一种具有抑制肝癌转移功能的基因抑制剂的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术一种具有抑制肝癌转移功能的基因抑制剂1.本案为分案申请，原申请的发明名称为：一种基因抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用，原申请的申请日为：2020-06-30，原申请的申请号为：cn202010200300.x。技术领域2.本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种基因抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用。背景技术：3.肝癌是目前临床上最为常见的癌症之一。肝癌每年的死亡率居全世界恶性肿瘤中的第三位，新发病率居全世界恶性肿瘤中的第五位，且肝癌的发生呈现出迅猛增加的趋势。肝癌的发病与病毒感染、非酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、遗传和环境因素等有关。大多数的肝癌患者是在晚期阶段被确诊治疗，所以患者的生存率较低。早诊断、早治疗是提高肝癌患者生存率的关键。4.人类基因组中只有少量的基因能够编码蛋白质，而98%的基因虽然可以转录形成rna，但是这些rna无法进一步的最终形成蛋白质，这些基因转录所形成的rna被称之为非编码rna.之前，人们将这些非编码rna视为转录噪音，并没有实际的具体功能。但是，最新的研究显示这些非编码rna具有基因调控功能。长链非编码rna是指长度大于200个碱基的非编码rna，而且其广泛存在于多种组织中，长非编码rna能够参与到细胞发育和代谢等多种生命功能调控途径中，包括基因重组、基因印记、细胞周期调控、染色质修饰、转录、翻译、mrna降解等。现有的研究表明，长链非编码rna的表达差异通常与癌症的发生、发展以及患者的术后恢复有着紧密的联系。一些异常表达的长链非编码rna能够作为癌症的基因诊断靶标，并且可以作为癌症患者早期诊断以及为判断癌症类型提供新的依据。因此，寻找新的肝癌相关lncrna基因标志物，对于实现肝癌患者的早期诊断和治疗具有重要的意义，并且也有助于肝癌药物的开发和利用。技术实现要素：5.本发明的目的在于一种在肝癌组织中高表达，且具有诊断价值的长链非编码rna，同时，本发明的目的在于提供一种用于制备治疗肝癌药物的长链非编码rna基因抑制剂。6.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明提供了一种肝癌相关的生物标志物，所述标志物为linc01988，所述linc01988在肝癌中高表达。7.优选地，所述linc01988的转录本为nr_144436.1，所述linc01988的序列如seq id no.1所示。8.其次，本发明提供了linc01988在制备用于诊断肝癌的试剂盒中的应用。9.优选地，所述试剂盒为实时荧光定量pcr试剂盒；所述实时荧光定量pcr试剂盒包括用于检测linc01988表达量的引物对；所述引物对的正向引物序列如seq id no.2所示，所示引物对的反向引物序列如seq id no.3所示。10.此外，本发明提供了linc01988基因抑制剂在制备治疗肝癌药物组合物中的应用。11.优选地，所述基因抑制剂为sirna，化学修饰sirna，shrna中的一种。12.优选地，所述基因抑制剂为sirna，所述sirna的正义链为seq id no.6，所述sirna的反义链为seq id no.7。13.优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的药物载体。14.除此之外，本发明提供了一种linc01988基因抑制剂，所述基因抑制剂用于制备治疗肝癌药物组合物。15.本发明的有益效果在于：本发明首次证明，长链非编码rna linc01988在肝癌组织中高表达，且检测linc01988癌旁和肝癌组织中的差异表达具有优异的诊断价值，因此，linc01988检测试剂盒可以用于肝癌患者的早期诊断。16.其次，本发明通过细胞划痕实验，transwell小室实验，western blot实验证明，通过linc01988基因抑制剂能够有效的抑制肝癌细胞的emt转化，从而有效的抑制肝癌的转移。因此，linc01988基因抑制剂可以用于制备治疗肝癌药物，从而为肝癌药物的开发开辟了新的途径。附图说明17.图1是linc01988在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况。18.图2是linc01988在肝癌组织和癌旁组织中表达情况的roc曲线。19.图3是linc01988转染linc01988的sirna对于肝癌hepg2细胞中linc01988表达的影响情况。20.图4是划痕实验检测干扰linc01988对肝癌hepg2细胞迁移的影响情况。21.图5是transwell实验检测干扰linc01988对肝癌hepg2细胞迁移和细胞侵袭的影响情况。22.图6是干扰linc01988对肝癌hepg2细胞emt相关蛋白 n-cadherin和vimentin蛋白表达的影响情况。具体实施方式23.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。如无特别说明，本发明所涉及的技术均为分子生物学或细胞生物学常规技术手段，其中涉及的酶、试剂以及反应条件均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。24.实施例1检测linc01988在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况1.研究对象选取20例肝癌组织以及相应的癌旁组织进行实验，组织来源于青岛市肿瘤医院，所有组织标本均通过医院伦理委员会审查和批准，所有组织标本来源患者均签署知情同意书。肝癌组织经病理检测证实为肝癌（肝癌组织切除时，患者尚未进行化疗，放疗等治疗）。25.具体标本如下：2.组织rna提取（1）从-80℃冰箱中取出组织标本，取约50mg组织标本放入到研钵中，加入少量的液氮，迅速的进行研磨，待组织变软后，再次加入少量液氮进行研磨，重复三次；（2）加入1ml trizol，使用自动匀浆器匀浆2分钟，匀浆结束后，将组织标本转移至离心管中，室温放置5min；（3）12000rpm离心5min，取上清，去除沉淀；（4）加入0.2ml氯仿，震荡混匀后，室温放置15分钟；（5）4℃ 12000rpm离心 15min；（6）取上清转移至另一个离心管中，加入等体积预冷的异丙醇混匀，混匀后冰上静置8分钟；（7）4℃ 12000rpm离心10分钟，去除上清，保留沉淀；（8）在沉淀中加入1ml 75%乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀；（9）4℃ 8000rpm离心5分钟，使用移液器小心的去除上清；（10）室温静置10分钟干燥rna，之后使用50μl depc水溶解沉淀；（11）使用微量紫外分光光度计测定组织总rna的纯度和浓度。26.3.逆转录获取cdna逆转录反应参照takara逆转录试剂盒说明书（1）去除基因组dna反应试剂：5×gdna eraser bufferꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ2.0μl，gdna eraserꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1.0μl，total rnaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1.0μg，rnase free dh2oꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀup to 10.0μl。27.反应条件：42℃ 2分钟，4℃。28.（2）逆转录反应反应试剂：步骤（1）的反应液ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ10.0μl，primescript rt enzyme mix iꢀꢀꢀꢀ1.0μl，rt primer mixꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1.0 μl，5×primescript buffer 2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ4.0 μl，rnase free dh2oꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ4.0 μl。29.反应条件：37℃ 15分钟，85℃ꢀꢀꢀꢀ5秒，4℃。30.4.荧光定量pcr检测反应试剂: sybr green premix ex taq（2×） 10.0μl，正向引物：ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ0.4μl，反向引物：ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ0.4μl，cdna模板ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ2.0μl，ddh2oꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ7.2μl。31.反应条件：95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 60s 40个循环；75℃ 5min。32.采用2‑△△ct方法处理实时定量pcr数据，计算linc01988的表达变化。33.linc01988引物序列为正向引物5’‐ꢀggacagctgccagagaatga-3’(seq id no.2)5’‐ꢀgctcagtggcatagggagtg-3’ꢀ(seq id no.3)gapdh引物序列为正向引物 5’‐ꢀacaactttggtatcgtggaaggꢀ‑3’（ seq no:4）反向引物 5’‐ꢀgccatcacgccacagtttcꢀ‑3’ꢀ（ seq no:5）实验结果肝癌组织和癌旁组织中linc01988的相对表达量结果如图1所示，可以看出，肝癌组织中的linc01988相对表达量（4.75±0.57）显著高于癌旁组织，且差异具有统计学意义（p ＜0. 0001）。34.使用graphpad prism5绘制linc01988相对表达量的roc曲线，结果如图2所示。linc01988的acu值为0.9088 (std. error 0.05008; 95% confidence interval 0.8106 to 1.007；p ＜0. 0001)，说明检测肝癌组织和癌旁组织中linc01988表达量差异具有有益的诊断价值。35.实施例2linc01988 sirna干扰效率检测1.si-linc01988序列为正义链：caccguguuucuuacugaaga（seq id no.6）反义链：uucaguaagaaacacggugga（seq id no.7）2.细胞培养人肝癌细胞hepg2采用高糖dmem培养液培养（10%胎牛血清），培养条件：细胞恒温培养箱37℃，5% co2。36.3.sirna转染（1）转染前一天将2×105的hepg2细胞接种到6孔细胞培养板上，37℃，5% co2细胞恒温培养箱中培养24h后，参照lipofectamine 2000说明书对细胞进行转染；（2）实验分组为对照组（空转染lipofectamine 2000），si-nc组，si-linc01988组，每组设置3个重复。37.4.荧光定量pcr检测linc01988的干扰效率（1）细胞总rna提取在6孔细胞培养板每孔中，加入500μl trizol，室温放置5分钟，充分裂解后，转移至离心管中；剩余步骤与实施例1组织rna提取步骤相同（相应添加量按比例减半）。38.（2）逆转录反应步骤和条件与实施例1相同。39.（3）荧光定量pcr检测步骤和条件与实施例1相同。40.实验结果实验结果如图3所示，可以看出，si-linc01988可以显著的抑制linc01988的表达，抑制率为82.3%。41.实施例3细胞划痕实验（1）将转染si-nc和si-linc01988的hepg2细胞接种至6孔板中；（2）当细胞密度达到85%时，使用200μl枪头在培养孔的垂直方向轻轻滑过贴壁细胞层，并且使用pbs洗去脱落下来的细胞；（3）分别于0h和24h在倒置显微镜下拍摄划痕。42.实验结果实验结果如图4所示，从图中可以看出，si-linc01988组的迁移距离显著小于si-nc组，说明抑制linc01988后能够抑制肝癌细胞hepg2的细胞迁移能力。43.实施例4transwell小室细胞迁移实验（1）将转染si-nc和si-linc01988的hepg2细胞消化，使用pbs洗涤细胞，之后使用无血清培养基悬浮细胞，并进行细胞计数；（3）在transwell小室的下室加入600μl含10%血清的培养基，上室中加入100μl 包含2.5×104个细胞的细胞悬液，继续于细胞培养箱中培养24h；（4）用镊子小心的将transwell小室取出，吸干上室的液体，将transwell小室转移到加入800μl甲醇的培养板中，室温固定30分钟；（5）将transwell小室取出，吸干上室固定液，转移到预先加入800μl giemsa染液的孔中，室温染色20分钟；（6）将transwell小室取出，用清水冲洗浸泡3次，吸去上室液体，用棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，置于显微镜下进行拍照。44.实验结果如图5细胞迁移所示，可以看出，si-linc01988组穿过transwell小室的细胞数量少于si-nc组穿过transwell小室的数量，说明抑制linc01988能够抑制肝癌细胞的迁移。45.实施例5（1）将固体matrigel胶置于4℃过夜融化为液态；（2）用移液器吸取200μl无血清培养基，加入40μl matrigel胶，冰上混匀，在transwell小室的上室加入100μl混匀后的matrigel胶，放入培养箱中孵育4小时，至matrigel胶完全变为固态；（3）将转染si-nc和si-linc01988的hepg2细胞消化，并且使用pbs洗涤细胞，之后使用无血清培养基悬浮细胞，并进行细胞计数；（4）在transwll下室中加入600 μl含10%血清的培养基，上室加入100μl包含2.5×104个细胞的细胞悬液，继续在细胞培养箱中培养24小时；（5）用镊子小心的将transwell小室取出，吸干上室液体，之后将transwell小室转移到加入800μl甲醇的培养板中，室温固定30分钟；（6）将transwell小室取出，吸干上室固定液，转移到预先加入800μl giemsa染液的孔中，室温染色20分钟；（7）用清水冲洗浸泡3次，取出transwell小室，吸去上室液体，用棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，置于显微镜下进行拍照。46.实验结果如图6细胞侵袭所示，从图中可以看出，si-linc01988组通过matrigel胶和transwell小室的细胞数量少于si-nc组，说明抑制linc01988能够抑制肝癌细胞的迁移。47.实施例6western blot实验（1）转染前一天将2×105的hepg2细胞接种到6孔培养板上， 37℃，5% co2细胞培养箱中培养24h后，参照lipofectamine 2000说明书对细胞进行转染，实验分组为si-nc组，si-linc01988组，每组重复3次；（2）转染48h后，pbs洗涤细胞，每孔加入100µl ripa细胞裂解液，裂解30分钟；（3）充分裂解后，将裂解液转移至离心管中，10000g/min，4℃ 离心10分钟，取上清至新的离心管；（4）吸取2µl，使用bca法进行蛋白定量，加入5×上样缓冲液调整蛋白样品为2μg/μl，沸水水浴煮5分钟；（5）12000rpm/min 离心5分钟，得到制备好的蛋白样品；（6）组装好电泳槽，配置5%上层胶和10%下层胶；（7）每孔加入20µg蛋白样品和蛋白marker指示剂；（8）电泳槽加入新配置的电泳缓冲液，按照上层胶电压80v，下层胶120v条件下开始电泳，待溴酚蓝指示剂移至胶底时，结束电泳；（9）组装转膜夹子，装入倒满转移液的转移槽中，250ma，转膜1.5h；（10）将转膜后的pvdf膜转移至5%的脱脂奶粉中，室温，封闭1h；（11）tbst洗膜3次，每次5min，孵育β-actin，e-cadherin，n-cadherin和vimentin一抗稀释液，4℃摇床孵育过夜；（12）tbst洗膜3次，每次5min，孵育二抗，室温，摇床孵育1h；（13）暗室中，快速将发光液滴加至pvdf膜上，进行显像。48.实验结果实验结果如图6所示，从图中可以看出，相较于si-nc组，si-linc1988组中肿瘤emt促进蛋白n-cadherin和vimentin的蛋白表达量下调，而emt抑制蛋白e-cadherin的蛋白表达量上调。说明抑制linc1988能够有效的抑制肝癌细胞的emt转化，从而有效的抑制肝癌的转移。49.综上所述，本发明证明，长链非编码rna linc01988在肝癌组织中高表达，因此，可以作为肝癌标志物来诊断肝癌患者。其次，本发明通过细胞划痕实验，transwell小室实验，western blot实验证明，通过linc01988基因抑制剂能够有效的抑制肝癌细胞的emt转化，从而有效的抑制肝癌的转移。因此，linc01988基因抑制剂可以用于制备治疗肝癌药物。









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