治疗TRPV1活性介导疾病的药物组合物的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术治疗trpv1活性介导疾病的药物组合物技术领域1.本发明涉及一种新的治疗药物组合物，并且更具体而言，本发明涉及治疗trpv1介导疾病的药物组合物和治疗trpv1介导疾病的方法。背景技术：2.疼痛是“与实际或潜在的组织损伤相关的不愉快的感觉和情绪体验”，并且一般来说，随着受损组织的恢复，疼痛会得到缓解，但当疼痛变成慢性时，即使受损区域已经明显完全愈合，疼痛无需任何刺激就会继续发生，并且疼痛可能是由通常不会引起疼痛的无害刺激引起。3.同时，瞬时受体电位香草素1型(transient receptor potential vanilloid type 1)(trpv1)是瞬时受体电位(trp)家族的成员，是有害刺激引起疼痛的细胞机制中重要的伤害感受器之一。此外，trpv1是一种非选择性的阳离子通道，它会被各种刺激如热毒(noxious heat)(42℃或更高)、辣椒素、树脂毒素(resiniferatoxin)(rtx)、质子等激活，并且它是主要表达于伤害性(nociceptive)神经纤维末端并参与引起慢性疼痛的外周和中枢敏化的发展的关键分子。trpv1被认为是治疗慢性疼痛的主要靶标，但trpv1的药理学抑制作用会导致不明原因的严重高烧，并且已知很难将trpv1抑制剂开发为治疗药物。4.gdf11是一种属于tgf-β家族的蛋白质，并且已知它会增加年轻动物的表达以促进神经产生和血管生成。属于同一家族的tgf-β对慢性疼痛的控制作用已经进行了许多研究，但关于gdf11对慢性疼痛的缓解作用的内容尚不清楚。5.韩国专利公开第10-2017-0093286号涉及包括gdf11的组合物及其用途，并提供了包含gdf11的人源成体干细胞培养液的成纤维细胞增殖作用。然而，没有关于gdf11的慢性疼痛缓解作用的研究或公开。技术实现要素：6.【技术问题】7.由于本发明人通过努力提供一种能够解决伴随trpv1抑制作用的如严重高烧等副作用同时通过trpv1抑制作用治疗慢性疼痛的物质，本发明人通过验证gdf11具有缓解各种原因引起的疼痛的效果而完成了本发明。8.因此，本发明的一个目的是提供一种用于治疗trpv1介导疾病和包括慢性疼痛在内的疼痛相关疾病而无副作用的药物组合物。然而，这些问题是示例性的，并且本发明的范围不限于此。9.【技术方案】10.根据本发明的一个方面，提供了一种用于治疗trpv1介导疾病的药物组合物，其包含含有seq id no:1的氨基酸序列的生长分化因子11(gdf11)肽、编码该肽的多核苷酸或包含该多核苷酸作为活性成分的表达载体。11.根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗trpv1介导疾病的方法，包括向患有trpv1介导疾病的患者给予包含含有seq id no:1的氨基酸序列的生长分化因子11(gdf11)肽、编码该肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的表达载体的组合物。12.术语定义：13.正如本文所用，术语“生长分化因子11(gdf11)”，也称为骨形态发生蛋白11(bmp11)，是指由存在于人类12号染色体上的gdf11基因表达的蛋白质。14.正如本文所用，术语“瞬时受体电位通道香草素亚家族成员1(trpv1)”属于由非电压门控阳离子通道组成的trp通道的大家族，包括热、视觉、味觉、嗅觉和触觉区域。trpv1通过相互作用热、质子和内源性物质协同激活而触发伤害感受信号。15.正如本文所用，术语“载体”是指用于基因递送的工具。它能够看作是一个与药物载体相对应的概念。因此，广义上的载体不仅包括与一般质粒载体类似的由与待导入的转基因相同的核酸分子组成的dna载体，还包括由二氧化硅或金制成的纳米颗粒、脂质体、细胞外囊泡和磷脂膜结构如外泌体、壳聚糖、阳离子聚合物如聚乙烯亚胺和聚赖氨酸以及用于dna 转染的试剂如磷酸钙。具体实施方式16.根据本发明的一个方面，提供了一种用于治疗trpv1介导疾病的药物组合物，其包含：含有seq id no:1的氨基酸序列的生长分化因子11(gdf11)肽、编码该肽的多核苷酸或包含该多核苷酸作为活性成分的表达载体。17.在该药物组合物中，所述表达载体可以是病毒载体或非病毒载体，而病毒载体可以是腺相关病毒(aav)载体、腺病毒载体、甲病毒载体(alphavirus vector)、单纯疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、仙台病毒载体、黄病毒载体、弹状病毒载体(rhabdovirus vector)、逆转录病毒载体或慢病毒载体。此外，腺相关病毒(aav)载体的血清型可以是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15或aav16。18.在该药物组合物中，所述非病毒载体可以是dna载体、纳米粒子、阳离子聚合物、外泌体、胞外囊泡或脂质体，而所述dna载体可以是质粒载体、粘粒载体、噬菌粒载体或人工的人染色体。19.在该药物组合物中，所述trpv1介导疾病可以选自由疼痛、高血压、中风、心肌缺血、尿失禁、膀胱超敏、肠易激综合征、大便急迫、胃十二指肠溃疡、胃食管反流疾病(gerd)、克罗恩病、痔疮、哮喘、慢性阻塞性肺病、瘙痒、牛皮癣、听力损失、耳鸣、咳嗽、多毛症和脱发组成的组中。20.在该药物组合物中，所述疼痛可以是伤害性疼痛、心因性疼痛、炎性疼痛或病理性疼痛，而所述病理性疼痛可以是神经性疼痛、癌症疼痛、化疗引起疼痛、术后疼痛、三叉神经痛、特发性疼痛、糖尿病性神经疼痛或偏头痛。21.根据本发明的另一个方面，提供了一种缓解或治疗疼痛的方法，包括给予所述药物组合物。22.根据本发明的疼痛包括伤害性疼痛、心因性疼痛、与组织损伤和免疫细胞侵入有关的炎性疼痛、病理性疼痛(功能失调性疼痛如纤维肌痛、肠易激综合征和紧张性头痛)，其是由神经系统受损或其异常功能引起的疾病状态。此外，疼痛可以包括解剖学上不同的背痛。疼痛可以包括诸如神经性疼痛、偏头痛等的疼痛，以及颈痛、中背痛、下背痛或尾骨痛。神经性疼痛是一种慢性神经系统疾病，是由于外伤、炎症、缺血性损伤、代谢物等各种原因导致神经系统受损时引起，并且它可能是由影响体感系统的损伤或疾病引起。一般来说，它是一种由神经、脊髓和大脑异常引起的非恶性慢性疼痛，并据估计有1％以上的人群患有这种疼痛。23.神经性疼痛可能与称为感觉迟钝的异常感觉、即使在不会引起疼痛的无害刺激下也能感觉到疼痛的异常性疼痛以及对有害刺激如发烧作出反应而感到疼痛更强烈和持续时间更长的痛觉过敏有关。此外，神经性疼痛可能是持续性和/或间歇性(癫痫发作)因素。后者被比作触电。常见的特征包括灼热、寒冷、针刺、麻木和瘙痒。根据受影响的是周围神经系统还是中枢神经系统，可以将其分为周围神经性疼痛和中枢神经性疼痛。相对而言，伤害性疼痛通常表现为疼痛。此外，偏头痛是一种慢性病障，与自主神经系统的许多症状相关，并引起从正常到严重的头痛。迄今为止，尚未确定这些偏头痛的确切机制。基本理论与大脑皮层的兴奋性增加和脑干三叉神经核中疼痛神经元的异常调节有关。例如，疼痛可以是选自由神经性疼痛、癌症疼痛、术后疼痛、三叉神经痛、特发性疼痛、糖尿病性神经疼痛、偏头痛等组成的组中的一种或多种。24.在本发明的药物组合物中，该化合物的有效量可以根据患者患部的类型、应用部位、治疗次数、治疗时间、剂型、患者病状、佐剂类型等而变化。所用的量没有特别限制，但可以是0.01μg/kg/天-10mg/kg/天。日剂量可以每天给予一次、以适当的间隔每天分成2-3次给予或以相隔数天间歇给予。25.在本发明的药物组合物中，基于所述组合物的总重量，可以包含0.01wt％-100wt％的量的化合物。本发明的药物组合物可以还包括通常用于药物组合物制备中的合适载体、赋形剂和稀释剂。此外，用于配制的固体或液体添加剂可以用于制备该药物组合物。用于配制的添加剂可以是有机的或无机的。赋形剂的实例包括乳糖、蔗糖、白糖、葡萄糖、玉米淀粉、淀粉、滑石、山梨糖醇、结晶纤维素、糊精、高岭土、碳酸钙、二氧化硅等。粘合剂的实例包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、乙基纤维素、甲基纤维素、阿拉伯树胶、黄蓍胶、明胶、虫胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、柠檬酸钙、糊精、果胶等。润滑剂的实例包括硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、二氧化硅、氢化植物油等。可以使用允许添加到常规药物中的任何着色剂。根据其他需要，这些片剂和颗粒剂可以适当地涂有糖衣和明胶衣。另外，可以根据需要添加防腐剂、抗氧化剂等。26.本发明的药物组合物可以制备成本领域常规制备的任何剂型，并且制剂的形式没有特别限制。27.本发明的药物组合物可以口服或非肠道给予，并且优选非肠道给予可以是静脉内注射、皮下注射、脑室内注射、脑脊液内注射、鞘内注射、经椎间孔注射、肌肉内注射、腹腔内注射等。28.本发明提供一种减轻和/或治疗疼痛的方法，包括向需要减轻和/或治疗疼痛的患者给予治疗有效量的药物组合物。该方法还可以包括在给予步骤之前将患者确定为需要缓解和/或治疗疼痛的患者的步骤。术语“治疗有效量”可以取决于能够实现所需效果、疼痛缓解和/或治疗效果的活性梯度的量。29.本发明的药物组合物适用于预防和治疗与trpv1活性相关的疾病，包括疼痛，如急性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛、术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛、关节炎疼痛、后部疱疹神经痛、神经痛、头痛、牙痛、骨盆痛、偏头痛、骨癌痛、化疗引起疼痛、乳房痛和内脏痛；神经相关疾病，如神经病变、hiv相关神经病变、神经损伤、神经变性和中风；糖尿病性周围神经病变；大便紧迫；肠易激综合症；炎性肠病；胃肠道疾病，如胃食管反流病(gerd)、胃十二指肠溃疡和克罗恩病；呼吸系统疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺病和咳嗽；尿失禁；膀胱超敏；神经性/过敏性/炎性皮肤病，如牛皮癣、瘙痒、瘙痒症和皮炎；听觉过敏；听力损失；耳鸣；前庭超敏；心脏病，如心肌缺血；失血性休克；毛发生长相关疾病，如多毛症、泛臭(effluvium)和脱发；鼻炎；胰腺炎；膀胱炎；外阴痛；精神障碍，如紧张或恐惧；肥胖；1型糖尿病和2型糖尿病，但不仅限于此。30.本发明的gdf11是由生长分化因子第12基因编码的蛋白质，而gdf11充当细胞因子，并在人和小鼠中具有相同的分子结构。该骨形态发生蛋白组的特征在于多碱基蛋白水解加工位点，并被切割而产生含有7个保守半胱氨酸残基的蛋白质。全身性gdf11治疗会改善老年小鼠海马和皮质的血管结构而改善神经发生，并且全身性补充gdf11改善了非遗传和遗传2型糖尿病小鼠模型中β细胞的存活率和形态，并改善了葡萄糖代谢。31.gdf11会诱导热量限制等表型，而不会影响食欲或血液中gdf15水平，恢复胰岛素/igf-1信号通路，直接作用于脂肪细胞而刺激白色脂肪组织分泌脂联素，并恢复老年人大脑中的神经发生。此外，它是皮肤生物学的调节剂，对前胶原i和透明质酸的产生有重要作用，激活皮肤内皮细胞中的smad2/3磷酸化途径，并改善皮肤血管系统。老年小鼠中gdf11水平的增加也会改善肌肉结构和功能特征，并增加力量和耐力运动能力。32.此外，据发现，gdf11能够降低氧化应激，降低age、蛋白氧化和脂质过氧化的水平，减缓与年龄相关的组织学标志物的积累，并显著抑制cat、gpx和sod活性的降低。gdf11家族的成员是胚胎和成体组织中细胞生长和分化的调节因子，并且对小鼠和非洲爪蛙(非洲爪蟾属)的研究表明，该蛋白参与胚胎发育期间的中胚层形成和神经发生。33.也可以使用由seq id no:2表示的人gdf11和源自与其具有至少96％或更多同源性的其他哺乳动物的gdf11。其他哺乳动物来源的gdf11可以是小鼠(小白鼠(mus musculus)，seq id no:3)、黑猩猩(普通黑猩猩(pan troglodytes)，seq id no:4)、大猩猩(东部大猩猩(gorilla beringeigraueri)，seq id no:5)、金丝雀-鼻猴(秦岭川金丝猴(rhinopithecusroxellana)，seq id no:6)、北方白颊长臂猿(白颊长臂猿(nomascusleucogenys)，seq id no:7)、孟加拉猴(猕猴(macaca mulatta)，seq id no:8)、倭黑猩猩(pan paniscus，seq id no:9)或猪(家猪(sus scrofa domesticus)，seq id no:10)。34.来源于人的gdf11蛋白质是与来源于其他灵长类的gdf11具有非常高的同源性的蛋白质，并可以使用来源于其他动物的全长肽或成熟肽的全部或部分。其中，成熟肽对应于氨基酸位置299-407(seq id no:1)，氨基酸位置1-298是信号肽和前体蛋白中的被切部分。由于成熟肽与其他哺乳动物具有几乎100％的同源性，而因此可以使用来自其他动物的基因或蛋白质。此外，编码成熟肽的多核苷酸可以由seq id no:11表示。35.本发明可以通过使用基因代替蛋白质或肽的基因疗法进行实施。对于这样的基因疗法，为了促进基因扩增和操作，使用了重组载体，其中将编码gdf11的多核苷酸可操作地连接到调节序列的基因构建体插入到各种表达载体中。这种表达载体分为病毒载体和非病毒载体。对于病毒载体，一直使用腺相关病毒(aav)载体、腺病毒载体、甲病毒载体、单纯疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、仙台病毒载体、黄病毒载体、弹状病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。用于基因疗法的病毒载体在文献中有详细记载。上述文献通过引用结合于本文。然而，在这些病毒载体中的逆转录病毒或慢病毒的情况下，将转基因插入宿主的基因组中，但由于它是随机插入，而因此担心会出现癌症等意想不到的副作用。因此，仅插入宿主细胞基因组的特定位置的腺相关病毒已受到关注。36.腺相关病毒(aav)是一种单链dna病毒，并且是一种辅助依赖性人类细小病毒。基因组大小为约4.7kbp，并且基因组n端部分编码参与病毒复制和病毒基因表达的rep基因，而c端部分编码cap基因，其会编码病毒衣壳蛋白。此外，它由两端插入约145个碱基的反向末端重复(itr)组成。从rep区域翻译出四种蛋白质，按分子量分为rep78、rep68、rep52和rep40，在aav dna复制中发挥重要作用。从cap区域，翻译了三种蛋白质，即vp1、vp2和vp3，并且它们是aav病毒组装所需的结构蛋白。37.根据本领域已知的各种病毒感染方法，本发明的aav载体可以用于将外源基因序列转运到细胞中，并且该方法没有特别限制。38.同时，根据本发明的示例性实施方式用于基因疗法的表达载体可以插入dna载体如非病毒表达载体中，该dna载体包括其中编码gdf11的多核苷酸可操作地连接至调控序列的基因构建体，特别是质粒载体等。39.正如本文所用，术语“可操作地连接至”是指靶核酸序列以允许在要引入转基因的活体中表达的方式连接至调控序列。40.术语“调控序列”是指包括启动子、增强子和其他调控元件(例如，多腺苷酸化信号)。该调控序列包括指示靶核酸总是能够在许多宿主细胞中表达，指示该靶核酸只能在特异性组织的细胞中表达(例如，组织特异性调节序列)，和指示该表达由特异性信号(例如，诱导型调控序列)诱导。本领域技术人员能够理解的是，基因疗法中使用的表达载体的设计可能会根据多种因素而有所不同，这些因素为例如要引入转基因的宿主的选择、所需蛋白质表达水平等。本发明的表达载体可以引入宿主中而表达gdf11蛋白。因此，根据本发明示例性实施方式的表达载体必须具有能够在真核细胞，特别是哺乳动物中表达外源基因的真核细胞的调控序列。使外源基因能够在此类真核细胞中表达的调控序列是相应行业的技术人员所熟知的。如上所述，它们通常包括负责转录起始的调节序列，并且可选地包括负责终止和稳定转录本转录的poly-a信号。除了转录调节子之外，额外的调节序列可以包括翻译增强因子和/或天然组合的或异源的启动子区域。例如，允许在哺乳动物细胞中表达的调控序列是cmv-hsv胸苷激酶启动子、sv40、rsv启动子(劳斯(rous)肉瘤病毒)、人肾元件1α-启动子、糖皮质激素诱导型mmtv-启动子(moloni小鼠肿瘤病毒)、金属硫蛋白诱导型或四环素诱导型启动子或扩增剂如cmv扩增剂或sv40扩增剂。对于神经元中的表达，被认为可以使用神经丝启动子、pgdf-启动子、nse-启动子、prp-启动子或thy-1启动子。这样的启动子在本领域中是已知的并且在文献中有述。该调节序列可以包括转录终止信号，如根据本发明示例性实施方式的多核苷酸下游的sv40-poly-a位点或tk-poly-a位点。在本发明中，合适的表达载体是本领域已知的，而其实例包括冈山-伯格(okayama-berg)cdna表达载体pcdvl(parmacia)、prc/cmv、pcdnal、pcdna3(invitrogen)、psportl(gibco brl)、pgx-27、px、酵母双杂交载体，以及，例如，peg202、dpjg4-5等。除了本发明的核酸分子之外，该载体还可以包括编码分泌信号的多核苷酸。这些分泌信号对于相应行业的技术人员而言是众所周知的。此外，根据所使用的表达系统，能够将gdf11引导至细胞区室的前导序列可以与根据本发明示例性实施方式的多核苷酸的编码序列进行组合，并且优选的是，它是能够将所翻译的蛋白质或其蛋白质直接分泌到周质或胞外基质中的前导序列。41.此外，本发明的表达载体可以通过，例如，标准重组dna技术进行制备，并且该标准重组dna技术包括，例如，平末端和粘性末端的连接、用限制酶处理而提供合适的末端，通过碱性磷酸酶处理去除磷酸基团而防止不当结合，通过t4 dna连接酶进行的酶促连接，等等。本发明的载体可以通过将编码通过化学合成或基因重组技术获得的信号肽的dna和编码本发明的双特异性融合蛋白的dna重组于包含合适调节序列的载体中而制备。包括调节序列的载体可以商购获得或进行制备。42.该表达载体还可以包括编码分泌信号序列的多核苷酸，并且该分泌信号序列会诱导细胞内表达的重组蛋白分泌到该细胞之外，并且它可以是组织纤溶酶原激活物(tpa)信号序列、单纯疱疹病毒糖蛋白ds(hsv gds)信号序列，或生长激素信号序列。43.根据本发明示例性实施方式用于基因疗法的非病毒表达载体可以是能够在宿主细胞中表达gdf11的dna载体，并且该dna载体可以是任何形式，如质粒载体、粘粒载体、噬菌粒载体、人工性人染色体等。44.此外，在使用上述dna表达载体的基因疗法中使用的基因递送方法包括电穿孔、基因枪、超声微泡疗法、磁转染，而使用载体如金或二氧化硅纳米粒子、阳离子聚合物、脂质体、纳米粒子、外泌体等的转染方法，都可以使用。这些基因转移方法在业内是众所周知的。最近，已经使用了一种通过使用小型电穿孔器件应用不可逆电穿孔方法将dna疫苗组合物直接注射到人体肌肉中的方法。45.trpv1是可渗透的非选择性阳离子通道的家族之一，其活性会诱导ca2+摄取，并被某些拮抗剂(如辣椒平(capsazepine))抑制。此外，它还被辣椒素、热、低ph、缓激肽(bradykinin)、pge2、atp等直接激活，而这种激活条件是指trpv1是热化学刺激和组织损伤的主要生物传感器。据报道，trpv1存在于各种组织中，如脑、肾、支气管上皮细胞和表皮角质形成细胞，而辣椒素刺激会增加角质形成细胞的细胞质中的ca2+浓度，而辣椒素却可抑制这种浓度。尽管已经报道了trpv1的拮抗剂作为慢性疼痛的治疗剂，但是由于trpv1的药理学抑制会引起高烧，而因此需要开发没有高烧作用的镇痛剂。因此，本发明人对能够有效抑制trpv1的疼痛治疗组合物进行了研究，并证实gdf11可以是一种新的疼痛治疗拮抗剂，而因此本发明人开发了一种使用抑制本发明trpv1活性的疼痛治疗组合物。本发明人使用细胞内钙(ca2+)成像和全细胞膜片钳观察到重组gdf11抑制与浓度依赖性方式相关的小原代小鼠背根神经节(drg)中trpv1通道的功能。此外，在trpv1-转染hek293细胞系中证实了与drg神经元相似的结果，因此，上述结果表明本发明的gdf11能够用作慢性疼痛中拮抗trpv1通道的新的疼痛治疗剂，并且它能够用作治疗剂，能够治愈各种与trpv1活性相关的各种介导疾病。46.根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗trpv1介导疾病的方法，包括向患有trpv1介导疾病的患者给予包含包括seq id no:1的氨基酸序列的生长分化因子11(gdf11)肽以及编码该肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的表达载体的组合物的步骤。47.由于表达载体或trpv1介导疾病与用于药物组合物的概念相同，因此其描述用上述描述替换。48.【有利效果】49.由于使用本发明的trpv1活性的抑制作用治疗疼痛的组合物显示出抑制由脊神经损伤引起的神经性疼痛的优异效果，它能够用作与trpv1通道相关的各种疼痛病症和疾病如关节炎和糖尿病性周围神经病变的新的疼痛治疗药物。此外，由于它会有效抑制trpv1活性，它能够用作治疗各种trpv1介导疾病的治疗药物。当然，本发明的范围不受这些效果的限制。附图说明50.图1是示意性图示说明通过制备小鼠慢性疼痛模型根据本发明的gdf11治疗用于(a)评价热痛觉过敏的抑制作用和(b)评价trpv1离子通道活性的抑制作用的方法的示意图。51.图2a是分析根据将本发明的gdf11注射到脊神经横断小鼠模型中由于辐射热刺激引起的回避反应的延迟时间的曲线图。52.图2b是分析根据将本发明的gdf11(0.1mg/kg)注射到化疗诱导的周围神经病的小鼠模型中由于辐射热刺激引起的回避反应的延迟时间的曲线图。53.图2c是分析根据将本发明的gdf11(0.2mg/kg)注射到化疗诱发的周围神经病的小鼠模型中由于辐射热刺激引起的回避反应的延迟时间的曲线图。54.图3a是显示小鼠感觉神经元中用本发明的gdf11和辣椒素处理的钙流入曲线的曲线图。55.图3b是比较在小鼠感觉神经元中用本发明的gdf11和辣椒素处理的钙流入浓度量与对照组相比的比率的曲线图。56.图4a是显示在使用pcdna-trpv1载体转化的人胚肾293(hek293)细胞中用本发明的gdf11和辣椒素处理的钙流入曲线的曲线图。57.图4b是分析在使用pcdna-trpv1载体转化的人胚胎肾293(hek293)细胞中通过用本发明的gdf11和辣椒素处理的钙流入浓度量与对照组相比的比率的曲线图。58.图5a是显示在小鼠感觉神经元中用本发明的gdf11和辣椒素处理的内向电流曲线的曲线图。59.图5b是分析在小鼠感觉神经元中通过本发明的gdf11和辣椒素处理的内向电流大小(通过浓度计)与对照组相比的比率的曲线图。60.图6a是显示在使用pcdna-trpv1载体转化的hek293细胞中用本发明的gdf11和辣椒素处理的trpv1内向电流曲线的曲线图。61.图6b是分析在用pcdna-trpv1载体转化的hek293细胞中用本发明的gdf11和辣椒素处理的内向电流大小(通过浓度计)与对照组相比的比率的曲线图。62.图7显示将本发明的gdf11给予于化疗引起的周围神经病变的小鼠模型后体温的变化。即使给予gdf11时，也能够确认小鼠的体温没有突然变化。63.图8显示在小鼠感觉神经元(l4 drg或l5 drg)中本发明的表达gdf11的腺相关病毒载体aav-gdf11会稳定表达gdf11。64.图9是分析根据向神经性疼痛小鼠模型给予本发明的表达gdf11的腺相关病毒载体aav-gdf11由于辐射热刺激引起的回避反应的延迟时间的曲线图。65.【本发明最佳模式】66.一般方法67.神经源性疼痛的脊髓神经横断小鼠模型的制备68.本发明人制备了脊神经横断(spinal nerve transection)(snt)的动物模型。具体而言，将6周龄c57bl/6雄性小鼠在动物实验室饲养环境中进行1周的驯化期，然后用红外热刺激设备对右后足进行一次辐射热刺激，测量直到回避反应的时间以建立参考值。之后，随机分离实验组(n＝5-6只小鼠/组)，并实施脊神经横断的手术。首先，腹腔内注射戊巴比妥钠(60mg/kg)，在麻醉状态下切开小鼠等的皮肤，以切断第5腰神经(l5脊神经)，并用外科手术线(staple)缝合切开的肌肉和皮肤。69.周围神经病变动物模型的构建70.本发明人制备了化疗诱发的周围神经病变(cipn)的动物模型。71.具体而言，将6周龄c57bl/6雄性小鼠在动物实验室饲养环境中进行1周的驯化期。将10mg紫杉醇(sigma aldrich，美国)溶解于1.66ml溶液中，其中cremophor el和无水乙醇以1:1的比率混合制成6mg/ml的原液，然后将其分成100μl置于微管中，并在-20℃保存。即将给予前，将紫杉醇原液溶解后，用盐水将其稀释1/30，以2mg/kg的剂量(累积剂量为10mg/kg)腹膜内给予，每天1次，持续5天，以诱导化疗-诱发疼痛。在最后一次给予后7天评价热伤害感受反应，对辐射热刺激的回避反应时间小于6秒的受试者被认为出现了化疗诱发疼痛。72.热痛觉过敏的测量73.将底部开口的丙烯酸室放置于热痛测量设备(足底测试镇痛仪)的玻璃板上，并将小鼠放置于该室内2小时长达3天而完成稳定过程。在制作脊髓神经横断小鼠模型之前，测量了对辐射热刺激的基本疼痛反应值。红外强度设置为25或30以获得8-10秒的基本疼痛回避反应时间。以每名受试者至少1分钟以上的间隔对小鼠的右后脚掌进行3次辐射热刺激，测定回避反应时间，而将平均值作为热痛反应值。在评价热痛反应时，热刺激的持续时间限制为20秒，以防止因辐射热刺激对足底组织造成热损伤。测量基本疼痛反应值后，根据所有受试者的平均值计算每个受试者反应值的变化率，选择出总平均值±50％范围内的受试者。仅使用选定的受试者构建神经性疼痛模型，并在上述条件下神经损伤后第5天测量热痛觉过敏反应。当测量热痛反应时，将实验动物置于丙烯酸室内每次2小时，稳定后进行辐射热刺激，并在下午4点到6点之间测量热痛反应。之后，将神经性疼痛动物模型任意分为两组，并且鞘内给予人重组gdf11或盐水，并随后评价热痛反应的镇痛效果(图2a)。对于实验组，由一名处于暗盲状态的研究人员测量热痛反应，并在完成计划的热痛反应评价测试后，利用给予药物组的信息对结果进行分析，以实施统计处理。74.脊髓腔内给予药物75.在异氟烷呼吸麻醉下使用注射器将药物直接注入脊髓。将30号针头连接到哈密顿(hamilton)注射器，填充gdf11或盐水，并注入第5和第6椎骨之间的空间，并以10ng/5μl的浓度给予gdf11。76.小鼠感觉神经元的培养77.本发明人首先培养了来自小鼠中背根神经节(drg)的感觉神经元。具体而言，将6-9周龄c57bl/6小鼠用异氟烷麻醉5分钟，用70％乙醇消毒，切开背部。之后，解剖所有部位的脊髓背根神经节并将其置于混合有10x hbss和10mm hepes的溶液中(wood,et al.,j neurosi.8,pp3208-3220,1988)。然后，在混合了0.2mg/ml胶原酶a和3mg/ml分散酶ii的溶液中培养该背根神经节，用含有10％fbs的dmem培养基洗涤一次，用巴斯德(pasteur)吸管(pipette)压碎。随后，将平均100-300个细胞分散于涂有聚-d-赖氨酸的盖玻片上，培养1小时后，加入2ml包含10％fbs、1％青霉素/链霉素和1x b27补充剂的神经基础培养基对其进行培养。78.细胞内ca2+流入实验79.对于钙流入测量实验，将原代培养的感觉神经元暴露于含有2μm fura-2am的dmem培养基长达40分钟，并随后通过f340/f380比率测量钙离子流入细胞的程度，并且对于增加200nm辣椒素的f340/f380，测量了gdf11预处理对钙流入的抑制率。具体而言，细胞内钙离子浓度的测定使用配备有摄像照相机和与其连接的荧光测定仪的显微镜进行。荧光测量期间出现的荧光波长比(f340/f380)反映了细胞中的钙离子浓度。以2ml/min-3ml/min的速率灌注含药物灌注液。该灌注液的组成为140mm nacl、5mm kcl、1mm cacl2、1mm mgcl2、10mm葡萄糖和10mm hepes，并且通过加入naoh将该ph值调节至7.4(图1中的b)。80.单细胞膜片钳实验81.通过膜片钳实验，测量了gdf11对辣椒素诱导的内向电流抑制率。贴片吸管中溶液的组成为126mm k-葡萄糖酸盐、10mm nacl、1mm mgcl2、0.1mm na2gtp、2mm na2atp、10mm hepes、10mm egta，并且通过加入koh将ph值调节至7.4。胞外灌注液的组成为140mm nacl、2mm egta、1mgcl2、10mm葡萄糖、5mm kcl和10mm hepes，并通过加入naoh将ph值调节至7.4。包括药物的胞外灌注液通过重力以2ml/min-3ml/min的速率灌注，并通过细胞外灌注液将辣椒素和gdf11灌注到伤害性神经元中，以测量gdf11对辣椒素诱导的内向电流的抑制率。82.pcdna trpv1表达载体转化到hek293细胞中83.本发明人将trpv1基因和绿色荧光蛋白(gfp)基因同时转化到hek293细胞中，并且随后通过上述细胞内ca2+流入量测定实验和单细胞膜片钳实验而测定钙流入量和内向电流。具体而言，通过使用lipofectaminetm2000(invitrogen，美国)，使用以下方法转化pcdna trpv1表达载体。首先，去除35mm细胞培养皿中培养的hek293细胞培养基后，仅加入dmem培养基，在37℃ 5％co2下对其进行湿培养，并将pcdna-trpv1(1μg)和lipofectamine(10μl)溶解于每个dmem培养基中。等待5分钟后，将两种培养基混合，并再等待20分钟。之后，去除附着hek293细胞的培养皿的dmem培养基，并分散含有预先制备的pcdna的培养基，然后在5％co2和37℃下湿培养4小时。换成含有10％fbs和1％青霉素/链霉素的dmem培养基，培养12小时后，在24小时内进行钙成像或膜片钳实验。84.病毒载体的制备85.本发明人试图制备含有gdf11基因的病毒载体。86.具体而言，选择aav5血清型和cmv启动子以诱导gdf11在感染的或感染至神经元的细胞中持续表达。此外，内部核糖体进入位点(ires)和增强型绿色荧光蛋白(egfp)核苷酸序列在gdf11核苷酸序列之后加入，而使gdf11和gfp蛋白能够在所述感染的细胞中相互独立地表达。在实验动物组织中能够评价受感染细胞的分布和gdf11的表达。通过在aav5载体中载入gdf11基因而制备病毒载体后，正常gdf11基因的插入通过核苷酸测序进行验证，而所测试的gdf11-表达病毒的滴度为1.22×1013gc/ml。87.组织免疫染色88.本发明人实施组织免疫染色，以验证鞘内注射含有该基因的病毒载体后gdf11在感觉神经元中的表达。89.具体而言，将戊巴比妥钠(60mg/kg)腹膜内注射于实验动物中并麻醉。将30ml注射器充满30ml 0.9％nacl溶液，并切开心脏右心房侧，将该注射器刺入左心室抽血。随后，将30ml 10％福尔马林溶液给予至左心室进行固定，然后采集l4和l5 drg组织的样品。所去除的drg组织在10％福尔马林溶液中浸泡16小时进行额外固定，然后将该组织转移到30％蔗糖溶液中脱水两天。之后，将drg组织冷冻于-20℃下，然后制成厚度为12μm的切片组织。微管蛋白抗体(santa cruz，美国)在0.1m pbs溶液中稀释1/100，并在drg组织切片上处理24小时，并在用0.1m pbs洗涤后，使用共聚焦显微镜捕获荧光图像。90.实验统计91.使用prism(graphpad,version 501)软件进行统计学分析。具体而言，通过正态性检验确认是否为正态分布后，使用了参数或非参数检验。对于参数和非参数检验，对两组或更多组进行t-检验，并对三组或更多组通过单向方差检验(one-way anova test)或双向方差检验(two-way anova test)进行分析。误差条通过测量标准误差(sem)可视化，并且如果实验结果是显著性的，则表示为*或#[1表示p《0.05，2表示p《0.005，3表示p《0.001]。[0092][实施例1][0093]热痛觉过敏的评价[0094]《1-1》脊髓神经横断的慢性疼痛小鼠模型[0095]本发明人通过脊髓神经横断(snt)制备了具有慢性疼痛的小鼠实验模型，在脊髓内给予gdf11(10ng)后，使用hargreaves设备评价热痛反应。结果是，与对照组相比，根据向慢性疼痛小鼠模型给予本发明的gdf11，通过抑制热痛觉过敏现象，提高了后足回避反应的延迟时间(图2a)。[0096]《1-2》周围神经病变小鼠模型[0097]本发明人制备了化疗诱发周围神经病变(cipn)小鼠实验模型，并且在腹腔内给予0.1mg/kg或0.2mg/kg的gdf11后，使用hargreaves设备评价热痛反应。[0098]结果证实，如图2b和图2c所示，根据gdf11的给予，通过抑制热痛觉过敏现象增加了回避反应的延迟时间。具体而言，据发现，gdf11抑制热痛觉过敏现象的更长的时间段(以加巴喷丁(gabapentin)(sigma aldrich，美国)少650倍的量)，加巴喷丁是代表性的疼痛治疗剂之一(图2b)。[0099][实施例2][0100]小鼠感觉神经元和hek293细胞内的钙流入量的分析[0101]比较和分析了由于本发明的gdf11(10nm)和辣椒素(200nm)处理，在使用pcdna-trpv1载体转化的原代培养小鼠感觉神经元和hek293细胞中的钙流入量和根据由gdf11浓度(0.1nm、1nm或10nm)处理的钙流入量。[0102]与未用gdf11处理的对照组相比，结果发现本发明的gdf11处理以浓度依赖性方式降低了trpv1-介导的ca2+流入(ca2+瞬变)现象(图3a，图3b，图4a和图4b)。钙流入的程度进行标准化，并基于辣椒素的第一钙反应的大小进行显示。[0103][实施例3][0104]小鼠感觉神经元和hek293细胞中的内向电流大小的分析[0105]比较并分析了由于本发明的gdf11(10nm)和辣椒素(200nm)的处理在使用pcdna-trpv1载体转化的原代培养小鼠感觉神经元和hek293细胞中的内向电流大小和根据gdf11浓度(0.1nm、1nm或10nm)的处理的内向电流大小。结果发现，与未用gdf11处理的对照组相比，本发明的gdf11降低了由辣椒素在小鼠感觉神经元中以浓度依赖性方式诱导的trpv1介导内向电流(图5a、图5b、图6a和图6b)。内向电流的测量进行标准化，并基于辣椒素的第一响应大小进行显示。[0106]上述实施例1-3的结果表明，由于gdf11处理在低浓度下有效抑制trpv1离子通道活性，它能够用作trpv1的有效拮抗剂。[0107][实施例4][0108]gdf11副作用的验证[0109]已知现有的trpv1拮抗剂在显示镇痛效果的给予条件下具有诸如异常发热或体温过低等副作用，而因此本技术人试图验证副作用是否因gdf11的给予而发生。[0110]具体而言，将bctc(30mg/kg)或gdf11(0.1mg/kg或0.2mg/kg)以在皮肤通过将背面一部分毛发剃掉而暴露的患化疗引起疼痛的模型小鼠中以通过辣椒素抑制trpv1活性至相似程度的浓度，进行腹膜内给予，然后使用热成像相机按时间间隔测量暴露皮肤的温度。[0111]结果如图7中所示，即使给予gdf11，小鼠的体温也没有发生显著变化，而这能够证实，给予gdf11不会引起异常发热或体温过低的副作用。另一方面，当以30mg/kg的剂量腹膜内给予作为代表性trpv1拮抗剂的bctc时，却出现异常发热的副作用。[0112][实施例5][0113]病毒载体gdf11表达的验证[0114]本发明人试图确定当给予所制备的病毒载体时是否会诱导体内gdf11表达。[0115]具体而言，将5μl gdf11病毒载体以1.22×1011gc/ml的浓度注射到周围脊神经损伤引起的神经性疼痛模型的脊髓中。5周后，处死小鼠而对l4和l5 drg组织取样，并制备冻干切片。采用微管蛋白(tubulin)抗体对组织进行免疫染色，并且将gfp荧光信号作为gdf11的表达水平，在共聚焦显微镜下进行成像。[0116]结果证实，gdf11在小鼠的l4或l5 drg神经元中表达，如图8所示。[0117][实施例6][0118]病毒载体疼痛缓解效果的验证[0119]本发明人试图确定所制备的病毒载体aav5-gdf11在神经性疼痛动物模型中是否表现出镇痛作用。[0120]具体而言，在制备疼痛模型前测定基本疼痛反应值后，通过切断周围脊神经而制成神经性疼痛模型。疼痛模型手术3天后，评价热痛反应，将回避反应阈值低于6秒的受试者视为疼痛模型。在该疼痛模型中，将5μl浓度为1.22×1011gc/ml的gdf11病毒载体注入脊髓中，使用hargreaves设备每周一次评价热疼痛反应。[0121]结果证实，如图9所示，通过给予aav5-gdf11，通过抑制热痛觉过敏现象提高了回避反应的延迟时间。[0122]总之，由于本发明的gdf11(其是一种利用trpv1活性抑制作用治疗疼痛的组合物)，已被证明可快速有效地抑制trpv1通道，因此它能够作为一种新的治疗药物用于治疗trpv1通道相关的各种疼痛病症和疾病，如关节炎和糖尿病性周围神经病变。[0123]本发明已经参考上述示例性实施方式进行了描述，但这些仅仅是示例性的，并且本领域的普通技术人员将会理解的是，各种修改和等同的其他示例性实施方式都是可能来自于此的。因此，本发明真正的技术保护范围应该以所附权利要求的技术精神为准。[0124]【工业适用性】[0125]由于利用本发明的trpv1活性抑制作用治疗疼痛的组合物表现出抑制由脊髓神经损伤引起的神经性疼痛的优异的效果，因此它可以用作与trpv1通道相关的各种疼痛病症和疾病如关节炎和糖尿病性周围神经病变的新的疼痛治疗药物。此外，由于其有效抑制trpv1活性，因此它能够用作治疗各种trpv1-介导疾病的治疗药物，因此具有很高的工业实用性。[0126]【序列列表免费文本】[0127]seq id no:1显示了生长分化因子11(gdf11)成熟肽的氨基酸序列。[0128]seq id no:2显示了人gdf11肽的全长氨基酸序列。[0129]seq id no:3显示了小鼠gdf11的氨基酸序列。[0130]seq id no:4显示了黑猩猩gdf11的氨基酸序列。[0131]seq id no:5显示了大猩猩gdf11的氨基酸序列。[0132]seq id no:6显示了金丝猴gdf11的氨基酸序列。[0133]seq id no:7显示了北方白颊长臂猿gdf11的氨基酸序列。[0134]seq id no:8显示孟加拉猕猴gdf11的氨基酸序列。[0135]seq id no:9显示了倭黑猩猩gdf11的氨基酸序列。[0136]seq id no:10显示了猪gdf11的氨基酸序列。[0137]seq id no:11显示了编码gdf11肽(seq id no:1)的多核苷酸序列。









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