序列工程化的λ抗体轻链的表达的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术序列工程化的λ抗体轻链的表达技术领域：：1.本发明涉及抗体λ(λ)轻链可变(vl)结构域和包含它们的抗体(λ抗体)。本发明还涉及在重组宿主细胞中由工程化核酸表达的λ抗体。背景技术：：：2.单克隆抗体是成功的和正在扩大的一类生物药物。目前临床使用的大多数抗体是igg免疫球蛋白，其包含两对二硫键连接的重链和轻链多肽链。在天然人抗体中，有两类抗体轻链，κ(κ)和λ(λ)，因此igg可以是iggκ或iggλ，这取决于轻链是否是通过发育中的b淋巴细胞中免疫球蛋白κ或λ轻链基因座(locus)的重排产生的。在人体中，发现iggκ和iggλ的量大致相等(55％κ；45％λ)。然而，开发用于人类临床应用的大多数抗体是iggκ抗体，其中相对少的λ抗体在生产中。3.单克隆抗体的主要生产方法是在体外培养的宿主细胞中编码抗体重链和轻链的核酸的重组表达。在典型的生产系统中，抗体重链和轻链被共翻译并从宿主细胞分泌。4.已经在通过改变重组系统的许多不同方面做出了努力以增加多肽表达，因为更高的抗体产量提高了生产效率并降低了生产成本。5.分泌途径中一个已知的瓶颈是抗体多肽通过信号肽转运到内质网(er)的内腔中。信号肽是抗体重链和轻链n末端的短(15-30个氨基酸)序列，指导其转运，并且在转运过程中被切割，因此不是分泌的成熟多肽链的一部分。已经努力寻找产生更高抗体产量的信号肽。6.除了它们在分泌效率中的作用之外，信号肽还与切割异质性(cleavageheterogeneity)的工业问题有关，所述切割异质性是由于信号肽的非特异性切割而发生的。这种现象可能导致重链和轻链n末端的延长或截短，这可能不适合于生物药物治疗，并且可能改变抗体亲和力。修饰的信号肽还被报道调节它们所搭载蛋白蛋白的折叠、热力学稳定性和聚集倾向。最近由gupta等(biotechnoladv2019)综述了信号肽和其它变量在单克隆抗体生产中的作用。7.rance&young(evaluationofalternativesignalsequences,int.noll(ed.),cellsandculture,esactproceedings4,271doi10.1007/978-90-481-3419-9_47；wo2008/148519lonza)评价了在瞬时表达系统和稳定细胞系中关于抗体产生的19个信号序列。抗体基因被设计为包括通常用于lonza的信号序列或19种替代序列(v1-v19)。他们鉴定了许多信号序列，据报道当用于哺乳动物宿主细胞中的表达盒时，所述信号序列提供了有效连接的多肽序列的正确加工和有效分泌，包括本发明表p中所示的v12、v14、v16和v19。v19和v17被认为与使用常规使用的信号序列的对照细胞系相比，平均抗体浓度产生特别强烈的增加。8.kotia和raghani(analbiochem399190-1952010)记载了由于在cho细胞中表达的单克隆抗体的重链和轻链中信号肽的切割位点不同，单克隆抗体中的异质性。9.haryadi等(plosone10((2))：e01168782015)优化了五种最流行单克隆抗体的信号肽序列。与天然信号肽相比，利妥昔单抗的信号肽的优化物导致滴度增加两倍。10.gibson等(biotechnolbioeng114:1970-19772017)和wo2017/072310(medimmune)报道了在翻译后加工过程中，具有鼠分泌前导序列mgwsciilflvatatgvhs(seqidno：74)(重组抗体产生常用的信号序列)和n-末端sye基序的重组抗体轻链被截短，观察到约3-8％的最终抗体产物medi8490含有截短的轻链。截短的轻链在其n-末端缺少三个氨基酸(sye)，并且被认为对产物形成存在风险。两种蛋白质工程化溶液被尝试来防止轻链n-末端的截短：改变sye氨基酸序列或改变分泌前导肽序列。他们举例说明了两种λ前导序列，即mawtplllplltlctsea(vλ3家族seqidno：75)和magfpllltllthcagswa(vλ1家族seqidno：76)，以及κ前导序列mdmrvpaqllgllllwlpgakc(vκ1家族seqidno：77)，并且这些前导序列不发生sye截短。技术实现要素：11.本发明人发现，改变λvl结构域的信号肽导致信号肽从vl结构域切下的位点的改变，从而不同的信号肽导致具有不同n-末端序列的λvl结构域。因此，含有这种λvl结构域的抗体(例如，包含两条重链和两条λ轻链的抗体)具有不同的vl结构域n-末端氨基酸序列，这取决于由其编码核酸表达的信号肽的氨基酸序列。12.与早期的表达异质性的报道(其中不同序列的抗体链获自相同的编码核酸)不同，本发明的发明人观察到每个核酸编码序列的单个vl结构域氨基酸序列的一致表达。然而，vl结构域的确切n-末端序列根据存在于预切割轻链中的信号肽的上游序列而不同。13.具体而言，本发明的发明人比较了包含n-末端信号肽的λ轻链的表达，所述信号肽是(i)与种系dna中编码的vλ基因片段相关的天然信号肽，或(ii)通常用于重组宿主细胞中轻链表达但源自不同的v基因片段(小鼠vκ基因片段)的信号肽。他们观察到，用天然信号肽表达的λ轻链被切割以产生n-末端残基对应于imgt第2位(imtgposition2)的成熟轻链，而用非天然信号肽表达的λ轻链被切割以产生n-末端残基对应于imgt第1位的成熟轻链，这是出乎意料的，因为通常认为imgt第1位是抗体中成熟多肽链的第一个残基。vl结构域的imgt编号，和在各种公共序列数据库中所表示的vl结构域序列，预先假定vl结构域的n-末端残基是imgt第1位。本发明的发明人被相信是首次发现当抗体由其天然编码核酸表达时，存在其vl结构域的n-末端残基对应于imgt第2位的λ抗体。本发明提供的工作表明，某些天然存在的λ抗体，和使用编码具有其天然信号肽的轻链的核苷酸序列表达的λ抗体，缺少先前基于imgt记法假定存在的n-末端氨基酸，即这些λ抗体在imgt第1位不具有氨基酸。如在各种实施方式中所证实的，天然n-末端信号肽被切割以提供具有对应于imgt第2位的n-末端残基的λvl结构域，而非天然n-末端信号肽被切割以提供具有对应于imgt第1位的n-末端残基的λvl结构域。因此，根据信号肽的序列，切割位点可能相差一个氨基酸。14.类似地，在另一个实验中，本发明的发明人比较了包含n-末端信号肽的另一个λ轻链的表达，所述n-末端信号肽是(i)与种系dna中编码的vλ基因片段相关的天然信号肽或(ii)“campath前导”，其是本领域已知用于抗体表达的不同的非天然信号肽。再次，本发明的发明人观察到，与用非天然信号肽表达的λ轻链相比，用天然信号肽表达的λ轻链被切割以提供n-末端截短的成熟轻链。用天然信号肽表达(和从其切下)的轻链n末端残基对应于imgt第3位，而用非天然信号肽表达(和从其切下)的轻链对应于imgt第1位。有趣的是，用小鼠vκ信号肽表达相同λ轻链也导致切割以产生imgt第1位的n末端，但这里也观察到异质切割(heterogeneouscleavage)，轻链较小一部分被切割以提供imgt第3位的n末端。值得注意的是，本发明的发明人发现，在一些实施方式中，切割位点的变化，以及因此n-末端vl结构域序列的变化，影响了λ抗体的性质。例如，包含具有不同n-末端序列的vl结构域的λ抗体显示出不同的功能活性。在各种实施方式中，本发明建立在这种效果上以提供具有所需特性的λ抗体。例如，当用非天然信号肽表达vl结构域时，非天然信号肽序列对vl结构域n-末端序列的影响可通过imgt第1位的“强制”缺失而被超调(over-ridden)，以使所得成熟vl结构域具有与用其天然信号肽表达时相同的序列(即成熟vl结构域的n-末端残基对应于imgt第2位)。如实施例中所证明的，这恢复了抗体的活性，该活性在从其天然轻链前导改变为非天然前导时已经丧失。在各个方面，本发明提供了λ抗体，λvl结构域，编码核酸，用于在重组宿主细胞中表达它们的方法和组合物，所述组合物含有从这样的重组表达系统分离的λ抗体。15.本发明的各方面在所附权利要求书和所附公开中阐述。16.在第一方面，本发明提供了包含具有n-末端信号肽的抗体vl结构域的多肽，其中17.vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列，其中18.n-末端信号肽与所述vλ基因片段的天然n-末端信号肽不同，并且其中19.对应于vl结构域imgt第1位的残基不存在。20.因此，该多肽在vl结构域的imgt第1位缺少氨基酸，从而在该位置有效地存在缺失，并且vl结构域的n-末端残基对应于imgt第2位。21.在本发明的实施方式中，vl结构域是当用其天然信号肽(即，源自所述vl结构域的vλ基因片段的n-末端信号肽)表达时，在vl结构域的imgt第1位缺少氨基酸的结构域。当表达并从其天然信号肽上切下时，vl结构域的n-末端残基因此对应于imgt第2位。22.vλ基因片段可以是人vλ3基因片段，例如vλ3-21。23.在另一个实例中，本发明提供了包含具有n-末端信号肽的抗体vl结构域的多肽，其中24.vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列，其中25.n-末端信号肽与所述vλ基因片段的天然n-末端信号肽不同，并且其中26.对应于vl结构域的imgt第1位和第2位的残基不存在。27.因此，该多肽在vl结构域的imgt第1位和第2位上都缺乏氨基酸，从而在这些位置上有效地存在缺失，而vl结构域的n-末端残基对应于imgt第3位。28.在本发明的实施方式中，vl结构域是当用其天然信号肽(即，源自所述vl结构域的vλ基因片段的n-末端信号肽)表达时，在vl结构域的imgt第1位和imgt第2位缺乏氨基酸的结构域。当表达并从其天然信号肽上切下时，vl结构域的n-末端残基因此对应于imgt第3位。29.因此，该多肽在vl结构域的imgt第1位缺少氨基酸，从而在该位置有效地存在缺失，并且vl结构域的n-末端残基对应于imgt第2位。30.vλ基因片段可以是人vλ10基因片段，例如vλ10-54。31.如本发明所证明的，当人λvl结构域表达并从非天然小鼠vκ信号肽msvptqvlgllllwltdarc(seqidno：62)切下时，与表达并从其天然信号肽切下的相同人λvl结构域(例如，对于vλ3-21衍生的vl结构域，天然人vλ3信号肽，或对于vλ10-54衍生的vl结构域，天然人vλ10信号肽)相比，所述vl结构域在其n末端不同。为了校正这种异常，可以将用非天然前导表达的vl结构域的n末端工程化以匹配从天然前导表达的vl结构域的n末端。因此，将在由其天然前导表达的vl结构域中发现的n-末端截短(相对于用非天然前导表达的产物和/或相对于预测的在imgt第1位n末端截短)引入编码vl结构域的核苷酸序列。例如，从编码核酸中缺失起始的一个或两个氨基酸残基(imgt第1位，以及任选地imgt第2位)。32.因此，本发明的多肽可以包含具有n-末端信号肽的vl结构域，其中33.vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列，其中34.n-末端信号肽为小鼠κ信号肽seqidno：62，其中35.vl结构域包含相对于由vλ基因片段编码的起始于imgt第1位的氨基酸序列的n-末端截短。36.如上所述，n-末端截短可以是对应于imgt第1位的氨基酸残基的缺失，以便vl结构域的n-末端残基对应于imgt第2位。或者，n-末端截短可以是对应于imgt第1位和第2位的氨基酸残基的缺失，以便vl结构域的n-末端残基对应于imgt第3位。这些较小的(minor)截短已经在结构不同的vλ基因片段中被观察到，并且可以比较通过用其它天然和非天然信号肽表达的多肽产物进行比较来鉴定其它实施例，其中vl结构域包含源自其它vλ基因片段的vl结构域，任选地本发明示例的人vλ基因片段的任一种。37.本发明的方法可以包括38.(i)提供编码抗体轻链可变(vl)结构域的核苷酸序列，39.(ii)提供第一dna分子，其包含所述核苷酸序列，所述核苷酸序列之前是编码天然信号肽的前导序列，40.(iii)提供第二dna分子，其包含所述核苷酸序列，所述核苷酸序列之前是编码非天然信号肽的前导序列，41.(iv)在宿主细胞(例如cho细胞)中表达第一和第二dna以产生分别包含vl结构域的第一和第二多肽，42.(v)比较从宿主细胞表达的第一和第二多肽的vl结构域氨基酸序列(例如，使用质谱)，43.(vi)鉴定与第二多肽相比第一多肽序列中的n-末端截短，44.(vii)提供编码所述第一多肽的序列的工程化核苷酸序列，包括n-末端截短，45.(viii)提供第三dna分子，其包含所述工程化核苷酸序列，在所述工程化核苷酸序列之前是编码非天然信号肽的前导序列，和46.(ix)在宿主细胞中表达第三dna分子以产生包含编码的vl结构域的第三多肽，其中第三多肽的氨基酸序列与第一多肽的氨基酸序列相同。47.因此，通过比较天然与非天然信号肽的表达产物，可以鉴定信号肽和vl结构域氨基酸序列之间切割位置的差异。然后，差异的鉴定告知了工程化vl结构域序列的设计，当从非天然前导表达时，其将被切割以产生具有野生(natrual)或天然(native)n末端的vl结构域序列，其对应于用天然信号肽表达的vl结构域可以获得的切割产物。48.本发明的vl结构域可以包含在抗体轻链和/或抗体分子(例如，人igg)中。因此，本发明中vl结构域和/或轻链的表达可以在抗体表达的情况下，并且可以涉及抗体vh结构域和/或抗体重链在宿主细胞中的共表达。49.vl结构域来源于v基因片段和j基因片段的重组。在体内，重组在dna水平发生，并涉及发育成b细胞的细胞中的基因组重排。因此，由b细胞表达的抗体的vl结构域包含从v和j基因片段重组产生的核酸翻译的氨基酸序列。通过与种系v和j基因片段的翻译序列进行比较，对vl结构域的氨基酸序列的检查使得v和j基因片段得以鉴定。50.优选地，本发明的基因片段是脊椎动物基因片段，例如哺乳动物基因片段。更优选地，基因片段是人基因片段。本发明特别涉及人vl结构域和包含它们的人抗体的表达。人vl结构域来源于人v基因片段和人j基因片段的重组。因此，在优选的实施方式中，vλ基因片段是人vλ基因片段和/或j基因片段是人j基因片段。j基因片段优选是λ基因片段，尽管vλ与jκ基因片段的组合是可能的。51.随附的表l显示了人λv基因片段的实例。优选地，vλ基因片段是vλ3基因片段，即iglv3家族的成员。这包括下列人vλ基因片段：vλ3-1、vλ3-9、vλ3-10、vλ3-12、vλ3-13、vλ3-16、vλ3-19、vλ3-21、vλ3-22、vλ3-25、vλ3-27、vλ3-31和vλ3-32。优选地，vλ基因片段为功能化基因片段。因此，vλ基因片段任选地选自由以下各项组成的组中：vλ3-1、vλ3-9、vλ3-10、vλ3-12、vλ3-16、vλ3-19、vλ3-21、vλ3-22、vλ3-25和vλ3-27。人vλ3基因片段在本发明的实施方式中是特别优选的，其中从天然信号肽表达产生n-末端残基对应于imgt第2位的多肽产物。52.在其它实施方式中，人vλ基因片段是vλ10基因片段，即iglv10家族的成员。任选地，它是vλ10-54。已知的功能等位基因包括vλ10-54*02和vλ10-54*01。53.从vλ基因片段产生的vl结构域的氨基酸序列可从imgt获得，实例示于表l中。imgt预测成熟vl结构域的第一个残基，并将其命名为imgt第1位。本发明的vλ基因片段可编码其中第一个残基(imgt第1位)是ser(s)的氨基酸序列。本发明的vλ基因片段可编码其中前两个残基(imgt第1位和2)是ser和tyr(sy)的氨基酸序列。它可编码其中前三个残基(imgt第1位、2和3)是ser、tyr和val(syv)的氨基酸序列。54.优选的vλ基因片段是vλ3-21。vλ3-21的等位基因是已知的。这些包括vλ3-21*01、vλ3-21*d01、vλ3-31*02和vλ3-21*03。55.根据本发明的多肽可以包含具有n-末端信号肽的vl结构域，其中56.vl结构域包含源自人vλ3基因片段(例如vλ3-21)的序列和源自j基因片段的序列，其中57.n-末端信号肽不是人vλ3基因片段的天然信号肽，其中58.vλ3基因片段编码在imgt第1位和2的n-末端残基分别为ser和tyr(sy)的氨基酸序列，并且其中59.vl结构域包含在imgt第1位的ser的缺失。60.所述vl结构域包含紧接(immediately)融合至所述vl结构域的信号肽，其中所述vl结构域源自人vλ3基因片段和vj基因片段的重组，其中所述vl结构域在imgt第1位处缺少ser残基，即所述vl结构域的n-末端ser缺失。61.在宿主细胞中表达时，信号肽切割后vl结构域的n-末端残基因此是imgt第2位上的残基(例如tyr)。基因片段v3-21编码的氨基酸序列中的前三个残基根据imgt是sertyrval(syv)，因此当imgt第1位的ser缺失时，信号肽切割后vl结构域的n-末端残基是tyrval(yv)。62.在本发明的实施方式中，非天然信号肽(不同于所述vλ基因片段的天然n-末端信号肽的n-末端信号肽)是这样的肽，如果所述残基存在，其将在紧接对应于vl结构域imgt第1位的残基之前从多肽上被切下。因此，当对应于vl结构域的imgt第1位的残基(例如ser)存在于多肽的vl结构域中时，信号肽在紧接对应于vl结构域的imgt第1位的所述残基之前被切割。因此，缺失所述残基避免了成熟多肽中该残基的存在。在各种实施方式中，与包含其中存在所述残基的vl结构域的抗体相比，这可能具有恢复或增强抗体功能的作用。63.信号肽可以具有不同的长度，但通常在大约18-22个氨基酸之间。任选地，信号肽的长度为20个氨基酸。信号肽不是多肽中vλ基因片段的天然信号肽。它可以是来自相同或不同物种的另一基因的信号肽，例如小鼠信号肽可以与源自人基因片段重组的vl结构域组合。尽管信号肽可以是天然存在的，并且因此可以是来自不同基因组编码序列的天然信号肽，但任选地它不是来自任何vλ基因片段的信号肽。异源(heterologous)信号肽的实例在本发明中公开，包括来自轻链κ基因片段的信号肽，包括小鼠vκ基因片段，例如常用的信号肽msvptqvlgllllwltdarc(seqidno：62)。64.信号肽的c-末端区被认为会影响切割位点。优选地，信号肽包含c-末端cys残基，因此在宿主细胞中表达时，在紧接cys之后从vl结构域被切下。因此成熟vl结构域的n-末端残基是紧接在信号肽的c-末端cys之后的残基。信号肽可以包含c-末端序列alaargcys(arc)。它可以包含c-末端序列thraspalaargcys(tdarcseqidno：114)。65.在一个实施方式中，本发明的多肽包含具有n-末端信号肽的vl结构域，其中66.vl结构域包含源自人vλ3-31基因片段的序列和源自人jλ基因片段的序列，其中67.n-末端信号肽为小鼠vκ基因片段信号肽，其中68.vl结构域包含在imgt第1位的ser的缺失。69.vl结构域可以是本发明示例的0325lvl结构域，或者可以是其变体，例如与0325vl结构域具有至少90％氨基酸序列同一性的vl结构域。氨基酸序列同一性可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。70.本发明的其它方面包括编码多肽的核酸分子(例如cdna或基因组dna)，例如dna载体。71.宿主细胞可以用所述核酸转染，并培养以表达多肽。宿主细胞可以在体外提供并在实验室条件下培养。宿主细胞也可以例如作为冷冻贮存物储存。宿主细胞可包含编码多肽的重组dna，例如，其中编码dna被稳定整合到细胞dna中(例如，在宿主细胞基因组中)。也可使用用编码核酸瞬时转染的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞。许多已建立的用于多肽表达的细胞系是本领域已知的，并且可从细胞库获得。还可以进一步修饰这种细胞以获得额外的期望属性。实例包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，例如cho-k1或chogs，和人胚肾(hek)细胞，例如hek293。72.在宿主细胞内表达时，信号肽将多肽导向er膜，在那里它被信号肽酶切割。将信号肽从多肽上切下，得到包含对应于imgt第2位的n-末端残基的成熟vl结构域。细胞可分泌由此所得的包含成熟vl结构域(缺乏信号肽)的多肽，然后其可从培养基中回收，并任选地进一步按需纯化和配制。或者，细胞可以在细胞表面上以膜蛋白(例如igm)的形式展示多肽。73.因此，本发明的其它方面涉及产生包含vl结构域的多肽的方法，其中所述vl结构域具有通过切割本发明所述n-末端信号多肽而产生的n-末端，其中所述vl结构域的n-末端对应于imgt第2位。74.表达包含vl结构域的多肽的方法可以包括：75.在表达所述多肽的条件下培养细胞群(populationofcells)，其中所述细胞包含编码包含n-末端信号肽和vl结构域的多肽的核酸，其中76.n-末端信号肽从vl结构域被切除以提供包含成熟vl结构域的多肽，并且其中77.包含成熟vl结构域的多肽的n-末端残基是vl结构域的imgt第2位。78.多肽可以是抗体轻链，任选地包含λ恒定结构域(constantdomain)。所述方法可以包括产生包含所述vl结构域或轻链和vh结构域或重链的抗体。抗体轻链和重链可以在相同细胞中共表达或分开表达然后组装。79.一种方法包括表达包含vh结构域和vl结构域的抗体，其中vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列，包括：80.向细胞提供编码本发明所述的vl结构域和n-末端信号肽的核酸，其中所述细胞还包含编码所述vh结构域的核酸，81.在用于表达包含vl结构域的多肽和用于表达vh结构域的条件下培养所述细胞群，其中82.n-末端信号肽从vl结构域被切除以提供包含成熟vl结构域的多肽，其中83.包含成熟vl结构域的多肽的n-末端残基是vl结构域的imgt第2位，并且其中84.vl结构域与vh结构域组装以提供所述抗体。85.因此，在本发明的各种实施方式中，细胞包含编码包含n-末端信号肽和vl结构域(例如抗体轻链)的多肽的核酸，并且还包含编码抗体vh结构域(例如抗体重链)的核酸。任选地，细胞包含编码两种不同抗体vh结构域的核酸，例如，其可包含编码第一抗体重链的核酸和编码第二抗体重链的核酸，其中第一和第二抗体重链两者都与抗体轻链组装。因此，所得抗体可包含由第一重链的vh结构域和vl结构域形成的第一结合位点，以及由第二重链的vh结构域和vl结构域形成的第二结合位点。第一和第二结合位点可分别结合第一和第二抗原，例如在第一和第二表位。这样的细胞将产生具有共同轻链的双特异性抗体。或者，细胞可包含编码多个不同vh结构域和多个不同vl结构域，例如两个不同vh结构域和两个不同vl结构域的核酸，以产生具有四个不同抗体链的双特异性抗体。86.在本发明优选的实施方式中，vl结构域通常源自vλ3-21基因片段和jλ基因片段。vl结构域氨基酸序列可以是本发明所示的0325lvl结构域氨基酸序列。多肽优选是包含0325vl结构域的抗体轻链，例如，它可以是本发明所示0325l轻链。优选的实施方式包括包含与重链配对的含有vl结构域的λ轻链的抗体。双特异性抗体可包含两个不同的抗体重链，其各自与轻链配对，其中一个或两个轻链包含如本发明所述的λvl结构域。优选的实施方式是双特异性抗体、其产生方法和包含编码它们的核酸的细胞，其中所述双特异性抗体包含：87.第一重链，其包含n1280hvh结构域或n1441hvh结构域，与包含0325lvl结构域的轻链配对；以及88.第二重链，其包含t0999hvh结构域，与包含0325lvl结构域的轻链配对。89.第一和/或第二重链可以包含表s中所示的vh结构域和人igg4恒定区(constantregion)，轻链可以是共同轻链，例如，表s中所示的0325l轻链。完整的重链和轻链的实例在表s中示出。90.本发明显示，与包括在imgt第1位的ser但在其他方面相同的双特异性抗体相比，0325l轻链的在imgt第1位的ser的缺失增加了包含0325l作为共同轻链的双特异性抗体的功能活性(functionalactivity)。不受理论束缚，本发明的发明人相信这可能是n-末端ser影响vh和vl结构域之间的联合(association)的结果。在不存在n-末端ser的情况下，双特异性抗体的一个或两个臂的vh和vl结构域可以与其抗原不同地结合，从而影响抗体的功能。生物物理性质的优化对于治疗性抗体的开发是关键的，并且本发明所述的ixax双特异性抗体在轻链上不存在n-末端ser的情况下可以表现出更强的稳定性。另一种可能性，尤其与双特异性抗体相关的是，在轻链imgt第1位的残基的存在或不存在可能影响异二聚化，即两个不同重链的组装产生双特异性，而不是两个相同重链的组装产生不需要的单特异性同二聚体。91.虽然在一些实施方式中，抗体可能受益于vl结构域的imgt第1位处n-末端ser的不存在，但是通过工程化序列以使imgt第1位处的n-末端残基存在，可能改善其他λ抗体的期望功能。根据抗体的预期用途，例如可能需要具有不同的抗原结合特征，例如较高亲和力或较低亲和力、不同的结合动力学或影响抗体重链和轻链的组装。特别是在由于具有存在imgt第1位的n-末端残基的功能而被选择抗体的情况下(例如，在用非天然信号肽表达的λ抗体的情况下)，可能希望确保当抗体在宿主细胞中重组表达时保留所述残基，即使这不反映天然存在的λ抗体的天然结构。因此，可能需要提供包含具有n-末端信号肽的vl结构域的多肽，其中vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列，其中对于所述λv基因片段，n-末端信号肽不同于天然n-末端信号肽，并且其中存在对应于vl结构域的imgt第1位的残基。一个实例是包含0128lvl结构域和非天然信号肽的多肽，例如小鼠κ轻链信号肽msvptqvlgllllwltdarc(seqidno：62)。92.因此，本发明的其它方面涉及提供n-末端残基存在于imgt第1位的vl结构域，其中所述残基不存在于用其天然信号肽表达的成熟vl结构域中。例如，可以提供包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列的vl结构域，其中存在对应于vl结构域的imgt第1位的残基。vl结构域可以是当用其vλ基因片段的天然信号肽表达时，在imgt第1位缺乏残基，因而具有对应于imgt第2位的n-末端残基的结构域。通过重组用非天然信号肽表达vl结构域，切割可以在紧接对应于imgt第1位的n-末端残基之前发生，因而改变vl结构域序列以包括在imgt第1位处的n-末端残基。在各种实施方式中，本发明提供了包含此vl结构域的多肽和抗体、编码它们的核酸、包含此核酸的宿主细胞和通过从宿主细胞表达进行制备的方法。93.本发明还涉及改变包含vh结构域和vl结构域的抗体的稳定性、组装和/或抗原结合动力学的方法，其中vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列。94.这种方法可以包含提供编码所述抗体的核酸，其包含编码所述具有n-末端信号肽的所述vl结构域的核苷酸序列，其中对应于所述vl结构域的imgt第1位的残基的密码子被缺失，并且其中所述n-末端信号肽不是所述λv基因片段的天然n-末端信号肽，以及提供编码所述vh结构域的核酸，95.表达所述核酸以提供包含所述vh结构域和所述vl结构域的抗体，其中所述vl结构域的n-末端残基是对应于imgt第2位的残基，96.其中所述抗体的稳定性、组装和/或抗原结合动力学不同于包含vh结构域和vl结构域的抗体的稳定性和/或抗原结合动力学，其中所述vl结构域的n-末端残基是对应于imgt第1位的残基。因此，相对于由其中imgt残基1的密码子未缺失的核酸表达的抗体，稳定性增加，或组装或抗原结合动力学发生改变。对抗体组装的影响是指组成抗体的多肽链或结构域的配对。例如，当两条不同的重链和共同轻链共表达时，可以观察到对异二聚体(heterodimer)形成的影响，其中异二聚体相对于同源二聚体的比例发生改变。97.或者，方法可以包含提供编码所述抗体的核酸，其包含编码所述具有n-末端信号肽的vl结构域的核苷酸序列，其中存在对应于所述vl结构域的imgt第1位的残基的密码子，并且其中所述n-末端信号肽不是所述λv基因片段的天然n-末端信号肽，以及编码vh结构域的核酸，98.表达所述核酸以提供包含vh结构域和vl结构域的抗体，其中vl结构域的n-末端残基是对应于imgt第1位的残基，99.其中所述抗体的稳定性和/或抗原结合动力学不同于包含vh结构域和vl结构域的抗体的稳定性、组装和/或抗原结合动力学，其中所述vl结构域的n-末端残基是对应于imgt第2位的残基。100.或者，方法可以包含提供编码所述抗体的核酸，其包含编码所述具有n-末端信号肽的vl结构域的核苷酸序列，其中存在对应于所述vl结构域的imgt第1位的残基的密码子，并且其中所述n-末端信号肽是所述λv基因片段的天然n-末端信号肽，以及编码vh结构域的核酸，101.表达所述核酸以提供包含所述vh结构域和所述vl结构域的抗体，其中所述vl结构域的n-末端残基是对应于imgt第2位的残基，102.其中所述抗体的稳定性、组装和/或抗原结合动力学不同于包含vh结构域和vl结构域的抗体的稳定性和/或抗原结合动力学，其中所述vl结构域的n-末端残基是对应于imgt第1位的残基。103.因此，可以选择或改造信号肽的序列和/或vl结构域的n末端以实现在所需位置的切割，提供起始于imgt第1位的vl结构域或起始于imgt第2位的vl结构域。104.等同实施方式：本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验确定本发明所述的本发明的具体实施方式的许多等同方案。这些等同实施方式落入随附权利要求的保护范围内。附图说明105.现在将参考附图详细描述本发明的实施例，其中106.图1示出：107.(a)对包含vl结构域seqidno：97和天然n-末端信号肽seqidno：60的多肽seqidno：115的氨基酸序列加工。天然n-末端信号肽以下划线标示。多肽的其余部分是vl结构域氨基酸序列，用imgt表示。在紧接vl结构域的对应于imgt残基1的位置之后切割n端信号肽。切割位点用v型图案标记，位于imgt残基1和2之间。切割产生成熟的vl结构域seqidno：101，其中n-末端残基对应于imgt第2位。产生的vl结构域具有0325vl结构域的氨基酸序列。108.(b)对包含vl结构域seqidno：97和非天然n-末端信号肽seqidno：62的多肽seqidno：68的氨基酸序列的加工。非天然信号肽以下划线标示。多肽的其余部分是vl结构域氨基酸序列，用imgt表示。在紧接vl结构域的对应于imgt残基1的位置之前切割n-末端信号肽。切割位点用v型图案标记，位于imgt残基-1和1之间，切割产生成熟的vl结构域seqidno：97，其中n-末端残基对应于imgt第1位，产生的vl结构域具有0128lvl结构域的氨基酸序列。109.(c)对包含vl结构域seqidno：101和非天然n-末端信号肽seqidno：62的多肽seqidno：66的氨基酸序列的加工，其中对应于imgt第1位的残基缺失。非天然信号肽以下划线标示。天然n-末端信号肽以下划线标示。多肽的其余部分是由imgt表示的vl结构域氨基酸序列，除了在imgt第1位不存在氨基酸。在紧接vl结构域的对应于imgt残基2的位置之前切割n-末端信号肽。切割位点用v型图案标记。切割产生成熟的vl结构域seqidno：101，其中n-末端残基对应于imgt第2位，该成熟的vl结构域的氨基酸序列与(a)中产生的成熟的vl结构域的氨基酸序列相同，即0325lvl结构域。110.图2显示了vl结构域0325l的氨基酸序列。imgt编号被并排示出。0325lvl结构域来源于人vλ基因片段iglv3-21*d01与人jλ基因片段iglj2*01的重组。111.图3显示了在fxase测定中在500秒时测量的双特异性抗体的fxase活性。ixax双特异性抗体由编码抗fixn1280h重链、包含特定vh结构域的抗fx重链和用非天然小鼠κ前导(左)或人vλ3-21前导(右)的0128l共同轻链的核酸表达。人vλ3-21前导为天然0128l，其源自人vλ基因片段iglv3-21*d01和人jλ基因片段iglj2*01的重组。112.图4显示了在fxase测定中在(a)570秒和(b)600秒测量的双特异性抗体的fxase活性。在(a)中，显示的数据是具有包含n1280hvh结构域和t0736hvh结构域的重链加上包含下列vl结构域的轻链(从左到右)的双特异性抗体：来自用天然λ前导的表达的n0128l；n0310l；n0311l；n0312l；n0313l；n0314l；n0315l；n0316l；n0317l；n0318l；n0319；n0320l；n0321l；n0322l；n0323l；n0324l；n0325l；n0326l；n0327l；n0328l、n0329l；依米赛珠单抗(emicizumab)阳性对照。所有n310l-n329l来自用密码子优化的小鼠κ前导的表达。在(b)中，显示的数据是具有包含n1280hvh结构域和t0736hvh结构域的重链加上包含下列vl结构域的轻链(从左到右)的双特异性抗体：n0310l；n0311l；n0312l；n0313l；n0314l；n0315l；n0316l；n0317l；n0318l；n0319；n0320l；n0321l；n0322l；n0323l；n0324l；n0325l；n0326l；n0327l；n0328l、n0329l；来自用天然λ前导的表达的n0128l；依米赛珠单抗阳性对照。所有n310l-n329l来自具有密码子优化的小鼠κ前导的表达。113.图5显示了来自用包含0128lvl结构域和天然λ信号肽(集合体a，左)或非天然小鼠κ信号肽(集合体b，右)的共同轻链序列表达的双特异性抗体的产量的比较。使用密码子优化的前导核苷酸序列。重链序列是包含n1172hvh结构域的重链和包含t0201hvh结构域的重链。抗体在使用75μmmsx选择的cho细胞中表达，数据从透析到pbs中后的蛋白a纯化后的35ml样品中获得。114.在说明书的结尾处列出了表格。具体实施方式115.信号肽116.许多真核多肽表达有n-末端序列，其将新生多肽引导至内质网(er)的膜。该n-末端序列通常被称为“信号肽”或“前导”。在er膜，n-末端序列被信号肽酶切割，缺乏n-末端序列的多肽穿过膜转移，并将从细胞分泌或作为膜蛋白展示在细胞表面。所表达的多肽，缺少信号肽，可以被称为成熟多肽。117.当多肽具有信号肽时，信号肽的切割通常产生成熟多肽的新n-末端。因此，紧接在切割位点之后的氨基酸残基成为成熟多肽的n-末端残基。对某些多肽可以进行进一步的氨基酸序列修饰，以使成熟多肽包含进一步的改变，但这通常不发生在抗体轻链。因此，缺少信号肽的多肽序列代表由细胞表达的成熟多肽。因此，多肽可以包含直接融合到vl结构域的信号肽，其中信号肽代表多肽的n-末端序列。vl结构域可以代表多肽的剩余部分，或者另外的残基和/或另外的结构域可以被包括在vl结构域的c-末端。例如，多肽可以是包含cl结构域的抗体轻链。118.在基因组水平上，信号肽在多肽的基因内编码。尽管不同多肽的信号肽具有一些共同的结构特征，但它们在序列上不是全部相同的。在源自抗体可变结构域的可变区基因片段的情况下，基因组的每个可变区基因片段具有其自身的信号肽。基因组dna中可变区基因片段的信号肽可以被称为该基因片段的天然或种系信号肽。119.对于重组基因表达，其中编码序列在体外被引入宿主细胞，通常替换天然信号肽。因此，成熟多肽的编码序列与不同于天然信号肽的信号肽融合，尽管它可以任选地来自相同的多肽家族，例如，在抗体vl结构域的情况下，它可以是不同v基因片段的信号肽。尽管非天然信号肽具有与天然信号肽不同的氨基酸序列，但本领域技术人员预期无论使用哪种信号肽，成熟多肽的序列都是相同的，因为信号肽会从成熟多肽上被切下。如本发明所教导的，事实上，当表达λ抗体时，信号肽序列的差异可以导致成熟vl结构域的差异。本发明的实施方式使用非天然或异源信号肽，其包含不同于vλ基因片段的天然或种系信号肽的核苷酸序列。信号肽任选地不是vλ信号肽。120.信号肽的实例示于表p中。mawtalllgllshctgsvt(seqidno：60)是v基因片段vλ3-21的天然信号肽。表p中所示的所有其它信号肽氨基酸序列代表源自vλ3-21的vl结构域的非天然信号肽的实施例。可以使用密码子优化的编码核苷酸序列的变体。因此，vl结构域的编码序列可以融合到编码非天然前导的上游核苷酸序列上。优选的信号肽是msvptqvlgllllwltdarc(seqidno：62)。对于cho细胞表达，编码该信号肽的优选核苷酸序列为atgtctgtgcctacacaggttctgggactgctgctgctgtggctgaccgacgccagatgt(seqidno：64)，其为在cho细胞中表达而对其进行了密码子优化。121.抗体122.抗体是免疫球蛋白或包含免疫球蛋白结构域的分子。抗体可以是igg、igm、iga、igd或ige分子或包括其抗原特异性抗体片段的分子。术语“抗体”涵盖包含抗体抗原-结合位点的任何多肽或蛋白质。抗体抗原结合位点(互补位)是抗体的一部分，其结合至其靶抗原的表位并与其互补。术语“表位”是指被抗体结合的抗原区域。表位可以被定义为结构性的或功能性的。功能性表位通常是结构性表位的子集，并且具有直接有助于相互作用的亲和性的那些残基。表位也可以是构象的(conformational)，即由非线性氨基酸组成。在某些实施方式中，表位可以包括决定簇(determinants)，其是分子例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的化学活性表面基团，并且在某些实施方式中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。123.抗体抗原结合位点由抗体vh和/或vl结构域中的一组互补决定区(cdr)提供，并且能够结合抗原。在一个实例中，抗体结合位点由单个可变结构域提供，例如重链可变结构域(vh结构域)或轻链可变结构域(vl结构域)。在另一个实例中，结合位点由vh/vl对(fv)或两个或多个这样的对提供。124.抗体可变结构域是抗体的轻链和重链的部分，其包括互补决定区(cdr；即cdr1、cdr2和cdr3)和骨架区(fr)的氨基酸序列。因此，在每个vh和vl结构域内是cdr和fr。vh结构域包含一组hcdr，并且vl结构域包含一组lcdr。vh指重链的可变结构域。vl指轻链的可变结构域。每个vh和vl通常由三个cdr和四个fr组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。指定为cdr和fr的氨基酸位置可以根据imgt命名法(imgtnomenclature)来定义。抗体可包含抗体vh结构域，所述抗体vh结构域包含vhcdr1、cdr2和cdr3以及骨架。其可以可选地或还包含抗体vl结构域，该抗体vl结构域包含vlcdr1、cdr2和cdr3以及骨架。抗体vh和vl结构域和cdr的示例性序列形成本公开的一部分。cdr根据imgt系统进行定义。125.抗体可以在抗体骨架内包含一个或多个cdr，例如一组cdr。骨架区可以是人种系基因片段序列。因此，抗体可以是具有包含人种系骨架中的一组hcdr的vh结构域和包含例如在人种系骨架中的一组lcdr的vl结构域的人抗体。126.抗体“基因片段”，例如vh基因片段、d基因片段或jh基因片段，是指具有得到(derived)抗体的该部分的核酸序列的寡核苷酸，例如vh基因片段是包含对应于从fr1至部分的cdr3的多肽vh结构域的核酸序列的寡核苷酸。人v、d和j基因片段重组以产生vh结构域，并且人v和j片段重组以产生vl结构域。d结构域或区域是指抗体链的多样性(diversity)结构域或区域。j结构域或区域指抗体链的连接结构域或区域。发育中b细胞的基因组dna中的免疫球蛋白重链基因座处的种系vd和j基因片段的重组产生编码重链的dna。发育中b细胞的基因组dna中的免疫球蛋白κ轻链基因座处的种系vκ和jκ基因片段的重组产生编码κ轻链的dna。如果κ基因座处的重组不能产生生产性轻链，则λ基因座重排。发育中b细胞的基因组dna中的免疫球蛋白λ轻链基因座处的种系vλ和jλ基因片段的重组产生编码λ轻链的dna。重链与κ或λ链装配而产生抗体。127.体细胞高变(somatichypermutation)可导致抗体vh或vl结构域具有与相应种系基因片段不完全匹配或对齐的骨架区，但序列比对可用于鉴定最接近的基因片段，并因此鉴定特定vh或vl结构域源自哪个基因片段的特定组合。当比对抗体序列与基因片段时，抗体氨基酸序列可以与基因片段编码的氨基酸序列比对，或者抗体核苷酸序列可以直接与基因片段的核苷酸序列比对。128.来自人λv基因片段的序列提供于本发明的表l和表n中，用于参考。129.抗体可以是完整的免疫球蛋白，包括恒定区，或者可以是抗体片段。抗体片段是完整抗体的一部分，例如包含完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段可以包括一个或多个恒定区结构域。130.本发明的抗体可以是人抗体或包含人可变区和非人(例如小鼠)恒定区的嵌合抗体。本发明的抗体例如具有人可变区，并且任选地还具有人恒定区。131.因此，抗体任选地包括恒定区或其部分，例如人抗体恒定区或其部分，如人igg4恒定区。例如，vl结构域可以在其c-末端附于抗体轻链κ或λ恒定结构域。类似地，抗体vh结构域可以在其c-末端附于源自任何抗体同种型(例如igg、iga、ige和igm和任何同种型亚类(例如igg1或igg4))的免疫球蛋白重链恒定区的全部或部分(例如ch1结构域或fc区)连接。抗体恒定区的实例示于表s中。132.用木瓜蛋白酶消化完整(二价)免疫球蛋白，产生两个相同的(单价)抗原结合片段，称为“fab”片段，和“fc”片段。fc没有抗原结合活性，但具有结晶能力。“fab”在用于本发明时指包括每个重链和轻链的一个恒定域和一个可变域的抗体片段。本发明中术语“fc区”用于定义免疫球蛋白重链的c-末端区，包括天然序列fc区和变体fc区。“fc片段”是指通过二硫化物结合在一起的两条h链的羧基末端部分。133.用胃蛋白酶消化抗体产生二价f(ab')2片段，其中抗体分子的两个臂保持连接。f(ab')2片段是一个二价片段，包括通过铰链区的二硫键连接的两个fab片段。单链抗体(例如scfv)是另一个片段。两种不同的单价单特异性抗体片段如scfv可以连接在一起以形成二价双特异性抗体。[0134]“fv”当用于本发明时指保留抗原识别和抗原结合位点的抗体的最小片段。该区域由紧密、非共价或共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在这种构型中，每个可变区的三个cdr相互作用以在vh-vl二聚体的表面上限定抗原结合位点。共同地，六个cdr赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含抗原特异性的三个cdr的半个fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常亲和力低于完整的结合位点。[0135]抗体可以是多特异性抗体(multispecificantibody)，例如，其可以是包含针对两种不同抗原的抗原结合结构域的双特异性抗体，其中两种抗原结合结构域都由vh/vl对形成。多特异性抗体形式的实例包括fit-ig(参见wo2015/103072)、mab-dab、锚定和锁定(dockandlock)、fab-臂交换、seedbody、triomab、luz-y、fcab、κλ-body、正交fab、scdiabody-fc，双抗体-fc，串联scfv-fc，fab-scfv-fc，fab-scfv，胞内抗体，bite，双抗体，dart，tandab，scdiabody，scdiabody-ch3，双抗体-ch3，三联体，微型抗体，小抗体，scfv-ch3kih，scfv-ch-cl-scfv，f(ab')2-scfv，scfv-kih，fab-scfv-fc，四价hcab，immtac，knobs-in-hole，具有共同轻链的knobs-in-hole，具有共同轻链和电荷对(chargepairs)的knobs-in-hole，电荷对，具有共同轻链的电荷对，dt-igg，dutamab，igg(h)-scfv，scfv-(h)igg，igg(l)-scfv，scfv-(l)igg，igg(l,h)-fv，igg(h)-v，v(h)-igg，igg(l)-v，v(l)-igg，kihigg-scfab，2scfv-igg、igg-2scfv和scfv4-ig。[0136]在一个实施方式中，双特异性抗体是包含第一抗原结合多肽臂和第二抗原结合多肽臂的双特异性igg，每个多肽臂包含重链和轻链。igg是四聚体免疫球蛋白，包含：[0137]包含第一抗原结合fv区的第一对抗体重链和轻链(重-轻链对)，[0138]包含第二抗原结合fv区的第二重-轻链对，[0139]其中每条重链包含vh结构域和恒定区，并且每条轻链包含vl结构域和恒定区，并且其中所述第一和第二重-轻链对通过其重链恒定区的异二聚化缔合以形成免疫球蛋白四聚体。[0140]任选地，第一重-轻链对的重链恒定区包含与第二重-轻链对的重链恒定区不同的氨基酸序列，其中不同的氨基酸序列被工程化以促进重链恒定区的异二聚化(例如，它们可包含knobs-in-hole突变或电荷对突变)。在一个实施方式中，一个(例如，第一)重-轻链对的重链恒定区是包含取代k439e的人igg4恒定区，并且其中另一个(例如，第二)重-轻链对的重链恒定区是包含取代e356k的igg4区，其中恒定区编号根据eu编号系统。表s中提供了抗体恒定区和包含它们的抗体重链的实例。[0141]任选地，两个多肽臂包含共同的轻链，因此第一和第二重-轻链对的轻链具有相同的氨基酸序列，或者两个多肽臂可包含不同的轻链。[0142]任选地，双特异性抗体对于结合每种抗原是单价的。[0143]双特异性抗体的实例包括结合凝血因子ix和因子x的抗体。具有共同轻链的双特异性抗体的命名是ixax-nnnn.tttt.llll，其中nnnn是抗fixvh结构域的4位数字的标识符，tttt是抗fxvh结构域的4位数字的标识符，llll是共同vl结构域的4位数字的标识符。序列显示于所附的表s和本发明其它地方。[0144]优选地，共同轻链包含0128lvl结构域或0325lvl结构域。它可以是表s中所示的0128l轻链序列或0325l轻链序列。[0145]双特异性抗体可包含fix结合臂，所述结合臂包含含有n0128hvh结构域的重链(例如，n0128h重链)。或者，双特异性抗体可包含fix结合臂，所述结合臂包含含有n1441hvh结构域、n1442hvh结构域、n1454hvh结构域或n1172hvh结构域的重链。[0146]双特异性抗体可以包含fx结合臂，所述fx结合臂包含含有t0201hvh结构域的重链(例如，t0201h重链)。或者，双特异性抗体可以包含fx结合臂，所述fx结合臂包含含有t0999hvh结构域或t0736hvh结构域的重链。[0147]双特异性抗体的优选实施方式是下列igg：[0148]ixax-1280.0999.0325(抗fixavh结构域n1280h；抗fxvh结构域t0999h；0325l共同vl结构域)[0149]ixax-1441.0999.0325(抗fixavh结构域n1441h；抗fxvh结构域t0999h；0325l共同vl结构域)。[0150]第一重链可以是n1280h重链或n1441h重链。第二重链可以是t0999h重链。轻链可以是0325lλ轻链。[0151]结合fixa和fx并催化fixa介导的fx活化的双特异性抗体可包含两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中[0152]第一重-轻链对包含fixa结合fv区，所述fixa结合fv区包含与第一vl结构域配对的第一vh结构域，和[0153]第二重-轻链对包含fx结合fv区，所述fx结合fv区包含与第二vl结构域配对的第二vh结构域，其中[0154]第一vh结构域与n1280hvh结构域具有至少95％的氨基酸序列同一性，[0155]第二vh结构域与t0201hvh结构域具有至少95％氨基酸序列同一性，和[0156]所述第一vl结构域和所述第二vl结构域各自与所述0325lvl结构域具有至少95％氨基酸序列同一性。[0157]结合fixa和fx并催化fixa介导的fx活化的双特异性抗体可包含两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中[0158]第一重-轻链对包含fixa结合fv区，所述fixa结合fv区包含与第一vl结构域配对的第一vh结构域，其中所述第一vh结构域是n1280hvh结构域，和[0159]第二重-轻链对包含fx结合fv区，所述fx结合fv区包含与第二vl结构域配对的第二vh结构域，其中所述第二vh结构域是t0999hvh结构域，并且其中[0160]第一和第二重-轻链对各自包含含有0325lvl结构域的共同轻链。[0161]结合fixa和fx并催化fixa介导的fx活化的双特异性抗体可包含两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中[0162]第一重-轻链对包含fixa结合fv区，所述fixa结合fv区包含与第一vl结构域配对的第一vh结构域，其中所述第一vh结构域是n1441hvh结构域，并且[0163]第二重-轻链对包含fx结合fv区，所述fx结合fv区包含与第二vl结构域配对的第二vh结构域，其中所述第二vh结构域是t0999hvh结构域，并且其中[0164]第一和第二重-轻链对各自包含含有0325lvl结构域的共同轻链。[0165]imgt编号[0166]imgt系统在lefranc,m.-p.etal.,dev.comp.immunol.,27,55-772003有记载。除非另有说明，本发明所用抗体多肽的编号是imgt编号，并且结构定义抗体vh结构域、vl结构域、cdr和fr也是基于imgt的。表l显示了参照imgt系统从编码vλ基因片段翻译的vl结构域氨基酸序列。图2显示了对λvl结构域0325l的imgt编号。[0167]编码核酸和表达方法[0168]可以提供分离的核酸，其编码包含根据本发明的抗体vl结构域和轻链的多肽，以及包含它们的抗体。核酸可以是dna和/或rna。合成来源的基因组dna、cdna、mrna或其它rna或其任意组合可编码抗体。[0169]本发明提供了质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包含至少一种上述多核苷酸。示例性的核苷酸序列如本发明所示。除非上下文另有要求，本发明所述的核苷酸序列包括具有特定序列的dna分子，并包括具有特定序列的rna分子，其中u取代t。[0170]本发明还提供了包含编码所述多肽或抗体的一种或多种核酸的重组宿主细胞。产生所编码分子的方法可包含从核酸表达，例如通过培养含有核酸的重组宿主细胞。因此，可以获得多肽或抗体，并且可以使用任何合适的技术分离和/或纯化，然后适当使用。生产方法可包含将产物配制成包含至少一种另外的组分如药学上可接受的赋形剂的组合物。[0171]在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母和杆状病毒系统以及转基因植物和动物。[0172]抗体和抗体片段在原核细胞中的表达在本领域中是充分确立的。常见的细菌宿主是大肠杆菌。培养的真核细胞中的表达也是本领域技术人员可以选择的生产方法。本领域可获得的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞、幼仓鼠肾细胞、nso小鼠黑素瘤细胞、yb2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚肾(hek)细胞、人胚视网膜细胞和许多其它细胞。通常使用cho、ns0、sp2/0、hek293和perc6(dumont等，critrevbiotechnol36(6)：1110-11222016)。[0173]用于生物药物的重组表达的常用系统是lonza'sgssystemtm。谷氨酰胺合成酶(gs)是负责从谷氨酸和氨生物合成谷氨酰胺的酶。在生长培养基中不存在谷氨酰胺时，gs酶对于培养的哺乳动物细胞的存活是必需的。一些哺乳动物细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系，不表达足够的gs以在不添加谷氨酰胺的情况下存活。使用这些细胞系，转染的gs基因可以通过允许在无谷氨酰胺的培养基中生长而作为筛选标记(selectablemarker)起作用。其它细胞系，例如cho细胞系，表达足够的gs以在没有外源谷氨酰胺的情况下存活。在这些情况下，gs抑制剂、蛋氨酸亚砜亚胺(methioninesulphoximine,msx)，可以用于抑制内源性gs活性，使得只有具有额外gs活性的转染子(transfectants)可以存活。lonza提供了包含编码gs的核酸和抗体序列可以插入其中的克隆位点的载体，用于转染到宿主细胞中，然后选择所述宿主细胞用于所需基因的整合。lonza提供chok1sv宿主细胞系，尽管也可以使用其它宿主细胞如chok1。[0174]载体可以含有适当的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它适当的序列。最近gupta等，biotechnologyadvances2019，综述了用于重组基因表达的启动子和其它调节元件。在gupta等，2019的表1中鉴定的启动子和/或其它元件可用于本发明。[0175]编码多肽或抗体的核酸可以被导入宿主细胞。核酸可以通过各种方法导入真核细胞，包括磷酸钙转染、deae-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其它病毒(例如牛痘，或者对于昆虫细胞，杆状病毒)转导。将核酸导入宿主细胞，特别是真核细胞可以使用基于病毒或质粒的系统。质粒系统可以保持游离状态(episomally)，或者可以并入(incorporated)宿主细胞或人工染色体中。并入可以通过在单个或多个基因座随机或靶向整合一个或多个拷贝来进行。对于细菌细胞，合适的技术包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体转染。导入之后可以表达核酸，例如通过在表达基因的条件下培养宿主细胞，然后任选地分离或纯化抗体。[0176]本发明的核酸可以整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。根据标准技术，通过包含促进与基因组重组的序列可以促进整合。编码多肽或抗体的核酸可整合到宿主(例如cho)细胞的基因组dna中，例如整合到染色体dna中，并且可培养所得重组细胞以表达多肽或抗体。细胞系开发过程可以包含将编码多肽或抗体的核酸导入多个宿主细胞，并选择以期望的产量(例如，至少0.5g/l或至少1g/l)表达期望水平的多肽或抗体的细胞系。优选地，细胞系在细胞培养物中在多代中保持稳定表达，因此其可以在例如至少60代中维持这些生产水平。[0177]本发明还提供了一种方法，其包括在表达系统中使用本发明所述的核酸以表达多肽或抗体。理想地，多肽或抗体在初始发酵后在细胞上清液中以至少0.5g/l的产量表达，优选产量＞2g/l。溶解度应＞10mg/ml，优选＞50mg/ml，而没有分子的显著聚集或降解。[0178]为了提供适于全球治疗的药物，可以大规模生产抗体，例如在至少100升或至少200升的细胞培养体积中，例如100-250升之间的细胞培养体积中。分批培养，特别是补料分批培养，现在通常用于生产临床和商业用途的生物治疗剂，并且这样的方法可以适合地用于本发明以产生抗体，随后是如本发明所述的纯化和配制步骤。生物反应器可以是金属(例如不锈钢)容器或者可以是一次性使用的生物反应器。[0179]制剂和给药[0180]根据本发明的多肽或抗体及其编码核酸通常以分离的形式提供。vl结构域、抗体轻链、抗体和核酸可以从它们的天然环境或它们的生产环境中纯化提供。分离的多肽和分离的核酸将不含或基本上不含与它们天然结合的物质，例如在体内发现的其它多肽或核酸，或者当通过重组dna技术在体外制备时，在制备它们的环境(例如细胞培养物)中。任选地，分离的多肽或核酸(1)不含至少一些通常被发现的的其它蛋白质，(2)基本上不含来自tyrval。[0214]9.根据条目6或7的多肽，其中，vλ基因片段为人iglv3-21。[0215]10.根据前述任一项条目的多肽，其中，信号肽具有20个氨基酸的长度。[0216]11.根据前述任一项条目的多肽，其中，所述信号肽不是人λv基因片段信号肽。[0217]12.根据条目11的多肽，其中，所述信号肽不是λv基因片段信号肽。[0218]13.根据前述任一项条目的多肽，其中，所述信号肽包含c-末端cys残基。[0219]14.根据条目13的多肽，其中，信号肽包含c-末端序列alaargcys。[0220]15.根据条目14的多肽，其中，信号肽包含c-末端序列thraspalaargcys。[0221]16.根据前述任一项条目的多肽，其中，所述信号肽是κv基因片段信号肽。[0222]17.根据条目16的多肽，其中，信号肽是小鼠κv基因片段信号肽。[0223]18.根据条目17的多肽，其中，信号肽为msvptqvlgllllwltdarcseqidno：62。[0224]19.根据前述任一项条目的多肽，其中，所述多肽是包含vl结构域和轻链恒定(cl)结构域的抗体轻链。[0225]20.根据条目19的多肽，其中，cl结构域是λcl结构域。[0226]21.根据前述任一项条目的多肽，其中，vl结构域是n0325lvl结构域。[0227]22.根据条目21的多肽，其由氨基酸序列msvptqvlgllllwltdarcyvltqppsvsvapgetaritcggdnigrksvywyqqksgqapvlviyydsdrpsgiperfsgsnsgntatltisrveagdeadyycqvwdgssdhwvfgggtkltvlseqidno：66组成[0228]或包含所述序列作为n-末端结构域。[0229]23.根据条目22的多肽，其由以下氨基酸序列组成或包含以下氨基酸序列的抗体λ轻链msvptqvlgllllwltdarcyvltqppsvsvapgetaritcggdnigrksvywyqqksgqapvlviyydsdrpsgiperfsgsnsgntatltisrveagdeadyycqvwdgssdhwvfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshksyscqvthegstvektvaptecsseqidno：67。[0230]24.编码根据前述条目中任一项的多肽的核酸。[0231]25.根据条目24的核酸，其中，核酸是cdna。[0232]26.根据条目24的核酸，其中，核酸是包含内含子的基因组dna。[0233]27.根据条目24-26中任一项的核酸，其包含编码信号肽的核苷酸序列atgtctgtgcctacacaggttctgggactgctgctgctgtggctgaccgacgccagatgtseqidno：64。[0234]28.根据条目24-27中任一项的核酸，其包含编码vl结构域的核苷酸序列tacgtgctgacccagcctccttccgtgtctgttgctcctggcgagacagccagaatcacctgtggcggcgataacatcggccggaagtccgtgtactggtatcagcagaagtccggccaggctcctgtgctggtcatctactacgactccgaccggccttctggcatccctgagagattctccggctccaactccggcaataccgccacactgaccatctccagagtggaagctggcgacgaggccgactactactgccaagtgtgggacggctcctctgaccactgggttttcggcggaggcaccaagctgacagtgctgseqidno：100。[0235]29.根据条目28的核酸，其包含核苷酸序列atgtctgtgcctacacaggttctgggactgctgctgctgtggctgaccgacgccagatgttacgtgctgacccagcctccttccgtgtctgttgctcctggcgagacagccagaatcacctgtggcggcgataacatcggccggaagtccgtgtactggtatcagcagaagtccggccaggctcctgtgctggtcatctactacgactccgaccggccttctggcatccctgagagattctccggctccaactccggcaataccgccacactgaccatctccagagtggaagctggcgacgaggccgactactactgccaagtgtgggacggctcctctgaccactgggttttcggcggaggcaccaagctgacagtgctgseqidno：65。[0236]30.一种体外宿主细胞，其包含根据条目24-29中任一项的核酸。[0237]31.根据条目30的细胞，其是哺乳动物细胞。[0238]32.根据条目31的细胞，其为cho细胞。[0239]33.根据条目31的细胞，其是人细胞。[0240]34.根据条目33的细胞，其是hek细胞。[0241]35.根据条目30-34中任一项的细胞，其中，所述核酸整合至细胞的染色体dna中。[0242]36.根据条目30-35中任一项的细胞的体外细胞群。[0243]37.根据条目36的细胞群，其中[0244]所述细胞表达所编码的多肽，并且其中[0245]在细胞中表达时，信号肽从多肽上切下，以提供包含对应于imgt第2位的n-末端残基的成熟vl结构域。[0246]38.表达包含vl结构域的多肽的方法，所述方法包括：[0247]在表达所述多肽的条件下培养根据条目36或37的细胞群，其中[0248]n-末端信号肽从vl结构域被切除以提供包含成熟vl结构域的多肽，其中[0249]包含成熟vl结构域的多肽的n-末端残基是vl结构域的imgt第2位。[0250]39.一种表达包含vh结构域和vl结构域的抗体的方法，其中，所述vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列，所述方法包括：[0251]提供根据条目36或37的细胞群，其中，所述细胞还包含编码vh结构域的核酸，[0252]在用于表达包含vl结构域的多肽和用于表达vh结构域的条件下培养所述细胞群，其中[0253]n-末端信号肽从vl结构域被切除以提供包含成熟vl结构域的多肽，其中[0254]包含成熟vl结构域的多肽的n-末端残基是vl结构域的imgt第2位，并且其中[0255]vl结构域与vh结构域组装以提供所述抗体。[0256]40.根据条目38或39的方法，其中，所述多肽或抗体从细胞分泌。[0257]41.根据条目38-40中任一项的方法，其包含从细胞群分离多肽或抗体。[0258]42.根据条目41的方法，其包括通过蛋白质层析的一个或多个步骤纯化多肽或抗体。[0259]43.根据条目38-42中任一项的方法，其中，抗体是igg。[0260]44.根据条目38-43中任一项的方法，其中，抗体是多特异性抗体。[0261]45.一种表达双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含两条各自含有一个不同vh结构域的重链和一条含有vl结构域的共同轻链，其中所述vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列，所述方法包括：[0262]提供根据条目36或37的细胞群，其中细胞还包含编码两条重链的核酸，[0263]在表达抗体重链和轻链的条件下培养所述细胞群，其中[0264]n-末端信号肽从vl结构域被切除以提供包含成熟vl结构域的抗体轻链，其中[0265]包含成熟vl结构域的多肽的n-末端残基是vl结构域的imgt第2位，并且其中[0266]轻链结构域与两条重链的每一条组装以提供所述双特异性抗体。[0267]46.根据条目45的方法，其中，所述两条重链分别包含vh结构域n1280h和t0999h，且其中所述轻链包含vl结构域0325l。[0268]47.根据条目46的方法，其中，所述抗体是包含n1280h重链、t0999h重链和0325l轻链的igg4。[0269]48.根据条目45的方法，其中，所述两条重链分别包含vh结构域n1441h和t0999h，且其中所述轻链包含vl结构域0325l。[0270]49.根据条目46的方法，其中，所述抗体是包含n1441h重链、t0999h重链和0325l轻链的igg4。[0271]50.抗体vl结构域，其通过切割来自条目1-23中任一项的多肽的n-末端信号肽而获得。[0272]51.一种分离的抗体，其包含根据条目50的vl结构域。[0273]52.一种分离的抗体，其通过条目39-49中任一项的方法获得。[0274]53.一种分离的抗体，其包含vh结构域和vl结构域，其中，所述vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列，并且其中所述vl结构域的n-末端残基是对应于imgt第2位的残基。[0275]54.根据条目53的抗体，其中，所述vλ基因片段是人vλ3-21基因片段。[0276]55.根据条目54的抗体，其中，所述vl结构域氨基酸序列是0325lvl结构域氨基酸序列。[0277]56.根据条目55的抗体，其中，抗体包含λ轻链，其中所述轻链的氨基酸序列是0325l轻链氨基酸序列。[0278]57.根据条目53-56中任一项的抗体，其为双特异性抗体，其包含两条各自含有一个不同的vh结构域的重链和含有所述vl结构域的共同轻链。[0279]58.根据条目57的抗体，其中，双特异性抗体包含[0280]含有n1280hvh结构域的重链；[0281]含有t0999hvh结构域的重链；以及[0282]含有0325lvl结构域的共同轻链。[0283]59.根据条目58的抗体，其包含n1280h重链、t0999h重链和0325l共同轻链。[0284]60.根据条目57的抗体，其中，双特异性抗体包含[0285]含有n1441hvh结构域的重链；[0286]含有t0999hvh结构域的重链；以及[0287]含有0325lvl结构域的共同轻链。[0288]61.根据条目60的抗体，其包含n1441441h重链、t0999h重链和0325l共同轻链。[0289]62.一种配制药物组合物的方法，包含将抗体与药学上可接受的赋形剂组合，其中，所述抗体是根据条目51-61中任一项的抗体。[0290]63.一种制备或改善包含vh结构域和vl结构域的抗体的稳定性和/或抗原结合的方法，其中，所述vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列，所述方法包括：[0291]提供编码所述抗体的核酸，其包含编码具有n-末端信号肽的所述vl结构域的核苷酸序列，其中所述vl结构域的对应于imgt第1位的残基的密码子缺失，并且n-末端信号肽不是所述λv基因片段的天然n-末端信号肽，以及[0292]表达所述核酸以提供包含vh结构域和vl结构域的抗体，其中，所述vl结构域的n-末端残基是对应于imgt第2位的残基，并任选地分离和纯化所述抗体。[0293]描述性声明(descriptivestatements)[0294]1.一种包含具有n-末端信号肽的抗体轻链可变(vl)结构域的多肽，其中[0295]vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列，其中[0296]n-末端信号肽与所述λv基因片段的天然n-末端信号肽不同，并且其中[0297]vl结构域包含相对于由vλ基因片段编码的起始于imgt第1位的氨基酸序列的n-末端截短。[0298]2.根据声明1的多肽，其中对应于vl结构域的imgt第1位的残基是不存在的，且vl结构域的n-末端残基对应于imgt第2位。[0299]3.根据声明1或声明2的多肽，其中vλ基因片段是人vλ基因片段。[0300]4.前述任一项声明的多肽，其中j基因片段是人jλ基因片段。[0301]5.根据声明1至4中任一项的多肽，其中vλ基因片段的第一个编码残基(imgt第1位)是ser，任选地其中所述vλ基因片段是脊椎动物iglv3家族基因区段。[0302]6.根据声明5的多肽，其中vλ基因片段是iglv3-21、iglv3-1、iglv3-9、iglv3-10、iglv3-12、iglv3-13、iglv3-16、iglv3-19、iglv3-22、iglv3-25或iglv3-27。[0303]7.根据声明5或声明6的多肽，其中vλ基因片段的前两个编码残基(imgt第1-2位)是sertyr。[0304]8.根据声明7的多肽，其中vλ基因片段的前三个编码残基(imgt第1-3位)是sertyrval。[0305]9.根据声明6或声明7的多肽，其中vλ基因片段是人iglv3-21。[0306]10.根据前述任一项权利要求的多肽，其中信号肽具有20个氨基酸的长度。[0307]11.根据前述任一项声明的多肽，其中信号肽不是人λv基因片段信号肽。[0308]12.根据声明11的多肽，其中信号肽不是λv基因片段信号肽。[0309]13.根据前述任一项声明的多肽，其中信号肽包含c-末端cys残基。[0310]14.根据声明13的多肽，其中信号肽包含c-末端序列alaargcys。[0311]15.根据声明14的多肽，其中信号肽包含c-末端序列thraspalaargcys。[0312]16.根据前述声明中任一项的多肽，其中信号肽是κv基因片段信号肽。[0313]17.根据声明16的多肽，其中信号肽是小鼠κv基因片段信号肽。[0314]18.根据声明17的多肽，其中信号肽是msvptqvlgllllwltdarcseqidno：62。[0315]19.根据声明1-4中任一项的多肽，其中信号肽是seqidno：74。[0316]20.根据前述任一项声明的多肽，其中多肽是包含vl结构域和轻链恒定(cl)结构域的抗体轻链，任选地其中所述cl结构域是λcl结构域。[0317]21.根据前述任一项声明的多肽，其中vl结构域是n0325lvl结构域seqidno：101。[0318]22.根据声明21的多肽，其由氨基酸序列seqidno：66组成或包含所述序列作为n-末端结构域。[0319]23.根据声明22的多肽，其是抗体λ轻链，由氨基酸序列seqidno：67组成或包含该序列。[0320]24.根据声明1-20中任一项的多肽，其中vl结构域是larivl结构域seqidno：117。[0321]25.编码根据前述任一项声明的多肽的核酸。[0322]26.根据声明25的核酸，其中，核酸是cdna。[0323]27.根据声明25的核酸，其中，核酸是包含内含子的基因组dna。[0324]28.根据声明25-27中任一项的核酸，其包含编码信号肽的核苷酸序列seqidno：64。[0325]29.根据声明25-28中任一项的核酸，其包含编码vl结构域的核苷酸序列seqidno：100。[0326]30.根据声明29的核酸，其包含核苷酸序列seqidno：65。[0327]31.一种体外宿主细胞，其包含根据声明25-30中任一项的核酸。[0328]32.根据声明31的细胞，其是哺乳动物细胞。[0329]33.根据声明32的细胞，其是cho细胞。[0330]34.根据声明31的细胞，其是人细胞，任选地是hek细胞。[0331]35.根据声明31-34中任一项的细胞，其中，所述核酸整合到该细胞的染色体dna中。[0332]36.根据声明31至35中任一项的细胞的体外细胞群。[0333]37.根据声明36的细胞群，其中[0334]所述细胞表达所编码的多肽，并且其中[0335]在细胞中表达时，信号肽从多肽上切下，以提供成熟的vl结构域，成熟的结构域包含n-末端残基，该n-末端残基对应于由相同的vλ基因编码的vl结构域在用其天然信号肽表达并从其天然信号肽切下时的n-末端残基，任选地其中n-末端残基是imgt第2位或imgt第3位。[0336]38.表达包含vl结构域的多肽的方法，所述方法包括[0337]在表达所述多肽的条件下培养根据声明36或声明37的细胞群，其中[0338]将n-末端信号肽从vl结构域切除以提供包含成熟vl结构域的多肽，其中[0339]包含成熟vl结构域的多肽的n-末端残基对应于由相同的vλ基因片段编码的vl结构域在用其天然信号肽表达并从其天然信号肽切下时的n-末端残基，任选地其中n-末端残基是vl结构域的imgt第2位或imgt第3位。[0340]39.一种表达包含vh结构域和vl结构域的抗体的方法，其中vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列，所述方法包括[0341]提供根据声明36或声明37的细胞群，其中细胞还包含编码vh结构域的核酸，[0342]在用于表达包含vl结构域的多肽和用于表达vh结构域的条件下培养所述细胞群，其中[0343]将n-末端信号肽从vl结构域切除以提供包含成熟vl结构域的多肽，其中[0344]包含成熟vl结构域的多肽的n-末端残基对应于由相同的vλ基因片段编码的vl结构域在用其天然信号肽表达并从其天然信号肽切下时的n-末端残基，任选地其中所述n-末端残基是vl结构域的imgt第2位或imgt第3位，并且其中[0345]vl结构域与vh结构域组装以提供所述抗体。[0346]40.根据声明38或声明39的方法，其中多肽或抗体从所述细胞分泌。[0347]41.根据声明38-40中任一项的方法，其包含从细胞群分离所述多肽或抗体。[0348]42.根据声明41的方法，其包括通过蛋白质层析的一个或多个纯化所述多肽或抗体。[0349]43.根据声明38-42中任一项的方法，其中，抗体是igg。[0350]44.根据声明38-43中任一项的方法，其中，抗体是多特异性抗体。[0351]45.一种表达双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含两条各自含有不同的vh结构域的重链和一条含有vl结构域的共同轻链，其中所述vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列，所述方法包括[0352]提供根据声明36或声明37的细胞群，其中细胞还包含编码两条重链的核酸，[0353]在表达抗体重链和轻链的条件下培养所述细胞群，其中[0354]将n-末端信号肽从vl结构域切除以提供包含成熟vl结构域的抗体轻链，其中[0355]包含成熟vl结构域的多肽的n-末端残基对应于由相同的vλ基因片段编码的vl结构域在用其天然信号肽表达并从其天然信号肽切下时的n-末端残基，任选地其中所述n-末端残基是vl结构域的imgt第2位或imgt第3位，并且其中[0356]轻链结构域与两条重链的每一条组装以提供所述双特异性抗体。[0357]46.根据声明45的方法，其中包含成熟vl结构域的多肽的n-末端残基是vl结构域的imgt第2位。[0358]47.根据声明46的方法，其中两条重链分别包含vh结构域n1441hseqidno：83和t0999hseqidno：87，且其中轻链包含vl结构域0325lseqidno：101。[0359]48.根据声明47的方法，其中所述抗体是igg4，其包含n1441h重链seqidno：85、t0999h重链seqidno：89和0325l轻链seqidno：103。[0360]49.根据声明45-48中任一项的方法，其中信号肽是seqidno：62。[0361]50.抗体vl结构域，其通过切除声明124中任一项的多肽的n-末端信号肽获得。[0362]51.一种分离的抗体，其包含根据声明50的vl结构域。[0363]52.一种分离的抗体，其通过声明39-49中任一项的方法获得。[0364]53.一种改善包含vh结构域和vl结构域的抗体的稳定性和/或抗原结合或降低其免疫原性的方法，其中所述vl结构域包含源自vλ基因片段的序列和源自j基因片段的序列，所述方法包括[0365]提供编码所述抗体的核酸，其包含编码具有n-末端信号肽的所述vl结构域的核苷酸序列，其中所述vl结构域的对应于imgt第1位和任选地imgt第2位的残基的密码子缺失，并且其中所述n-末端信号肽不是所述λv基因片段的天然n-末端信号肽，以及[0366]表达所述核酸以提供包含vh结构域和vl结构域的抗体，其中vl结构域的n-末端残基是对应于imgt第2位或imgt第3位的残基，和任选地分离和纯化所述抗体。[0367]54.一种方法，包括[0368](i)提供编码抗体轻链可变(vl)结构域的核苷酸序列，[0369](ii)提供第一dna分子，其包含所述核苷酸序列，所述核苷酸序列前面是编码天然信号肽的前导序列，nnnn.tttt.llll，其中nnnn是抗fixvh结构域的4位数字的标识符，tttt是抗fxvh结构域的4位数字的标识符，llll是共同vl结构域的4位数字的标识符。ixax抗体的vh和vl结构域以及重链和轻链的序列示于随附的表s和本发明其它地方。[0388]实施例2：用不同前导序列和0128lvl结构域的λ抗体的表达[0389]对于工业生产，通常将成熟抗体多肽的编码序列导入包含前导序列的转染载体。因此，vl结构域序列用非天然前导表达。[0390]当我们将我们的双特异性抗体的天然前导序列更换为用于制造目的的替代前导序列时，我们观察到fxase试验中功能活性的降低。这不是抗体表达改变的结果，其保持恒定(参见实施例7)。出乎意料的是，我们发现当κ轻链前导用于表达0128l共同轻链时fviii模拟活性下降。[0391]更详细地，在fxase试验中筛选一组包含一系列不同的fx重链的21种双特异性抗体，每条与n0128h抗fix重链和0128l共同轻链组合。使用两种不同的0128l共同轻链构建体来表达n0128l共同轻链，一种使用天然前导，另一种使用小鼠κ轻链前导。序列示于随附的表p中。[0392]使用编码抗fix和抗fx重链和具有所选轻链前导的共同轻链n0128_igl的载体，在hek细胞中表达双特异性抗体。[0393]使用高通量2ml深孔阻断转染方法表达双特异性抗体。表达和收获后，使用蛋白a层析从hek培养基中纯化双特异性抗体，通过od280定量蛋白，并将所有样品的蛋白浓度标准化。[0394]与使用天然前导表达共同轻链的双特异性抗体相比，在使用小鼠κ轻链前导序列表达共同轻链的双特异性抗体中观察到fxa产生活性的显著下降。见图3。[0395]实施例3：0128l中依赖于前导的n-末端剪切(clipping)的鉴定[0396]治疗性单克隆抗体的结构完整性可能被导致产物异质性的多种类型的翻译后修饰破坏。质谱(ms)用于表征和评价阳离子交换纯化后双特异性抗体的分子量。[0397]出乎意料地，当与imgt参照序列相比时，对用天然人igλ前导序列表达包含0128l的的共同轻链的质谱分析鉴定出，完全组装的双特异性抗体上存在特异性n-末端ser剪切。然而，值得注意的是，当通过质谱分析时，非天然前导序列保留了n-末端丝氨酸。[0398]双特异性抗体ixax-1172.0201.0128由编码包含n1172hvh结构域的抗fix重链、包含t0201hvh结构域的抗fx重链和包含0128lvl结构域的共同轻链的核酸表达。[0399]使用天然前导或小鼠κ轻链前导表达抗体的共同轻链，通过阳离子交换纯化抗-fix/抗-fx异二聚体，并采用质谱进行分析。[0400]当使用天然前导表达轻链时，通过ms测定的抗-fix/抗-fx异二聚体的分子量(mw)小于通过ixax-1172.0201.0128抗-fix/抗-fx异二聚体的氨基酸序列所预测的理论mw。共同轻链的ms结果表明，当使用天然前导时，共同轻链的n-末端丝氨酸被截去。[0401]当使用小鼠κ轻链前导表达轻链时，通过ms测定的抗fix/抗fx异二聚体的mw与通过抗fix/抗fxixax-1172.0201.0128异二聚体的氨基酸序列预测的理论mw匹配。共同轻链的ms结果表明，当使用小鼠κ轻链前导时，共同轻链的n-末端丝氨酸是完整的。[0402]无论双特异性抗体是在hek还是cho细胞中表达，都观察到了一致的结果。[0403]值得注意的是，我们观察到，在0128l全长(包括n-末端丝氨酸)的情况下，通过质谱确定切割是完全的或根本没有发生切割，其取决于何种前导序列被使用。这与早期的前导错误加工的报道(gibson等，2017)形成对比，其中可变的切割位点被报道为导致回收的抗体产物中截短轻链的低水平(4-6％)。[0404]实施例4：0128l的imgt第1位的突变分析[0405]我们假设在新前导序列存在的情况下n-末端丝氨酸的除去会恢复功能活性。我们进一步研究了在imgt第1位上不同的氨基酸残基取代丝氨酸的作用。[0406]双特异性抗体的抗fix结合臂和抗fx结合臂的重链分别“固定”为n1280hvh结构域和t0736hvh结构域，同时对共同轻链vl结构域进行进一步细化以鉴定当使用小鼠κ轻链前导时保留双特异性抗体的fxa产生活性的突变体。[0407]下表e鉴定了0128lvl结构域的突变体，其中的一个或多个cdr残基被突变成其它氨基酸。该表显示了在imgt第1位具有已鉴定突变的每个变体vl结构域的名称，在每种情况下，除imgt第1位以外的残基保持不变。例如，0310lvl结构域是0128lvl结构域的ser1ala突变体，即，在骨架1中imgt第1位上的丝氨酸(s)被丙氨酸(a)所取代。0325lvl结构域是在imgt第1位具有缺失的0128lvl结构域，即，它代表n-末端丝氨酸被剪去的0128lvl结构域。[0408][0409][0410]测试通过蛋白a层析纯化的双特异性抗体的功能活性，以寻找当使用天然前导时包含0128lvl结构域的亲本双特异性抗体的fxa产生活性的保留。心产生的双特异性抗体通过在实施例1中描述的fxase试验进行表征。[0411]轻链骨架1的诱变产生fviii模拟活性的改善。n0325l，其阻止n-末端丝氨酸的缺失，是当使用小鼠κ轻链前导时保留双特异性抗体的fxa产生活性的唯一突变体。包含0325lvl结构域的双特异性抗体显示出与使用天然前导时包含0128lvl结构域的亲本双特异性抗体相当的活性。见图4。[0412]因此，在替代前导序列的存在下，与具有n-末端丝氨酸的相同双特异性抗体相比，n-末端丝氨酸的缺失显示出更大的生物活性。这证实了在替代前导序列的存在下，丝氨酸n-末端缺失对分子功能性的影响。[0413]实施例5：具有0325lvl结构域的抗体的表达[0414]在鉴定n0325l后，随后以30ml进行大规模瞬时hekexpi293转染，并且在该hek表达系统中产生的ixax双特异性抗体证实了小规模转染的观察结果(实施例2)。[0415]我们还证实，当稳定表达为cho微集合体(mini-pool)时，具有缺乏n-末端丝氨酸的共同轻链、表达有非天然前导的ixax双特异性抗体表现出恢复的功能活性。[0416]hek和cho细胞系都用于表达ixax抗体，ixax抗体包括具有天然vλ3-21前导或非天然小鼠κ前导序列的0325l轻链。密码子优化的前导核苷酸序列被使用(对cho的优化，并且在hek中使用相同的序列)。[0417]hek细胞中的表达[0418]简言之，7.5×107细胞(最终细胞密度为2.5×106细胞/ml)用于每30ml的转染，并在具有空气中8％co2的湿润气氛的37℃培养箱中在以125-140rpm旋转的定轨摇床上培养(incubate)1小时。对于每个转染样品，通过在i培养基中混合30μg质粒dna至总体积1.5ml，然后温和混合，制备脂质-dna复合物。随后，将80μlexpifectaminetm293试剂在i培养基中稀释至总体积为1.5ml，然后温和混合。将该混合物在室温下培养5分钟。在5分钟的培养之后，将dna加入到稀释的expifectaminetm293试剂中，以获得3ml的总体积。将该混合物轻轻混合，并在室温下培养20-30分钟，以形成dna-expifectaminetm293试剂复合物。一旦温育完成，就将dna-expifectaminetm293试剂复合物加入到含有expi293细胞的每个摇瓶中。在具有空气中8％co2的湿润气氛的37℃培养箱中，于125-140rpm旋转的定轨摇床上培养细胞。转染后约16-18小时，向每个烧瓶中加入150μl的expifectaminetm293转染增强剂1和1.5ml的expifectaminetm293转染增强剂2。转染后5至6天收获上清液。表达和收获后，使用蛋白a层析从hek培养基中纯化双特异性抗体，通过od280定量蛋白，并将样品的蛋白浓度标准化。[0419]我们证实，在hek细胞中，具有用非天然前导表达的缺乏n-末端丝氨酸的共同轻链的ixax双特异性抗体与具有用天然前导表达的全长共同轻链具有相似水平的功能活性，不管表达规模是小规模(2ml)还是大规模(30ml)。[0420]cho细胞中的表达[0421]我们使用lonzagsxceedtm基因表达系统，该系统使用单一筛选标记-谷氨酰胺合成酶(gs)，其在载体中编码。cho-k1gs敲除细胞用于转染。存活的细胞将载体整合到cho基因组的转录活性基因座中-转录gs，以合成谷氨酰胺(对于存活是必需的)。用于筛选的培养基缺乏谷氨酰胺，但补充了蛋氨酸亚砜亚胺(msx)用于严格筛选。msx有效且不可逆地抑制gs酶。[0422]在转染到cho细胞之前，将编码ixax抗体的重链和0325l共同轻链的载体线性化，随后使用phaselockgeltube(quantabio)纯化。chok1svgs-ko宿主细胞在补充了200mml-谷氨酰胺(gibco)-的cd-cho培养基(gibco)中培养，谷氨酰胺终浓度为6mm。将细胞在36.5℃、140rpm、7％co2、70％湿度下培养。使用vi-cellxr细胞活力分析仪(beckmancoulter)测量细胞密度和活力。转染前五天，将细胞以0.2×106个细胞/ml在200mltvcd-cho6mml-谷氨酰胺(gln)中传代培养。转染前两天，将细胞分至两个400mltv，在cd-cho6mmgln中以0.3×106个细胞/ml。转染当天，以2.5/2.8×106细胞/ml测量烧瓶。使用amaxa4dnucleofector(lonza)电穿孔，按照制造商的方案，用线性化的dna转染chok1svgs-ko宿主细胞。[0423]一旦转染，将细胞在36.5℃、140rpm、7％co2、70％湿度下培养24小时。转染后第一天，将集合体(pools)以200×g离心5分钟。除去上清液。将沉淀物重悬于30mlcd-cho/sp4/msx中，并转移到新的烧瓶中。浓度为75μm的msx用于含有载体的cho细胞的阳性筛选，因此理论上表达双特异性抗体。细胞处于筛选状态总共29天。在第一次传代前，将微集合体在静态培养箱(36.5℃，7％co2，70％湿度)中总共培养19天。所有集合体保持在筛选条件下，直到分批补料过度生长(fed-batchovergrow)被建立以促进双特异性抗体的表达。[0424]对于分批补料过度生长(fog)，将细胞以0.2×106个活细胞/ml接种于新培养容器30ml预热的cm79培养基中(遵循制造商的方案)。将烧瓶置于培养箱中(36.5℃，140rpm，7％co2，70％湿度)。在这个阶段不包括msx筛选。从第三天起，每天测量葡萄糖浓度和活细胞浓度。达到＞1.5×106细胞/ml后，每天向细胞中加入sp76-加入的sp76的体积通过活细胞浓度确定。从第三天起每天加入400g/ld-葡萄糖补料以防止葡萄糖耗尽。加入的400g/ld-葡萄糖进料的体积取决于测量的葡萄糖浓度。按照制造商的建议，以固定体积、规则的间隔加入sf54、sf71和sf77。12天后，收获30ml培养物。表达和收获后，使用蛋白a层析从cho培养基纯化双特异性抗体，通过od280定量蛋白，并将样品的蛋白浓度标准化。[0425]实施例6：通过质谱分析确认表达的0325lvl结构域序列[0426]通过ms分析从cho细胞产生的抗fix/抗fx异二聚双特异性抗体(参见实施例5)。[0427]当使用小鼠κ轻链前导表达0325l共同轻链时，通过ms测定的抗fix/抗fx异二聚体的mw与通过抗fix/抗fx异二聚体的氨基酸序列预测的理论mw匹配。[0428]实施例7：有和没有n-末端vl残基的λ抗体的产量比较[0429]如实施例5中详述的，将包含编码双特异性抗体ixax-1172.0201.0128的dna的载体转染到cho细胞中。使用0128lvl结构域的两种不同的前导序列-密码子优化的天然λ前导或密码子优化的小鼠κ前导。使用抑制gs蛋白的75μmmsx(蛋氨酸亚砜亚胺)对细胞进行稳定转染的筛选。[0430]在双特异性抗体稳定表达后，通过分批补料过度生长培养微集合体，以在摇瓶中以35ml的规模表达双特异性抗体。表达和收获后，使用蛋白a亲和层析(mabselectsureresin-generalelectric)从cho上清液中纯化双特异性抗体。比较在存在两种不同前导序列-天然前导序列和小鼠κ前导序列的情况下，相同双特异性抗体之间的表达产量。当用不同前导序列表达的相同双特异性抗体时，观察到相似的表达产量(mg/l)。见图5。[0431]n-末端缺失的功能性影响可能是由于末端丝氨酸残基侧链的空间位阻，其可使轻链和重链之间的二硫键不稳定。以前已有报道，在λlc的c-末端倒数第二个半胱氨酸之后缺失额外的丝氨酸残基改善了igg1λ抗体的热稳定性、对高ph的稳定性、瞬时表达、纯化产量和adcc功能(shen等，mabs5(3)：418-4312013)。类似地，在本发明的情况下，稳定性的变化可能是对抗体功能的影响的基础，尽管不能排除其它解释。鉴于fxase试验中观察到的影响，fxase试验依赖于igg的两个臂与抗原的结合，我们还可以将活性的变化归因于抗体的抗体fv(成对的vh和vl结构域)形成的结合位点对抗原结合的影响。可能对结合动力学，例如解离速率和/或结合速率有影响，可能影响抗体-抗原相互作用的总亲和力(kd)。由于这是双特异性抗体，另一种可能性是vl结构域的imgt第1位处n-末端残基的存在与不存在改变了细胞表达的异二聚体％。异二聚体是有活性的双特异性分子，而通过相同重链配对形成的同二聚体为污染物种类。n-末端ser的包括可能减少异二聚体％，降低双特异性抗体的有效产量，并因此降低从抗体组合物观察到的活性。[0432]在包括λ共同轻链的抗fixxfx双特异性抗体的情况下，n-末端ser的想不到的不存在是优势，并且我们在本发明中已经证明了如何用多种不同的表达系统确保该优势，在λ轻链用替代前导序列表达时，克服包括n-末端ser，同时维持抗体产量。[0433]实施例8：λ抗体lari[0434]命名为lari的人抗体包含在vh结构域和λvl结构域内提供的抗原结合位点。lari是通过免疫小鼠产生的，其中重链和λ轻链免疫球蛋白基因座已经被工程化以分别含有人免疫球蛋白重链和λ轻链可变区基因片段。编码larivl结构域的核苷酸序列与种系基因片段的比较表明，其源自人λ基因片段iglv10-54(等位基因vλ10-54*d02)和iglj3*02(等位基因jλ3*)的重组。[0435]将包含编码λ抗体lari的dna的载体转染到cho细胞中。larivl结构域的3中不同给的前导序列被使用-天然人vλ10家族信号肽(seqidno：121)、通常称为“campath前导”的鼠信号肽(seqidno：74)或小鼠κ轻链信号肽(seqidno：62)。[0436]如实施例5所述，在cho细胞中表达包含larivl结构域和小鼠κ轻链信号肽的lariigg。[0437]在cho3e7细胞中表达lariigg，其包含具有天然vλ10信号肽或campath前导肽的larivl结构域。简言之，每2000ml转染使用2.1×106个细胞/ml，在空气中7％co2的湿润气氛下于37℃培养箱中在125-140rpm旋转的定轨摇床上培养1小时。[0438]如实施例3所述，用ms表征和评价表达的抗体产物的分子量。[0439]当用天然vλ10家族信号肽表达轻链的细胞中产生时，完整抗体的分子量(mw)通过ms被确定小于通过λ抗体lari的氨基酸序列预测的理论mw。理论mw假定轻链以imgt残基1作为成熟抗体的n末端残基开始。如表l所示，由种系基因片段vλ10-54编码的氨基酸序列从以下开始：[0440]123456789[0441]qagltqpps...[0442]ms结果表明，当使用天然信号肽时，n-末端谷氨酰胺和丙氨酸残基被截短。因此，从其天然信号肽表达的lari轻链开始：[0443]gltqpps...[0444]当使用鼠信号肽seqidno：74(campath前导)表达轻链时，通过ms测定的完整抗体的mw与通过λ抗体lari的氨基酸序列预测的理论mw匹配。ms结果表明，当使用鼠信号肽时，n-末端谷氨酰胺和丙氨酸残基是完整的。[0445]这反映了在实施例3中观察到的0128l抗体轻链的结果，即，如果人λ抗体的轻链用非天然信号肽表达，而用天然λ信号肽表达的(可能天然的)产物具有n-末端截短，则获得以imgt第1位作为第一个残基的“教科书”序列。这里，从序列与v基因片段vλ3-21不同的v基因片段vλ10-54获得λvl结构域(表l)，并且这些v基因片段的相关信号肽也不同(表p)。这表明，这种由天然λ前导序列表达带来的n末端剪切并不仅限于0128l轻链、vλ3-31v基因区段或vλ3基因区段家族。[0446]为了从larivl结构域前面有非天然前导序列(如campath前导)的构建体中(如在cho细胞中)表达时恢复lari轻链的天然n-末端，可以工程化缺失imgt残基1和2，即vl结构域的n-末端谷氨酰胺和丙氨酸残基。通过将非天然前导序列(直接在dna水平，或通过正常rna剪接的内含子)融合到开始于imgt第3位(甘氨酸)的vl结构域的n末端，lari轻链将在紧接imgt第3位之前从其信号肽切下。[0447]用这2种不同的前导肽表达的lariigg的生物学功能在体外试验中没有显示显著差异。然而，可能需要从非天然前导序列表达“天然”vl结构域(缺少imgt残基1和2)，因为这种天然vl结构域n末端被认为与人vl结构域n末端相同，因此当给药于人时不太可能是免疫原性的(immunogenic)。[0448]当用小鼠κ轻链信号肽seqidno：62表达lari轻链时，在回收的抗体产物中以3:2的比例鉴定了2种不同的mw。一个mw对应于由λ抗体lari的氨基酸序列预测的理论mw，另一个对应于更小的mw-与n-末端谷氨酰胺和丙氨酸残基的截短一致。ms结果表明发生了可变的切割，占回收的抗体产物中截短轻链的40％。同样，通过工程化vl结构域n-末端以使用该非天然信号肽表达的蛋白质与用其天然信号肽表达的蛋白质相同，可以克服这种困难。对于larivl结构域，这将涉及删除如上所述的imgt第1位和第2位处的编码残基。[0449]总之，这些实施例中提供的工作显示：[0450](i)信号肽的序列可以影响λ抗体轻链的切割位置；[0451](ii)令人惊讶地，当λ抗体轻链用其天然信号肽表达时(例如，用人vλ3信号肽表达的源自人vλ3-21基因片段的轻链，或用人vλ10信号肽表达的源自人vλ10-54基因区段的轻链)，信号肽被切割以产生不是imgt残基1的n-末端；[0452](iii)用天然与非天然信号肽的轻链产生的λ抗体的比较鉴定了对应于前者中n末端残基不存在的分子量差异；[0453](iv)可以进行vl结构域n末端的基因工程化以避免用非天然前导表达的成熟多肽产物与用天然前导表达的成熟多肽产物的差异。轻链的序列(特别是其n末端序列)可以被工程化以与在天然前导序列切割后获得的成熟轻链序列相同。这可以通过缺失vl结构域n-末端残基来实现，当轻链用其天然前导表达时，所述vl结构域n-末端残基不存在。当用非天然信号肽表达(和从其切下)时，该工程化轻链序列因此具有与从用其天然信号肽表达(和从其切下)的非工程化轻链获得的序列相同的n末端序列。[0454]表格[0455]表l[0456][0457][0458][0459][0460]表l.来自imgt数据库的人vλ等位基因和序列。仅示出了各区段的*01等位基因。点(.)表示根据由lefranc，m.-p.等，dev.comp.immunol.,27，55-77(2003)定义的imgt唯一编号的间隔。序列中的星号(*)表示终止密码子。如imgt所定义，f：功能性的；p：假基因；orf：开放阅读框。将每个种系v基因片段的翻译分成11个氨基酸序列块，分别对应于vl结构域的下列成分(显示iglv1-36*01序列实例)：[0461]qsvltqpps.vseapfr1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀimgt1–15[0462]rqrvtiscsgsꢀꢀꢀꢀꢀfr1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀbꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀimgt16-26[0463]ssni....gnnaꢀꢀꢀꢀcdr1ꢀꢀꢀꢀꢀb-cloopꢀꢀꢀimgt27-38[0464]vnwyqqlpꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀfr2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀcꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀimgt39-46[0465]gkapklliyꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀfr2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀc'ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀimgt47-55[0466]yd.......dꢀꢀꢀꢀꢀꢀcdr2ꢀꢀꢀꢀꢀc'-c"loopꢀꢀimgt56-65[0467]llpsgvs.dꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀfr3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀc"ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀimgt66-74[0468]rfsgsk..sgꢀꢀꢀꢀꢀꢀfr3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀdꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀimgt75-85[0469]tsaslaisglqsꢀꢀꢀꢀfr3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀeꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀimgt85-96[0470]edeadyycꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀfr3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀfꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀimgt97-104[0471]aawddslngꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀcdr3ꢀꢀꢀꢀꢀf-gloopꢀꢀꢀimgt105-117(j片段序列未示出)[0472]在重组产生vl结构域时，v片段与下游j片段结合，lcdr3包含v-j连接。[0473]表n[0474][0475][0476]表n.已知的人vλ3-21等位基因的核苷酸序列。[0477]表p[0478][0479][0480]表p.信号肽的实例[0481]表s[0482][0483][0484][0485][0486][0487]表s.抗体重链和轻链结构域的序列，所有这些序列均代表本发明的实施方式。[0488]表u[0489][0490]表u.已知的人vλ10-54等位基因的核苷酸序列。imgt将vλ10～54*03鉴定为假基因(pseudogene)。当前第1页12当前第1页12









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