-500，0.5％triton x-100和0.05％proclin-300)，并且在第2-12列中，分配0.026ml免疫测定缓冲液。稀释液1：将0.005ml重悬的裂解物(已经相对于宿主细胞培养物稀释1:20)添加到第一列中的0.2ml免疫测定缓冲液中，并且通过移液充分混合，从而产生1:820稀释液。稀释液2：将0.040ml第一稀释液转移到第二列中的0.026ml免疫测定缓冲液中，并且通过移液充分混合，从而得到1:1353稀释液。稀释液3-12：跨板在第3-12列中重复稀释液2的步骤；最终稀释液为大约1:202,366稀释液。还制备了曲妥珠单抗的两个标准样品的系列稀释液，所述系列稀释液以与实验样品相同的方式制备，但从曲妥珠单抗的标准溶液开始。最高浓缩的曲妥珠单抗标准稀释液样品为6nm，并且最低浓缩的曲妥珠单抗标准稀释液样品为大约24pm。如下进行时的邻近测定旨在测量浓度大约介于50pm与1nm之间的分析物。[0104]通过将适量的生物素化her2(马里兰州盖瑟斯堡speed生物系统公司(speed biosystems,gaithersburg,maryland))、链霉亲和素包被的αlisa供体和受体珠(马萨诸塞州沃尔瑟姆珀金埃尔默公司)和10x免疫测定缓冲液(250mm hepes ph 7.4，1％酪蛋白，10mg/ml葡聚糖-500，5％triton x-100和0.5％proclin-300，可从马萨诸塞州沃尔瑟姆珀金埃尔默公司获得))的原液制剂等分来制备检测试剂以产生检测试剂溶液，所述检测试剂溶液在1x免疫测定缓冲液中为1.5x(1.66nm)生物素化her2和1.5x(30mg/l)链霉亲和素供体珠和受体珠。将检测试剂分配到384孔板的孔中，每孔0.012ml，并且将来自裂解物稀释系列中的每个孔的0.006ml样品添加到384孔板中的孔中。384孔板用透明塑料板密封件(针对实时pcr设计)密封，并且用不透光盖子覆盖，然后夹在顶部和底部上的空白384孔板之间(以防止在密封件上冷凝)，并且在4℃下温育过夜。在将板在室温下放置约一小时将板温热回室温后，使用enspire多模式读板仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆珀金埃尔默公司)读取结果，其中在680nm处由激光脉冲激发，并且在620nm处检测到发射。[0105]将来自宿主细胞裂解物样品的系列稀释液和曲妥珠单抗标准品的系列稀释液的平均读数的发射读数绘制为曲线，并且计算曲线各段之间的线的斜率。每个宿主细胞裂解物样品的最大斜率除以曲妥珠单抗标准品的系列稀释液的最大斜率，并乘以曲妥珠单抗标准品的已知浓度，以确定宿主细胞裂解物样品中的每个宿主细胞裂解物样品中的曲妥珠单抗浓度。表1中示出了每个样品的活性曲妥珠单抗的浓度，如通过邻近测定确定的。[0106]表1.通过邻近测定定量曲妥珠单抗[0107][0108]b.通过proa亲和纯化和尺寸排阻色谱法(sec)对曲妥珠单抗四聚体进行定量[0109]从沉淀的宿主细胞中获得的曲妥珠单抗蛋白也使用proa纯化步骤，随后是尺寸排阻色谱法(sec)进行定量。在这种方法(被称为proa sec)中，分析了三种重复的宿主细胞沉淀物，所述沉淀物由与通过邻近测定分析的宿主细胞沉淀物相同的发酵培养物制备。将对应于0.1ml宿主细胞培养物体积的沉淀物在室温下解冻10分钟，并且向每种宿主细胞沉淀物中添加1ml具有1％辛基葡糖苷的glb完全裂解缓冲液。将样品剧烈涡旋并在冰上温育20分钟至30分钟，随后在4℃下以20,000x g离心60分钟。[0110]proa纯化步骤使用0.04ml的mabselecttm(马萨诸塞州马尔堡通用电气医疗集团(ge healthcare life sciences,marlborough,massachusetts))proa亲和介质在pbs缓冲液中的50％浆液，将所述浆液等分到每个样品的eppendorf管中，向所述管中添加0.7ml宿主细胞裂解物。将样品在4℃下在以20rpm运行的旋转器上温育60分钟至90分钟，然后转移到96孔1ml 0.45微米孔acropreptm真空过滤板(纽约华盛顿港颇尔公司(pall,port washington,new york))的孔中。通过真空过滤去除样品孔中的液体，通过添加0.2ml 1x pbs洗涤样品三次，随后用移液管尖端混合并进行真空过滤，然后将样品洗脱两次，每次向每个孔中添加0.2ml的ph为3.0的100mm甘氨酸，随后在4℃下以500x g离心板2分钟，将孔内含物离心到含有0.02ml 0.5mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)的收集板中。对于通过proa纯化的蛋白质的hp-sec分析，将0.025ml洗脱液上样到zenix-c sec-300柱(特拉华州纽瓦克赛分科技有限公司(sepax technologies,newark,delaware))上，用ph为7.0的150mm磷酸钠平衡，以每分钟1ml等度洗脱20分钟，通过280nm处的吸光度检测。曲妥珠单抗四聚体的峰保留时间为大约7.8分钟。[0111]为了确定由宿主细胞产生的曲妥珠单抗四聚体的量，通过测量每个样品的散射校正的280nm吸光度(从空白校正的280nm吸光度中减去空白校正的320nm吸光度)来确定使用proa亲和纯化的蛋白质的总量。将散射校正的280nm吸光度除以消光系数，即1.48l/g·cm，从而得到以g/l表示的proa洗脱液浓度，将所述洗脱液浓度乘以proa洗脱液体积(220ml)以得到通过proa纯化的蛋白质的总量(g)，并且将该值除以上样到proa树脂上的培养物体积的量(0.07ml)，并且对被测的三个重复样品中的结果取平均值以得到每个宿主细胞培养物体积的(平均)总proa蛋白质产率(g/l，参见表2)。通过sec分析确定所述总proa蛋白质产率(即曲妥珠单抗四聚体)的百分比；将总proa蛋白质产率乘以曲妥珠单抗四聚体的百分比产生按宿主细胞培养物体积计的以g/l为单位的proa sec曲妥珠单抗四聚体的量(参见表2)。除了通过proa sec对曲妥珠单抗蛋白进行定量的这些结果之外，表2还包含通过邻近测定确定的用于比较的量。在这些样品中，通过邻近测定测量的活性曲妥珠单抗的量略低于通过proa sec测量的量。此结果可能是由于两种测定之间的固有差异引起的。[0112]表2.通过proa sec和邻近测定对曲妥珠单抗进行定量[0113][0114]c.邻近测定与proa(sec)定量方法的进一步比较[0115]邻近测定和proa sec用于确定许多不同裂解物样品中的曲妥珠单抗的量，包含实例1a中描述的那些曲妥珠单抗。用于产生包括曲妥珠单抗的宿主细胞裂解物的程序与实例1a中描述的程序相似，其中使用不同的表达构建体序列以及培养和诱导条件。图7示出了通过这两种方法确定的所有这些样品中的曲妥珠单抗的量的比较。可以看出，通过两种不同测定确定的量之间存在强相关性：在去除指示的离群点数据点后，相关性系数的计算值为0.939457。在这些实验中，测量活性曲妥珠单抗的邻近测定几乎总是产生比测量proa纯化的曲妥珠单抗四聚体的proa sec测定略低的结果。除了所述离群点中的一个离群点之外，邻近测定产生比proa sec测定更高的结果的唯一数据点是在较低的曲妥珠单抗浓度下(参见图7中的图表的左下部分)，其中由于较低的信噪比，预期测定中的误差的相对水平较高。[0116]实例2[0117]用dna染色归一化细胞数的结果的邻近测定[0118]在添加用于dna染色的染料的情况下，邻近测定可以如下进行。[0119]1.如有必要，将冷冻的宿主细胞沉淀物在冰上解冻五分钟。[0120]2.将宿主细胞沉淀物重新悬浮于以下稀释缓冲液i中：1x pbs、1mm edta、0.1x免疫测定缓冲液(2.5mm hepes ph 7.4，0.01％酪蛋白，0.1mg/ml葡聚糖-500，0.05％triton x-100和0.005％proclin-300)。例如，将对应于0.05ml宿主细胞培养物的宿主细胞沉淀物重新悬浮于0.2ml稀释缓冲液i中，以相对于宿主细胞培养物进行初始四倍稀释。[0121]3.在裂解之前进行宿主细胞的四步稀释系列，其中稀释因子取决于在宿主细胞中产生的分析物的预期量：较高的稀释因数用于每个细胞在高浓度下产生的分析物(例如，将1:4宿主细胞重悬液进一步稀释25倍，并且然后进行三个12倍稀释步骤以生成从1:100至1:172,800的稀释范围)，并且较小的稀释因数用于每个细胞在中等浓度下产生的分析物(例如，四个8倍稀释步骤以生成从1:32至1:16,384的范围)。对于每个细胞以低水平产生的分析物和/或对于通过邻近测定产生的具有较低水平的可检测输出的分析物，所收集的宿主细胞可以浓缩，例如浓缩到宿主细胞培养物中存在的浓度的五倍，然后在四个5倍稀释步骤中稀释以生成从1:1至1:125的范围。稀释系列在384孔深孔板中制备，其中在每个稀释步骤中将宿主细胞溶液转移到含有以下稀释缓冲液ii的孔中：1mm edta和1x免疫测定缓冲液(25mm hepes ph 7.4，0.1％酪蛋白，1mg/ml葡聚糖-500，0.5％triton x-100和0.05％proclin-300)。还针对已知浓度的分析物的标准溶液创建了四步稀释系列，其中标准品的最高浓度通常不超过10nm，使得标准品的系列稀释范围与最佳测定范围重叠，所述最佳测定范围介于大约50pm与1nm之间。也可以创建dna标准稀释系列，例如，从已在1mm edta和0.1x免疫测定缓冲液中以1:25从0.1mg/ml稀释至4000ng/ml的dna溶液开始，然后是在1mm edta和0.1x免疫测定缓冲液中的四个1:5稀释步骤，从而产生32ng/ml的最低浓度。也可以将由测试样品中的dna生成的信号与由源自对照(如阳性对照宿主细胞品系)的样品中的dna生成的信号进行比较，以鉴定每个细胞产生比对照宿主细胞品系相对更多分析物的宿主细胞培养物。[0122]4.对于一些分析物和检测试剂的组合，溶菌酶(对于在宿主细胞质中产生的分析物)、一个或多个分析物缔合部分、信号供体、可激活化合物和包括分析物的宿主细胞的稀释液全部可以在一个步骤中组合在一个测定孔中，使得细胞裂解和分析物的检测一起发生。然而，某些分析物和/或检测试剂在如下所述的两个步骤中组合时生成更多的检测输出，这可能是由于供体珠和受体珠对分析物与一个或多个分析物缔合部分之间的相互作用的抑制性空间效应引起的。[0123]通过将0.006ml的测定/裂解缓冲液i(1mm edta，1x免疫测定缓冲液，240ku rlysozyme/100ml(如果需要的话)、有效浓度的一个或多个分析物缔合部分和picogreentm染料(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)，稀释度为1:200)分配到每个孔中来制备384孔浅孔测定板。这种1mm edta和溶菌酶的组合足以裂解宿主细胞；优选地不使用如辛基葡糖苷等洗涤剂，因为许多洗涤剂将抑制αlisa试剂产生可检测输出。将宿主细胞的每种稀释液的0.006ml等分试样转移到测定板的孔中，并且在室温下温育一小时，以允许分析物与一个或多个分析物缔合部分裂解和缔合。在此温育后，将0.006ml测定缓冲液ii(1mm edta，1x免疫测定缓冲液以及信号供体和可激活化合物，例如，60mg/l的链霉亲和素供体和受体珠)分配到每个孔中，并且将板密封，在4℃下温育1小时至24小时，温热到室温，读取并且分析数据，通常如实例1a中所描述的。除了读取与样品相关的发射外，还以480nm的激发和520nm处的发射读取板以测量dna含量。如果在相对较短的温育(例如，一小时至两小时)后开始读取板，则可以在较长的温育时间段后再次读取，因为来自受体珠的可检测输出继续增加，直到在平衡时达到最大可检测输出为止，通常在温育大约16小时至22小时后。当计算针对测试样品和标准品生成的稀释曲线的最大斜率时，如实例1a中所描述的，标准品可以被稀释到与测试样品不同的程度。在该情况下，为了生成稀释曲线，稀释调整的实际体积绘制在一个轴(如x轴)上，而检测到的输出绘制在另一个轴(如y轴)上，并且最大斜率根据这些曲线计算得出。测试样品和标准品的线斜率将具有相同的单位(信号/稀释调整的实际体积)，并且实例1a中描述的计算方法将给出期望的结果。[0124]实例3[0125]表征二硫键[0126]可以通过在非还原条件下用蛋白酶(如胰蛋白酶)消化多肽分析物并使所得肽片段经受将连续电子转移解离(etd)和碰撞诱导的解离(cid)ms步骤(ms2，ms3)组合的质谱法(ms)来确定多肽分析物中的二硫键的数量和位置(nili等人,“通过串联质谱法与电子转移解离和碰撞诱导的解离来定义胰岛素样生长因子结合蛋白-5的二硫键(defining the disulfide bonds of insulin-like growth factor-binding protein-5by tandem mass spectrometry with electron transfer dissociation and collision-induced dissociation)”,《生物化学杂志》2012年1月6日；287(2):1510-1519；电子版2011年11月22日)。[0127]共表达蛋白质的消化：为了防止二硫键重新布置，通过烷基化来阻断游离半胱氨酸残基：在20℃下将多肽分析物与烷基化剂碘乙酰胺(5mm)在含有4m脲的缓冲液中在摇晃下避光一起温育持续30分钟，并且然后使用预制凝胶通过非还原性sds-page分离。可替代地，在用碘乙酰胺进行电泳之后或在不作为对照的情况下，将多肽分析物在凝胶中温育。对蛋白质进行染色，用双去离子水脱色、切除，并且在0.5ml的50mm碳酸氢铵、50％(v/v)乙腈中温育两次，同时在20℃下摇晃持续30分钟。使蛋白质样品在100％乙腈中脱水持续2分钟，通过真空离心干燥，并且在含有50mm碳酸氢铵和5mm氯化钙的缓冲液中用10mg/ml的胰蛋白酶或糜蛋白酶在冰上再水化持续15分钟。去除多余的缓冲液，并且用0.05ml不含酶的相同缓冲液替换，随后将胰蛋白酶和糜蛋白酶分别在37℃下或在20℃下在摇晃下温育持续16小时。通过添加3微升的88％甲酸来停止消化，并且在短暂涡旋后，去除上清液并储存在–20℃下直到分析。[0128]通过质谱法定位二硫键：在含有0.1％甲酸的流动相中，将肽以20微升/分钟注射到1mm×8mm的捕集柱(加利福尼亚州奥本市michrom生物资源公司(michrom bioresources,inc.,auburn,ca)上。然后将捕集盒放置在0.5mm×250mm的含有5mm zorbax sb-c18固定相的柱上(加利福尼亚州圣克拉拉安捷伦科技公司(agilent technologies,santa clara,ca))，并且通过2％-30％乙腈梯度在90分钟内以10微升/分钟用1100系列毛细管hplc(安捷伦科技公司)分离肽。使用具有etd源(加利福尼亚州圣何塞赛默飞世尔科技公司)的ltq velos线性离子捕集器分析肽。使用captive spray源(michrom生物资源公司)进行电喷雾电离。调查ms扫描之后是由调查扫描中最强离子(例如，在扫描的m/e范围内具有最强峰的离子(m/e))上的cid和etd ms2扫描组成的七次数据依赖性扫描，随后是etd ms2扫描中的第一至第五最强离子上的五次ms3 cid扫描。在启用补充激活的情况下，cid扫描使用35的归一化碰撞能量，并且etd扫描使用100毫秒激活时间。启动ms2 cid和etd扫描的最小信号为10,000，启动ms3cid扫描的最小信号为1000，并且所有ms2和ms3扫描的隔离宽度为3.0m/z。软件的动态排除功能被启用，重复计数为1，排除列表大小为100，并且排除持续时间为30秒。使用靶向具体交联物种的包含列表以收集etd ms2扫描。使用zsa电荷状态分析，由bioworks 3.3(赛默飞世尔科技公司)创建ms2和ms3扫描的单独数据文件。ms2和ms3扫描与肽序列的匹配由sequest(v27，rev 12，赛默飞世尔科技公司)执行。在没有酶特异性、亲本离子质量耐受性为2.5、片段质量耐受性为1.0并且氧化甲硫氨酸残基的可变质量为+16的情况下进行分析。然后使用程序scafffold(v3_00_08，奥勒冈州波特兰蛋白质组软件公司(proteome software,portland,or))分析结果，其中使用最低肽和蛋白质概率为95％和99％。来自ms3结果的肽按照扫描编号进行分选，并且从由在etd ms2扫描中观察到的五种最强离子产生的ms3扫描组中鉴定含有半胱氨酸的肽。通过手动检查在调查扫描和etd ms2扫描中观察到的亲本离子质量，进一步证实了参与二硫键连接的物种中半胱氨酸肽的同一性。[0129]实施例[0130]另外地或作为上文的替代方案，描述了以下实施例：[0131]实施例1涉及一种用于确定样品中的分析物的存在或量的方法，所述分析物呈所述分析物的活性形式，所述方法包括：[0132](i)将包括所述分析物的所述样品、包括信号供体和第一分析物缔合部分的第一复合物以及包括可激活化合物和第二分析物缔合部分的第二复合物组合；[0133]其中所述样品包括呈所述分析物的活性形式的活性分析物和不呈所述分析物的活性形式的非活性分析物；并且[0134]其中所述活性分析物与所述第一复合物和所述第二复合物两者缔合，并且所述非活性分析物不与所述第一复合物和所述第二复合物两者缔合；[0135](ii)启动信号从所述第一复合物中的所述信号供体的转移，其中所述信号被所述第二复合物中的所述可激活化合物接收，所述可激活化合物与活性分析物缔合，所述活性分析物与所述第一复合物和所述第二复合物两者缔合；以及[0136](iii)检测来自所述可激活化合物的所述输出。[0137]实施例2涉及一种用于确定样品中的分析物的存在或量的方法，所述方法包括：[0138](i)使所述分析物与包括信号供体和第一分析物缔合部分的第一复合物以及包括可激活化合物和第二分析物缔合部分的第二复合物接触；[0139](ii)启动信号从所述信号供体到所述可激活化合物的转移，其中所述信号使所述可激活化合物产生可检测输出；以及[0140](iii)检测来自所述可激活化合物的所述输出。[0141]实施例3涉及根据实施例1或2所述的方法，其进一步包括：[0142]使所述分析物与包括第二可激活化合物和第三分析物缔合部分的第三复合物接触；[0143]其中所述信号从所述信号供体到所述第二可激活化合物的所述转移使所述第二可激活化合物产生可检测输出；以及[0144]检测来自所述第二可激活化合物的所述输出。[0145]实施例4涉及一种用于确定样品中的分析物的存在或量的方法，所述方法包括：[0146](i)提供共价标记的分析物，所述共价标记的分析物包括通过共价键与第一检测试剂连接的所述分析物，所述第一检测试剂选自由信号供体和可激活化合物组成的组；[0147](ii)使包括所述分析物的样品与所述共价标记的分析物以及与第二检测试剂连接的分析物缔合部分接触，所述宿主细胞群体包括来自所选宿主细胞群体的单个遗传变体，并且其中所述宿主细胞群体表达所述分析物，所述第二检测试剂选自由信号供体和可激活化合物组成的组，其中所述第一检测试剂不是所述第二检测试剂；[0148](iii)启动信号从所述信号供体到所述可激活化合物的转移，其中所述信号使所述可激活化合物产生可检测输出；以及[0149](iv)检测来自所述可激活化合物的所述输出。[0150]实施例5涉及根据实施例2至4中任一项所述的方法，其中所述样品包括呈所述分析物的活性形式的活性分析物和不呈所述分析物的活性形式的非活性分析物，其中所述活性分析物与所述第一复合物和所述第二复合物两者缔合，并且所述非活性分析物不与所述第一复合物和所述第二复合物两者缔合。[0151]实施例6涉及根据实施例1至5中任一项所述的方法，其中所述样品包括具有遗传多样性的宿主细胞群体，所述遗传多样性包括多个遗传变体，其中所述宿主细胞群体中的至少一些宿主细胞包括编码所述分析物的多核苷酸。[0152]实施例7涉及根据实施例6所述的方法，其中所述宿主细胞群体的所述遗传多样性是由所述宿主细胞群体中的所述宿主细胞中的至少一些宿主细胞构成的宿主细胞基因组变异、一种或多种表达构建体的多核苷酸序列变异或其组合。[0153]实施例8涉及根据实施例6或7所述的方法，其中所述宿主细胞群体的所述遗传多样性为约1500或约5000。[0154]实施例9涉及根据实施例6至8中任一项所述的方法，其进一步包括在使所述样品和/或所述分析物与分析物缔合部分、所述信号供体和所述可激活化合物中的一种或多种接触之前选择具有遗传多样性并编码所述分析物的所述宿主细胞群体。[0155]实施例10涉及根据实施例9所述的方法，其中选择具有遗传多样性并编码所述分析物的所述宿主细胞群体包括：[0156]培养宿主细胞群体，由此所述分析物通过所述群体中的所述宿主细胞的亚群表达，所述亚群由此包括表达的宿主细胞；[0157]标记所述亚群中的所述表达的宿主细胞中的至少一些表达的宿主细胞，其中所述标记包括使所关注的基因产物与可检测部分缔合，由此产生经标记的表达的宿主细胞；以及[0158]选择经标记的表达的宿主细胞的子集，其中所述选择包括通过细胞分选设备检测所述可检测部分。[0159]实施例11涉及根据实施例1至10中任一项所述的方法，其中所述分析物包括多肽、蛋白质、糖蛋白、磷蛋白、蛋白脂质、包括前述任一项中的一个或多个结构域或片段的多肽以及核酸。[0160]实施例12涉及根据实施例11所述的实施例，其中所述分析物选自由以下组成的组：黏附素、抗体、抗原、细胞因子、酶、生长因子、配体、受体、结构蛋白、转录因子、转运蛋白、多肽毒素、蛋白质毒素以及包括前述任一项的一个或多个结构域或片段的多肽。[0161]实施例13涉及根据实施例12所述的方法，其中所述分析物是抗体或包括抗体结构域的多肽。[0162]实施例14涉及根据实施例13所述的方法，其中所述分析物包括抗原结合结构域。[0163]实施例15涉及根据实施例14所述的方法，其中所述分析物是单克隆抗体和/或双特异性抗体。[0164]实施例16涉及根据实施例1至15中任一项所述的方法，其中所述分析物是同源多聚体和/或所述分析物具有适当形成的二硫键。[0165]实施例17涉及根据实施例1至16中任一项所述的方法，其中所述分析物是同源多聚体，并且所述第一复合物的所述分析物缔合部分与所述第二复合物的所述分析物缔合部分相同。[0166]实施例18涉及根据实施例1至17中任一项所述的方法，其中：[0167]所述分析物包括抗原结合结构域，并且所述分析物缔合部分是与所述分析物的所述抗原结合结构域结合的抗原；和/或[0168]所述分析物缔合部分包括抗原结合结构域，并且所述分析物是与所述分析物缔合部分的所述抗原结合结构域结合的抗原；和/或[0169]所述分析物包括配体结合结构域，并且所述分析物缔合部分是与所述分析物的所述配体结合结构域结合的配体；和/或[0170]所述分析物缔合部分包括配体结合结构域，并且所述分析物是与所述分析物缔合部分的所述配体结合结构域结合的配体；和/或[0171]所述分析物包括具有酶活性的结构域，并且所述分析物缔合部分是与所述分析物的所述具有酶活性的结构域结合的底物；和/或[0172]所述分析物缔合部分包括具有酶活性的结构域，并且所述分析物是与所述分析物缔合部分的所述具有酶活性的结构域结合的底物；和/或[0173]所述分析物缔合部分是与所述分析物特异性地结合的抗体；和/或所述分析物是与所述分析物缔合部分特异性地结合的抗体。[0174]实施例19涉及根据实施例1至18中任一项所述的方法，其进一步包括使测定组分与第一抗体接触，所述第一抗体与所述测定组分特异性地结合，其中所述测定组分选自由所述分析物和所述分析物缔合部分组成的组。[0175]实施例20涉及根据实施例19所述的方法，其进一步包括使所述第一抗体与第二抗体接触，所述第二抗体与所述第一抗体特异性地结合。[0176]实施例21涉及根据实施例20所述的方法，其中所述第二抗体是抗物种抗体。[0177]实施例22涉及根据实施例1至21中任一项所述的方法，其中所述分析物缔合部分是可以在所述分析物上的多个位点处与所述分析物相互作用的多聚体。[0178]实施例23涉及根据实施例1至22中任一项所述的方法，其中所述分析物缔合部分与检测试剂连接，所述检测试剂选自由信号供体和可激活复合物组成的组。[0179]实施例24涉及根据实施例23所述的方法，其中所述分析物缔合部分通过接头与所述检测试剂连接。[0180]实施例25涉及根据实施例24所述的方法，其中所述接头包括多肽连接子和/或结合对。[0181]实施例26涉及根据实施例25所述的方法，其中所述结合对是生物素和链霉亲和素，或者所述结合对是聚组氨酸和选自由镍离子(ni2+)和钴离子(co2+)组成的组的金属离子。[0182]实施例27涉及根据实施例1至26中任一项所述的方法，其中所述信号供体通过酶激活和/或所述信号供体通过照射激活。[0183]实施例28涉及根据实施例1至27中任一项所述的方法，其中所述信号供体产生荧光共振转移信号和/或所述信号供体产生化学信号。[0184]实施例29涉及根据实施例28所述的方法，其中所述化学信号是反应性氧物种。[0185]实施例30涉及根据实施例29所述的方法，其中所述反应性氧物种是单线态氧。[0186]实施例31涉及根据实施例1至30中任一项所述的方法，其中所述信号供体是敏化剂。[0187]实施例32涉及根据实施例31所述的方法，其中所述敏化剂是卤代过氧化物酶。[0188]实施例33涉及根据实施例31所述的方法，其中所述信号供体是光敏剂。[0189]实施例34涉及根据实施例33所述的方法，其中所述信号供体是在250-1100nm、和/或300-1000nm和/或450-950nm的波长范围内具有最大吸光度的光敏剂，和/或是在其最大吸光度下的消光系数在500m-1cm-1至100,000m-1cm-1的范围内、和/或在5,000m-1cm-1至100,000m-1cm-1的范围内和/或在50,000m-1cm-1至100,000m-1cm-1的范围内的光敏剂。[0190]实施例35涉及根据实施例33或34所述的方法，其中所述光敏剂选自由以下组成的组：酮、氧杂蒽、聚芳香族化合物、卟啉、噁嗪、方酸染料、花菁和噻嗪；和/或所述光敏剂选自由以下组成的组：二苯甲酮、9-噻吨酮、伊红、玫瑰红、巴克敏斯特富勒烯、9,10-二溴蒽、血卟啉、叶绿素、酞菁、萘酞菁、部花青和亚甲蓝。[0191]实施例36涉及根据实施例1至35中任一项所述的方法，其中所述可激活化合物是可光激活化合物。[0192]实施例37涉及根据实施例36所述的方法，其中所述可光激活化合物通过荧光发射光。[0193]实施例38涉及根据实施例37所述的方法，其中所述可光激活化合物的发射量子产率介于0.05与1.0之间、和/或介于0.1与1.0之间、和/或介于0.4与1.0之间和/或介于0.7与1.0之间。[0194]实施例39涉及根据实施例36至38中任一项所述的方法，其中所述可光激活化合物选自由以下组成的组：呫吨、比马内斯、香豆素、芳香族胺、方酸染料、苯并呋喃、花菁、稀土螯合物、卟啉、聚芳香族化合物以及色烯。[0195]实施例40涉及根据实施例39所述的方法，其中所述可光激活化合物选自由以下组成的组：罗丹明、荧光素、伞形酮、丹酰、部花青、酞菁、芘、蒽和苊。[0196]实施例41涉及根据实施例36至39中任一项所述的方法，其中所述可光激活化合物与单线态氧发生化学反应。[0197]实施例42涉及根据实施例41所述的方法，其中与所述单线态氧发生化学反应的所述可光激活化合物发射波长范围在250nm至1200nm、和/或300nm至1200nm、和/或500nm至1200nm、和/或600nm至1200nm和/或600nm至800nm内的光。[0198]实施例43涉及根据实施例41或42所述的方法，其中与单线态氧发生化学反应的所述可光激活化合物选自由以下组成的组：烯醇醚、烯胺、9-亚烷基-n-烷基吖啶、芳基乙烯基醚、二噁烷、芳基咪唑、9-亚烷基-氧杂蒽酮和光泽精。[0199]实施例44涉及根据实施例1至43中任一项所述的方法，其进一步包括测量所述样品的光密度。[0200]实施例45涉及根据实施例44所述的方法，其中在600nm处测量所述样品的光密度。[0201]实施例46涉及根据实施例44所述的方法，其中通过检测光散射来测量所述样品的光密度。[0202]实施例47涉及根据实施例1至46中任一项所述的方法，其进一步包括：将与核酸相互作用的化合物添加到所述样品中；照射所述样品以激发与核酸相互作用的所述化合物；以及测量由所激发的化合物发射的所述光。[0203]实施例48涉及根据实施例47所述的方法，其中所述核酸是dna。[0204]实施例49涉及根据实施例47或48所述的方法，与核酸相互作用的所述化合物选自由以下组成的组：picogreentm染料、hoechst 33342、7-氨基放线菌素-d(7-aad)和4'6'-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)。[0205]实施例50涉及根据实施例1至49中任一项所述的方法，其中至少一种选自由以下组成的组的测定组分与固相载体连接：所述分析物、分析物缔合部分、所述信号供体和所述可激活化合物。[0206]实施例51涉及根据实施例50所述的方法，其中所述固相载体包括聚合物。[0207]实施例52涉及根据实施例51所述的方法，其中所述聚合物选自由以下组成的组：硝酸纤维素、乙酸纤维素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二酯)、尼龙和聚(丁酸乙烯酯)。[0208]实施例53涉及根据实施例50所述的方法，其中所述固相载体包括合成乳胶。[0209]实施例54涉及根据实施例53所述的方法，其中所述合成乳胶是选自由以下组成的组的经取代的聚乙烯：聚苯乙烯-丁二烯、聚丙烯酰胺聚苯乙烯、具有氨基的聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、丙烯腈-丁二烯、苯乙烯共聚物、聚乙酸乙烯酯-丙烯酸酯、聚乙烯基吡啶和氯乙烯丙烯酸酯共聚物。[0210]实施例55涉及根据实施例50至54中任一项所述的方法，其中所述固相载体呈珠的形式。[0211]实施例56涉及根据实施例1至55中任一项所述的方法，其中所述样品处于包括多个孔的板中。[0212]实施例57涉及根据实施例56所述的方法，其中孔的数量选自由以下组成的组：6个、12个、24个、48个、96个、384个、1536个、3456个和9600个孔。[0213]实施例58涉及根据实施例1至57中任一项所述的方法，其中对所述样品进行另外的测定，并且所述测定选自由以下组成的组：生物层干涉、dna测序、酶联免疫吸附测定(elisa)、免疫荧光染色、亲和色谱法、高效液相色谱法(hp-lc)、液相色谱质谱法(lc-ms)、尺寸排阻色谱法、固相萃取质谱法(spe-ms)和表面等离子体共振。[0214]在实践本发明时，任选地使用分子生物学、微生物学和重组dna技术中的许多常规技术。此类传统技术涉及载体、宿主细胞和重组方法。这些技术是众所周知的并且在例如以下文献中有所解释：berger和kimmel,分子克隆技术指南(guide to molecular cloning techniques),《酶学方法(methods in enzymology)第152卷加利福尼亚州圣地亚哥学术出版社(academic press,mc,san diego,ca)；sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(molecular cloning-a laboratory manual)(第3版),第1-3卷,《冷泉港实验室(cold spring harbor laboratory)》,纽约冷泉港(cold spring harbor,new york),2000；以及《当代分子生物学实验指南(current protocols in molecular biology)》,f.m.ausubel等人编辑,《当今方案(current protocols)》,格林出版协会公司(greene publishing associates,inc.)与约翰威利父子公司(john wiley sons,inc.,)合资企业,(2006年补充)。例如用于细胞分离和培养以及用于随后的核酸或蛋白质分离的其它有用的参考，包含freshney(1994)动物细胞的培养(culture of animal cells),《基础技术手册(a manual of basic technique)》,第三版,纽约威利-丽斯出版社(wiley-liss,new york)以及其中引用的参考文献；payne等人(1992)《液体系统中的植物细胞和组织培养物(plant cell and tissue culture in liquid systems)》纽约州纽约约翰威利父子公司(john wiley&sons,inc.newyork,ny)；gamborg和phillips(编辑)(1995)《植物细胞、组织和器官培养；施普林格实验室手册基本方法(fundamental methods springer lab manual)》,施普林格出版社(springer-verlag)(纽约海德堡柏林(berlin heidelberg newyork))；以及atlas和parks(编辑)《微生物培养基手册(the handbook of microbiological media)》(1993)佛罗里达州波卡拉顿crc出版社(crc press,boca raton,fl)。在上述参考文献中描述了制备核酸(例如，通过体外扩增、从细胞中纯化或化学合成)的方法、用于操纵核酸的方法(例如，通过定点诱变、限制性酶消化、连接等)以及可用于操纵和制备核酸的各种载体、细胞系等。另外，基本上任何多核苷酸(包含经标记的或生物素化的多核苷酸)均可以从各种商业来源中定制或标准订购。[0215]已经按照发现或提出的包括用于实施本发明的某些模式的特定实施例描述了本发明。本领域普通技术人员将理解，鉴于本公开，在不脱离本发明的预期范围的情况下，可以对例示的特定实施例进行多种修改和改变。任何实施例或实施例的特征可以彼此组合，并且此类组合明确地涵盖在本发明的范围内。[0216]本文中所有引用的参考文献，包含专利出版物均以全文引用的方式并入本文。通过所公开的基因组位置或其它描述所提及的核苷酸和其它基因序列也以引用的方式明确地并入本文。









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