一种结节性皮肤病病毒单克隆抗体及其应用的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种结节性皮肤病病毒单克隆抗体及其应用。背景技术：2.结节性皮肤病(lsd)是一种由结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus， lsdv)引起的外来疾病，能够引起幼牛产生较高的死亡率(40～75％)及奶牛的产奶量下降、流产、肉牛产量下降等临床症状，从而造成了严重的经济损失。 lsd最早报道于1929年的撒哈拉以南的非洲地区，之后lsd的感染急剧蔓延，首先传播到非洲大部分地区，然后通过中东，并进一步传播到欧洲和欧亚大陆的亚洲部分。自2016年以来，在西南亚和东欧的许多国家，如土耳其、希腊、保加利亚、北马其顿共和国、塞尔维亚，都出现了lsd疫情，其次是东亚的几个新国家，包括中国，孟加拉和印度。3.lsd目前没有特效治疗药物，且我国没有商品化的结节性皮肤病的专用疫苗。结节性皮肤病病毒(lsdv)外来病毒，属于二类动物疫病，一类管理。即对该病毒的研究需要特定的实验室条件，这造成了对该病毒研究的障碍。4.已有的研究表明，lsdv与羊痘病毒(sppv)和山羊痘病毒(gtpv)同属于痘病毒科、羊痘病毒属(cappvs)。lsdv是一种相对较大的双链dna包膜病毒，基因组约为151kbp，包含156个预测基因，与其他两种羊痘病毒属的sppv 和gtpv的基因组具有97％的同源性，导致lsdv与山羊痘具有交叉保护作用。5.为此，我国目前疫苗的研究方向主要采用山羊痘病毒灭活疫苗来预防牛的结节性皮肤病。然而，由于lsd对于我国来说属于新型外来病，我国目前将该病按照二类动物疫病进行防控，感染牛按照要求应进行扑杀，无害化处理，且目前缺少有效的lsdv抗体检测试剂盒，导致相关疫苗研制过程中lsdv抗体阴性动物筛选较为困难，且靶动物的免疫效果评价只能采取涉及到具有活性的 lsdv的免疫攻毒法，存在较大的生物安全隐患。为此，急切需要建立快速、灵敏、特异的lsdv抗体elisa检测方法。6.现有技术中已经公开了结节性皮肤病病毒lsdv的p32蛋白及其抗原性，但获得的p32蛋白疏水性较强，影响了其生物学应用。现有技术获取的p32蛋白多以包涵体的形式存在，可溶性的蛋白量较少，而且对表达产物的处理过程复杂，表达量也偏低。技术实现要素：7.本发明的目的在于提供一种重组的lsdv的p32蛋白可溶性截断蛋白 rlp32δ，并提供一种分泌抗lsdv的杂交瘤细胞株，并利用该杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，进一步建立lsdv的阻断elisa检测方法，从而为lsdv疫苗的研发以及效力检验替代方法的研制提供技术支持。8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下。9.第一方面，本发明提供一种具有免疫原性的蛋白rlp32δ，所述rlp32δ的编码序列如seq id no.1的第4～717位所示。10.在一个具体实施例中，所述的编码序列是所按照大肠杆菌偏爱密码子对 lsdv的p32蛋白的1～238位氨基酸编码序列进行优化，并在c末端引入6×his 标签而合成基因片段glp32δ。11.进一步的，所述的蛋白rlp32δ的氨基酸序列如seq id no.2的第2～239位所示。12.在一个具体实施例中，其是由重组表达rlp32δ的宿主细胞大肠杆菌的bl21 (de3)细胞株作为生产菌株制备的；13.所述的菌株为大肠埃希氏菌bl/321株，保藏号为cgmcc no.24528。14.进一步的，所述的蛋白rlp32δ为可溶性蛋白。15.在一个具体实施例中，可溶性rlp32δ蛋白是用生产菌株大肠埃希氏菌 bl/321株经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后获得。16.第二方面，本发明提供一种分泌抗lsdv的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。17.一种分泌抗lsdv的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株为 lsdv杂交瘤细胞cp4e2；18.其的保藏号为cgmcc no.45131。19.在一个具体的实施例中，所述的杂交瘤细胞株由以下方法制备获得：20.s101山羊痘病毒作为抗原免疫动物，免疫后动物的脾细胞与sp2/0细胞融合；21.s102融合细胞利重组蛋白rlp32δ进行阳性克隆与亚克隆的筛选，能够稳定分泌抗lsdv单抗的杂交瘤细胞株为lsdv杂交瘤细胞cp4e2。22.第三方面，本发明提供一种lsdv的单克隆抗体。23.一种lsdv的单克隆抗体，所述的单克隆抗体由lsdv杂交瘤细胞cp4e2 分泌：24.所述的单克隆抗体为单克隆抗体4e2。25.在一个具体的实施例中，所述的单克隆抗体4e2从lsdv杂交瘤细胞cp4e2 的培养液中获得或用杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔产生腹水而获得。26.在一个具体的实施例中，所述的单克隆抗体4e2用杂交瘤细胞株cp4e2接种到小鼠腹腔产生腹水而获得。27.第四方面，本发明提供一种抗lsdv多克隆抗体的制备方法。28.一种抗lsdv多克隆抗体的制备方法，所述的制备方法为：用lsdv腹部皮下多点注射牛，攻毒后14天，采集发病牛的血清，从血清中分离得到lsdv 多克隆抗体。29.第五方面，本发明提供一种lsdv的单克隆抗体的用途。30.一种lsdv的单克隆抗体的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；31.所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中lsdv；32.所述药剂用于lsdv的抗体阴性动物的筛选和/或疫苗效力检验。33.单克隆抗体的制备是建立优良elisa检测方法的基础，而免疫原是单克隆抗体制备的关键。为此，本发明利用灭活的山羊痘病毒作为免疫原进免疫小鼠，并通过原核系统获得了lsdv免疫原性较强的p32蛋白的截断蛋白rlp32δ，利用rlp32δ用进行lsdv单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选以及后续elisa检测方法的建立，从而在最大程度上保持病毒抗原天然构象的同时，极大地避免了不必要的生物安全隐患。34.同时，本发明利用筛选获得的单克隆抗体建立lsdv抗体的阻断elisa检测方法，从而为lsdv相关疫苗的研究以及效力检验替代方法的研制提供了技术支持。35.本发明首次通过大肠杆菌表达系统获得以可溶性形式表达的lsdv截短的重组p32蛋白rlp32δ，并首次利用该蛋白作为包被抗原、灭活的山羊痘病毒作为免疫抗原进行抗单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选和lsdv抗体阻断elisa的建立。本发明技术方案具有以下优点：36.(1)首次通过密码子优化和人工合成技术，通过大肠杆菌表达系统实现了 lsdv的重组蛋白rlp32δ的可溶性表达，从而在避免了包涵体蛋白纯化的复杂性。37.(2)首次利用外源表达系统获得lsdv的重组蛋白和灭活的山羊痘病毒来制备单克隆抗体，能够降低lsdv的生物安全隐患。38.(3)首次利用利用纯度为90％以上rlp32δ作为包被抗原来建立lsdv抗体阻断elisa，既确保包被抗原的纯度，又解决了lsdv的安全隐患。39.本发明首次获得分泌抗lsdv的单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能够稳定、高效的分泌抗lsdv的单克隆抗体，并能实现大规模批量生产。40.本发明首次利用抗lsdv的单克隆抗体建立了一种lsdv的抗体阻断 elisa检测方法，该方法还具有样品操作简便、成本低廉、反应快速、特异性强等特点，从而为lsdv的抗体阴性动物的筛选和相关疫苗效力检验替代方法的研究提供了基础。细胞保藏：本发明提供的大肠埃希氏菌bl/321株、lsdv杂交瘤细胞cp4e2株，是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述大肠埃希氏菌bl/321株、lsdv杂交瘤细胞cp4e2株保藏名称为：大肠埃希氏菌escherichia coli、鼠源杂交瘤细胞，保藏号为cgmccno.24528、 cgmccno.45131。保藏日期为2022年3月14日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。大肠埃希氏菌bl/321株、lsdv杂交瘤细胞cp4e2株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心于2022年3月14日鉴定存活。附图说明41.图1为rlp32δ的可溶性表达鉴定结果。42.图2为rlp32δ纯化的sds-page鉴定结果。43.图3为单克隆抗体4e2纯化效果鉴定结果。44.图1中，1为未诱导细胞裂解物；2为15℃、16h诱导的细胞裂解物；3为 37℃、4h诱导的细胞裂解物；4为未诱导细胞裂解上清；5为15℃、16h诱导的细胞裂解上清；6为37℃、4h诱导的细胞裂解上清；7为未诱导细胞裂解沉淀； 8为15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；9为37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。45.图2中，m为protein marker；1为bsa(1μg)；2为纯化的rlp32δ蛋白。46.图3中，m为protein marker；1为纯化的单克隆抗体4e2。具体实施方式47.为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。48.实施例149.rlp32δ蛋白的制备50.1.rlp32δ的表达载体的构建51.(1)基因合成52.按照大肠杆菌偏爱密码子对lsdv(genbank:aak85035.1)p32蛋白的第 1～238位氨基酸编码序列进行优化，并在c末端引入6×his标签，用化学合成的方法人工合成基因片段glp32δ，共包含744个核苷酸。具体的核酸序列如 seq id no.1所示；具体的氨基酸序列如seq id no.2所示。53.(2)融合表达载体的构建54.以人工合成的glp32δ基因为模板，采用引物对1f/1r进行pcr扩增。55.其中上游引物1f序列为：[0056]5’‑cggccatatg gcagatattc c-3’；[0057]其5’端引入限制性内切酶nde i位点及保护性碱基。[0058]下游引物1r序列为：[0059]5’‑ccgcaagctt ttagtggtga tg-3’；[0060]其5’端引入限制性内切酶hind iii位点及保护性碱基。[0061]pcr体系为：buffer(mg2+plus)10μl，dntps 4μl，上、下游引物各1μl，聚合酶1μl，dna模板2μl，补充dd h2o至 50μl体系。[0062]pcr反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸 1min，共33个循环；最后72℃环延伸10min。[0063]扩增得到的目的dna条带回收后，采用nde i/hind iii双酶切消化，与经过相同酶切消化的pet30a载体连接，得到插入glp32δ基因阳性克隆 pet30a-glp32δ，将获得的原核表达质粒pet30a-glp32δ转化dh5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用。[0064]2.rlp32δ的表达与纯化[0065](1)重组glp32δ基因的基因工程菌株的构建[0066]将提取得到的质粒，转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经pcr鉴定，含有目的dna片段后，命名为大肠埃希氏菌(escherichia coli)bl/lp32δ株，并加入等体积的50％甘油lb，-70℃冻存。[0067](2)rlp32δ的表达与纯化[0068]将重组的大肠埃希氏菌(e.coli)bl/lp32δ株接种于1l含有卡那霉素的 lb液体培养基中发酵培养，37℃振荡培养od600为0.6～0.8时，加入终浓度为 0.5mm的iptg溶液诱导培养4h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体温重加10ml裂解液[0.02mol/l tris缓冲液(ph值7.2)，0.3mol/l nacl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体30min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400w，可溶性表达鉴定如图1所示。[0069]将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心10min，收集上清。按照ni-ida 亲和层析介质试剂盒(南京金斯瑞公司)的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白进行纯化，经0.22μm孔径滤膜过滤，即为初步纯化的目的蛋白rlp32δ。rlp32δ纯化的sds-page鉴定结果如图2所示。[0070]实施例2[0071]分泌节性皮肤病病毒p32蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选以及单克隆抗体腹水的制备[0072]1.balb/c小鼠的免疫及抗体效价测定[0073]用灭活后的山羊痘病毒为免疫抗原免疫6～8周龄balb/c小鼠3只，共免疫4次，每次间隔2周。[0074]首次免疫用蛋白加等体积弗氏完全佐剂，乳化后，经颈背部多点皮下注射途径免疫小鼠，50μg/只；此后免疫则将佐剂换成弗氏不完全佐剂，其他与首免相同；三免后7～10天，尾部小量采血，将纯化的rlp32δ以2μg/ml包被酶标板用间接elisa法测定血清效价，选取效价高于1:4000的小鼠在融合前三天加强免疫，直接用蛋白腹腔注射，剂量为50μg/只。最后一次免疫后3～5天取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合。[0075]2.细胞融合和杂交瘤细胞株的筛选[0076]取生长状态良好的骨髓瘤细胞sp2/0与上述elisa检测效价最高小鼠脾细胞利用peg1450进行化学法融合，运用以rlp32δ为包被抗原的间接elisa方法筛选阳性杂交瘤细胞，采用有限稀释法进行3～5次亚克隆后，得到1株分泌抗节性皮肤病病毒p32蛋白的杂交瘤细胞株4e2，按照isoquicktmstrips and kits for mouse monoclonal isotyping试剂盒说明书进行鉴定，该株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体亚型是g2a。[0077]3.抗节性皮肤病病毒p32蛋白单克隆抗体腹水的制备[0078]选用6～8月龄、健康的经产balb/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂致敏， 0.5ml/只，7d后注射杂交瘤细胞。收集上述三株对数生长期杂交瘤细胞以及 sp2/0细胞，800r/min离心10min，用dmem培养液将细胞洗涤一次后，重悬，调整细胞密度为106个/ml后，每只小鼠腹腔注射0.5ml。用酒精棉轻揉小鼠腹部，使细胞均匀分散于腹腔中；7～14天后，待小鼠腹部明显鼓胀时，用20ml 注射器的针头无菌刺入小鼠腹部下围鼓胀处，轻轻揉压，使腹水流出或滴出；用15ml离心管收集腹水，3000r/min离心10min，标记为4e2以及骨髓瘤细胞 sp2/0的腹水对照(s)，分装后置于-20℃保存备用。[0079]实施例3[0080]单克隆腹水的纯化及检测[0081]选用protein a(ge healthcare 17-5079-01)亲和柱纯化方法进行纯化，纯化步骤如下：[0082]样品预处理：用偶联缓冲液(20mm磷酸钠缓冲液，ph7.0)以1:3稀释腹水，12000rpm 4℃离心10min后，选用0.22μm滤膜过滤，除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质。[0083]平衡：用5～10倍柱体积的偶联缓冲液平衡柱子，保持流速为2s/滴。[0084]上样：用注射器把样品注入柱子上端接口，收集流出液于50ml离心管中，保持流速为4s/滴。[0085]洗杂：用5倍柱体积的偶联缓冲液过柱，保持流速为2s/滴。[0086]洗脱：用5倍柱体积洗脱缓冲液(0.1m柠檬酸钠缓冲液，ph9.0)洗脱抗体，收集于上述ep管中，保持流速为4s/滴。[0087]样品的检测：对纯化获得的单克隆抗体进行sds-page鉴定，经protein a 亲和柱纯化的方法获得了纯度很高的单克隆抗体；采用bca法进行单克隆抗体浓度的测定，其浓度可达3.2mg/ml。[0088]单克隆抗体4e2纯化效果鉴定结果如图3所示。[0089]实施例4[0090]单克隆抗体的hrp偶联[0091]取0.1mg的单克隆抗体4e2，加入25μl的活化hrp，用移液头反复吹打10 次混匀，加入2μl偶联催化液到上述已经加入抗体和hrp酶的混合物中，用移液头反复吹打10次混匀，室温静置反应2小时，得到hrp标记的4e2(hrp-4e2)，分装备用。[0092]实施例5[0093]基于单克隆抗体4e2的结节性皮肤病病毒(lsdv)抗体的阻断elisa检测方法的建立[0094]1.抗lsdv多克隆抗体的制备：[0095]选取牛作为免疫动物，用105.0tcid50的lsdv腹部皮下多点注射，攻毒后 14天，采集发病牛的血清，待用。[0096]2.lsdv抗体的阻断elisa检测方法条件的确定[0097](1)牛抗lsdv多克隆抗体和单克隆抗体的最佳工作浓度[0098]用pbs将纯化后的rlp32δ稀释至2μg/ml，100μl/孔，4℃封闭过夜，用pbst 洗涤三次，加入含5％脱脂奶粉的pbst溶液作为封闭液，200μl/孔，4℃封闭过夜；[0099]用pbst溶液洗涤3次，将96孔酶标板拍干，置于-20℃保存备用。[0100]从-20℃冰箱取出包被好的96孔酶标板，置于室温30min，加入获得的牛抗 lsdv多克隆抗体，稀释液选用pbs，稀释度依次为1:20、1:40和1:80，100μl/ 孔，同时加入相应稀释度的阴性血清，37℃孵育1h。[0101]用pbst溶液洗涤3次，加入hrp-4e2，稀释液选用pbs，浓度从2000倍系列稀释至1.6万倍，100μl/孔，37℃孵育30min。[0102]pbst溶液洗涤3次，加入可溶性tmb底物显色液50μl/孔，室温条件避光反应15min，用2m h2so4溶液终止反应，450nm处读取吸光值。[0103]选择阴性对照孔的od值接近1.0，同时阳性血清阻断率≥50％时所对应的稀释度为最佳工作浓度。[0104]最终确定牛抗lsdv多克隆抗体的工作稀释度为1:20，hrp-4e2的工作浓度为1:8000。[0105](3)结果判定标准的确定[0106]运用建立的抗体阻断elisa检测60份牛血清样品，同时设阳性和阴性对照，测定od450，计算平均值和标准差(s)＝9.208％。当样品阻断率则血清判为阳性；当则为阴性，对于介于二者间的判为可疑，需要重检一次，如仍为可疑则判为阳性。[0107](4)lsdv抗体阻断elisa方法特异性检测[0108]将牛的巴氏杆菌病抗体阳性血清、牛bvdv抗体阳性血清、a和d型产气荚膜梭菌毒素抗体阳性血清进行1:20稀释后，进行elisa检测。结果显示以上血清的阻断率均小于25.95％，呈阴性，表明无交叉反应，说明本方法特异性好。[0109](5)lsdv抗体阻断elisa方法的应用[0110]采用本发明提供的检测方法对5份lsdv攻毒发病牛血清和临床收集的无 lsd症状的30份牛血清，检测显示5份lsdv攻毒发病牛血清lsdv抗体均为阳性，临床收集的无lsd症状的30份牛血清lsdv抗体均为阴性。[0111]以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。[0112]另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。[0113]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。









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