用于诊断反复流产的分析方法及试剂盒

测量装置的制造及其应用技术1.本发明涉及一种用于提供诊断反复流产所需的信息的分析方法及用于诊断反复流产的试剂盒。背景技术：2.与过去不同，随着现代社会女性的社会地位的提高等，女性的初婚年龄增加，因此包括反复流产在内的各种与不孕相关的疾病的比例也在稳步上升。此外，由于反复流产，因传宗接代的压迫感而承受心理痛苦，并且往往会导致家庭破裂，因此加剧社会严重性。反复流产是指在妊娠20周之前发生2-3次以上连续流产的情况(kim,m.s.,gu,b.h.,song,s.,choi,b.c.,cha,d.h.,and baek,k.h.,iti-h4,as a biomarker in the serum of recurrent pregnancy loss patients.mol.biosyst.2011,7)。尽管反复流产是各种因素相互作用的结果，如胎儿或父母的染色体异常、子宫解剖异常、激素分泌异常、免疫学异常等，但40％至50％的反复流产的原因仍未被查明(li,l.；choi,b.c.；ryoo,j.e.；song,s.j.；pei,c.z.；lee,k.y.；paek,j.；baek,k.h.opposing roles of inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4in recurrent pregnancy loss.ebiomedicine 2018,37)。因此，到目前为止，没有反复流产的预防和诊断方法，并且没有特殊的治疗方法。3.近年来，作为反复流产的诊断方法有羊水穿刺检查、脐带血检查、绒毛膜活检等，但这些方法可能会导致流产等并发症，因此很多患者拒绝接受检查，并且在临床应用中受到很大的阻力。因此，本领域需要开发可以通过血液检查等容易地诊断反复流产的生物标记物并研究该生物标记物的作用。技术实现要素：要解决的技术问题4.本发明人对反复流产患者中表达特异性改变的基因进行了各种研究，其结果发现，htra4蛋白在反复流产患者中的表达显著低于正常人，并且揭示了htra4蛋白在反复流产中的功能。因此，htra4蛋白的低水平表达的检测可以有用地用于诊断反复流产，并且htra4蛋白或编码该蛋白的基因可以用作用于诊断反复流产的生物标记物。5.因此，本发明的目的在于提供一种利用htra4蛋白或编码该蛋白的基因的分析方法，以提供诊断反复流产所需的信息。6.此外，本发明的目的在于提供一种用于诊断反复流产的试剂盒，所述试剂盒包含可以测量htra4蛋白或编码该蛋白的基因的表达水平的分子。技术方案7.根据本发明的一个实施方案，提供一种分析方法，其包括测量受试者的样本中htra4蛋白的表达水平或编码该蛋白的基因的表达水平的步骤，以提供诊断反复流产所需的信息。8.在本发明的分析方法中，所述受试者的样本可以是血液或血清。所述htra4蛋白的表达水平可以通过蛋白质印迹法或酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)来进行测量，并且编码所述htra4蛋白的基因的表达水平可以通过测量mrna的量来进行测量，优选通过逆转录pcr(reverse transcription pcr，rt-pcr)或实时pcr(real time pcr)测量mrna的量来进行。9.根据本发明的另一个实施方案，提供一种试剂盒，其为包含可以测量htra4蛋白的表达水平或编码该蛋白的基因的表达水平的分子的用于诊断反复流产的试剂盒，所述分子是与所述蛋白特异性结合的抗体、底物、配体或辅因子(cofactor)，或者具有对编码所述蛋白的基因有特异性的互补序列的引物。10.本发明的诊断用试剂盒中，所述分子可以用可检测的标记物进行标记。另一个具体实施方案中，所述试剂盒可以为所述引物固定在基板上的微阵列形式。有益效果11.在本发明中发现htra4蛋白在反复流产患者中的表达显著低于正常人。因此，根据本发明的分析方法和试剂盒可以有用地用于诊断反复流产。即，htra4蛋白或编码该蛋白的基因可以有用地用作用于诊断反复流产的生物标记物。附图说明12.图1示出反复流产患者和正常组血清中确认htra4的表达水平的结果。(c表示正常组(对照组)，p表示反复流产患者)13.图2示出基于图1的结果对htra4的相对表达率进行统计分析的结果。14.图3示出通过蛋白质印迹分析在绒毛膜癌细胞株bewo、htr/svneo、jeg3细胞中确认htra4的表达水平的结果。15.图4示出通过t7e1分析确认敲除(knockout)htra4基因的两个bewo细胞株的敲除与否的结果。16.图5示出在野生型和经敲除的细胞株中对htra4基因被敲除的部分进行ta克隆并进行序列分析的结果。17.图6示出通过蛋白质印迹分析在野生型和经敲除的bewo细胞中确认htra4的表达水平的结果。18.图7示出用cck-8确认野生型和经敲除的bewo细胞的增殖能力的结果。19.图8示出通过集落形成分析确认野生型和经敲除的bewo细胞的增殖能力的结果。20.图9示出通过蛋白质印迹分析确认野生型和经敲除的bewo细胞中与细胞增殖相关的erk、p-erk、p38和p-p38的表达水平的结果。21.图10是基于图9的结果对erk、p-erk、p38和p-p38的相对蛋白表达率进行统计分析的结果。22.图11示出通过蛋白质印迹分析确认野生型和经敲除的bewo细胞中与细胞的周期相关的细胞周期蛋白e(cyclin e)和细胞周期蛋白a(cyclin a)的表达水平的结果。23.图12示出基于图11的结果对细胞周期蛋白e和细胞周期蛋白a的相对蛋白表达率进行统计分析的结果。24.图13示出通过侵袭分析(invasion assay)确认野生型和经敲除的bewo细胞的侵袭能力的结果。25.图14是示出通过蛋白质印迹分析确认野生型和经敲除的bewo细胞的与侵袭相关的mmp-2和mmp-9的表达水平的结果。26.图15示出基于图14的结果对mmp-2和mmp-9的相对蛋白表达率进行统计分析的结果。27.图16示出通过划痕分析(scratch wound assay)确认野生型和经敲除的bewo细胞的迁移能力的结果。28.图17是示出通过蛋白质印迹分析确认野生型和经敲除的细胞中与细胞的迁移能力相关的fak的表达水平的结果。29.图18示出基于图17的结果对fak的相对蛋白表达率进行统计分析的结果。30.图19示出用显微镜在彼此不同的放大倍数下拍摄野生型和经敲除的细胞的形态(morphology)的照片。31.图20示出通过蛋白质印迹分析确认野生型和经敲除的细胞中促进细胞与细胞之间的连接的血管内皮钙粘蛋白(ve-cadherin)的表达水平的结果。32.图21示出基于图20的结果对血管内皮钙粘蛋白的相对蛋白表达率进行统计分析的结果。具体实施方式33.在本说明书中，“反复流产(recurrent pregnancy loss)”是指妊娠20周之前连续流产2-3次以上的疾病。34.本发明人对从反复流产患者和正常组中分别分离的血清显示表达差异的基因进行了各种研究。其结果发现，特定蛋白即htra4蛋白在反复流产患者中的表达显著低于正常人。此外，为了研究htra4蛋白的表达变化对反复流产所产生的作用机制，本发明人选择htra4表达水平高的bewo细胞株并构建了htra4基因被敲除的细胞，并通过比较野生型和经敲除的细胞株来评价htra4对细胞的增殖、迁移、侵袭、粘附力等产生的影响。其结果发现，野生型bewo细胞的侵袭、粘附功能比经敲除的bewo细胞更活跃，但经敲除的bewo细胞中的细胞的增殖、迁移功能比野生型bewo细胞更活跃，并且htra4被敲除的bewo细胞周期比野生型bewo细胞短。从这些结果可知，htra4蛋白在受精卵的着床、胎盘形成、发育和功能中起着重要作用，因此，htra4蛋白和编码该蛋白的基因可以有用地用作预测反复流产的生物标记物和诊断试剂盒的生物标记物。35.本发明提供一种分析方法，其包括测量受试者的样本中htra4蛋白的表达水平或编码该蛋白的基因的表达水平的步骤，以提供诊断反复流产所需的信息。36.本发明的分析方法中用作生物标记物的所述htra4蛋白和编码该蛋白的基因是公知的，因此，可以将公知的蛋白质和基因序列用于本发明的分析方法中。即，htra丝氨酸肽酶4(htra serine peptidase 4，htra4)蛋白的ncbi登记号(ncbi accession number)为np_710159.1、xp_011542733.1、xp_011542734.1，编码该蛋白的mrna的ncbi登记号为nm_153692.4、xm_011544431.2、xm_011544432.1、bc057765.1。37.在本发明的分析方法中，所述受试者的样本是指从人体向体外分离的样本，例如，包含从人体向体外分离的血液、血清等。38.本发明的分析方法包括测量htra4蛋白的表达水平或编码该蛋白的基因的表达水平的步骤。所述htra4蛋白的氨基酸序列和编码该蛋白的基因序列可以是genbank等中公知的基因。39.htra4蛋白或基因的表达水平可以根据生命工程领域中通常使用的方法测量该蛋白或基因的mrna的水平(level)来进行测量。40.htra4蛋白的表达水平可以通过蛋白质印迹法或酶联免疫吸附分析来进行测量。例如，当htra4蛋白表达水平显著低于正常人的蛋白表达水平时(例如，至多约1/4)，可以判定为有反复流产风险的患者。此外，编码所述蛋白质水解调节酶的基因的表达水平可以通过测量mrna的量来进行测量，优选通过rt-pcr或实时pcr测量mrna的量来进行。当htra4的基因表达水平显著低于正常人的基因表达水平时，可以判定为有反复流产风险的患者。41.本发明还提供一种试剂盒，其为包含可以测量htra4蛋白的表达水平或编码该蛋白的基因的表达水平的分子的用于诊断反复流产的试剂盒，所述分子是与所述蛋白特异性结合的抗体、底物、配体或辅因子，或者具有对编码所述蛋白的基因有特异性的互补序列的引物。42.在本发明的诊断用试剂盒中，htra4蛋白可以通过生命工程领域中通常使用的方法制备多克隆抗体或单克隆抗体，并且可以制备包含该抗体的诊断用试剂盒。此外，已经揭示了所述htra4蛋白的功能，因此本发明的试剂盒还可以被制备成包含针对所述htra4蛋白的底物、配体或辅因子。此外，可以根据生命工程领域中通常使用的方法制备具有对编码所述蛋白质水解调节酶的基因有特异性的互补序列的引物，并且还可以制备包含该引物的诊断用试剂盒。43.本发明的诊断用试剂盒中，可以测量编码所述蛋白的基因的表达水平的分子可以用可检测的标记物(例如，发色团等)进行标记。此外，本发明的诊断用试剂盒具有所述引物固定在基板上的微阵列形式，因此也可以为dna芯片或蛋白芯片等芯片(chip)形式。44.以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。然而，下述实施例仅用于例示本发明，本发明并不受限于下述实施例。45.实施例46.1.试验方法47.(1)准备样本48.本试验获得了位于韩国首尔的cha医科大学伦理委员会的批准。本试验的所有参与者签署了知情同意书(informed consent)，该对于血液样本的研究获得了机构审查委员会(institutional review board)的批准(参考编号：08-16)。从cha医院不孕中心((cha综合医院生育中心)fertility center of the cha general hospital)就诊的反复流产患者组(60名)和正常组(32名)中采集血液，并分为外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)和血清，本试验仅使用了血清，并将其保存在-80℃。反复流产患者的诊断基准为妊娠20周之前至少有2-3次以上自然流产和连续流产记录的女性。正常组(对照组)以经过至少一次分娩的无产科(obstetric)并发症且无流产史的女性为基准。49.(2)htra4基因被敲除的bewo细胞株的构建50.从主页(http://www.rgenome.net)设计sgrna[正向引物：5'-cag cgg cac agg tcg aac acc gg-3'(序列号1)和反向引物：5'-aaa cca gac ttc acg ctc ggc-3'(序列号2)]，然后克隆到pspcas9(bb)-2a-gfp(px458)载体(addgene，质粒(plasmid)目录#：48138)上，以制备sgrna-px458质粒。根据制造商的说明书，使用lonza4d-nucleofector(龙沙(lonza)，50829clogne，德国(germany))并通过电泳(electrophoresis)将sgrna-px458质粒转染到绒毛膜癌细胞株bewo细胞(kclb:10098，韩国细胞株银行)。将所获得的细胞以1个细胞(cell)/孔(well)分于96孔板中，然后培养8天以达到60-70％的汇合度。根据制造商的说明书，使用accuprep基因组dna提取(genomic dna extraction)试剂盒(百奥尼公司(bioneer corporation)，大田(daejeon)，韩国(korea))提取基因组dna，使用正向引物：5'-gag ggt ttg cag gtc cag ag-3'(序列号3)和反向引物：5'-aca tgc tgg ggt agg tgc-3'(序列号4)进行聚合酶链式反应(pcr)。对于pcr产物，通过t7e1分析，仅选择htra4基因被敲除的细胞，并进行ta克隆以确认碱基序列。通过蛋白质印迹分析确认htra4的表达水平。[0051](3)集落形成分析(colony forming assay)[0052]将野生型(wild type)和经敲除的细胞株分别以相同的数量接种，然后用结晶紫(crystal violet)染色以进行集落形成分析。将细胞以1×103个细胞/孔接种到96孔板中，然后培养0小时、24小时、36小时、48小时、60小时。用含有10μl的wst-8溶液(细胞计数试剂盒(cell counting kit)-8dojindo，熊本(kumamoto)，日本(japan))的dulbecco改良eagle培养基(dulbecco's modified eagle medium，dmem)处理细胞，然后培养4小时，并在450nm下测量od值。并且，14天后，通过比较野生型和敲除细胞形成的集落的数量来确认细胞的增殖能力。[0053](4)划痕分析[0054]将野生型和敲除细胞株接种(seeding)到6孔板中，然后当细胞培养至70-80％的汇合度时，用微量吸管尖(micropipette tip)产生划痕。使用磷酸盐缓冲液洗涤细胞以除去剥离的细胞(stripped cells)，在0小时、24小时、48小时后使用image-j软件进行分析。使用显微镜(奥林巴斯(olympus)，东京(tokyo)，日本)拍摄数码照片。[0055](5)侵袭分析[0056]将野生型和敲除细胞株以1×106个细胞/ml的密度接种于具有无血清培养基(dmem)的24孔上室(80-μm孔膜(pore membranes)；bd生物科学(biosciences)，富兰克林湖(franklin lakes)，新泽西州(nj)，美国(usa))中。将包含10％的fbs的dmem培养基添加到下室中。在37℃下培养36小时，然后使用棉签(cotton swabs)将非侵袭性细胞从上室去除，将下膜表面上的细胞用结晶紫染色10秒以附着侵袭性bewo细胞。用磷酸盐缓冲液洗涤侵袭室2次，然后在显微镜(奥林巴斯，东京，日本)下计数侵袭性bewo细胞的数量。各实验重复3次。[0057](6)蛋白质印迹法[0058]将野生型和敲除细胞分别在冰上在裂解缓冲液(lysis buffer)中溶解20分钟，然后以13000rpm离心20分钟。将样本与2x sds蛋白上样缓冲液一起煮沸10分钟，然后将样本上样至sds-page凝胶中，并转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，pvdf)微多孔膜(millipore，比勒利卡(billerica)，马萨诸塞州(ma)，美国)上。将一抗与所述膜一同在4℃下过夜反应，然后进行洗涤，加入二抗，并在室温下反应1小时。使用ecl试剂溶液(young in frontier，首尔(seoul)，韩国)检测印迹。[0059](7)抗体[0060]htra4抗体购自proteintech(proteintech，罗斯蒙特(rosemont)，伊利诺伊州(il)，美国)，erk1/2抗体、p-erk(thr202/tyr204)抗体、p38抗体、p-p38抗体、细胞周期蛋白a抗体、细胞周期蛋白e抗体、血管内皮钙粘蛋白抗体购自cell signaling technology(cell signaling technology inc.，丹弗斯(danvers)，马萨诸塞州(ma)，美国)，mmp-2抗体、mmp-9抗体、p-fak(try397)抗体、β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自圣克鲁斯生物技术(santa cruz biotechnology，加利福尼亚州(ca)，美国)。[0061](9)所得结果的确认和分析[0062]使用image j(美国国立卫生研究院(national institutes of health)，贝塞斯达(bethesda)，马里兰州(md)，美国)进行密度计分析(densitometric analysis)，t-检验(t-test)通过graphpad prism版本(version)5(graphpad软件，拉荷亚(la jolla)，加利福尼亚州(ca)，美国)进行。anova通过用于显示显著差异的单向分析(one-way analysis)进行。[0063]2.试验结果[0064]将反复流产患者和正常对照组的血液分离为血清和pbmc，通过蛋白质印迹分析确认htra4在血清中的表达水平的结果如图1和图2所示。图1是反复流产患者和正常组的血清中确认htra4的表达水平的结果，图2是基于图1的结果对htra4的相对蛋白表达率进行统计分析的结果。从图1和图2的结果可以确认，htra4在反复流产患者中以显著低的水平表达。[0065]图3示出在绒毛膜癌细胞株bewo、htr/svneo、jeg3细胞中确认htra4的表达水平的结果，确认到htra4在bewo细胞中表达最多。图4是在htra4被敲除的两个bewo细胞株和野生型bewo细胞株中通过t7e1分析确认敲除与否的结果。k.o.1和k.o.2细胞株中htra4基因均被敲除，k.o.2中2个等位基因(allele)均被敲除。图5是k.o.2细胞株中显示的两条带进行ta克隆后进行序列分析的结果。确认到等位基因1中95个碱基(base)被敲除，等位基因2中35个碱基被敲除，利用k.o.2细胞株进行了后续的实验。[0066]图6是通过蛋白质印迹分析在野生型和经敲除的bewo细胞中确认htra4的表达水平的结果，可以确认经敲除的细胞中htra4的表达显著低。[0067]图7是用cck-8确认野生型和经敲除的bewo细胞的增殖能力的结果，可以确认经敲除的细胞的增殖能力在24小时后显示出统计学意义，并且随着时间的流逝增殖更快。图8是通过集落形成分析确认野生型和经敲除的bewo细胞的增殖能力的结果，可以确认经敲除的细胞的增殖能力如预期一样更强。[0068]图9是在野生型和经敲除的bewo细胞中确认与细胞增殖相关的erk、p-erk、p38和p-p38的表达水平的结果，图10是基于图9的结果对erk、p-erk、p38和p-p38的相对蛋白表达率进行统计分析的结果。从图9和图10的结果中可以确认，在具有更强的细胞增殖能力的敲除细胞中促进细胞的增殖的erk、p-erk、p38和p-p38表达更多。[0069]图11是通过蛋白质印迹分析确认作为调节细胞的周期的蛋白的细胞周期蛋白a和细胞周期蛋白e的表达水平的结果，图12是基于图11的结果对细胞周期蛋白a和细胞周期蛋白e的相对蛋白表达率进行统计分析的结果。从图11和图12的结果中可以确认，在野生型bewo细胞中与从g1期到s期的转化相关的细胞周期蛋白e的表达水平更高，但在经敲除的细胞中与从s期到g2期的转化相关的细胞周期蛋白a的表达水平更高。[0070]图13是通过侵袭分析确认野生型和经敲除的bewo细胞的侵袭能力的结果，可以确认经敲除的细胞的侵袭能力弱于野生型细胞。图14是通过蛋白质印迹分析确认野生型和经敲除的bewo细胞的与侵袭相关的mmp-2和mmp-9的表达水平的结果，图15是基于图14的结果对mmp-2和mmp-9的相对蛋白表达率进行统计分析的结果。从图14和图15的结果中可以确认，在经敲除的细胞中促进细胞的侵袭的mmp-2和mmp-9的表达水平低。[0071]图16是通过划痕分析确认野生型和经敲除的bewo细胞的迁移能力的结果，可以确认经敲除的细胞的迁移能力比野生型细胞更强。图17是确认野生型和经敲除的细胞中与细胞的迁移能力相关的fak的表达水平的结果，图18是基于图17的结果对fak的相对蛋白表达率进行统计分析的结果。从图17和图18的结果中可以确认，与野生型细胞相比，促进细胞的迁移的fak在迁移能力强的经敲除的细胞中更多表达。[0072]图19是用显微镜在彼此不同的放大倍数下拍摄野生型和经敲除的细胞的形态的照片。如图19中可以确认，野生型细胞彼此紧密接触而生长，但经敲除的细胞生长却没有细胞与细胞之间的紧密接触。图20是通过蛋白质印迹分析确认野生型和经敲除的细胞中促进细胞与细胞的连接的血管内皮钙粘蛋白的表达水平的结果，图21是基于图20的结果对血管内皮钙粘蛋白的相对蛋白表达率进行统计分析的结果。可以确认促进细胞与细胞的连接的血管内皮钙粘蛋白如预期一样与野生型细胞相比在敲除细胞中表达更少。[0073]3.讨论[0074]虽然已经对反复流产的原因进行了许多研究，但对蛋白酶在反复流产发病机制中的研究仍然不足。本发明人发现，htra4基因在反复流产患者的血清中的表达低于正常组。这证明htra4是反复流产的生物标记物，并且htra4可以应用于制备可利用少量的血液预测和诊断反复流产的试剂盒。[0075]基于这些结果，对htra4基因在反复流产中的功能进行了研究。为此，构建了敲除htra4基因的bewo细胞株，并将其与野生型bewo细胞进行了比较。其结果发现，htra4会促进胎盘的绒毛膜细胞的侵袭能力和粘附力，并抑制细胞的增殖能力和迁移能力。因此，发现反复流产患者中htra4的低表达影响胎盘的绒毛膜细胞功能，并导致胎盘的形成、发育和功能异常，从而导致流产。









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