抑制ASAH1基因表达的组合物和方法与流程

有机化合物处理,合成应用技术抑制asah1基因表达的组合物和方法1.相关申请2.本技术涉及于2020年3月5日提交的美国临时申请号no.62/985599的权益。上述申请的全部教导通过引用并入本文。技术领域3.本发明提供了用于降低细胞或动物中n-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1(asah1)mrna的量或活性，并在某些情况下用于降低细胞或动物中asah1蛋白的量的化合物、方法和药物组合物。此类化合物、方法和药物组合物可用于预防或改善神经疾病的至少一种症状或标志。这种神经系统疾病是球状细胞脑白质营养不良(gld)或克拉伯病(kd)。背景技术：4.酸性神经酰胺酶(acdase)是一种异二聚体蛋白，由非糖基化α亚基和糖基化β亚基组成，可催化神经酰胺合成和降解为鞘氨醇和脂肪酸。它由名为n-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1(asah1，n-酰基乙醇胺水解酶1，asah，php32，ec 3.5.1.23，ac，acdase，php，ec3.5.1，smapme)的基因编码。asah1的突变与播散性脂质肉芽肿病(farber disease)和伴有肌阵挛性癫痫的脊髓性肌萎缩症有关1。也有人提出asah1的过表达在胶质母细胞瘤的辐射抗性和复发性胶质母细胞瘤的发展中发挥了作用2。5.最近，acdase已被证明可将半乳糖神经酰胺分解代谢脱酰化为有毒的糖脂，半乳糖基鞘氨醇(psychosine)3。半乳糖基鞘氨醇长期以来一直被认为是球状细胞脑白质营养不良(也称为克拉伯病(krabbe disease)，一种溶酶体贮积病(lsd))的病理罪魁祸首4。6.克拉伯病是一种罕见的神经系统常染色体隐性遗传疾病。该疾病是由于编码半乳糖神经酰胺酶的galc基因突变所致5。半乳糖神经酰胺酶负责降解半乳糖神经酰胺和半乳糖基鞘氨醇6。galc缺乏会导致kd患者的半乳糖基鞘氨醇积累7。半乳糖基鞘氨醇已被证明对少突胶质细胞和神经元有毒8，并且循环中的半乳糖基鞘氨醇水平可以作为疾病表型和治疗效果的标志物9。twitcher小鼠(kd的一种小鼠模型)的半乳糖基鞘氨醇水平也有所增加。骨髓移植或干细胞疗法已被证明对twitcher小鼠和kd患者都提供了一些有益效果10。这类疗法的治疗效果与其降低的半乳糖基鞘氨醇水平有关。由于acdase可以将半乳糖神经酰胺脱酰化为半乳糖基鞘氨醇，因此以acdase为靶向的底物减少疗法对于kd是可行的。用twitcher小鼠杂交acdase敲除小鼠不仅减少了半乳糖基鞘氨醇的积累，而且延长了小鼠寿命3。卡莫氟(carmofur)对acdase的药理抑制作用也延长了twitcher小鼠的寿命。7.目前尚无获批的克拉伯病治疗方法。因此，需要一种治疗选择来减少克拉伯病中的致病物质——半乳糖基鞘氨醇，从而潜在地改变病程。技术实现要素：8.本发明提供了用于降低细胞或动物中n-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1(asah1)mrna的量或活性，并在一些实施方案中用于降低细胞或动物中asah1蛋白的量的化合物、方法和药物组合物，其中降低asah1的量或活性将是有益的。一些实施方案涉及减少细胞中asah1表达的方法，包括使细胞与本文所述的寡聚化合物或修饰的寡核苷酸接触。一些实施方案涉及减少患者中asah1表达的方法，包括施用如本文所述的寡聚化合物或修饰的寡核苷酸。9.在一些实施方案中，动物可以是转基因动物或腺病毒介导的病毒感染动物。10.在一些实施方案中，可用于降低asah1 mrna表达的化合物是寡聚化合物或修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡聚化合物包含修饰的寡核苷酸。11.本发明还提供了用于治疗疾病或病症的方法，其中减少asah1的量或活性asah1将是有益的。在一些实施方案中，该疾病是播散性脂质肉芽肿病、伴有肌阵挛性癫痫的脊髓性肌萎缩症或胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，胶质母细胞瘤是抗辐射胶质母细胞瘤或复发性胶质母细胞瘤。12.在一些实施方案中，该疾病是克拉伯病(kd)。附图说明13.图1展示了人hep3b细胞中asah1反义寡核苷酸(aso)的作用。14.图2展示了人hep3b细胞中修饰asah1反义寡核苷酸(aso)的作用。具体实施方式15.应当理解，前述的一般性描述和以下的详细描述都只是示例性和解释性的，而不是限制性的。在此，除非另有特别说明，单数的使用包括复数。如本文所用，除非另有说明，否则使用的“或”指“和/或”。此外，术语“包括”以及诸如“包括”和“包含”的其他形式的使用不是限制性的。此外，除非另有明确说明，诸如“元素”或“成分”之类的术语包括一个单元的元素和成分以及包括一个亚单元以上的元素和成分。16.本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应解释为限制所描述的主题。本技术中引用的所有文件或文件部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，在此通过引用明确并入本文讨论的文件的部分以及它们的全部内容。17.定义18.除非提供了具体定义，否则本文所述的与分析化学、合成有机化学以及药物和制药化学结合使用的术语及其程序和技术是本领域公知和常用的那些。在允许的情况下，在本公开的全文中引用的所有专利、申请、公开的申请、其他出版物和其他数据通过引用整体并入本文。19.除非另有说明，以下术语具有以下含义：20.如本文所用，“2'-脱氧核苷”是指包含2'-h(h)呋喃糖基糖部分(furanosyl sugar moiety)的核苷，如在天然存在的脱氧核糖核酸(dna)中发现的。在一些实施方案中，2'-脱氧核苷可包含修饰的核碱基或可包含rna核碱基(尿嘧啶)。21.如本文所用，“2'-取代的核苷”是指包含2'-取代的糖部分的核苷。如本文所用，关于糖部分的“2'-取代的”是指包含至少一个除h或oh之外的2'-取代基的糖部分。22.如本文所用，“5-甲基胞嘧啶”是指用连接到5位的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。23.如本文所用，“给药/施用”是指向动物提供药剂。24.如本文所用，“动物”是指人或非人动物。25.如本文所用，“有需要的个体”是指被选择用于治疗或疗法的需要此类治疗或疗法的人或非人动物。26.如本文所用，“反义活性”是指可归因于反义化合物与其靶核酸杂交的任何可检测和/或可测量的变化。在一些实施方案中，反义活性是与不存在反义化合物的情况下的靶核酸水平或靶蛋白水平相比，靶核酸或由此类靶核酸编码的蛋白质的量或表达降低。27.如本文所用，“反义化合物”是指能够实现至少一种反义活性的寡聚化合物。28.如本文所用，关于治疗的“改善”是指相对于不存在治疗时的相同症状而言至少一种症状的改善。在一些实施方案中，改善是症状的严重性或频率的降低或延迟发作或症状的严重性或频率的进展减慢。在一些实施方案中，症状或标志是共济失调、神经病变和聚集体形成。在一些实施方案中，这些症状的改善使得运动功能改善、神经病变减少或聚集物数量减少。29.如本文所用，“双环核苷”或“bna”是指包含双环糖部分的核苷。如本文所用，“双环糖”或“双环糖部分”是指包含两个环的修饰的糖部分，其中第二环通过连接第一环中的两个原子的桥形成，从而形成双环结构。在一些实施方案中，双环糖部分的第一环是呋喃糖基部分。在一些实施方案中，双环糖部分不包含呋喃糖基部分。30.如本文所用，“手性富集群”是指具有相同分子式的多个分子，如果特定手性中心是立构无规的(stereorandom)，其中群内在特定手性中心包含特定立体化学构型的分子的数量或百分比大于预期的在群内的同一特定手性中心包含相同的特定立体化学构型的分子的数量或百分比。在每个分子内具有多个手性中心的手性富集分子群可以包含一个或多个立构无规手性中心。在一些实施方案中，分子是修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，分子是包含修饰的寡核苷酸的化合物。31.如本文所用，“可切割部分”是指在生理条件下例如在细胞、动物或人内部被切割的原子键或基团。32.如本文所用，关于寡核苷酸的“互补”是指，当寡核苷酸的核碱基序列和其他核酸以相反方向对齐时，寡核苷酸或其一个或多个区域的至少70％的核碱基和另一种核酸或其一个或多个区域的核碱基能够彼此形成氢键。互补核碱基是指能够彼此形成氢键的核碱基。33.互补的核碱基对包括腺嘌呤(a)和胸腺嘧啶(t)、腺嘌呤(a)和尿嘧啶(u)、胞嘧啶(c)和鸟嘌呤(g)、5-甲基胞嘧啶(mc)和鸟嘌呤(g)。互补的寡核苷酸和/或核酸不需要在每个核苷处具有核碱基互补性。相反，可以允许一些错配。如本文所用，关于寡核苷酸的“完全互补”或“100％互补”是指寡核苷酸在寡核苷酸的每个核苷处与另一个寡核苷酸或核酸互补。34.如本文所用，“缀合基团(conjugate group)”是指直接或间接连接至寡核苷酸的原子基团。缀合基团包括缀合部分和将缀合部分连接至寡核苷酸的缀合连接子。35.如本文所用，“缀合连接子”是指原子基团，其包含将缀合部分连接到寡核苷酸的至少一个键。36.如本文所用，“缀合部分”是指通过缀合连接子与寡核苷酸连接的原子基团。37.如本文所用，寡核苷酸上下文中的“连续”是指彼此直接相邻的核苷、核碱基、糖部分或核苷间键。例如，“连续的核碱基”是指在序列中彼此直接相邻的核碱基。38.如本文所用，“gapmer”是指包含位于具有一个或多个核苷的外部区域之间的具有多个支持rnase h切割的核苷的内部区域的修饰寡核苷酸，其中包含内部区域的核苷在化学上不同于包含外部区域的核苷。内部区域可称为“间隙”，而外部区域可称为“翼”。除非另有说明，“gapmer”是指糖基序。除非另有说明，gapmer的间隙的核苷的糖部分是未修饰的2'-脱氧呋喃糖基。因此，术语“moe gapmer”表示在两翼中具有2'-moe核苷的糖基序和2'-脱氧核苷的间隙的gapmer。除非另有说明，moe gapmer可以包含一个或多个修饰的核苷间键和/或修饰的核碱基，并且此类修饰不一定遵循糖修饰的gapmer模式。39.如本文所用，“热点区域”是靶核酸上的一系列核碱基，其适用于降低靶核酸的量或活性的寡聚化合物，如下文实施例所示。40.如本文所用，“杂交”是指互补寡核苷酸和/或核酸的配对或退火。虽然不限于特定机制，但最常见的杂交机制涉及互补核碱基之间的氢键，其可以是watson-crick、hoogsteen或反向hoogsteen氢键。41.如本文所用，术语“核苷间键”是寡核苷酸中相邻核苷之间的共价键。如本文所用，“修饰的核苷间键”是指除磷酸二酯核苷间键之外的任何核苷间键。“硫代磷酸酯键”是修饰的核苷间键，其中磷酸二酯核苷间键的非桥连氧原子之一被硫原子取代。42.如本文所用，术语“抑制表达或活性”是指相对于未处理或对照样品中的活性表达，表达或活性减少或阻断，并不一定表示表达或活性完全消除。43.如本文所用，“连接子-核苷”是指将寡核苷酸直接或间接连接至缀合部分的核苷。连接子-核苷位于寡聚化合物的缀合连接子内。连接子核苷不被认为是寡聚化合物的寡核苷酸部分的一部分，即使它们与寡核苷酸邻接。44.如本文所用，“非双环修饰糖基”是指包含修饰如取代基的修饰的糖部分，该修饰不会在糖的两个原子之间形成桥以形成第二环。45.如本文所用，“错配”或“非互补”是指当第一和第二寡聚化合物比对时第一寡核苷酸的核碱基与第二寡核苷酸或靶核酸的相应核碱基不互补。46.如本文所用，“moe”是指甲氧基乙基。“2'-moe”是指2'-och2ch2och3基团代替核糖基糖部分的2'oh基团。47.如本文所用，“基序”是指寡核苷酸中未修饰和/或修饰的糖部分、核碱基和/或核苷间键的模式。48.如本文所用，“mrna”是指编码蛋白质的rna转录物，除非另有说明，包括前mrna和成熟mrna。49.如本文所用，“核碱基”是指未修饰的核碱基或修饰的核碱基。如本文所用，“未修饰的核碱基”是腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)、尿嘧啶(u)和鸟嘌呤(g)。如本文所用，“修饰的核碱基”是除未修饰的a、t、c、u或g之外的能够与至少一个未修饰的核碱基配对的原子基团。“5-甲基胞嘧啶”是修饰的核碱基。通用碱基是可以与五种未修饰的核碱基中的任意一种配对的修饰的核碱基。如本文所用，“核碱基序列”是指独立于任何糖或核苷间键合修饰的核酸或寡核苷酸中的连续核碱基的顺序。50.如本文所用，“核苷”是指包含核碱基和糖部分的化合物。核碱基和糖部分各自独立地未修饰或修饰。如本文所用，“修饰的核苷”是指包含修饰的核碱基和/或修饰的糖部分的核苷。修饰的核苷包括无碱基核苷，其缺乏核碱基。“连接的核苷”是以连续顺序连接的核苷(即，在连接的核苷之间不存在额外的核苷)。51.如本文所用，“寡聚化合物”是指寡核苷酸和任选的一个或多个附加特征，例如缀合基团或末端基团。寡聚化合物可以与与第一寡聚化合物互补的第二寡聚化合物配对或可以不配对。“单链寡聚化合物”是未配对的寡聚化合物。52.如本文所用，“寡核苷酸”是指通过核苷间键连接的连接核苷链，其中每个核苷和核苷间键可以被修饰或未修饰。除非另有说明，寡核苷酸由8-50个连接的核苷组成。53.如本文所用，“修饰的寡核苷酸”是指其中至少一个核苷或核苷间键被修饰的寡核苷酸。如本文所用，“未修饰的寡核苷酸”是指不包含任何核苷修饰或核苷间修饰的寡核苷酸。54.如本文所用，“药学上可接受的载体或稀释剂”是指适用于对动物给药的任何物质。类似的载体能够使药物组合物配制成，例如片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液和锭剂以供受试者口服摄取。在一些实施方案中，药学上可接受的载体或稀释剂是无菌水、无菌盐水、或无菌缓冲溶液。55.如本文所用，“药学上可接受的盐”是指化合物的生理学和药学上可接受的盐，例如寡聚化合物，即保留母体化合物的所需生物活性且不赋予其不希望的毒理作用的盐。56.如本文所用，“药物组合物”是指适合施用于受试者的物质的混合物。例如，药物组合物可以包含反义化合物和无菌水溶液。在一些实施方案中，药物组合物在某些细胞系中的自由摄取测定中显示出活性。57.如本文所用，“磷部分”是指包含磷原子的原子基团。在一些实施方案中，磷部分包括单-、二-或三-磷酸酯，或硫代磷酸酯。58.如本文所用，“前药”是指体外形式的治疗剂，其在动物或其细胞内转化为不同的形式。通常，前药在动物体内的转化是通过酶(例如内源性或病毒酶)或细胞或组织中存在的化学物质的作用和/或生理条件来促进的。59.如本文所用，“ome”是指甲氧基。“2'-ome”是指2'-och3基团代替核糖基糖部分的2'oh基团。60.如本文所用，“降低或抑制量或活性”是指相对于未处理或对照样品中的转录表达或活性而言，转录表达或活性的降低或阻断，并不一定表示转录表达或活性的完全消除。61.如本文所用，关于寡核苷酸的“自身互补”是指与其自身至少部分杂交的寡核苷酸。62.如本文所用，“标准细胞测定”是指实施例1中描述的测定及其合理变体。63.如本文所用，在具有相同分子式的分子群的上下文中的“立构无规手性中心”是指具有无规立体化学构型的手性中心。例如，在包含立构无规手性中心的分子群中，具有立构无规手性中心的(s)构型的分子的数目可以但不一定与具有立构无规手性中心的(r)构型的分子的数目相同。当手性中心的立体化学构型是非设计用于控制立体化学构型的合成方法的结果时，手性中心的立体化学构型被认为是无规的。在一些实施方案中，立构无规手性中心是立构无规硫代磷酸酯核苷间键。64.如本文所用，“糖部分”是指未修饰的糖部分或修饰的糖部分。如本文所用，“未修饰的糖部分”是指在rna中发现的2'-oh(h)呋喃糖基部分(“未修饰的rna糖部分”)，或在dna中发现的2'-h(h)部分(“未修饰的dna糖部分”)。未修饰的糖部分在3'和4'位置各有一个氢，在3'位置有一个氧，在5'位置有两个氢。如本文所用，“修饰的糖部分”或“修饰的糖”是指修饰的呋喃糖基糖部分或糖替代物。如本文所用，修饰的呋喃糖基糖部分是指包含非氢取代基代替未修饰的糖部分的至少一个氢的呋喃糖基糖。在一些实施方案中，修饰的呋喃糖基糖部分是2'-取代的糖部分。这种修饰的呋喃糖基糖部分包括双环糖和非双环糖。65.如本文所用，“糖替代物”是指具有除呋喃糖基部分之外的修饰的糖部分，其可以将核碱基连接到另一个基团，例如寡核苷酸中的核苷间键、缀合基团或末端基团。可以将包含糖替代物的修饰核苷掺入寡核苷酸内的一个或多个位置，并且此类寡核苷酸能够与互补的寡聚化合物或核酸杂交。66.如本文所用，“靶核酸”和“靶rna”是指设计反义化合物影响的核酸。67.如本文所用，“靶区域”是指设计寡聚化合物与之杂交的靶核酸的一部分。68.如本文所用，“末端基团”是指与寡核苷酸末端共价连接的化学基团或原子基团。69.如本文所用，“治疗有效量”是指为动物提供治疗益处的药剂的量。例如，改善了疾病的症状的治疗有效量。70.如本文所用，“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指施用本文所述的化合物以实现疾病、病症或病况的改变或改善。[0071]“部分(portion)”是指核酸的限定数量的连续(即连接的)核碱基。在一些实施方案中，部分是靶核酸的限定数量的连续核碱基。在一些实施方案中，部分是反义化合物的限定数量的连续核碱基。[0072]一些实施方案提供了用于降低n-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1(asah1)mrna和蛋白质表达的化合物、组合物和方法。在一些实施方案中，所述化合物是用于治疗、预防或改善asah1相关疾病的asah1特异性抑制剂。在一些实施方案中，所述化合物是靶向asah1的反义寡核苷酸。[0073]在一些实施方案中，提供了靶向人asah1核酸的反义化合物。在一些实施方案中，人asah1核酸是genbank登录号nm_004315.6中列出的序列(seq id no:1)：[0074][0075][0076][0077]一些实施方案提供靶向asah1的化合物，其中该化合物包含12-30个连接的核苷。在一些实施方案中，化合物由15-30、18-24、19-22、13-25、14-25或15-25个连接的核苷组成。在一些实施方案中，化合物包含至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或30个连接的核苷。在一些实施方案中，该化合物由20个连接的核苷组成。在一些实施方案中，该化合物由21个连接的核苷组成。[0078]合成的寡核苷酸化合物，其包含12-30个硫代磷酸酯连接的核苷酸，具有至少12个与seq id no:1的等长部分互补的连续核碱基。一些实施方案提供靶向asah1的化合物，其中该化合物由12-30个连接的核苷组成并且核碱基序列包含seq id no:1的任意核碱基序列中至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21或22个连续核碱基。合成的寡核苷酸化合物，其包含12至30个硫代磷酸酯连接的核苷酸，具有至少21个与seq id no:1的等长部分互补的连续核碱基。[0079]合成的寡核苷酸化合物，其包含12-30个硫代磷酸酯连接的核苷酸，其中该化合物的核碱基序列与seq id no:1的等长部分至少80％互补。[0080]在实施方案中，本发明提供了寡聚化合物，其包含由12-50个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸，其中修饰的寡核苷酸的核碱基序列与n-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1(asah1)核酸的等长部分至少90％互补，并且其中修饰的寡核苷酸包含至少一种修饰，所述修饰选自修饰的糖、糖替代物和修饰的核苷间键。[0081]在本文的任意实施方案中，本发明提供了寡聚化合物，其包含由10-30个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸，并且核碱基序列包含seq id no:23-43中任一个的至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基。[0082]在本文中寡聚化合物的任意实施方案中，当在修饰的寡核苷酸的整个核碱基序列上测定时，修饰的寡核苷酸的核碱基序列与seq id no:1的核碱基序列至少80％、85％、90％、95％或100％互补。[0083]在一些实施方案中，asah1特异性抑制剂是包含12-30个连接的核苷酸的合成寡核苷酸化合物，其中该化合物的核碱基序列与seq id no:1的250-450或700-1500的核碱基的等长部分至少80％互补。[0084]在一些实施方案中，基因沉默化合物靶向跨越seq id no:1的核碱基300-400、750-950、1100-1500的区域内的任意位置。[0085]在一些实施方案中，基因沉默化合物靶向跨越seq id no:1的核碱基350-400、800-900、1050-1450、500-600或930-960的区域内的任意位置。[0086]在一些实施方案中，基因沉默化合物靶向跨越seq id no:1的核碱基370-400、820-860、1100-1200、1200-1400、1250-1350、1300-1500、1300-1400或1350-1450的区域内的任意位置。[0087]在一些实施方案中，基因沉默化合物靶向跨越seq id no:1的核碱基350-400的区域内的任意位置。[0088]在一些实施方案中，基因沉默化合物靶向跨越seq id no:1的核碱基820-860的区域内的任意位置。[0089]在一些实施方案中，基因沉默化合物靶向跨越从seq id no:1的核碱基1100-1200的区域内的任意位置。[0090]在一些实施方案中，基因沉默化合物靶向跨越seq id no:1的核碱基1130-1175的区域内的任意位置。[0091]在一些实施方案中，基因沉默化合物靶向跨越seq id no:1的核碱基1250-1350的区域内的任意位置。[0092]在一些实施方案中，基因沉默化合物靶向跨越seq id no:1的核碱基1275-1325的区域内的任意位置。[0093]在一些实施方案中，基因沉默化合物靶向跨越seq id no:1的核碱基1300-1400的区域内的任意位置。[0094]在一些实施方案中，基因沉默化合物靶向跨越seq id no:1的核碱基1350-1450的区域内的任意位置。[0095]在一些实施方案中，基因沉默化合物靶向跨越seq id no:1的核碱基1350-1400的区域内的任意位置。[0096]在一些实施方案中，基因沉默化合物靶向跨越从seq id no:1的核碱基1375-1425的区域内的任意位置。[0097]在本文的任意实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷。[0098]在本文的任意实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷，该修饰的核苷包含修饰的糖部分。[0099]在本文的任意实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷，该修饰的核苷包含双环糖部分。[0100]在本文的任意实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷，该修饰的核苷包含具有2'-4'桥的双环糖部分，其中2'-4'桥选自-o-ch2-和-o-ch(ch3)-。[0101]在本文的任意实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷，该修饰的核苷包含修饰的非双环糖部分。[0102]在本文的任意实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷，该修饰的核苷包含非双环糖部分，该非双环糖部分包含2'-moe或2'-ome。[0103]在本文的任意实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷，该修饰的核苷包含糖替代物。[0104]在本文的任意实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷，该修饰的核苷包含选自吗啉基(morpholino)和pna的糖替代物。[0105]在本文的任意实施方案中，修饰的寡核苷酸具有糖基序，该糖基序包含：[0106]由1-6个连接的5'-核苷组成的5'-区域；[0107]由6-15个连接的中心区域核苷组成的中心区域；和[0108]由1-6个连接的3'-区域核苷组成的3'-区域；[0109]其中每个5'-区域核苷和每个3'-区域核苷包含修饰的糖部分，并且每个中心区域核苷包含未修饰的dna糖部分。[0110]在本文的任意实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。[0111]在本文的任意实施方案中，其中修饰的寡核苷酸的每个核苷间键是修饰的核苷间键。[0112]在本文的任意实施方案中，其中至少一个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。[0113]在本文的任意实施方案中，其中修饰的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷间键。[0114]在本文的任意实施方案中，其中每个核苷间键是磷酸二酯核苷间键或硫代磷酸酯核苷间键。[0115]在本文的任意实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核碱基。[0116]在本文的任意实施方案中，其中修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。[0117]在本文的任意实施方案中，其中修饰的寡核苷酸由12-22、12-22、14-22、16-22或18-22个连接的核苷组成。[0118]在本文的任意实施方案中，其中修饰的寡核苷酸由16、17、18、19、20、21或22个连接的核苷组成。[0119]在本文的任意实施方案中，其中修饰的寡核苷酸由21个连接的核苷组成。[0120]在本文的任意实施方案中，由修饰的寡核苷酸组成。[0121]在本文的任意实施方案中，包含缀合基团，该缀合基团包含缀合部分和缀合连接子。[0122]在本文的任意实施方案中，其中缀合基团包含galnac簇，该galnac簇包含1-3个galnac配体。[0123]在本文的任意实施方案中，其中缀合连接子由单键组成。[0124]在本文的任意实施方案中，其中缀合连接子是可切割的。[0125]在本文的任意实施方案中，其中缀合连接子包含1-3个连接子-核苷。[0126]在本文的任意实施方案中，其中缀合基团在修饰的寡核苷酸的5'端与修饰的寡核苷酸连接。[0127]在本文的任意实施方案中，其中缀合基团在修饰的寡核苷酸的3'端与修饰的寡核苷酸连接。[0128]在本文的任意实施方案中，包含末端基团。[0129]在本文的任意实施方案中，其中寡聚化合物是单链寡聚化合物。[0130]在本文的任意实施方案中，其中寡聚化合物不包含连接子-核苷。[0131]在实施方案中，本发明提供了一种反义化合物，其包含或由本文任意实施方案的寡聚化合物组成。[0132]在本文的任意实施方案中，本发明提供了修饰的寡核苷酸，其由10-30个连接的核苷组成，并且核碱基序列包含seq id no:23-43中任一个的至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基。[0133]在本文的任意实施方案中，本发明提供了寡聚化合物，其包含由10-30个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸，并且核碱基序列包含至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或至少14个与seq id no:1的热点的等长部分100％互补的连续核碱基。在实施方案中，在修饰的寡核苷酸全长上测量时，修饰的寡核苷酸的核碱基序列与seq id no:1至少90％互补。[0134]在实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本文任意实施方案中的寡聚化合物，或本文所述的修饰的寡核苷酸和药学上可接受的载体或稀释剂。[0135]在实施方案中，本发明提供了一种方法，该方法包括向动物给药本文所述的药物组合物。[0136]一些实施方案涉及减少细胞中asah1表达的方法，包括使细胞与本文所述的寡聚化合物或修饰的寡核苷酸接触。[0137]一些实施方案涉及减少患者中asah1表达的方法，包括施用如本文所述的寡聚化合物或修饰的寡核苷酸。[0138]在实施方案中，本发明提供抑制细胞中asah1表达的方法，包括使细胞与本文所述的寡聚化合物或修饰的寡核苷酸接触，从而抑制asah1的表达。[0139]在实施方案中，本发明提供抑制患者体内asah1表达的方法，包括施用本文所述的寡聚化合物或修饰的寡核苷酸，从而抑制asah1的表达。[0140]在实施方案中，本发明提供治疗与asah1相关的疾病的方法，包括向患有或有患上与asah1相关的疾病的风险的个体施用治疗有效量的本文所述的药物组合物，从而治疗与asah1相关的疾病。[0141]在本文的任意实施方案中，与asah1相关的疾病是克拉伯病。[0142]在实施方案中，本发明提供本文任意实施方案中的寡聚化合物的手性富集群，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸包含至少一个具有特定立体化学构型的特定硫代磷酸酯核苷间键。[0143]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸包含至少一个具有(sp)构型的特定硫代磷酸酯核苷间键。[0144]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸包含至少一个具有(rp)构型的特定硫代磷酸酯核苷间键。[0145]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸在每个硫代磷酸酯核苷间键处具有特定、独立选择的立体化学构型。[0146]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸在每个硫代磷酸酯核苷间键处具有(sp)构型。[0147]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸在每个硫代磷酸酯核苷间键处具有(rp)构型。[0148]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸在一个特定硫代磷酸酯核苷间键处具有(rp)构型且在每个剩余硫代磷酸酯核苷间键处具有(sp)构型。[0149]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸在5'至3'方向上具有至少3个sp、sp和rp构型的连续硫代磷酸酯核苷间键。[0150]在本文的任意实施方案中，其中修饰的寡核苷酸的所有硫代磷酸酯核苷间键是立构无规的。[0151]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸包含至少一个具有特定立体化学构型的特定硫代磷酸酯核苷间键。[0152]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸包含至少一个具有(sp)构型的特定硫代磷酸酯核苷间键。[0153]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸包含至少一个具有(rp)构型的特定硫代磷酸酯核苷间键。[0154]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸在每个硫代磷酸酯核苷间键处具有特定、独立选择的立体化学构型。[0155]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸在每个硫代磷酸酯核苷间键处具有(sp)构型。[0156]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸在每个硫代磷酸酯核苷间键处具有(rp)构型。[0157]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸在一个特定硫代磷酸酯核苷间键处具有(rp)构型且在每个剩余硫代磷酸酯核苷间键处具有(sp)构型。[0158]在本文的任意实施方案中，其中该群富含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸在5'至3'方向上具有至少3个sp、sp和rp构型的连续硫代磷酸酯核苷间键。[0159]在本文的任意实施方案中，其中修饰的寡核苷酸的所有硫代磷酸酯核苷间键是立构无规的。[0160]在一些实施方案中，本文提供了寡核苷酸，其由连接的核苷组成。寡核苷酸可以是未修饰的寡核苷酸(rna或dna)或可以是修饰的寡核苷酸。修饰的寡核苷酸相对于未修饰的rna或dna包含至少一种修饰。即，修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷(包含修饰的糖部分和/或修饰的核碱基)和/或至少一个修饰的核苷间键。[0161]修饰的核苷包含修饰的糖部分或修饰的核碱基，或包含修饰的糖部分和修饰的核碱基两者。[0162]在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个包含未修饰核碱基的核苷。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个包含修饰的核碱基的核苷。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个不包含核碱基的核苷，称为无碱基核苷。[0163]在一些实施方案中，修饰的核碱基选自：5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶、烷基或炔基取代的嘧啶、烷基取代的嘌呤以及n-2、n-6和o-6取代的嘌呤。在一些实施方案中，修饰的核碱基选自：2-氨基丙基腺嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-n-甲基鸟嘌呤、6-n-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫氧嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-丙炔基(-c≡c-ch3)尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-核糖基尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫氧嘧啶、8-卤代，8-氨基，8-硫醇，8-硫代烷基，8-羟基，8-氮杂和其他8-取代的嘌呤、5-卤代，特别是5-溴代、5-三氟甲基、5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-f-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤、3-脱氮杂鸟嘌呤、3-脱氮杂腺嘌呤、6-n-苯甲酰基腺嘌呤、2-n-异丁酰基鸟嘌呤、4-n-苯甲酰基胞嘧啶、4-n-苯甲酰基尿嘧啶、5-甲基-4-n-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基-4-n-苯甲酰基尿嘧啶、通用碱基、疏水碱基、混杂碱基(promiscuous base)、尺寸扩展碱基和氟化碱基。进一步修饰的核碱基包括三环嘧啶，例如1，3-二氮杂吩噁嗪-2-酮、1，3-二氮杂吩噻嗪-2-酮和9-(2-氨基乙氧基)-1，3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(g-clamp)。修饰的核碱基还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的那些，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其他核碱基包括公开于以下文献的那些：merigan等，u.s.3687808；the concise encyclopedia of polymer science and engineering.，kroschwitz，j.i.，ed.，john wiley&sons，1990，858-859；englisch等，angewandte chemie，international edition，1991，30，613；sanghvi，y.s.，第15章，antisense research and applications，crooke，s.t.和lebleu，b.，eds.，crc press，1993，273-288；第6章和第15章，antisense drug technology，crooke s.t.，ed.，crc press，2008，163-166和442-443。[0164]在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核苷酸可以使用任意核苷间键连接在一起。两种主要类型的核苷间连接基团取决于磷原子存在与否。代表性的含磷核苷间键包括但不限于含有磷酸二酯键(“p＝o”)(也称为未修饰或天然存在的键)的磷酸酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(“p＝s”)和二硫代磷酸酯(“hs-p＝s”)。代表性的不含磷的核苷间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-ch2-n(ch3)-o-ch2-)、硫代二酯、硫代氨基甲酸酯(-o-c(＝o)(nh)-s-)、硅氧烷(-o-sih2-o-)和n，n'-二甲基肼(-ch2-n(ch3)-n(ch3)-)。与天然存在的磷酸键相比，修饰的核苷间键可用于改变(通常是增强)寡核苷酸的核酸酶抗性。制备含磷和不含磷的核苷间键的方法为本领域技术人员所熟知。[0165]具有手性中心的代表性核苷间键包括但不限于烷基磷酸酯和硫代磷酸酯。包含具有手性中心的核苷间键的修饰寡核苷酸可以制备为包含立构无规核苷间键的修饰寡核苷酸群，或制备为包含特定立体化学构型的硫代磷酸酯键的修饰寡核苷酸群。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸群包含硫代磷酸酯核苷间键，其中所有的硫代磷酸酯核苷间键是立构无规的。这种修饰的寡核苷酸可以通过导致每个硫代磷酸酯键的立体化学构型随机选择的合成方法产生。尽管如此，如本领域技术人员所熟知的，每个单独的寡核苷酸分子的每个单独的硫代磷酸酯都具有确定的立体构型。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸群富含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸包含一个或多个特定的、独立选择的立体化学构型的特定硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，特定硫代磷酸酯键的特定构型存在于群中至少65％的分子中。在一些实施方案中，特定硫代磷酸酯键的特定构型存在于群中至少70％的分子中。在一些实施方案中，特定硫代磷酸酯键的特定构型存在于群中至少80％的分子中。在一些实施方案中，特定硫代磷酸酯键的特定构型存在于群中至少90％的分子中。在一些实施方案中，特定硫代磷酸酯键的特定构型存在于群中至少99％的分子中。这种手性富集的修饰寡核苷酸群可以通过本领域已知的合成方法产生，例如oka等，jacs 125，8307(2003)；wan等，nuc.acid.res.42，13456(2014)和wo 2017/015555中描述的方法。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸群富含具有至少一种指定的(sp)构型的硫代磷酸酯的修饰寡核苷酸。在一些实施方案中，修饰寡核苷酸群富含具有至少一种(rp)构型的硫代磷酸酯的修饰寡核苷酸。在一些实施方案中，包含(rp)和/或(sp)硫代磷酸酯的修饰寡核苷酸分别包含一个或多个下述结构式，式中“b”表示核碱基：[0166][0167]除非另有说明，本文所述的修饰寡核苷酸的手性核苷间键可以是立构无规的或具有特定立体化学构型。[0168]中性核苷间键包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、mmi(3'-ch2-n(ch3)-o-5')、酰胺-3(3'-ch2-c(＝o)-n(h)-5')、酰胺-4(3'-ch2-n(h)-c(＝o)-5')、甲缩醛(3'-o-ch2-o-5')、甲氧基丙基和硫代甲缩醛(3'-s-ch2-o-5')。其他的中性核苷间键包括包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、甲酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺的非离子键(参见例如：carbohydrate modifications in antisense research；y.s.sanghvi和p.d.cook，eds.，acs symposium series 580；第3章和第4章，40-65)。其他的中性核苷间键包括包含混合的n、o、s和ch2组分的非离子键。[0169]在一些实施方案中，修饰的糖部分是非双环修饰的糖部分。在一些实施方案中，修饰的糖部分是双环或三环糖部分。在一些实施方案中，修饰的糖部分是糖替代物。这样的糖替代物可以包含一个或多个对应于其他类型的修饰糖部分的取代基。[0170]在一些实施方案中，修饰的糖部分是非双环修饰的糖部分，其包含具有一个或多个取代基的呋喃糖基环，其中没有一个取代基团桥接呋喃糖基环的两个原子以形成双环结构。这种非桥接取代基可以位于呋喃糖基的任何位置，包括但不限于在2'、4'和/或5'位置的取代基。在一些实施方案中，非双环修饰的糖部分的一个或多个非桥接取代基是支链的。适用于非双环修饰的糖部分的2'-取代基的实例包括但不限于：2'-f、2'-och3(“ome”或“o-甲基”)和2'-o(ch2)2och3(“moe”)。在一些实施方案中，2'-取代基选自：卤素、烯丙基、氨基、叠氮基、sh、cn、ocn、cf3、ocf3、o-c1-c10烷氧基、o-c1-c10取代的烷氧基、o-c1-c10烷基、o-c1-c10取代的烷基、s-烷基、n(rm)-烷基、o-烯基、s-烯基、n(rm)-烯基、o-炔基、s-炔基、n(rm)-炔基、o-亚烷基-o-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基、o-芳烷基、o(ch2)2sch3、o(ch2)2on(rm)(rn)或och2c(＝o)-n(rm)(rn)，其中每个rm和rn独立地为h、氨基保护基团，或取代或未取代的c1-c10烷基，以及cook等，us 6531584；cook等，us 5859221和cook等，us 6005087中描述的2'-取代基。这些2'-取代基的一些实施方案可以进一步被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(no2)、硫醇、硫代烷氧基、硫代烷基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。适用于非双环修饰的糖部分的4'-取代基的例子包括但不限于烷氧基(例如甲氧基)、烷基以及manoharan等，wo 2015/106128中描述的那些。适用于非双环修饰的糖部分的5'-取代基的实例包括但不限于：5'-甲基(r或s)、5'-乙烯基和5'-甲氧基。在一些实施方案中，非双环修饰的糖部分包含多于一个非桥接糖取代基，例如，2'-f-5'-甲基糖部分，以及migawa等，wo 2008/101157和rajeev等，us 2013/0203836中描述的修饰的糖部分和修饰的核苷。[0171]在一些实施方案中，2'-取代的非双环修饰的核苷包含糖部分，该糖部分包含选自以下的非桥接2'-取代基：f、nh2、n3、ocf3、och3、o(ch2)3nh2、ch2ch＝ch2、och2ch＝ch2、och2ch2och3、o(ch2)2sch3、o(ch2)2on(rm)(rn)、o(ch2)2o(ch2)2n(ch3)2和n-取代乙酰胺(och2c(＝o)-n(rm)(rn))，其中每个rm和rn独立地为h、氨基保护基团，或取代或未取代的c1-c10烷基。[0172]在一些实施方案中，2'-取代的核苷非双环修饰的核苷包含糖部分，该糖部分包含选自以下的非桥接2'-取代基：f、ocf3、och3、och2ch2och3、o(ch2)2sch3、o(ch2)2on(ch3)2、o(ch2)2o(ch2)2n(ch3)2和och2c(＝o)-n(h)ch3(“nma”)。[0173]在一些实施方案中，2'-取代的非双环修饰的核苷包含糖部分，该糖部分包含选自以下的非桥接2'-取代基：f、och3、och2ch2och3。[0174]某些修饰的糖部分包含桥接呋喃糖基环的两个原子以形成第二个环的取代基，从而产生双环糖部分。在一些此类实施方案中，双环糖部分包含4'和2'呋喃糖环原子之间的桥。此类4'-2'桥接糖取代基的例子包括但不限于：4'-ch2-2'、4'-(ch2)2-2'、4'-(ch2)3-2'、4'-ch2-o-2'(“lna”)、4'-ch2-s-2'、4'-(ch2)2-o-2'(“ena”)、4'-ch(ch3)-o-2'(称为“受约束的乙基”或“cet”)、4'-ch2-o-ch2-2'、4'-ch2-n(r)-2'、4'-ch(ch2och3)-o-2'(“受约束的moe”或“cmoe”)及其类似物(参见，例如，seth等，us 7399845；bhat等，us 7569686；swayze等，us 7741457和swayze等，us 8022193)、4'-c(ch3)(ch3)-o-2'及其类似物(参见，例如，seth等，us 8278283)、4'-ch2-n(och3)-2'及其类似物(参见，例如，prakash等，us 8278425)、4'-ch2-o-n(ch3)-2'(参见，例如，allerson等，us 7696345和allerson等，us 8124745)、4'-ch2-c(h)(ch3)-2'(参见，例如，zhou等，j.org.chem.，2009，74，118-134)、4'-ch2-c(＝ch2)-2'及其类似物(参见，例如，seth等，us 8278426)、4'-c(rarb)-n(r)-o-2'、4'-c(rarb)-o-n(r)-2'、4'-ch2-o-n(r)-2'和4'-ch2-n(r)-o-2'，其中在每个r中，ra和rb独立地为h、保护基团或c1-c12烷基(参见，例如，imanishi等，us7427672)。[0175]在一些实施方案中，此类4'-2'桥独立地包含独立地选自以下的1-4个取代基：-[c(ra)(rb)]n-、-[c(ra)(rb)]n-o-、-c(ra)＝c(rb)-、-c(ra)＝n-、-c(＝nra)-、-c(＝o)-、-c(＝s)-、-o-、-si(ra)2-、-s(＝o)x-和-n(ra)-；[0176]其中：[0177]x为0、1或2；[0178]n为1、2、3或4；[0179]每个ra和rb独立地为h、保护基团、羟基、c1-c12烷基、取代的c1-c12烷基、c2-c12烯基、取代的c2-c12烯基、c2-c12炔基、取代的c2-c12炔基、c5-c20芳基、取代的c5-c20芳基、杂环自由基、取代的杂环自由基、杂芳基、取代的杂芳基、c5-c7脂环自由基、取代的c5-c7脂环自由基、卤素、oj1、nj1j2、sj1、n3、cooj1、酰基(c(＝o)-h)、取代的酰基、cn、磺酰基(s(＝o)2-j1)或亚磺酰基(s(＝o)-j1)；并且每个j1和j2独立地是h、c1-c12烷基、取代的c1-c12烷基、c2-c12烯基、取代的c2-c12烯基、c2-c12炔基、取代的c2-c12炔基、c5-c20芳基、取代的c5-c20芳基、酰基(c(＝o)-h)、取代的酰基、杂环自由基、取代的杂环自由基、c1-c12氨基烷基、取代的c1-c12氨基烷基或保护基团。[0180]其他双环糖部分是本领域已知的，参见，例如：freier等，nucleic acids research，1997，25(22)，4429-4443；albaek等，j.org.chem.，2006，71，7731-7740；singh等，chem.commun.，1998，4，455-456；koshkin等，tetrahedron，1998，54，3607-3630；kumar等，bioorg.med.chem.lett.，1998，8，2219-2222；singh等，j org.chem.，1998，63，10035-10039；srivastava等，j am.chem.soc，20017，129，8362-8379；wengel等，us 7053207；imanishi等，us 6268490；imanishi等us 6770748；imanishi等，us re44779；wengel等，us 6794499；wengel等，us 6670461；wengel等，us 7034133；wengel等，us 8080644；wengel等，us 8034909；wengel等，us 8153365；wengel等，us 7572582；ramasamy等，us 6525191；torsten等，wo 2004/106356；wengel等，wo 1999/014226；seth等，wo 2007/134181；seth等，us 7547684；seth等，us 7666854；seth等，us 8088746；seth等，us 7750131；seth等，us 8030467；seth等，us 8268980；seth等，us 8546556；seth等，us 8530640；migawa等，us 9012421；seth等，us 8501805；以及美国专利公开号，allerson等，us 2008/0039618和migawa等，us 2015/0191727。[0181]在一些实施方案中，双环糖部分和掺入此类双环糖部分的核苷进一步由异构体构型限定。例如，lna核苷(本文所述)可以是α-l构型或β-d构型。[0182][0183]α-l-亚甲氧基(4'-ch2-o-2')或α-l-lna双环核苷已掺入表现出反义活性的寡核苷酸中(frieden等，nucleic acids research，2003，21，6365-6372)。本文中，双环核苷的一般描述包括两种异构体构型。当本文的示例性实施方案中涉及到特定双环核苷(例如，lna或cet)的位置时，除非另有说明，它们都是β-d构型。[0184]在一些实施方案中，修饰的糖部分包含一个或多个非桥接糖取代基和一个或多个桥接糖取代基(例如，5'-取代和4'-2'桥接糖)。[0185]在一些实施方案中，修饰的糖部分是糖替代物。在一些此类实施方案中，糖部分的氧原子被例如硫、碳或氮原子取代。在一些此类实施方案中，此类修饰的糖部分还包含如本文所述的桥接和/或非桥接取代基。例如，某些糖替代物包含4'-硫原子和2'-位的取代基(参见，例如，bhat等，us 7875733和bhat等，us 7939677)和/或5'-位的取代基。[0186]在一些实施方案中，糖替代物包含具有非5个原子的环。例如，在一些实施方案中，糖替代物包含六元四氢吡喃(“thp”)。这种四氢吡喃可以被进一步修饰或取代。包含此类修饰的四氢吡喃的核苷包括但不限于己糖醇核酸(“hna”)、茴香醇(anitol)核酸(“ana”)、甘露醇核酸(“mna”)(参见，例如，leumann，cj.bioorg.&med.chem.2002，10，841-854)、氟代hna(f-hna)：[0187][0188](“f-hna”，参见，例如，swayze等，us 8088904；swayze等，us 8440803；swayze等，us 8796437和swayze等，us 9005906；f-hna也可以称为f-thp或3'-氟代四氢吡喃)，和包含具有下述结构式的其他修饰的thp化合物的核苷：[0189][0190]其中，独立地，对于每个所述修饰的thp核苷：[0191]bx是核碱基部分；[0192]t3和t4各自独立地是核苷间连接基团，其将修饰的thp核苷与寡核苷酸的其余部分连接；或者t3和t4中的一个是核苷间连接基团，其将修饰的thp核苷与寡核苷酸的其余部分连接，t3和t4中的另一个为h、羟基保护基团、连接的缀合基团或5'或3'-末端基团；[0193]q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地是h、c1-c6烷基、取代的c1-c6烷基、c2-c6烯基、取代的c2-c6烯基、c2-c6炔基或取代的c2-c6炔基，r1和r2各自独立地选自：氢、卤素、取代或未取代的烷氧基、nj1j2、sj1、n3、oc(＝x)j1、oc(＝x)nj1j2、nj3c(＝x)nj1j2和cn，其中x是o、s或nj1，并且每个j1、j2和j3独立地为h或c1-c6烷基。[0194]在一些实施方案中，提供了修饰的thp核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自分别是h。在一些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个是h之外的其他基团。在一些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个是甲基。在一些实施方案中，提供了修饰的thp核苷，其中r1和r2之一是f。在一些实施方案中，r1是f且r2是h，在一些实施方案中，r1是甲氧基且r2是h，并且在一些实施方案中，r1是甲氧基乙氧基且r2是h。[0195]在一些实施方案中，糖替代物包含具有多于5个原子和多于一个杂原子的环。例如，已经报道了包含吗啉基糖部分的核苷及其在寡核苷酸中的用途(参见，例如，braasch等，biochemistry，2002，41，4503-4510；summerton等，us 5698685；summerton等，us 5166315；summerton等，us 5185444；和summerton等，us 5034506)。如本文所用，术语“吗啉基”是指具有以下结构的糖替代物：[0196][0197]在一些实施方案中，可以修饰吗啉基，例如通过添加或改变来自上述吗啉基结构的各种取代基。这种糖替代物在本文中称为“修饰的吗啉基”。[0198]在一些实施方案中，糖替代物包含非环部分。包含此类非环糖替代物的核苷和寡核苷酸的例子包括但不限于：肽核酸(“pna”)、非环丁基核酸(参见例如，kumar等，org.biomol.chem.，2013，11，5853-5865)、以及manoharan等，wo2011/133876中描述的核苷和寡核苷酸。[0199]许多其他双环、三环糖和糖替代物环体系是本领域已知的，它们可用于修饰的核苷。[0200]在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷，该修饰的核苷包含修饰的糖部分。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷，该修饰的核苷包含修饰的核碱基。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷间键。在此类实施方案中，修饰的寡核苷酸的修饰的、未修饰的和不同修饰的糖部分、核碱基和/或核苷间键定义了其模式或基序。在一些实施方案中，糖部分、核碱基和核苷间键的模式各自彼此独立。因此，修饰的寡核苷酸可以通过其糖基序、核碱基基序和/或核苷间键基序来描述(如本文所用，核碱基基序描述了对核碱基的修饰，而与核碱基序列无关)。[0201]在一些实施方案中，寡核苷酸包含一种或多种类型的修饰的糖和/或未修饰的糖部分，其沿着寡核苷酸或其区域以限定的模式或糖基序排列。在某些情况下，此类糖基序包括但不限于本文讨论的任何糖修饰。[0202]在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含具有gapmer基序的区域或由其组成，gapmer基序由两个外部区域或“翼”和中央或内部区域或“间隙”限定。gapmer基序的三个区域(5'-翼、间隙和3'-翼)形成连续的核苷序列，其中每个翼的核苷的至少一些糖部分不同于间隙的核苷的至少一些糖部分。具体而言，至少每个翼的最靠近间隙的核苷的糖部分(5'-翼的最3'-核苷和3'-翼的最5'-核苷)与相邻间隙核苷的糖部分不同，从而限定了翼和间隙之间的边界(即翼/间隙连接)。在一些实施方案中，间隙内的糖部分彼此相同。在一些实施方案中，间隙包括一个或多个核苷，所述一个或多个核苷的糖部分不同于间隙的一个或多个其他核苷的糖部分。在一些实施方案中，两个翼的糖基序彼此相同(对称gapmer)。在一些实施方案中，5'-翼的糖基序不同于3'-翼的糖基序(不对称gapmer)。[0203]在一些实施方案中，gapmer的翼独立地包含1-6个核苷。在一些实施方案中，gapmer的翼独立地包含1-5个核苷。在一些实施方案中，gapmer的翼包含相同数量的核苷。在一些实施方案中，gapmer的翼包含4个核苷。在一些实施方案中，gapmer的每个翼的每个核苷是修饰的核苷。[0204]在一些实施方案中，gapmer的间隙包含7-24个核苷。在一些实施方案中，gapmer的间隙包含7-18个核苷。在一些实施方案中，gapmer的间隙包含9-14个核苷。在一些实施方案中，gapmer的间隙包含7-23个核苷。在一些实施方案中，gapmer的间隙包含9个核苷。在一些实施方案中，gapmer的间隙包含10个核苷。在一些实施方案中，gapmer的间隙包含11个核苷。在一些实施方案中，gapmer的间隙包含13个核苷。在一些实施方案中，gapmer的间隙包含14个核苷。在一些实施方案中，gapmer的间隙包含17个核苷。在一些实施方案中，gapmer的间隙包含18个核苷。在一些实施方案中，gapmer的间隙的每个核苷是未修饰的2'-脱氧核苷。[0205]在一些实施方案中，gapmer是脱氧gapmer。在实施方案中，每个翼/间隙连接的间隙侧的核苷是未修饰的2'-脱氧核苷，并且每个翼/间隙连接的翼侧的核苷是修饰的核苷。在一些实施方案中，间隙的每个核苷是未修饰的2'-脱氧核苷。在一些实施方案中，gapmer的每个翼的每个核苷是修饰的核苷。[0206]本文中，gapmer的三个区域的长度(核苷数)可以使用标注[5'翼中的核苷数]-[间隙中的核苷数]-[3'翼中的核苷数]表示。因此，5-10-5gapmer由每个翼中的5个连接核苷和间隙中的10个连接核苷组成。依照这种命名法，在特定修饰的情况下，该修饰是翼中的修饰，间隙核苷包含未修饰的脱氧核糖。因此，5-11-5moe或ome gapmer由5'-翼中的5个连接的moe或ome修饰的核苷、间隙中的11个连接的脱氧核苷和3'-翼中的5个连接的moe或ome核苷组成。[0207]在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸是4-13-4moe或ome gapmer。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸是5-11-5moe或ome gapmer。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸是3-15-3bna gapmer。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸是3-15-3lna gapmer。[0208]在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含或由具有完全修饰的糖基序的区域组成。在此类实施方案中，修饰寡核苷酸的完全修饰区域的每个核苷包含修饰的糖部分。在一些实施方案中，整个修饰寡核苷酸的每个核苷都包含修饰的糖部分。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含具有完全修饰的糖基序的区域或由其组成，其中完全修饰的区域内的每个核苷包含相同的修饰的糖部分，在本文中称为均匀修饰的糖基序。在一些实施方案中，完全修饰的寡核苷酸是均匀修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，均匀修饰的每个核苷包含相同的2'-修饰。在一些实施方案中，均匀修饰的糖基序长度为12-30个核苷。在一些实施方案中，均匀修饰的糖基序的每个核苷是2'-取代的核苷、糖替代物或双环核苷。在一些实施方案中，均匀修饰的糖基序的每个核苷包含2'-och2ch2och3基团或2'-och3基团。在一些实施方案中，具有至少一个完全修饰的糖基序的修饰寡核苷酸还可以具有至少1个、至少2个、至少3个或至少4个2'-脱氧核苷。[0209]在一些实施方案中，整个修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含修饰的糖部分(完全修饰的寡核苷酸)。在一些实施方案中，完全修饰的寡核苷酸包含不同的2'-修饰。在一些实施方案中，完全修饰的寡核苷酸的每个核苷是2'-取代的核苷、糖替代物或双环核苷。在一些实施方案中，完全修饰的寡核苷酸的每个核苷包含2'-och2ch2och3基团和至少一个2'-och3基团。[0210]在一些实施方案中，完全修饰的寡核苷酸的每个核苷包含相同的2'-修饰(均匀修饰的寡核苷酸)。在一些实施方案中，均匀修饰的寡核苷酸的每个核苷是2'-取代的核苷、糖替代物或双环核苷。在一些实施方案中，均匀修饰的寡核苷酸的每个核苷包含2'-och2ch2och3基团或2'-och3基团。[0211]在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25或至少26个核苷，该核苷包含修饰的糖部分。在一些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷是2'-取代的核苷、糖替代物、双环核苷或2'-脱氧核苷。在一些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷包含2'-och2ch2och3基团、2'-h(h)脱氧核糖基糖部分或cet修饰糖。[0212]在一些实施方案中，寡核苷酸包含沿寡核苷酸或其区域以限定的模式或基序排列的修饰的和/或未修饰的核碱基。在一些实施方案中，每个核碱基都被修饰。在一些实施方案中，没有一个核碱基被修饰。在一些实施方案中，每个嘌呤或每个嘧啶都被修饰。在一些实施方案中，每个腺嘌呤都被修饰。在一些实施方案中，每个鸟嘌呤都被修饰。在一些实施方案中，每个胸腺嘧啶都被修饰。在一些实施方案中，每个尿嘧啶都被修饰。在一些实施方案中，每个胞嘧啶都被修饰。在一些实施方案中，修饰寡核苷酸中的一些或所有胞嘧啶核碱基是5-甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，所有胞嘧啶核碱基都是5-甲基胞嘧啶，修饰寡核苷酸的所有其他核碱基都是未修饰的核碱基。[0213]在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含修饰的核碱基嵌段。在一些此类实施方案中，嵌段位于寡核苷酸的3'端。在一些实施方案中，嵌段位于寡核苷酸的3'端的3个核苷内。在一些实施方案中，嵌段位于寡核苷酸的5'端。在一些实施方案中，嵌段位于寡核苷酸的5'端的3个核苷内。[0214]在一些实施方案中，具有gapmer基序的寡核苷酸包含核苷，该核苷包含修饰的核碱基。在某些此类实施方案中，包含修饰的核碱基的一个核苷位于具有gapmer基序的寡核苷酸的中央间隙内。在一些此类实施方案中，所述核苷的糖部分是2'-脱氧核糖基部分。在一些实施方案中，修饰的核碱基选自：2-硫代嘧啶和5-丙炔嘧啶。[0215]在一些实施方案中，寡核苷酸包含沿寡核苷酸或其区域以限定的模式或基序排列的修饰的和/或未修饰的核苷间键。在一些实施方案中，每个核苷间连接基团是磷酸二酯核苷间键(p＝o)。在一些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间连接基团是硫代磷酸酯核苷间键(p＝s)。在一些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间键独立地选自：硫代磷酸酯核苷间键和磷酸二酯核苷间键。在一些实施方案中，每个硫代磷酸酯核苷间键独立地选自：立构无规硫代磷酸酯、(sp)硫代磷酸酯和(rp)硫代磷酸酯。在一些实施方案中，修饰寡核苷酸的糖基序是gapmer并且间隙内的核苷间键均被修饰。在一些此类实施方案中，翼中的一些或所有核苷间键是未修饰的磷酸键(phosphate linkage)。在一些实施方案中，末端核苷间键被修饰。在一些实施方案中，修饰寡核苷酸的糖基序是gapmer，并且核苷间键基序在至少一个侧翼中包含至少一个磷酸二酯核苷间键，其中至少一个磷酸二酯键不是末端核苷间键，并且其余的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在一些此类实施方案中，所有硫代磷酸酯键都是立构无规的。在一些实施方案中，翼中的所有硫代磷酸酯键都是(sp)硫代磷酸酯，并且间隙包含至少一个sp、sp、rp基序。在一些实施方案中，修饰寡核苷酸群富含包含此类核苷间键基序的修饰寡核苷酸。[0216]在一些实施方案中，将上述修饰(糖、核碱基、核苷间键)掺入修饰的寡核苷酸中。在一些实施方案中，修饰寡核苷酸的特征在于它们的修饰基序和总长度。在某些实施方案中，这些参数各自相互独立。因此，除非另有说明，具有gapmer糖基序的寡核苷酸的每个核苷间键可以被修饰或未修饰，并且可以遵循或不遵循糖修饰的gapmer修饰模式。例如，糖gapmer的翼区域中的核苷间键可以彼此相同或不同，并且可以与糖基序的间隙区域中的核苷间键相同或不同。同样，此类糖gapmer寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核碱基，而与糖修饰的gapmer模式无关。除非另有说明，所有修饰均独立于核碱基序列。[0217]其中群的所有修饰寡核苷酸具有相同分子式的修饰寡核苷酸群可以是立构无规群或手性富集群。所有修饰寡核苷酸的所有手性中心在立构无规群中都是立构无规的。在手性富集的群中，至少一个特定的手性中心在群的修饰寡核苷酸中不是立构无规的。在一些实施方案中，手性富集群的修饰寡核苷酸富含β-d构型的核糖基糖部分，并且所有硫代磷酸酯核苷间键都是立构无规的。在一些实施方案中，手性富集群的修饰寡核苷酸富含β-d构型的核糖基糖部分和特定立体化学构型的至少一个特定硫代磷酸酯核苷间键。[0218]可以增大或减小寡核苷酸的长度而不消除活性。例如，在woolf等(proc.natl.acad.sci.usa 89:7305-7309，1992)中，在卵母细胞注射模型中测试了一系列长度为13-25个核碱基的寡核苷酸引起靶rna切割的能力。长度为25个核碱基、在寡核苷酸末端附近有8个或11个错配碱基的寡核苷酸能够指导靶mrna的特异性切割，尽管程度低于不含错配的寡核苷酸。类似地，使用13个核碱基的寡核苷酸(包括具有1个或3个错配的那些)也实现了目标特异性切割。[0219]在一些实施方案中，寡核苷酸(包括修饰的寡核苷酸)可以具有多种长度范围中的任一种。在一些实施方案中，寡核苷酸由x-y个连接的核苷组成，其中x代表该范围内核苷的最少数量，y代表该范围内核苷的最大数量。在一些此类实施方案中，x和y各自独立地选自8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；前提是x≤y。例如，在一些实施方案中，寡核苷酸由12-13、12-14、12-15、12-16、12-17、12-18、12-19、12-20、12-21、12-22、12-23、12-24、12-25、12-26、12-27、12-28、12-29、12-30、13-14、13-15、13-16、13-17、13-18、13-19、13-20、13-21、13-22、13-23、13-24、13-25、13-26、13-27、13-28、13-29、13-30、14-15、14-16、14-17、14-18、14-19、14-20、14-21、14-22、14-23、14-24、14-25、14-26、14-27、14-28、14-29、14-30、15-16、15-17、15-18、15-19、15-20、15-21、15-22、15-23、15-24、15-25、15-26、15-27、15-28、15-29、15-30、16-17、16-18、16-19、16-20、16-21、16-22、16-23、16-24、16-25、16-26、16-27、16-28、16-29、16-30、17-18、17-19、17-20、17-21、17-22、17-23、17-24、17-25、17-26、17-27、17-28、17-29、17-30、18-19、18-20、18-21、18-22、18-23、18-24、18-25、18-26、18-27、18-28、18-29、18-30、19-20、19-21、19-22、19-23、19-24、19-25、19-26、19-29、19-28、19-29、19-30、20-21、20-22、20-23、20-24、20-25、20-26、20-27、20-28、20-29、20-30、21-22、21-23、21-24、21-25、21-26、21-27、21-28、21-29、21-30、22-23、22-24、22-25、22-26、22-27、22-28、22-29、22-30、23-24、23-25、23-26、23-27、23-28、23-29、23-30、24-25、24-26、24-27、24-28、24-29、24-30、25-26、25-27、25-28、25-29、25-30、26-27、26-28、26-29、26-30、27-28、27-29、27-30、28-29、28-30或29-30个连接的核苷组成。[0220]在一些实施方案中，寡核苷酸(未修饰或修饰的寡核苷酸)进一步由其核碱基序列描述。在一些实施方案中，寡核苷酸具有与第二寡核苷酸或经识别的参考核酸(例如靶核酸)互补的核碱基序列。在一些此类实施方案中，寡核苷酸的区域具有与第二寡核苷酸或经识别的参考核酸(例如靶核酸)互补的核碱基序列。在一些实施方案中，寡核苷酸的区域或整个长度的核碱基序列与第二寡核苷酸或核酸(例如靶核酸)至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。[0221]在一些实施方案中，本发明提供了寡聚化合物，其由寡核苷酸(修饰的或未修饰的)和可选的一个或多个缀合基团和/或末端基团组成。缀合基团由一个或多个缀合部分和缀合连接子组成，该缀合连接子将缀合部分与寡核苷酸连接。缀合基团可以连接到寡核苷酸的任一端或两端和/或任何内部位置。在一些实施方案中，缀合基团连接至修饰寡核苷酸的核苷的2'-位。在一些实施方案中，连接到寡核苷酸的一端或两端的缀合基团是末端基团。在一些此类实施方案中，缀合基团或末端基团连接在寡核苷酸的3'和/或5'-末端。在一些此类实施方案中，缀合基团(或末端基团)连接在寡核苷酸的3'端。在一些实施方案中，缀合基团连接在寡核苷酸的3'端附近。在一些实施方案中，缀合基团(或末端基团)连接在寡核苷酸的5'-末端。在一些实施方案中，缀合基团连接在寡核苷酸的5'端附近。[0222]末端基团的例子包括但不限于缀合基团、封端基团、磷酸酯部分、保护基团、修饰或未修饰的核苷，以及独立修饰或未修饰的两个或多个核苷。[0223]在一些实施方案中，寡核苷酸与一个或多个缀合基团共价连接。在一些实施方案中，缀合基团改变所连接的寡核苷酸的一种或多种性质，包括但不限于药效、药代动力学、稳定性、结合性、吸收性、组织分布、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除。[0224]在一些实施方案中，缀合基团赋予其连接的寡核苷酸以新的特性，例如使寡核苷酸能够被检测的荧光团或报告基团。某些缀合基团和缀合部分已在前文描述过，例如：胆固醇部分(letsinger等，proc.natl.acad.sci.usa，1989，86，6553-6556)、胆酸(manoharan等，bioorg.med.chem.lett.，1994，4，1053-1060)、硫醚，例如己基-s-三苯甲基硫醇(manoharan等，ann.n.y.acad.sci.，1992，660，306-309；manoharan等，bioorg.med.chem.lett.，1993，3，2765-2770)、硫代胆固醇(oberhauser等，nucl.acids res.，1992，20，533-538)、脂肪链，例如十二烷基二醇或十一烷基残基(saison-behmoaras等，embo j.，1991，10，1111-1118；kabanov等，febs lett.，1990，259，327-330；svinarchuk等，biochimie，1993，75，49-54)、磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵-1,2-二-o-十六烷基-外消旋-甘油-3-h-膦酸酯(manoharan等，tetrahedron lett.，1995，36，3651-3654；shea等，nucl.acids res.，1990，18，3777-3783)、多胺或聚乙二醇链(manoharan等，nucleosides&nucleotides，1995，14，969-973)、或金刚烷乙酸棕榈基部分(mishra等，biochim.biophys.acta，1995，1264，229-237)、十八胺或己氨基-羰基-羟胆甾醇部分(crooke等，j.pharmacol.exp.ther.，1996，277，923-937)，生育酚基团(nishina等，molecular therapy nucleic acids，2015，4，e220和nishina等，molecular therapy，2008，16，734-740)或galnac簇(例如，wo2014/179620)。[0225]缀合部分包括但不限于嵌入剂、报告分子、多胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、维生素部分、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫代胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、荧光团和染料。[0226]在一些实施方案中，缀合部分包含活性药物物质，例如，阿司匹林、华法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(s)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹磺酰肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、芬戈莫德、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂卓、吲哚美辛、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺类药物、抗糖尿病药、抗菌药或抗生素。[0227]缀合部分通过缀合连接子与寡核苷酸连接。在某些寡聚化合物中，缀合连接子是单个化学键(即，缀合部分通过单键直接连接至寡核苷酸)。在一些实施方案中，缀合连接子包含链结构(例如烃基链)或重复单元(例如乙二醇、核苷或氨基酸单元)的寡聚物。[0228]在一些实施方案中，缀合连接子包含一个或多个选自下组的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟氨基。在一些此类实施方案中，缀合连接子包含选自烷基、氨基、氧代、酰胺和醚基团的基团。在一些实施方案中，缀合连接子包含选自烷基和酰胺基团的基团。在一些实施方案中，缀合连接子包含选自烷基和醚基团的基团。在一些实施方案中，缀合连接子包含至少一个磷部分。在一些实施方案中，缀合连接子包含至少一个磷酸基。在一些实施方案中，缀合连接子包括至少一个中性连接基团。[0229]在一些实施方案中，缀合连接子，包括上述缀合连接子，是双功能连接部分，例如，本领域已知可用于将缀合基团连接至母体化合物(例如本文提供的寡核苷酸)的那些连接子。通常，双功能连接部分包含至少两个官能团。选择其中一个官能团与母体化合物上的特定位点结合，选择另一个官能团与缀合基团结合。用于双功能连接部分的官能团的例子包括但不限于用于与亲核基团反应的亲电体和用于与亲电基团反应的亲核体。在一些实施方案中，双功能连接部分包含一个或多个选自氨基、羟基、羧酸、硫醇、烷基、烯基和炔基的基团。[0230]缀合连接子的例子包括但不限于吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧辛酸(ado)、琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)和6-氨基己酸(ahex或aha)。其他缀合连接子包括但不限于取代或未取代的c1-c10烷基、取代或未取代的c2-c10烯基或取代或未取代的c2-c10炔基，其中优选的取代基的非限制性列表包括羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。[0231]在一些实施方案中，缀合连接子包含1-10个连接子-核苷。在一些实施方案中，缀合连接子包含2-5个连接子-核苷。在一些实施方案中，缀合连接子包含正好3个连接子-核苷。在一些实施方案中，缀合连接子包含tca基序。在一些实施方案中，此类连接子-核苷是修饰的核苷。在一些实施方案中，此类连接子-核苷包含修饰的糖部分。在一些实施方案中，连接子-核苷是未修饰的。在一些实施方案中，连接子-核苷包含可选保护的杂环碱基，该杂环碱基选自嘌呤、取代的嘌呤、嘧啶或取代的嘧啶。在一些实施方案中，可切割部分选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-n-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-n-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-n-苯甲酰基腺嘌呤、鸟嘌呤和2-n-异丁酰鸟嘌呤。通常希望连接子-核苷在到达靶组织后从寡聚化合物上切割下来。因此，连接子-核苷通常彼此连接并且通过可切割键与寡聚化合物的其余部分连接。在一些实施方案中，此类可切割键是磷酸二酯键。[0232]本文中，连接子-核苷不被认为是寡核苷酸的一部分。因此，在寡聚化合物包含由特定数量或范围的连接核苷组成和/或与参考核酸以特定百分比互补的寡核苷酸并且寡聚化合物还包含包括缀合连接子(所述缀合连接子包含连接子-核苷)的缀合基团的实施方案中，这些连接子-核苷不计入寡核苷酸的长度，并且不用于确定寡核苷酸与参考核酸的互补百分比。例如，寡聚化合物可包含(1)由8-30个核苷组成的修饰寡核苷酸和(2)包含与修饰寡核苷酸的核苷邻接的1-10个连接子-核苷的缀合基团。这种寡聚化合物中连续连接的核苷的总数超过30个。或者，寡聚化合物可以包含由8-30个核苷组成且没有缀合基团的修饰寡核苷酸。这种寡聚化合物中连续连接的核苷的总数不超过30个。除非另有说明，缀合连接子包含不超过10个连接子-核苷。在一些实施方案中，缀合连接子包含不超过5个连接子-核苷。在一些实施方案中，缀合连接子包含不超过3个连接子-核苷。在一些实施方案中，缀合连接子包含不超过2个连接子-核苷。在一些实施方案中，缀合连接子包含不超过1个连接子-核苷。[0233]在一些实施方案中，希望从寡核苷酸上切割缀合基团。例如，在某些情况下，包含特定缀合部分的寡聚化合物更好地被特定细胞类型吸收，但是一旦寡聚化合物被吸收，则希望缀合基团被切割以释放未缀合的或母体寡核苷酸。因此，某些缀合连接子可以包含一个或多个可切割部分。在一些实施方案中，可切割部分是可切割键。在一些实施方案中，可切割部分是包含至少一个可切割键的原子基团。在一些实施方案中，可切割部分包含具有一个、两个、三个、四个或更多可切割键的原子基团。在一些实施方案中，可切割部分在细胞或亚细胞结构(例如溶酶体)内被选择性切割。在一些实施方案中，可切割部分被内源酶如核酸酶选择性切割。[0234]在一些实施方案中，可裂解键选自：酰胺、酯、醚、磷酸二酯的一种或两种酯、磷酸酯、氨基甲酸酯或二硫化物。在一些实施方案中，可切割键是磷酸二酯的一种或两种酯。在一些实施方案中，可切割部分包含磷酸酯或磷酸二酯。在一些实施方案中，可切割部分是寡核苷酸和缀合部分或缀合基团之间的磷酸键。[0235]在一些实施方案中，可切割部分包含一个或多个连接子-核苷或由其组成。在一些此类实施方案中，一个或多个连接子-核苷通过可切割键彼此连接和/或与寡聚化合物的其余部分连接。在一些实施方案中，此类可切割键是未修饰的磷酸二酯键。在一些实施方案中，可切割部分是2'-脱氧核苷，其通过磷酸核苷间键连接至寡核苷酸的3'或5'-末端核苷，并通过磷酸或硫代磷酸键与缀合连接子或缀合部分的其余部分共价连接。在一些此类实施方案中，可切割部分是2'-脱氧腺苷。[0236]在一些实施方案中，寡聚化合物包含一个或多个末端基团。在一些此类实施方案中，寡聚化合物包含稳定的5'-磷酸酯。稳定的5'-磷酸酯包括但不限于5'-膦酸酯，包括但不限于5'-乙烯基膦酸酯。在一些实施方案中，末端基团包含一个或多个无碱基核苷和/或倒置核苷(inverted nucleoside)。在一些实施方案中，末端基团包含一个或多个2'-连接的核苷。在一些此类实施方案中，2'-连接的核苷是无碱基核苷。[0237]在一些实施方案中，寡聚化合物能够与靶核酸杂交，产生至少一种反义活性；这种寡聚化合物是反义化合物。在一些实施方案中，当反义化合物在标准细胞测定中将靶核酸的量或活性降低或抑制25％以上时，该反义化合物具有反义活性。在一些实施方案中，反义化合物选择性地影响一个或多个靶核酸。此类反义化合物包含与一个或多个靶核酸杂交的核碱基序列，产生一个或多个所需的反义活性，并且不与一个或多个非靶核酸杂交，或不以导致显著的不期望的反义活性的方式与一个或多个非靶核酸杂交。[0238]在一些反义活性中，反义化合物与靶核酸的杂交引发募集切割靶核酸的蛋白质。例如，一些反义化合物引发rnase h介导的靶核酸切割。rnase h是一种细胞内切核酸酶，其切割rna:dna双链中的rna链。这种rna:dna双链体中的dna链不必是未经修饰的dna。在一些实施方案中，本文描述的是足够“dna样”以引发rnase h活性的反义化合物。在一些实施方案中，gapmer间隙中的一个或多个非dna样的核苷是可接受的。[0239]在一些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交不会引发募集切割靶核酸的蛋白质。在一些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交导致靶核酸剪接的改变。在一些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交使得靶核酸与蛋白质或其他核酸之间的结合相互作用受到抑制。在一些实施方案中，反义化合物与靶核酸的杂交导致靶核酸翻译的改变。[0240]可以直接或间接地观察到反义活性。在一些实施方案中，反义活性的观察或检测涉及对于靶核酸或由这种靶核酸编码的蛋白质的量的变化、核酸或蛋白质的剪接变体比率的变化、和/或细胞或动物的表型变化的观察或检测。[0241]在一些实施方案中，寡聚化合物包含寡核苷酸或由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的区域。在一些实施方案中，靶核酸是内源性rna分子。在一些实施方案中，靶核酸编码蛋白质。在一些此类实施方案中，靶核酸选自：成熟mrna和前mrna，包括内含子区、外显子区和非翻译区。在一些实施方案中，靶rna是成熟mrna。在一些实施方案中，靶核酸是前mrna。在一些此类实施方案中，靶区域完全在内含子中。在一些实施方案中，靶区域跨越内含子/外显子交界处。在一些实施方案中，靶区域至少50％在内含子中。在一些实施方案中，靶核酸是逆转录基因的rna转录产物。在一些实施方案中，靶核酸是非编码rna。在一些此类实施方案中，靶非编码rna选自：长非编码rna、短非编码rna、内含子rna分子。[0242]可以在不消除活性的情况下引入错配碱基(参见例如gautschi等(j.natl.cancer inst.93:463-471，march 2001))。在一些实施方案中，寡聚化合物包含在寡核苷酸的全长上与靶核酸互补的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸有99％、95％、90％、85％或80％的互补。在一些实施方案中，寡核苷酸在寡核苷酸的全长上与靶核酸有至少80％的互补并且包含与靶核酸100％或完全互补的区域。在一些实施方案中，完全互补的区域的长度为6-20、10-18或18-20个核碱基。[0243]在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个相对于靶核酸错配的核碱基。在一些实施方案中，针对靶标的反义活性因这种错配而降低，但针对非靶标的活性降低的程度更大。因此，在一些实施方案中，包含寡核苷酸的寡聚化合物的选择性被改善。在一些实施方案中，错配特异性位于具有gapmer基序的寡核苷酸内。在一些实施方案中，错配位于距离间隙区的5'端的1、2、3、4、5、6、7或8位。在一些实施方案中，错配位于距离间隙区的3'端的9、8、7、6、5、4、3、2、1位。在某些实施方案中，错配位于距离翼区的5'端的1、2、3或4位。在一些实施方案中，错配位于距离翼区的3'端的4、3、2或1位。[0244]在一些实施方案中，寡聚化合物包含寡核苷酸或由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的区域，其中靶核酸是n-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1(asah1)。在一些实施方案中，人asah1核酸具有如seq id no:1(genbank登录号：nm_004315.6)所示的序列。[0245]在一些实施方案中，使细胞和与seq id no:1或2互补的寡聚化合物接触减少了asah1 mrna的量，并且在一些实施方案中减少了asah1蛋白的量。在一些实施方案中，使动物的细胞和与seq id no:1或2互补的寡聚化合物接触改善了乙型肝炎病毒感染或阿尔茨海默病的一种或多种症状或表征。[0246]在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸与seq id no:1的热点互补。在一些实施方案中，此类修饰的寡核苷酸的长度为20-26个核碱基。在一些实施方案中，此类修饰的寡核苷酸长度为20个核碱基。在一些实施方案中，此类修饰的寡核苷酸长度为21个核碱基。在一些实施方案中，此类修饰的寡核苷酸长度为22个核碱基。在一些实施方案中，此类修饰的寡核苷酸长度为23个核碱基。在一些实施方案中，此类修饰的寡核苷酸长度为24个核碱基。在一些实施方案中，此类修饰的寡核苷酸长度为25个核碱基。在一些实施方案中，此类修饰的寡核苷酸长度为26个核碱基。[0247]在一些实施方案中，此类修饰的寡核苷酸统一为moe或ome修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键连接。[0248]在一些实施方案中，此类修饰的寡核苷酸是gapmer。在一些此类实施方案中，例如，修饰的寡核苷酸的长度为21个核苷酸，并且gapmer为5-11-5moe或ome gapmer，或者4-13-4moe或ome gapmer。在一些此类实施方案中，gapmer为5-11-5moe gapmer。在一些此类实施方案中，gapmer为5-11-5ome gapmer。在一些此类实施方案中，gapmer为4-13-4moe gapmer。在一些此类实施方案中，gapmer为4-13-4ome gapmer。如本文所述，可以针对长度为20、21、22、23、24、25或26个核苷酸的修饰寡核苷酸测定gapmer的翼和间隙的长度和组成。[0249]在一些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷通过混合的磷酸二酯(“o”)和硫代磷酸酯(“s”)核苷间键连接。[0250]在一些实施方案中，在标准细胞测定法中，与seq id no:1的热点互补的修饰寡核苷酸实现了体外asah1 mrna的至少40％减少。[0251]在一些实施方案中，寡聚化合物包含寡核苷酸或由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸包含与靶核酸互补的区域，其中靶核酸在药理学相关组织中表达。[0252]在一些实施方案中，本文描述的是包含一种或多种寡聚化合物或其盐的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的稀释剂或载体。在一些实施方案中，药物组合物包含无菌生理盐水和一种或多种寡聚化合物。在一些实施方案中，药物组合物由无菌生理盐水和一种或多种寡聚化合物组成。在一些实施方案中，无菌生理盐水是药用级盐水。在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种寡聚化合物和无菌水。在一些实施方案中，药物组合物由一种寡聚化合物和无菌水组成。在某些实施方案中，无菌水是药用级水。在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种寡聚化合物和磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在一些实施方案中，药物组合物由一种或多种寡聚化合物和无菌pbs组成。在一些实施方案中，无菌pbs是药用级pbs。[0253]在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种寡聚化合物和一种或多种赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。[0254]在一些实施方案中，寡聚化合物可以与药学上可接受的活性和/或惰性物质混合以制备药物组合物或制剂。[0255]用于配制药物组合物的组合物和方法取决于许多标准，包括但不限于给药途径、疾病程度或给药剂量。[0256]在一些实施方案中，包含寡聚化合物的药物组合物包含寡聚化合物的任何药学上可接受的盐、寡聚化合物的酯或此类酯的盐。在一些实施方案中，包含含有一种或多种寡核苷酸的寡聚化合物的药物组合物在施用于动物(包括人)后，能够(直接或间接)提供生物活性代谢物或其残基。因此，例如，本公开还涉及寡聚化合物的药学上可接受的盐、前药、此类前药的药学上可接受的盐和其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施方案中，前药包含一个或多个与寡核苷酸连接的缀合基团，其中缀合基团由体内的内源性核酸酶切割。[0257]脂质部分已以多种方法用于核酸治疗。在一些此类方法中，将核酸(例如寡聚化合物)引入到由阳离子脂质和中性脂质的混合物制成的预制脂质体或脂质复合物中。在一些方法中，在不存在中性脂质的情况下形成具有单阳离子或多阳离子脂质的dna复合物。在一些实施方案中，选择脂质部分以增加药剂向特定细胞或组织的分布。在一些实施方案中，选择脂质部分以增加药剂向脂肪组织的分布。在一些实施方案中，选择脂质部分以增加药剂向肌肉组织的分布。[0258]在一些实施方案中，药物组合物包含递送系统。递送系统的例子包括但不限于脂质体和乳液。一些递送系统可用于制备某些药物组合物，包括包含疏水化合物的药物组合物。在一些实施方案中，使用某些有机溶剂例如二甲亚砜。[0259]在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种组织特异性递送分子，其被设计用于将本发明的一种或多种药剂递送至特定组织或细胞类型。例如，在一些实施方案中，药物组合物包括覆有组织特异性抗体的脂质体。[0260]在一些实施方案中，药物组合物包含助溶剂系统。一些此类助溶剂系统包括例如苯甲醇、非极性表面活性剂、水混溶性有机聚合物和水相。在一些实施方案中，此类助溶剂系统用于疏水化合物。此类助溶剂系统的一个非限制性例子是vpd助溶剂系统，这是一种无水乙醇溶液，包含3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂吐温80tm(polysorbate 80tm)和65％w/v聚乙二醇300。此类助溶剂系统的比例可以有很大的变化，而不会显著影响其溶解度和毒性特征。此外，助溶剂成分的种类可以变化：例如，可以使用其他表面活性剂代替吐温80tm；聚乙二醇的级分大小可以变化；其他生物相容性聚合物可以替代聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；并且其他糖或多糖可以替代葡萄糖。[0261]在一些实施方案中，制备药物组合物用于口服给药。在一些实施方案中，制备药物组合物用于口腔给药。在一些实施方案中，制备药物组合物用于注射(例如，静脉内、皮下、肌肉内、鞘内、脑室内等)给药。在一些此类实施方案中，药物组合物包含载体并配制成水溶液，例如水或生理相容的缓冲液，例如汉克氏液(hank's solution)、林格氏液(ringer's solution)或生理盐水缓冲液。在一些实施方案中，还包括其他成分(例如，有助于溶解或用作防腐剂的成分)。在一些实施方案中，使用合适的液体载体、悬浮剂等制备可注射混悬剂。某些注射用药物组合物以单位剂型存在于例如安瓿或多剂量容器中。某些注射用药物组合物是在油性或水性载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可以包含配方剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。适用于注射用药物组合物的某些溶剂包括但不限于亲脂性溶剂和脂肪油，例如芝麻油、合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，以及脂质体。[0262]本文列出的每篇文献和专利出版物均通过引用整体并入本文。虽然本文描述的某些化合物、组合物和方法已根据一些实施方案进行了具体描述，但以下实施例仅用于说明本文所述的化合物，并不旨在对其进行限制。本技术中引用的每一个参考文献、genbank登录号等均通过引用整体并入本文。[0263]尽管本技术随附的序列表中根据需要将每个序列标识为“rna”或“dna”，实际上，这些序列可以用化学修饰的任何组合进行修饰。本领域技术人员很容易理解，在某些情况下，描述修饰寡核苷酸的诸如“rna”或“dna”这样的名称是任意的。例如，包含含有2'-oh糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的寡核苷酸可以被描述为具有修饰糖的dna(2'-oh代替dna的一个2'-h)或具有修饰碱基的rna(胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶)代替rna的尿嘧啶)。因此，本文提供的核酸序列，包括但不限于序列表中的那些，旨在涵盖含有天然或修饰的rna和/或dna的任意组合的核酸，包括但不限于具有修饰的核碱基的此类核酸。作为进一步且非限制性的例子，具有核碱基序列“atcgatcg”的寡聚化合物包括含有这样的核碱基序列的任何寡聚化合物，无论是修饰的还是未修饰的，包括但不限于此类包含rna碱基的化合物，例如具有序列“aucgaucg”的此类化合物，以及具有一些dna碱基和一些rna碱基的化合物，例如“aucgatcg”，以及具有其他修饰核碱基的寡聚化合物，例如“atmcgaucg”，其中mc表示在5位包含甲基的胞嘧啶碱基。[0264]本文所述的一些化合物(例如，修饰的寡核苷酸)具有一个或多个不对称中心，因此产生对映异构体、非对映异构体和其他立体异构体等构型，可以在绝对立体化学方面定义为(r)或(s)，如针对糖端基异构体的α或β，或如针对氨基酸等的(d)或(l)。本文中绘制或描述为具有某些立体异构构型的化合物仅包括指定的化合物。除非另有说明，本文提供的以未定义的立体化学绘制或描述的化合物包括所有此类可能的异构体，包括其立构无规和光学纯形式。同样，除非另有说明，本文所述的化合物的所有互变异构形式也包括在内。除非另有说明，本文所述的化合物旨在包括相应的盐形式。[0265]本文所述的化合物包括其中一个或多个原子被指定元素的非放射性同位素或放射性同位素替换的变体。例如，本文中包含氢原子的化合物涵盖每个1h氢原子的所有可能的氘取代。本文化合物涵盖的同位素取代包括但不限于：2h或3h代替1h，13c或14c代替12c，15n代替14n，17o或18o代替16o，33s、34s、35s或36s代替32s。在一些实施方案中，非放射性同位素取代可以赋予寡聚化合物新的特性，这些特性有利于用作治疗或研究工具。在一些实施方案中，放射性同位素取代可以使化合物适用于研究或诊断目的，例如成像。[0266]实施例[0267]以下实施例说明了本公开的一些实施方案并且不是限制性的。此外，在提供特定实施方案时，发明人已经考虑了这些特定实施方案的一般应用。例如，公开具有特定基序的寡核苷酸为具有相同或相似基序的其他寡核苷酸提供了合理的支持。并且，除非另有说明，例如当特定的高亲和力的修饰出现在特定位置时，相同位置处的其他高亲和力修饰被认为是合适的。[0268]实施例1：修饰寡核苷酸对人asah1的体外影响[0269]可以设计与asah1核酸互补的修饰寡核苷酸并在体外测试其对asah1 mrna的影响。修饰的寡核苷酸可以在具有相似培养条件的一系列实验中进行测试。[0270]例如，在每孔20000个细胞的密度条件下培养的hepg2细胞可以使用2000nm浓度的修饰寡核苷酸进行电穿孔转染。在大约24小时的处理期后，从细胞中分离rna，并通过定量实时pcr测量asah1 mrna水平。根据总rna含量调整asah1mrna水平。相对于未处理的对照细胞，结果可以表示为asah1 mrna量的百分比减少。可以使用其他测定方法测定这些寡核苷酸的效价和效力。[0271]下表中的修饰寡核苷酸可以是统一修饰的寡核苷酸。寡核苷酸的长度可以是21个核碱基，并且每个核苷可以具有如本文所述的2'取代或修饰。[0272]下表中的修饰寡核苷酸也可以设计为gapmer。5'翼区中的每个核苷和3'翼区中的每个核苷都包含2'修饰。[0273]在实施方案中，遍及每个修饰寡核苷酸的一些或所有胞嘧啶残基都可以是5-甲基胞嘧啶。[0274]在实施方案中，每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。[0275]在实施方案中，核苷间键是混合的磷酸二酯和硫代磷酸酯键。[0276]“起始位点”表示人基因序列中修饰的寡核苷酸靶向的最5'-核苷。“终止位点”表示人类基因序列中修饰寡核苷酸靶向的最3'-核苷。[0277]表1中列出的每个修饰的寡核苷酸都靶向人asah1 mrna序列(本文指定为seq id no:1)。[0278]表1[0279][0280][0281]实施例2[0282]使用自动化dna/rna合成仪(mermade 6，bioautomation，tx)在固体支持物上使用β-氰乙基亚磷酰胺反应以10μmol的量级合成所有寡核苷酸。da、dc、dg和dt和/或2'-moe修饰的a、c、g和t的亚磷酰胺在自动dna/rna合成仪上按所需序列顺序偶联。通过在55℃下过夜处理浓缩氢氧化铵，将粗寡核苷酸去保护并从固体支持物上切割下来。通过制备型阴离子交换hplc纯化粗寡核苷酸。纯化的寡核苷酸从c18柱中脱盐并用大量无菌水过夜透析。用无菌过滤器(0.2μm或0.45μm ht tuffryn膜，pall corporation)过滤寡核苷酸溶液，然后冻干获得最终产品。所有寡核苷酸分别通过ie-hplc(waters 600、waters 486可调吸光度检测器，在260nm，empower软件)和maldi-tof质谱仪(配备337nm n2激光的waters maldi-tof质谱仪)表征其纯度和分子量。经离子交换hplc测定，全长寡核苷酸的纯度范围为95-98％，其余部分缺少一或两个核苷。[0283]为了识别有效的人asah1反义物，在人hep3b细胞系(atcc，manassas，va)中筛选一些靶向人asah1 mrna的反义寡核苷酸(aso)。将5×105个细胞接种在12孔组织培养板中，并在37℃、5％co2下孵育过夜。转染当天，向每个孔中加入新鲜培养基。在50μl无血清培养基中制备浓度50nm的反义寡核苷酸，并与含有3μl lipofectamine(thermo fisher scientific，waltham，ma)的50μl无血清培养基混合。将混合物在室温下孵育10分钟，然后应用于培养板。然后将板在37℃、5％co2下孵育48小时。按照制造商的建议，使用rna easy mini(qiagen，germantown，md)分离总rna。rna浓度通过紫外分光光度计在260/280nm波长处测定。对于cdna合成，按照制造商的建议，使用高容量cdna逆转录试剂盒(thermo fisher scientific)转录1μg总rna。通过实时定量pcr测定人asah1 mrna的表达水平。简而言之，将约75μg cdna、10μl taqmantmfast advanced master mix(thermo fisher scientific)和1μl人asah1基因表达探针(hs01001660_m1，thermo fisher scientific)或1μl人hprt1基因表达探针(hs02800695_m，thermo fisher scientific)混合。使用steponeplustmreal-time pcr系统(thermo fisher scientific)进行实时定量pcr，并使用stepone软件(版本2)(thermo fisher scientific)计算asah1基因相对表达。[0284]为了进一步表征反义寡核苷酸的化学修饰的影响，合成了2'-moe gapmer，如表2所示。[0285]表2[0286][0287][0288]下划线处为2'-moe修饰的寡核苷酸[0289]人hep3b细胞系(atcc，manassas，va)用于评估人asah1 mrna的表达。将5×105个细胞接种在12孔组织培养板中，并在37℃、5％co2下孵育过夜。转染当天，向每个孔中加入新鲜培养基。在50μl无血清培养基中制备浓度为3.2、6.3、12.5、25和50nm的2'-moe修饰的反义寡核苷酸，并与含有3μl lipofectamine(thermo fisher scientific，waltham，ma)的50μl无血清培养基混合。将混合物在室温下孵育10分钟，然后应用于培养板。然后将板在37℃、5％co2下孵育48小时。[0290]按照制造商的建议，使用rna easy mini(qiagen，germantown，md)分离总rna。rna浓度通过紫外分光光度计在260/280nm波长处测定。对于cdna合成，按照制造商的建议，使用高容量cdna逆转录试剂盒(thermo fisher scientific)转录1μg总rna。通过实时定量pcr测定人asah1 mrna的表达水平。简而言之，将约75μg cdna、10μl taqmantmfast advanced master mix(thermo fisher scientific)和1μl人asah1基因表达探针(hs01001660_m1，thermo fisher scientific)或1μl hprt1基因表达探针(hs02800695_m，thermo fisher scientific)混合。使用steponeplustmreal-time pcr系统(thermo fisher scientific)进行实时定量pcr，并使用stepone软件(版本2)(thermo fisher scientific)计算asah1基因相对表达。结果如图2所示。[0291]参考文献[0292]1.zhou j等spinal muscular atrophy associated with progressive myoclonic epilepsy is caused by mutations in asah1.am j hum genet.2012 91:5–14.[0293]2.doan nb等acid ceramidase confers radioresistance to glioblastoma cells.onco rep.2017 38:1932–40.[0294]3.li y等genetic ablation of acid ceramidase in krabbe disease confirms the psychosine hypothesis and identifies a new therapeutic target.proc natl acad sci u s a.2019 116:20097-20103.[0295]4.miyatake t and suzuki k.globoid cell leukodystrophy:additional deficiency of psychosine galactosidase.biochem.biophys.res.commun.1972 48:539–543.[0296]5.cannizzaro,l.a.regional mapping of the human galactocerebrosidase gene(galc)to 14q31 by in situ hybridization.cytogenetic and genome research.1994 66:244–245.[0297]6.suzuki k and suzuki y.globoid cell leukodystrophy(krabbe’s disease):deficiency of galactocerebroside beta-galactosidase.proc natl acad sci u s a 1970 66:302–309.[0298]7.graziano ac and cardile v.history,genetic,and recent advances on krabbe disease.gene 2014 555:2–13.[0299]8.nicaise am等a microglial hypothesis of globoid cell leukodystrophy pathology.j neurosci res.2016 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