牛奶外泌体产品和方法、营养组合物和治疗方法与流程 专利技术说明

食品,饮料机械,设备的制造及其制品加工制作,储藏技术牛奶外泌体产品和方法、营养组合物和治疗方法发明领域1.本发明涉及从含乳清的牛奶级分或特别是从奶酪乳清中获得富含外泌体的产品的方法。本发明还涉及一种富含外泌体的产品、含有源自牛奶的外泌体的营养组合物以及改善受试者的胰岛素敏感性的方法。2.发明背景3.牛奶含有外泌体，所述外泌体是细胞外膜囊泡。例如，牛奶外泌体含有已知在调节健康和疾病方面发挥作用的生物活性剂，包括但不限于酶蛋白和非酶蛋白(cd9、cd63、mhc-ii类、乳凝集素、tsg101和hsc70等)、核酸(包括大量的微rna(mirna)和信使rna(mrna))和脂质(磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和鞘磷脂等)。牛奶外泌体可被细胞主动摄取以传递其内容物，但摄取需要保留牛奶外泌体囊泡膜。4.虽然外泌体结构保护生物活性剂，但从牛奶中分离外泌体的已知方法会损坏外泌体膜，阻止外泌体的摄取并导致生物活性剂的释放和其生物活性的降低。因此，尽管mirna在调节健康和疾病方面发挥着重要作用，但营养行业尚未将食源性mirna作为潜在的功能成分进行探索，因为分离的mirna极不稳定并且可能会在几秒钟内降解。5.除了上述问题外，从牛奶产品中分离外泌体时还会出现其它技术难题。例如，牛奶外泌体是纳米粒子，并且大小典型地为10至200nm。占乳蛋白近80％的酪蛋白倾向于形成大小约为20至600nm的胶体聚集体。外泌体和酪蛋白聚集体的大小因此重叠。鉴于这种重叠，乳制品行业常用的基于大小的分离技术倾向于共纯化外泌体和酪蛋白。因此，需要改进的分离牛奶外泌体的方法。6.胰岛素敏感性抵抗、前驱糖尿病和糖尿病是葡萄糖失调的病况。生活方式改变和胰岛素增敏剂属于可用的治疗策略，但是这些通常会失败并且可能需要胰岛素疗法。饮食管理可改善代谢健康并使得体重减轻。计划随着时间的推移保持体重、维持和改善肌肉质量、服用维生素和矿物质可提高生活质量。不幸的是，在许多情况下，生活方式改变不足以完全治疗此类病况。因此需要用于改善胰岛素敏感性的新组合物和方法以治疗胰岛素抵抗、前驱糖尿病和糖尿病。技术实现要素：7.在一个实施方案中，本发明涉及一种从牛奶级分获得富含外泌体的产品的方法。所述方法包括提供含乳清的牛奶级分；第一离心，其包括对含乳清的牛奶级分进行离心以获得乳清中间级分；第二离心，其包括以与第一离心的速度相比增加的速度对乳清中间级分进行离心，以获得经浓缩乳清级分；过滤经浓缩乳清级分，以获得经过滤乳清级分；以及第三离心，其包括以与第二离心的速度相比增加的速度对经过滤乳清级分进行离心，以获得富含外泌体的产品，其中所述富含外泌体的产品包含完整外泌体和按所述富含外泌体的产品中的蛋白质的总重量计小于5重量％的酪蛋白。8.在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种从奶酪乳清中获得富含外泌体的产品的方法。所述方法包括第一离心，其包括对奶酪乳清进行离心以获得乳清中间级分；第二离心，其包括以与第一离心的速度相比增加的速度对乳清中间级分进行离心，以获得经浓缩乳清级分；过滤经浓缩乳清级分，以获得经过滤乳清级分；以及第三离心，其包括以与第二离心的速度相比增加的速度对经过滤乳清级分进行离心，以获得富含外泌体的产品，其中所述富含外泌体的产品包含完整外泌体和按所述富含外泌体的产品中的蛋白质的总重量计小于5重量％的酪蛋白。9.在另一实施方案中，本发明涉及一种源自牛奶的富含外泌体的产品，其包含完整外泌体和按所述富含外泌体的产品中的蛋白质的总重量计小于5重量％的酪蛋白。在另一实施方案中，本发明涉及通过如本文所述的方法获得的富含外泌体的产品。10.在另一实施方案中，本发明涉及一种营养组合物，其包含蛋白质、碳水化合物和/或脂肪以及源自牛奶的外泌体，其中外泌体是通过添加本发明的富含外泌体的产品提供的。在具体实施方案中，营养组合物呈粉末或液体形式。11.在另外的实施方案中，本发明涉及改善受试者的胰岛素敏感性的方法。所述方法包括向有患上胰岛素抵抗、前驱糖尿病或糖尿病的风险或患有所述疾病的受试者施用本发明的富含外泌体的产品或包含本发明的富含外泌体的产品的营养组合物。12.获得本发明的富含外泌体的产品的方法的优势在于它们适用于牛奶外泌体的工业化富集，并且进一步在于它们能够降低与其它牛奶外泌体分离和富集技术相关的成本，特别是如果在本发明方法中使用来自奶酪制作的乳清副产品作为起始材料。此外，在某些实施方案中，本发明的方法提供了改进的富含外泌体的产品，因为大小与牛奶外泌体相似的酪蛋白从或已经从奶酪乳清或含乳清的牛奶级分来源中基本上去除。另外，本发明的富含外泌体的产品有利于以方便和稳定的形式，并且在某些实施方案中，在营养组合物中提供包含生物活性剂，例如mirna的完整外泌体。因此促进了将富集的外泌体产品和营养组合物用于治疗益处，例如用于改善胰岛素敏感性。鉴于以下详细描述，本发明的这些和额外目的和优点将更加显而易见。13.附图简述14.附图说明了本发明的某些实施方案并且在本质上是示例性的，并且不旨在限制由权利要求书限定的本发明，其中：15.图1说明了与增加浓度的冷冻干燥奶酪乳清外泌体一起培育5或24小时的肌肉细胞中的葡萄糖摄取，如实施例2所述。具体实施方式16.本文描述了本发明的具体实施方案。然而，本发明可以许多不同形式来实施并且不应被理解为局限于本文中所阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案以向本领域技术人员说明本发明的某些实施方案的更具体特征。17.如本文所陈述的术语仅用于描述实施方案，并且不应被解释为总体上限制本公开。除非在进行引用的上下文中另有规定或明确暗示相反，否则对本公开的单一特征或限制的所有引用应包括对应的多个特征或限制，并且反之亦然。除非另有规定，否则“一(a/an)”、“所述”和“至少一个”可互换使用。此外，除非上下文另有清楚指示，否则如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一(a/an)”和“所述”包括其复数形式。18.就术语“包括(includes/including)”用于本说明书或权利要求书而言，其意图以与术语“包含(comprising)”在所述术语于权利要求书中用作过渡词时所解释类似的方式包括额外要素或步骤。此外，就使用术语“或”(例如a或b)而言，其意图指“a或b或两者”。当意指“仅a或b而不是两者”时，则采用术语“仅a或b而不是两者”。因此，在本文中术语“或”的使用是包括性的，而不是排他性的使用。当术语“和”以及“或”一起使用时，如在“a和/或b”中，这指示a或b以及a和b。19.本公开所述的富含外泌体的产品、营养组合物和方法可包含如本文所述的任何要素和步骤、由其组成或基本上由其组成。20.本文所公开的所有范围和参数(包括但不限于百分比、份数和比率)应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围以及端点之间的每个数字。例如，所陈述的“1至10”的范围应被认为包括以最小值1或更大开始并且以最大值10或更小结束的任何和所有子范围(例如1至6.1，或2.3至9.4)，以及所述范围内的每个整数(1、2、3、4、5、6、7、8、9和10)。21.除非在进行引用组合的上下文中相反地另有说明或清楚暗指，否则如本文所用的方法或工艺步骤的任何组合可按任何顺序进行。22.除非另外指示，否则所有百分比均为重量百分比。23.除非另有说明，否则本文所用的术语“源自牛奶的外泌体”是指已与其它牛奶组分，例如脂质、细胞和碎片基本上分离，并且浓度高于牛奶中的浓度的外泌体。外泌体是小的细胞外囊泡，并且只占牛奶总含量的一小部分。如本文所述的外泌体的富集产生了其中最初存在于乳中的外泌体被浓缩的产品。24.除非另有说明，本文所用的术语“富含外泌体的粉末”是指含有已从牛奶级分中分离的外泌体的干粉。将外泌体干燥以形成干粉。在具体实例中，分离的外泌体已被冷冻干燥以形成富含外泌体的粉末。25.除非另有说明，本文所用的术语“富含外泌体的产品”是指含有已从牛奶级分中分离的外泌体的产品。在具体实例中，分离的外泌体已被冷冻干燥以形成富含外泌体的产品。26.重要的是，本发明的富含外泌体的产品包含完整外泌体。完整外泌体是其中囊泡膜未受损且外泌体的内容物，例如功能性脂质(例如神经节苷脂、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺)、蛋白质(例如乳铁蛋白、免疫球蛋白)和调节性mirna(例如mir-23a、mir-26a、mir-26b、mir-27b)保留在外泌体内的外泌体。27.如前所述，牛奶含有外泌体，其含有可改善健康的生物活性剂。例如，牛奶含有多种mirna，用于促进各种器官、组织和系统的健康功能，范围从肌肉到骨骼，以及从脂肪到皮肤、大脑、肝脏、肠道和脉管系统。更具体地说，已知调节性mirna，包括mir23a、mir-26a、mir-26b和mir-27b在肌肉功能和葡萄糖代谢调节中发挥作用。然而，mirna倾向于快速降解，并且失去了此类有益功能。牛奶外泌体为mirna提供了保护环境，但目前用于分离外泌体的技术常常导致外泌体膜受损。此外，用于从牛奶中分离外泌体的现有技术难以在工业规模上实施。28.另外，已知的牛奶外泌体分离技术倾向于共纯化酪蛋白和外泌体。因此，需要一种从牛奶中分离外泌体的方法，所述方法提供富含外泌体的产品，所述产品含有非常低水平的酪蛋白，例如按富含外泌体的产品中的蛋白质的总重量计低于5、4、3、2、1、0.5、0.1重量％或甚至更低。如上所述，各种牛奶固体，例如酪蛋白在大小上与牛奶外泌体相似，并且因此在采用现有富集技术时与牛奶外泌体共分离。本发明提供了不仅减少酪蛋白与外泌体的共分离，而且还产生包含大量完整外泌体的富含外泌体的产品的方法。更进一步，本发明的方法适用于工业规模。29.通常，本发明的富含外泌体的产品是使用温和的程序从含乳清的牛奶级分来源，或更具体地从奶酪乳清来源获得的，所述程序不会破坏外泌体囊泡膜，从而使外泌体保持完整并且活性生物活性剂包含于外泌体结构中。30.在一个实施方案中，提供了一种含乳清的牛奶级分。在第一离心中，对含乳清的牛奶级分进行离心以获得乳清中间级分。在第二离心中，以与第一离心的速度相比增加的速度对乳清中间级分进行离心以获得经浓缩乳清级分，并且经浓缩乳清级分被过滤以获得经过滤乳清级分。在第三离心中，以与第二离心的速度相比增加的速度对经过滤乳清级分进行离心以获得富含外泌体的产品，其包含完整外泌体和按所述富含外泌体的产品中的蛋白质的总重量计小于5重量％的酪蛋白。31.在一个具体实施方案中，通过降低牛奶产品(典型地是脱脂牛奶)的ph以使牛奶固体沉淀并去除牛奶固体来提供含乳清的牛奶级分。这种级分通常作为奶酪制作中的副产品产生，并且称为酸乳清或酸奶酪乳清。在另一具体实施方案中，牛奶级分的ph降低至约3.0至4.6。32.当ph降低至约3.0至约4.6时，某些牛奶固体，例如酪蛋白会凝固。例如，由于酪蛋白的等电点为4.6，将含乳清的牛奶级分的ph降低至4.6会导致酪蛋白沉淀。接着可去除酪蛋白，从而减少在外泌体富集期间将与外泌体共分离的酪蛋白的量。因此，所得浓缩乳清级分所含的酪蛋白明显少于根据直接从牛奶中富集外泌体的典型方法所含的酪蛋白。令人惊讶的是，去除酪蛋白所需的低ph条件不会不利地影响所得牛奶级分中外泌体的完整性。因此，所得牛奶级分含有完整外泌体并且典型地具有约4.6的ph。33.在另一实施方案中，奶酪乳清(有时称为甜乳清或甜奶酪乳清)用作起始材料。奶酪乳清是牛奶在奶酪制作或酪蛋白制造过程中形成凝乳后的液体副产品。由于奶酪乳清在奶酪制造过程中已经从酪蛋白级分中分离出来，因此奶酪乳清的酪蛋白含量非常低。此外，奶酪乳清有利地保留了超过50％的牛奶营养成分，包括乳糖、脂肪、蛋白质、矿物盐，以及令人惊讶地，大量呈完整形式的最初存在于牛奶中的外泌体。除了这些益处之外，奶酪乳清还比生牛奶便宜，且因此使用奶酪乳清作为起始材料显著降低了生产富含外泌体的产品的成本。因此，奶酪乳清是一种用于分离牛奶外泌体和生产富含外泌体的产品的新型且有前景的来源。34.在一个具体实施方案中，奶酪乳清是通过将酶或酶混合物，并且更具体地，将蛋白酶，例如凝乳酶施加至牛奶以水解酪蛋白肽键，从而允许牛奶中酪蛋白的酶法凝固而获得的。因此，当蛋白酶裂解蛋白质时，它会使得牛奶中的酪蛋白凝固并形成凝胶结构。酪蛋白凝胶网络和乳脂接着一起收缩并形成凝乳。与凝乳分离的所得液体通常被称为甜乳清或奶酪乳清，典型地具有约6.0至约6.5的ph，并且包含乳清蛋白、乳糖、矿物质、水、脂肪和其它低含量组分。35.如上所述，重要的是酶或酶混合物能够通过裂解使牛奶中的酪蛋白稳定的肽而使牛奶中的酪蛋白不稳定。因此，任何适用于此目的的蛋白水解酶均可用于获得奶酪乳清。然而，在一个优选实施方案中，奶酪乳清是通过将凝乳酶添加至牛奶中，从而导致酪蛋白的酶法凝固来提供的。凝乳酶通常用于奶酪制作过程，并且包含一组在反刍哺乳动物的胃中产生的酶。这些酶通常包括凝乳酶、胃蛋白酶和脂肪酶。凝乳酶混合物通过蛋白水解裂解使牛奶中的蛋白质稳定的肽而使牛奶中的酪蛋白不稳定。如上所述，牛奶中的酪蛋白与乳脂一起凝固并收缩以形成奶酪凝乳。剩余的液体，即甜奶酪乳清包含乳清蛋白、乳糖、矿物质、水、脂肪和其它低含量组分。36.在另一具体实施方案中，首先对奶酪乳清进行离心以获得乳清中间级分。在第二离心中，对乳清中间级分进行离心至少两次以获得经浓缩乳清级分，并且经浓缩乳清级分被过滤以获得经过滤乳清级分。在第三离心中，以与第二离心的速度相比增加的速度对经过滤乳清级分进行离心以获得富含外泌体的产品，其包含完整外泌体和按所述富含外泌体的产品中的蛋白质的总重量计小于5重量％的酪蛋白。37.在其它具体实施方案中，富含外泌体的产品包含至少约10重量％的外泌体。在其它具体实施方案中，富含外泌体的产品包含至少约15、20、25、30或35重量％。在另外的实施方案中，富含外泌体的产品包含约10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、15-20、15-25、15-30、15-35、20-25、20-30、20-35、25-30、25-35或30-35重量％。在另一实施方案中，富含外泌体的产品中至少约50重量％的外泌体是完整的。在其它具体实施方案中，富含外泌体的产品中至少约55、60、65、70、75、80、85、90或95重量％的外泌体是完整的。38.在另外的实施方案中，按富含外泌体的产品中的蛋白质的总重量计，富含外泌体的产品包含小于4、3、2、1、0.5、0.1或甚至更低重量％的酪蛋白。39.获得本发明的富含外泌体的产品的方法可包括以特定速度、时间和/或温度离心。含乳清的牛奶级分或源自奶酪乳清的含乳清级分(以下称为“含乳清级分”)的第一离心将形成脂质级分顶层、乳清中间级分以及细胞和碎片的第一沉淀物。在具体实施方案中，含乳清级分可例如在约4℃下以12,000g离心约15分钟以去除残留脂肪，即脂质级分顶层，和其它碎片，即细胞和碎片的第一沉淀物。也可进行第二离心，其包括以与第一离心的速度相比增加的速度对乳清中间级分进行离心，以形成包含残留脂肪的上层、经浓缩乳清级分和其它碎片的第二沉淀物。在一个具体实施方案中，第二离心包括对乳清中间级分进行离心至少两次以获得经浓缩乳清级分。40.在另外的具体实施方案中，乳清中间级分可至少两次以21,500g在4℃下离心30分钟，以去除残留脂肪和其它碎片。在一个具体实施方案中，进行离心步骤直至所得经浓缩乳清级分基本上澄清。在另一实施方案中，过滤经浓缩乳清级分以获得经过滤乳清级分。在某些实施方案中，过滤经浓缩乳清级分的步骤可包括微滤。在这方面，经浓缩乳清级分可通过微滤器过滤以去除残留碎片。合适的过滤器的实例包括0.22μm聚醚砜(pes)过滤器或其它类似的亲水性、低蛋白质保留过滤器。最后，第三离心可例如按以下进行：以与第二离心的速度相比增加的速度对经过滤乳清级分进行离心以获得富含外泌体的产品，其中所述富含外泌体的产品包含完整外泌体和按所述富含外泌体的产品中的蛋白质的总重量计小于5重量％的酪蛋白。41.在具体实施方案中，第三离心包括对经过滤乳清级分进行超速离心以获得含有完整外泌体的第三沉淀物。在某些实施方案中，第三离心包括以与第二离心的速度相比增加的速度对经过滤乳清级分进行超速离心，例如在4℃下以100,000g离心1小时，以使经过滤乳清级分中所含的外泌体沉淀。42.在具体实施方案中，所述方法进一步包括在水性介质中培育含有完整外泌体的第三沉淀物以溶解第三沉淀物而不破坏外泌体膜，从而产生外泌体悬浮液。在某些实施方案中，第三沉淀物可用水性缓冲液悬浮于离心管中并在例如定轨摇床中以4℃和150rpm培育12-36小时。合适的水性悬浮液的实例包括无菌pbs缓冲液(137mm nacl、2.7mm kcl、8mm na2hpo4和2mm kh2po4；ph 7.4)或无菌分子生物学级水。接着可使用富含外泌体的产品，或者如果需要供以后使用，则例如在-80℃下冷冻至少2小时。43.在具体实施方案中，获得富含外泌体的产品的方法还包括干燥外泌体悬浮液。在另一实施方案中，干燥步骤可包括冷冻干燥。冷冻干燥的步骤可包括将外泌体悬浮液暴露于-80℃的温度和小于0.3毫巴的真空足够长的时间。在具体实施方案中，取决于待冷冻干燥的液体量和冷冻干燥设备的特征，时间可变化，但可为约5至约40小时，更具体地为约10至约30小时，或约15至约25小时。重要的是，所述过程应完全干燥外泌体。在实施例中所述的具体实施方案中，在-80℃的温度和小于0.3毫巴的真空下，冷冻干燥的时间段合适地为24小时或更长时间。一旦冷冻，有利的是在冷冻干燥之前保持外泌体冷冻，即避免解冻-冷冻循环。44.在具体实施方案中，富含外泌体的产品包含功能性脂质(即神经节苷脂、鞘磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺)、蛋白质(即乳铁蛋白和免疫球蛋白)、调节性mirna(即mir-23a、mir-26a、mir-26b和mir-27b)。如本领域技术人员将理解的，富含外泌体的产品可包含额外的生物活性分子。45.根据本发明的另一实施方案，提供了一种源自牛奶的富含外泌体的产品，其包含源自牛奶的完整外泌体和按所述富含外泌体的产品中的蛋白质的总重量计小于5重量％的酪蛋白。在特定实施方案中，按富含外泌体的产品中的蛋白质的总重量计，富含外泌体的产品包含小于4、3、2、1、0.5或0.1重量％的酪蛋白。46.在额外具体实施方案中，源自牛奶的富含外泌体的产品包含至少约10重量％的外泌体。在其它具体实施方案中，富含外泌体的产品包含至少约15、20、25、30或35重量％。在另外的实施方案中，富含外泌体的产品包含约10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、15-20、15-25、15-30、15-35、20-25、20-30、20-35、25-30、25-35或30-35重量％。根据某些实施方案，源自牛奶的富含外泌体的产品中至少50重量％的外泌体是完整的。在其它实施方案中，源自牛奶的富含外泌体的产品中至少约55、60、65、70、75、80、85、90或95重量％的外泌体是完整的。47.本发明的源自牛奶的富含外泌体的产品包含生物活性分子，例如功能性脂质、蛋白质和调节性mirna。在具体实施方案中，功能性脂质包括神经节苷脂、鞘磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。在其它具体实施方案中，蛋白质包括乳铁蛋白和免疫球蛋白。调节性mirna包括mir-23a、mir-26a、mir-26b和mir-27b。同样，如本领域技术人员将理解的，源自牛奶的富含外泌体的产品可包含额外的生物活性分子。48.在一个具体实施方案中，源自牛奶的富含外泌体的产品是粉末。本发明的源自牛奶的富含外泌体的粉末包含完整外泌体，即其中囊泡膜未破裂和/或以其它方式降解并且外泌体的生物活性内容物以活性形式保留在其中的外泌体。这种含外泌体的粉末在较高温度条件下表现出良好稳定性。49.在另一实施方案中，本发明的营养组合物包含蛋白质、碳水化合物和/或脂肪以及源自牛奶的外泌体，其中外泌体是通过添加本文所述的富含外泌体的产品或通过添加通过本文所述的方法获得的富含外泌体的产品提供的。外泌体可以任何有效提供营养或治疗益处的所需量包括于营养组合物中。在具体实施方案中，按营养组合物的重量计，营养组合物包含约0.001至约10重量％外泌体。50.种类繁多的一种或多种蛋白质、碳水化合物和/或脂肪可用于本发明的营养组合物中。例如，蛋白质可包括完整的、水解的和/或部分水解的蛋白质，其可来源于合适的来源，例如奶(例如酪蛋白、乳清)、动物(例如肉、鱼)、谷物(例如大米、玉米)、蔬菜(例如大豆、豌豆)和其组合。在营养组合物的具体实施方案中使用的蛋白质的更具体实例包括但不限于乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白分离物、乳清蛋白水解物、酸性酪蛋白、酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙、酪蛋白酸钾、酪蛋白水解物、乳蛋白浓缩物、乳蛋白分离物、乳蛋白水解物、脱脂奶粉、脱脂炼乳、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、大豆蛋白水解物、豌豆蛋白浓缩物、豌豆蛋白分离物、豌豆蛋白水解物、胶原蛋白、胶原蛋白分离物、大米蛋白质、马铃薯蛋白质、蚯蚓蛋白质和/或昆虫蛋白质，以及其两种或更多种的组合。本发明的具体实施方案包括蚕豆蛋白、乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白分离物、乳清蛋白水解物、乳蛋白浓缩物、乳蛋白分离物、乳蛋白水解物、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、大豆蛋白水解物、豌豆蛋白浓缩物、豌豆蛋白分离物、豌豆蛋白水解物以及其两种或更多种的组合。51.合适的碳水化合物的实例包括简单碳水化合物、复合碳水化合物或其组合。适用于本文所述的营养组合物中的碳水化合物的非限制性实例包括人乳寡糖(hmo)、麦芽糖糊精、玉米麦芽糖糊精、水解淀粉、葡萄糖聚合物、玉米糖浆、玉米糖浆固体、源自大米的碳水化合物、蔗糖、葡萄糖、乳糖、蜂蜜、糖醇、异麦芽酮糖、舒可慢(sucromalt)、三氯蔗糖、普鲁兰多糖(pullulan)、马铃薯淀粉、低聚半乳糖、燕麦纤维、大豆纤维、玉米纤维、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、纤维素凝胶、纤维素胶、瓜尔豆胶、结冷胶、刺槐豆胶、魔芋粉、羟丙基甲基纤维素、黄蓍胶、刺梧桐树胶、阿拉伯树胶、壳聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡甘露聚糖、黄原胶、海藻酸盐、果胶、低甲氧基果胶、高甲氧基果胶、谷类β-葡聚糖、角叉菜胶、洋车前子、抗消化碳水化合物，例如抗消化麦芽糖糊精、抗消化淀粉、缓慢消化碳水化合物、菊粉、低聚果糖以及其两种或更多种的组合。本发明的具体实施方案包括人乳寡糖(hmo)、麦芽糖糊精、玉米麦芽糖糊精、玉米糖浆、三氯蔗糖、纤维素凝胶、纤维素胶、结冷胶、角叉菜胶、低聚果糖以及其两种或更多种的组合。52.合适的脂肪的实例包括以下中的一种或多种：椰子油、分馏椰子油、大豆油(例如高油酸大豆油)、大豆卵磷脂、玉米油、橄榄油、红花油(例如高油酸红花油)、中链甘油三酯油(mct油)、高γ亚麻酸(gla)红花油、葵花油(例如高油酸葵花油)、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、芥花油(例如高油酸芥花油)、海洋油、鱼油(例如金枪鱼油)、海藻油、琉璃苣油、棉籽油、真菌油、二十碳五烯酸(epa)、二十二碳六烯酸(dha)、花生四烯酸(ara)、共轭亚油酸(cla)、α-亚麻酸、酯交换油(interesterified oil)、转酯油(transesterified oil)、结构化脂质和其组合。脂肪来源可包括甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、磷脂(例如卵磷脂)和/或游离脂肪酸。脂肪酸可包括但不限于癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸(ara)、二十碳五烯酸(epa)和/或二十二碳六烯酸(dha)。本公开的营养组合物可包括任何单独的脂肪来源或两种或更多种以上列出的各种脂肪来源的组合。更具体的实例包括芥花油、高油酸葵花油、中链甘油三酯和/或一种或多种脂肪酸，例如亚油酸、α-亚麻酸、ara、epa和/或dha。本发明的具体实施方案包含椰子油、分馏椰子油、大豆油、大豆卵磷脂、玉米油、红花油、葵花油、棕榈油精、芥花油、甘油单酯、卵磷脂以及其两种或更多种的组合。53.在一个具体实施方案中，蛋白质来源包含乳蛋白和/或大豆蛋白。在另一实施方案中，碳水化合物包含纤维。在另一实施方案中，脂肪包含至少一种ω-3脂肪酸。在一个具体实施方案中，组合物的至少一种ω-3脂肪酸选自由以下组成的组：二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、花生四烯酸和α-亚麻酸。54.在营养组合物的具体实施方案中，蛋白质占营养组合物的约1重量％至约30重量％。在更具体的实施方案中，蛋白质占营养组合物的约1重量％至约25重量％，包括占营养组合物的约1重量％至约20重量％、约1重量％至约15重量％、约1重量％至约10重量％、约5重量％至约10重量％或约10重量％至约20重量％。在额外具体实施方案中，蛋白质占营养组合物的约1重量％至约5重量％。在额外具体实施方案中，蛋白质占营养组合物的约20重量％至约30重量％。55.在营养组合物的具体实施方案中，碳水化合物以营养组合物的约5重量％至约75重量％的量存在。在更具体的实施方案中，碳水化合物以营养组合物的约5重量％至约70重量％，包括营养组合物的5重量％至约65重量％、约5重量％至约50重量％、约5重量％至约40重量％、约5重量％至约30重量％、约5重量％至约25重量％、约10重量％至约65重量％、约20重量％至约65重量％、约30重量％至约65重量％、约40重量％至约65重量％、或约15重量％至约25重量％的量存在。56.在具体实施方案中，营养组合物包含营养组合物的约0.5重量％至约30重量％的量的脂肪。在某些具体实施方案中，脂肪占营养组合物的约1重量％至约30重量％，包括营养组合物的约1重量％至约20重量％、约1重量％至约15重量％、约1重量％至约10重量％、约1重量％至约5重量％、约3重量％至约30重量％、约5重量％至约30重量％、约5重量％至约25重量％、约5重量％至约20重量％、约5重量％至约10重量％、或约10重量％至约20重量％。57.在具体实施方案中，营养组合物可呈粉末或液体形式。58.在具体实施方案中，当营养组合物是液体，例如由如本文所述的粉末复原或制成即饮产品时，份量范围为约1ml至约500ml，包括约110ml至约500ml、约110ml至约417ml、约120ml至约500ml、约120ml至约417ml、约177ml至约417ml、约207ml至约296ml、约230m至约245ml、约110ml至约237ml、约120ml至约245ml、约110ml至约150ml、以及约120ml至约150ml。在具体实施方案中，份量为约1ml、或约100ml、或约225ml、或约237ml、或约500ml。59.在具体实施方案中，当营养组合物为粉末时，例如，份量为约40g至约60g，例如45g、或48.6g、或50g，以粉末形式施用或在约1ml至约500ml，例如约225ml，或约230ml至约245ml的液体中复原。60.营养组合物的额外具体实施方案包含一种或多种组分以改变营养组合物的物理、化学、美学或加工特征或用作额外营养组分。额外组分的非限制性实例包括防腐剂、乳化剂(例如卵磷脂)、缓冲剂、包括人造甜味剂(例如糖精、阿斯巴甜、安赛蜜k、三氯蔗糖)的甜味剂、着色剂、调味剂、增稠剂、稳定剂等。61.营养组合物的具体实施方案可包含多种维生素和/或相关营养成分，其非限制性实例包括维生素a、维生素b12、维生素c、维生素d、维生素e、维生素k、硫胺素、核黄素、吡哆醇、烟酸、叶酸、泛酸、生物素、胆碱、肌醇和/或其盐和衍生物以及其组合。62.营养组合物的具体实施方案包含矿物质，其非限制性实例包括钙、磷、镁、锌、锰、钠、钾、钼、铬、铁、铜和/或氯化物以及其组合。63.由于粉末形式的外泌体的完整性质，外泌体和添加了粉末状外泌体的组合物适用于提供基于外泌体中的生物活性剂，包括完整外泌体中所含的各种mirna的营养或治疗益处。在具体实施方案中，粉末状外泌体和添加了粉末状外泌体的组合物适用于降低胰岛素抵抗、前驱糖尿病或糖尿病的风险，和/或适用于治疗胰岛素抵抗、前驱糖尿病或糖尿病。发生胰岛素抵抗、前驱糖尿病或糖尿病的风险因素可包括超重、久坐或每周体育活动少于3次、先前患有妊娠糖尿病或患有免疫病症。患有胰岛素抵抗、前驱糖尿病或糖尿病的受试者也经常肥胖、高血压、患有血脂异常、和/或患有肌肉减少症。64.在具体实施方案中，用于降低胰岛素抵抗、前驱糖尿病或糖尿病的风险或治疗这些病况的方法包括向受试者施用如本文所述的牛奶分离的粉末状外泌体或添加了如本文所述的牛奶分离的粉末状外泌体的营养组合物。营养组合物可根据需要以粉末或液体形式施用。在具体实施方案中，将牛奶分离的粉末状外泌体或添加了如本文所述的牛奶分离的粉末状外泌体的营养组合物每天或每周一次或多次施用于受试者。在具体实施方案中，每天或每周约1至约6次，或每天或每周约1至约5次，或每天或每周约1至约4次，或每天或每周约1至约3次向受试者施用营养组合物。65.在具体实施方案中，本发明的粉末状外泌体以有效量直接或通过添加至营养组合物施用以降低有患上胰岛素抵抗、前驱糖尿病和/或糖尿病的风险的受试者患上一种或多种此类病况的风险。在额外实施方案中，本发明的粉末状外泌体以有效量直接或通过营养组合物施用以治疗经诊断患有胰岛素抵抗、前驱糖尿病和/或糖尿病的受试者的一种或多种此类病况。在本文所述方法的具体实施方案中，将约0.01至约10g剂量的粉末状外泌体直接或通过添加至营养组合物施用于受试者。在额外实施方案中，将约0.1至约10g或约1至约5g剂量的粉末状外泌体直接或通过添加至营养组合物施用于受试者。66.以下实施例展现本发明的各种实施方案。67.实施例68.实施例1：奶酪乳清外泌体产品和表征69.此实施例描述了一种从奶酪乳清制备富含外泌体的产品的方法，以及所得产品的表征。奶酪乳清是通过将凝乳酶添加至牛奶中，导致酪蛋白的酶法凝固和甜奶酪乳清的产生来提供的，如上所述。70.在4℃下接收后，奶酪乳清被等分并立即在80℃下冷冻。将等分试样在冰上解冻并在4℃下以12,000g离心15分钟。丢弃上部级分(即脂质级分顶层)和沉淀物(即细胞和碎片的第一沉淀物)并将中间级分(即乳清中间级分)转移至干净的管中。将乳清中间级分两次在4℃下以21,500g离心30分钟，以去除残留脂肪(上层)和其它碎片(第二沉淀物)。通过0.22微米(μm)聚醚砜(pes)过滤器(亲水性、低蛋白质保留)过滤从乳清中间级分的第二离心获得的经浓缩澄清乳清级分以去除残留碎片。将所得滤液在4℃下以100,000g超速离心1小时以产生含有外泌体的第三沉淀物。71.分离后，将外泌体重悬于离心管中的无菌pbs缓冲液(137mm nacl、2.7mm kcl、8mm na2hpo4和2mm kh2po4；ph 7.4)或无菌分子生物学级水中。为了在不破坏奶酪乳清外泌体膜的情况下溶解沉淀物，将无菌pbs缓冲液或无菌分子生物学级水添加至离心管中，并将含沉淀物的缓冲液/水在定轨摇床中以4℃和150rpm培育12-36小时。溶解后，将富含外泌体的产品在-80℃下冷冻至少2小时。冷冻产品随后在telstar cryodos-80冷冻干燥机中在-80℃和《0.3毫巴下冷冻干燥至少24小时至48小时。冷冻产品在冷冻干燥前没有解冻。72.在冷冻干燥步骤之后，将外泌体产品重悬于液体中并分析以确定外泌体的蛋白质、脂质和mirna组成。73.如前一段中所指示，根据脂质组成分析外泌体。进行超高效液相色谱结合飞行时间质谱分析(uplc-tof-ms)，以分析实验室规模下通过超速离心过滤分离的外泌体产品的脂质含量。样品一式三份地运行。主要生物活性脂质的结果列于表1中，并证明富含外泌体的产品含有大量功能性脂质，包括神经节苷脂、鞘磷脂和磷脂酰胆碱。结果表示为总脂质的％。74.表1.奶酪乳清外泌体的脂质组成。[0075][0076]还分析了外泌体产品的蛋白质组成。通过lc-ms/ms测定蛋白质组成，并在proteome discoverer v1.4(数据库bos taurus，uniprot 06/19+proteomics污染物数据库)中搜索质谱。几种感兴趣的蛋白质的结果列于表2中，并且出人意料地表明酪蛋白以非常低的水平存在(例如仅检测到0.04％的α-s2-酪蛋白)。另外，结果表明检测到大量的生物活性蛋白质(即乳铁蛋白和免疫球蛋白)。结果表示为鉴定的总蛋白质的％。样品一式三份地运行。[0077]表2.奶酪乳清外泌体的蛋白质组成。[0078][0079]还分析了外泌体产品的mirna组成。对外泌体携带的mirna进行测序。分离总rna并简要检查纯度和完整性。在测试rna质量后，制备用于基于illumina的测序的多重微rna文库，并在illumina nextseq 500设备上进行测序。所得序列经处理并在mirbase(bos taurus 5.0.1数据库)中进行搜索。序列与人类对应物的序列相同的几种感兴趣的mirna的结果列于表3中，并表示为样品中鉴定的总mirna的％。富含外泌体的产品含有相对较高水平的这些mirna。样品一式三份地运行。[0080]表3.奶酪乳清外泌体级分的mirna谱。[0081][0082]实施例2：治疗结果[0083]此实施例证明，包含完整外泌体和按如上所述制备的富含外泌体的产品中的蛋白质的总重量计小于5重量％酪蛋白的富含外泌体的产品能够以剂量依赖性方式增加肌肉细胞中的葡萄糖摄取。这通过证明l6.c11骨骼肌细胞中葡萄糖摄取的体外剂量依赖性增强来显示。[0084]l6.c11分化的肌肉细胞在48孔板(corning,ny,usa)中生长。细胞与不同浓度的冷冻干燥外泌体(0-45μg/ml)一起培育并培育5或24小时。接着用由以下各者组成的krph(hepes缓冲krebs-ringer磷酸盐)冲洗细胞：118mmol/l nacl、5mmol/l kcl、1.3mmol/l cacl2、1.2mmol/l mgso4、1.2mmol/l kh2po4和30mmol/l hepes(ph 7.4)。接着立即将细胞与2-脱氧-[3h]d-葡萄糖(2-dg，放射性标记的葡萄糖)一起一式三份地培育10分钟。10分钟后通过快速吸出放射性培养基并用冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞三次来终止2-dg的摄取。通过在0.5n naoh中裂解细胞并用0.5n hcl中和，然后进行液体闪烁来确定与细胞相关的放射性。来自每个孔的等分试样用于通过bca蛋白质分析确定蛋白质浓度。测量了与细胞相关的放射性，并且结果阐述于图1中。结果表明，与对照(即添加0μg/ml外泌体)相比，与外泌体一起培育5和24小时的肌肉细胞均有效地增加了它们的葡萄糖摄取率。[0085]如图1中的结果所证明的，根据本发明的富含外泌体的产品能够以剂量依赖性方式增加葡萄糖摄取。通过增加肌肉细胞中的葡萄糖摄取，有可能通过改善胰岛素敏感性来增强对胰岛素抵抗和糖尿病受试者的葡萄糖水平和肌肉功能的控制。[0086]总之，本发明的富含外泌体的产品提供了几个优点。富含外泌体的产品含有高水平的某些mirna，其序列与其人类对应物的序列相同，包括例如表3中列出的那些。除了含有mirna，本发明的富含外泌体的产品还携带其它功能分子，包括生物活性脂质和蛋白质。此外，本发明的富含外泌体的产品能够被肌肉细胞摄取，并且能够以剂量依赖性方式增加葡萄糖摄取，并且这样做时提供了一种通过改善胰岛素敏感性来增强对胰岛素抵抗、前期糖尿病和糖尿病患者的葡萄糖水平和肌肉功能的控制的方法。因此，在具体实施方案中，富含外泌体的产品和/或含有富含外泌体的产品的营养组合物可用于改善受试者的胰岛素敏感性。[0087]本文描述的具体实施方案和实施例仅是示例性的，并且不限制由权利要求书限定的本发明。









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