岩藻糖基化抑制剂用于生产无岩藻糖基化抗体的用途的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术岩藻糖基化抑制剂用于生产无岩藻糖基化抗体的用途1.本技术要求于2019年12月20日提交的美国临时申请号62/951,318的优先权，将其公开内容通过引用并入本文。2.序列表3.以电子方式随同提交的序列表也通过引用整体以其整体特此并入(文件名：202001104_seql_13347wopct_gb.txt；创建日期：2020年11月4日；文件大小：11kb)。背景技术：4.治疗性抗体越来越常用于治疗人类疾病。所产生的抗体与治疗感兴趣的靶标结合，并且被选择和修饰以对疾病机制展现出所希望的效果。通过使用与炎症介质(诸如细胞因子及其受体)结合的抗体，自身免疫性疾病的治疗已发生革命性变化。此类抗体典型地旨在简单地阻断炎症信号传导通路并且只需在阻断与靶蛋白的配体或受体结合的表位处与靶蛋白结合。5.还已开发出用于治疗癌症的抗体。最初的抗癌抗体治疗模型是将毒性药物特定引导至肿瘤细胞的“魔术子弹(magic bullet)”的概念。抗体将针对肿瘤特异性细胞表面抗原产生，并且然后用细胞毒性“有效载荷”(通常是常规化疗剂)衍生化。当施用于癌症患者时，抗体将循环并且特异性结合至肿瘤细胞，仅将毒性有效载荷递送至肿瘤细胞并且在很大程度上保留健康组织，从而减少副作用。药物可以通过接头附接，所述接头将在靶肿瘤细胞附近释放细胞毒素，在肿瘤处产生局部高浓度，或者它可以保持与抗体附接直到在与细胞表面受体结合后抗体被内化。6.细胞毒性有效载荷的替代方案是使用能够特异性地针对肿瘤细胞引导增强免疫反应的抗体。如魔术子弹方法中那样，抗体引导针对肿瘤细胞的细胞毒性，但在这种情况下，它们引导细胞毒性免疫反应。此类抗体必须被设计为不仅与肿瘤特异性细胞表面标志物结合，而且还必须吸引和/或激活免疫细胞(诸如抗肿瘤cd8+t细胞)到肿瘤附近。7.甚至更最近的用抗体治疗癌症的方法是免疫肿瘤学。在这种方法中，抗体被设计为不直接杀伤肿瘤细胞，而是通过改变免疫系统的活性来引发有效的抗肿瘤免疫反应。已经发现许多肿瘤会引发抗肿瘤免疫反应，但这种免疫反应会被各种细胞表面受体的活性所阻碍，所述细胞表面受体阻断激活抗肿瘤反应或增强免疫抑制机制的信号。免疫抑制机制对于恢复体内平衡至关重要，并且另外在不再需要它们后限制免疫反应，但当此类反应有益时，这些机制可能抑制抗肿瘤免疫反应。一种这样的免疫抑制因子是调节性t细胞(treg)，所述调节性t细胞是t细胞的子集，其作用是抑制细胞毒性cd8+t细胞的活性。在患有危及生命的肿瘤的患者中，此类抑制作用可能允许肿瘤生长，否则所述肿瘤可能被消除或控制。事实上，肿瘤内高水平treg的存在是预后不良的已知标志物。tao等人(2012)lung cancer 75:95。8.因此，在某些癌症的治疗中，消耗treg群体以允许不受限制的抗肿瘤免疫反应是有益的。如肿瘤细胞那样，一种方法是使用特异于treg的抗体，诸如抗ctla-4或抗ccr4。此类抗体被设计为消耗treg并且可以通过引导针对这些细胞的免疫反应来做到这一点，例如，通过由cd8+t细胞进行的抗体依赖性细胞毒性(adcc)。抗体设计有fc区，所述fc区与t细胞上的激活fc受体结合以增加抗肿瘤免疫反应-据说此类抗体具有效应子功能。效应子功能可以通过修饰与免疫细胞相互作用的抗体fc部分来增强，诸如通过修饰fc区的氨基酸序列或修饰糖基化。9.还已发现从人免疫球蛋白重链的n297处的n-连接聚糖链中消除岩藻糖导致与激活fc受体的结合增强，从而导致抗肿瘤adcc介导的毒性大大增强。rothman等人(1989)mol.immunol.26:1113,在1122(提出减少抗体的核心岩藻糖基化以增强用于瘤形成免疫疗法的抗体的adcc)；harris等人(1997)biochemistry 36:1581；satoh等人(2003)expert opin.bio.ther.6:1161。10.已知有几种方法产生此类岩藻糖基化降低的抗体，包括低岩藻糖基化抗体和非岩藻糖基化抗体。le等人(2016)biochim.biophys.acta 1860:1655。抗体可以在天然缺乏岩藻糖基化的细胞系中产生(lifely等人(1995)glycobiology 5:813)或者在岩藻糖基化通路的关键酶组分已被敲除的细胞系中(例如，在缺乏岩藻糖基转移酶8(fut8)的细胞中，诸如中国仓鼠卵巢(cho)细胞)产生。参见例如，rothman等人(1989)mol.immunol.26:1113；wo 97/27303；wo 99/54342；wo 00/61739；wo 02/31140。可替代地，可以在抗体产生期间将酶促岩藻糖基化通路抑制剂添加到培养物中。参见例如，rothman等人(1989)mol.immunol.26:1113；美国专利号8,071,336；wo 09/135181；wo 14/130613；ep 2958905 b1；allen等人(2016)acs chem.biol.11:2734。岩藻糖基化的示例性小分子抑制剂包括但不限于粟精胺、2f-全乙酰-岩藻糖、2-脱氧-2-氟-l-岩藻糖、6,6,6-三氟藻糖(岩藻糖基化抑素i)和6,6,6-三氟藻糖膦酸酯类似物(岩藻糖基化抑素ii)。rothman等人(1989)mol.immunol.26:1113；okeley等人(2016)proc.nat’l acad.sci.(usa)110:5404；rillahan等人(2012)nat.chem.biol.8:661；美国专利号8,163,551；ep2958905b1；allen等人(2016)acs chem.biol.11:2734。其他创造性方法包括酶促消耗抗体生产细胞系中的gdp-岩藻糖前体、岩藻糖基化抑制技术。参见例如，美国专利号8,642,292；von horsten等人(2010)glycobiology 20:1607；roy等人(2018)mabs 10:416。11.需要低岩藻糖基化抗体和非岩藻糖基化抗体以及改善的其制造方法。允许可调节地增加和减少具有岩藻糖基化的分子的百分比的方法在发现研究中可能特别有价值。理想情况下，此类方法将不需要将任何基因构建体引入用于产生抗体的细胞系中或耗时地创造新的稳定细胞系，并且与岩藻糖基化抗体的产生相比将不显著降低所产生抗体的滴度。技术实现要素：12.本发明提供了用作抑制哺乳动物gdp-甘露糖4,6-脱水酶(gmd)(例如，仓鼠gmd)的岩藻糖基化抑制剂的化合物。此类化合物将可用于例如制造n-连接聚糖岩藻糖基化降低的蛋白质(诸如抗体)，其中在蛋白质(例如，抗体)的产生过程中将所述化合物添加到细胞培养物中。13.在各种实施方案中，本发明化合物是鼠李糖衍生物，诸如gdp-d-鼠李糖、ac-gdp-d-鼠李糖或鼠李糖磷酸钠。在一个实施方案中，gdp-d-鼠李糖是本发明化合物。在另一个实施方案中，ac-gdp-d-鼠李糖是本发明化合物。在又另一个实施方案中，鼠李糖磷酸钠是本发明化合物。在各种实施方案中，本发明的岩藻糖基化抑制剂以6mm或更高浓度或10mm或更高浓度存在于培养基中。14.在另一方面，本发明提供了通过以下方式制造岩藻糖基化降低的蛋白质(诸如抗体)的方法：在由表达蛋白质(例如，抗体)的细胞系生产蛋白质期间使用的培养基中包含本发明化合物。在一些实施方案中，在细胞系产生有待分离的蛋白质(例如，抗体)的全部或基本上全部时间内培养基中存在所述化合物，以使所产生的非岩藻糖基化蛋白质(例如，抗体)的比例最大化，尽管原则上所述化合物只需要在足够的生产培养过程中存在即可达到所希望的非岩藻糖基化水平。15.在又一方面，本发明提供了通过本发明方法制备的岩藻糖基化降低的蛋白质，诸如岩藻糖基化降低的蛋白质(例如，≥20％或≥40％的无岩藻糖基化多肽链)或者低岩藻糖基化或非岩藻糖基化蛋白质。16.在相关方面，本发明提供了通过本发明方法制造的岩藻糖基化降低的抗体，诸如与在不存在岩藻糖基化抑制剂的情况下在相同细胞系中产生的相同抗体相比展现出两倍或更大的adcc增强的抗体(如通过实施例2中描述的方法确定)和/或岩藻糖基化降低的抗体(例如，≥20％或≥40％的无岩藻糖基化抗体链)或低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗体。17.在甚至又一方面，本发明提供了通过以下方式治疗人类疾病诸如癌症的方法：将通过本发明方法制造的岩藻糖基化降低的抗体或其他蛋白质施用于有需要的患者。18.在各种实施方案中，本发明的化合物以1mm、2mm、3mm、6mm、10mm或更高的浓度包含在抗体生产期间使用的细胞生长培养基中。19.可以通过本发明方法以低岩藻糖基化或非岩藻糖基化形式制造的示例性抗体包括与人cd20、ccr4、egfr、cd19、her2、il-5r、cd40、bcma、siglec 8、cd147、cd30、epha3、岩藻糖基gm1、ctla-4、mica和icos结合的抗体。附图说明20.图1提供了三种化合物的结构，特别是gdp-d-鼠李糖(式i)、ac-gdp-d-鼠李糖(式ii)和鼠李糖磷酸钠(式iiii)。21.图2a示出了对于在存在或不存在1mm至6mm浓度的本发明示例性岩藻糖基化抑制剂的情况下生长的抗体，非岩藻糖基化抗体的百分比。图1中提供了gdp-d-鼠李糖和ac-gdp-d-鼠李糖的结构。图2b示出了对于图2a的相同抗体制剂的抗体滴度。ac-gdp-d-鼠李糖在增加非岩藻糖基化抗体的百分比方面与gdp-d-鼠李糖一样有效，而对滴度(产率)的有害作用较小。22.图3a、3b和3c分别示出了使用在没有岩藻糖基化抑制剂或存在6mm或10mm ac-gdp-d-鼠李糖的情况下培养的细胞制造的抗体制剂的电泳图。指示了不同糖型的峰，其中白框表示岩藻糖基化种类并且黑框表示非岩藻糖基化种类。ac-gdp-d-鼠李糖浓度的增加使非岩藻糖基化种类的比例增加。23.图4a和4b提供了产生鼠李糖磷酸盐、gdp-d-鼠李糖和ac-gdp-d-鼠李糖的示例性合成方案。参见实施例1。24.图5a、5b和5c提供了产生gdp-d-鼠李糖和ac-gdp-d-鼠李糖的第二示例性合成方案。具体实施方式25.定义26.为了更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本技术所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个应当具有下文所阐述的含义。另外的定义贯穿本技术进行阐述。[0027]“施用”是指使用本领域技术人员已知的多种方法和递送系统中的任何一种将包含治疗剂的组合物物理引入至受试者。本发明抗体的优选施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除了肠施用和局部施用之外，通常通过注射的施用模式，并且包括而不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。可替代地，本发明的抗体可以是经由非肠胃外途径(诸如局部、表皮或粘膜施用途径)施用，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。施用还可以例如进行一次、多次和/或经一个或多个延长的时间段。可以由一个或多个个体进行施用，包括但不限于医生、护士、其他医疗保健提供者或患者本人进行施用。如权利要求中所列举，“有需要的患者”是指被诊断患有有待治疗的疾病诸如癌症的任何人类受试者。[0028]“抗体”(ab)应当包括但不限于糖蛋白免疫球蛋白，其与抗原特异性结合并且包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链。通过本发明方法(其包括在本发明岩藻糖基化抑制剂的存在下培养的细胞系中产生抗体)制造的抗体被称为本发明抗体。在常规抗体中，每条h链包含重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域ch1、ch2和ch3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域cl构成。vh和vl区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(cdr)，其散布有更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl由三个cdr和四个fr构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。[0029]如本文所用并且根据常规解释，被描述为包含“一个/种”重链和/或“一个/种”轻链的抗体是指包含重链和/或轻链中的“至少一个/种”的抗体，因此将包括具有两条或更多条重链和/或轻链的抗体。具体地，如此描述的抗体将包括具有两个基本相同的重链和两个基本相同的轻链的常规抗体。如果抗体链由于翻译后修饰(诸如赖氨酸残基的c末端切割、替代糖基化模式等)而不同，则它们可以基本相同但不完全相同。“抗体”还可以包含两个不同的抗原结合结构域，例如，双特异性抗体或结合同一靶标上两个不同表位的抗体，并且因此可以包含两条不相同的重链和/或轻链。[0030]除非另有指示或从上下文中清楚，否则由其靶标特异性定义的抗体(例如，“抗ctla-4抗体”)是指可与其人靶标(例如，人ctla-4)结合的抗体。此类抗体可以与或可以不与来自其他物种的ctla-4结合。[0031]免疫球蛋白可以源自任何熟知的同种型，包括但不限于iga、分泌型iga、igg和igm。igg同种型可以按某些物种分为亚类：人的igg1、igg2、igg3和igg4，和小鼠的igg1、igg2a、igg2b和igg3。igg抗体在本文中可以由符号gamma(γ)或简单的“g”来指代，例如igg1可以表示为“γ1”或“g1”，如从上下文可以明确看出的。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，igm或igg1)。“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体二者；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体或非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。除非另有指示或从上下文中清楚，否则本文公开的抗体是人igg1抗体。[0032]“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与ctla-4特异性结合的分离的抗体基本上不含与ctla-4以外的抗原特异性结合的抗体)。然而，与ctla-4特异性结合的分离的抗体可能与其他抗原(诸如来自不同物种的ctla-4分子)交叉反应。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。相比之下，“分离的”核酸是指这样的物质的核酸组成，其与自然界中存在的核酸显著不同，即具有独特的化学特性、性质和实用性。例如，与天然dna不同，分离的dna是天然dna的独立部分，而不是自然界中发现的更大结构复合物即染色体的组成部分。此外，与天然dna不同，分离的dna可以用作pcr引物或杂交探针，以用于测量基因表达和检测生物标记基因或突变以诊断疾病或预测治疗剂的功效等。还可以使用本领域熟知的标准技术纯化分离的核酸以使其基本上不含其他细胞组分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白质。[0033]术语“单克隆抗体”(mab)是指具有单一分子组成的抗体分子的制剂，即其一级序列基本上相同并且对特定表位展现出单一结合特异性和亲和力的抗体分子。单克隆抗体可以通过杂交瘤、重组、转基因或本领域技术人员已知的其他技术产生。[0034]“人抗体”(humab)是指具有这样的可变区的抗体，其中框架区和cdr区二者均源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则所述恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中源自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的cdr序列已经被移植到人框架序列上的抗体。术语“人”抗体和“完全人”抗体同义使用。[0035]“抗体片段”是指完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的“抗原结合部分”(“抗原结合片段”)，其保留与由完整抗体结合的抗原特异性结合的能力；或保留fcr结合能力的抗体fc区。示例性抗体片段包括fab片段和单链可变结构域(scfv)片段。[0036]“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(“adcc”)是指体外或体内细胞介导的反应，其中表达fcr的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)识别与靶细胞上的表面抗原结合的抗体，随后导致靶细胞的溶解。原则上，任何具有激活fcr的效应细胞都可以被触发以介导adcc。[0037]“癌症”是指一组广泛的不同疾病，其特征在于体内异常细胞的不受控制的生长。不受调节的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤或细胞的形成，恶性肿瘤侵入邻近组织并且还可以通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部分。[0038]“细胞表面受体”是指能够接收信号并且将这种信号传递穿过细胞的质膜的分子和分子复合物。[0039]“效应细胞”是指表达一种或多种fcr并且介导一种或多种效应子功能的免疫系统的细胞。优选地，所述细胞表达至少一种类型的激活fc受体(例如像人fcγriii)并且执行adcc效应子功能。介导adcc的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(pbmc)、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。[0040]“效应子功能”是指抗体fc区与fc受体或配体的相互作用或由此产生的生化事件。示例性的“效应子功能”包括clq结合、补体依赖性细胞毒性(cdc)、fc受体结合、fcγr介导的效应子功能(诸如adcc和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp))和细胞表面受体(例如，b细胞受体；bcr)的下调。此类效应子功能通常需要fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合。[0041]“fc受体”或“fcr”是与免疫球蛋白的fc区结合的受体。与igg抗体结合的fcr包含fcγr家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。fcγr家族由三种激活受体(小鼠中的fcγri、fcγriii和fcγriv；人中的fcγria、fcγriia和fcγriiia)和一种抑制受体(fcγriib)组成。表1中总结了人fcγr的各种特性。大多数先天性效应细胞类型共表达一种或多种激活性fcγr和抑制性fcγriib，而自然杀伤(nk)细胞选择性地表达一种激活性fc受体(小鼠中的fcγriii和人中的fcγriiia)，但在小鼠和人中不表达抑制性fcγriib。[0042]“fc区”(片段可结晶区)或“fc结构域”或“fc”是指抗体重链的c末端区，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的fc受体的结合或与经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。因此，fc区是包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区的多肽。在igg、iga和igd抗体同种型中，fc区由两个相同的蛋白质片段构成，其源自抗体两条重链的第二(ch2)和第三(ch2)恒定结构域；igm和ige fc区含有每个多肽链中的三个重链恒定结构域(ch结构域2-4)。对于igg，fc区包含免疫球蛋白结构域cγ2和cγ3以及cγ1与cγ2之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链的fc区的边界可能会发生变化，但是人igg重链的fc区通常定义为从位置c226或p230处的氨基酸残基延伸到重链的羧基末端，其中编号是根据如在kabat中的eu索引进行的。人igg fc区的ch2结构域从约氨基酸231延伸到约氨基酸340，而ch3结构域位于fc区中ch2结构域的c末端侧，即它从igg的约氨基酸341延伸到约氨基酸447。如本文所用，fc区可以是天然序列fc或变体fc。fc也可以单独地或在包含fc的蛋白质多肽(诸如“包含fc区的结合蛋白”，也称为“fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘附素))的上下文中指代此区域。[0043]表1[0044]人fcγr的特性[0045][0046]除非另有指示，否则如本文所用的“岩藻糖基化”是指在蛋白质上的n-连接聚糖链的最内部glcnac残基处存在支链岩藻糖残基。岩藻糖基化是蛋白质分子群体的整体特性，尽管所述术语也可以关于群体中的单独蛋白质使用。例如，任何单独的抗体可以在两条重链上均被“岩藻糖基化”(岩藻糖基化)，在重链上均未被岩藻糖基化(非岩藻糖基化)，或在两条重链中的仅一条上被岩藻糖基化(半岩藻糖基化)。抗体群体(例如，来自生产运行的制剂)将包含单独的岩藻糖基化抗体、非岩藻糖基化抗体和半岩藻糖基化抗体的混合物，并且因此可以展现出从0％至100％的任何程度的岩藻糖基化。如本文所用，岩藻糖基化百分比是指存在岩藻糖的所有潜在岩藻糖基化位点的百分比。例如，纯半岩藻糖基化抗体的制剂将是50％岩藻糖基化的。实施例2提供了确定抗体制剂中岩藻糖基化百分比的示例性方法。[0047]gmd是指来自哺乳动物(诸如仓鼠或人)的“gdp-甘露糖4,6-脱水酶”。gmd被称为酶委员会(enzyme commission)(ec)编号4.2.1.47。人gmd也称为gmds和sdr3e1。gmd催化gdp-甘露糖转化为gdp-4-酮-6-脱氧甘露糖，这是使用nadp+作为辅因子从gdp-甘露糖合成gdp-岩藻糖的第一步。除非另有指示或从上下文中清楚，否则本文对gmd的提及是指仓鼠gmd，尽管在大多数上下文中将包括仓鼠和人类蛋白质。仓鼠(灰仓鼠(cricetulus griseus))gmd进一步描述于gene id no:100689436。仓鼠gmd(np_001233625.1)的序列(包括23个氨基酸的信号序列)提供在seq id no:1中，并且编码dna序列nm_001246696.1提供在seq id no:2中。人(智人(homo sapiens))gmd进一步描述在gene id no:2762和mim(人的孟德尔遗传):602884中。人gmd同种型1(np_001491.1)的序列(包括23个氨基酸的信号序列)提供在seq id no:3中，并且编码dna序列nm_001500.4提供在seq id no:4中。仓鼠和人gmd多肽与347aa成熟蛋白质共享98％的序列相似性和》99％的序列同一性。[0048]“免疫反应”是指脊椎动物内针对外来因子(agent)的生物反应，所述反应保护生物免受这些因子和由其引起的疾病的侵害。所述免疫应答是由免疫系统的细胞(例如，t淋巴细胞、b淋巴细胞、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)和通过这些细胞或肝脏中的任何一种产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导的，所述作用导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除脊椎动物中侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌性或其他异常细胞，或者在自身免疫性或病理性炎症的情况下导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除正常的人细胞或组织。[0049]“免疫调节剂”(“immunomodulator”或“immunoregulator”)是指可以参与调节(modulating、regulating)或改变免疫反应的信号传导通路的组分。“调节”(“modulating”、“regulating”)或“改变”免疫反应是指免疫系统的细胞或这种细胞的活性的任何改变。这种调节包括对免疫系统的刺激或抑制，这可以通过各种细胞类型数量的增加或减少、这些细胞的活性的增加或降低或免疫系统内可能发生的任何其他变化来显示。已经鉴定了抑制和刺激免疫调节剂二者，其中一些在肿瘤微环境中可能具有增强的功能。在所公开的本发明的优选实施方案中，所述免疫调节剂位于t细胞的表面。“免疫调节靶标”(“immunomodulatory target”或“immunoregulatory target”)是这样的免疫调节剂，其被靶向用于与物质、药剂、部分、化合物或分子结合，并且所述免疫调节靶标的活性因物质、药剂、部分、化合物或分子的结合而改变。免疫调节靶标包括例如细胞表面上的受体(“免疫调节受体”)和受体配体(“免疫调节配体”)。[0050]“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的方法治疗患有疾病或者有感染疾病或遭受疾病复发风险的受试者。[0051]“增强内源性免疫应答”意指增加受试者的现有免疫应答的有效性或效力。有效性和效力的这种增加可以例如通过以下方式来实现：克服抑制内源性宿主免疫应答的机制或者刺激增强内源性宿主免疫应答的机制。[0052]“蛋白质”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，所述链的长度没有上限。所述蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可以含有修饰，诸如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键形成。术语“蛋白质”在本文中可与“多肽”互换使用。“蛋白质”可以包含两条或更多条多肽链，其可以包括不同的多肽序列，诸如抗体的重链和轻链。常规的全长抗体将包含两条重链和两条轻链，并且是“蛋白质”。表达包含两种或更多种具有不同序列的多肽的“蛋白质”的细胞或细胞系表达蛋白质的所有链，例如抗体的重链和轻链。[0053]如本文所用(除非另有指示)并且关于本发明的用于产生岩藻糖基化降低的蛋白质的化合物和方法的“蛋白质”包含n-连接聚糖。具有n-连接糖基化(诸如抗体中的fc区(n297)糖基化)的蛋白质可以与本发明的化合物和方法一起使用以限制或防止岩藻糖残基以其他方式典型地添加到聚糖链的最内部glcnac残基。[0054]按照常规，术语“蛋白质”，诸如“抗体”，可以是指制剂中的蛋白质分子群体或群体中的单独蛋白质分子，取决于上下文。为清楚起见，本文使用的术语“去岩藻糖基化的”是指缺乏n-连接岩藻糖的单独蛋白质(例如，抗体链)，并且使用的“非岩藻糖基化的”是指蛋白质分子的群体或制剂。因此，任何单独的多肽链都可能是岩藻糖基化的或去岩藻糖基化的，而蛋白质群体可以经非岩藻糖基化至任何给定的去岩藻糖基化百分比。因此，对一种或多种蛋白质关于岩藻糖基化水平的提及，例如“岩藻糖基化降低的抗体”，必须是指蛋白质分子的异质群体，即使没有明确规定也是如此。[0055]除非另有指示或从上下文中清楚，否则抗体fc区中的氨基酸残基编号是根据eu编号惯例的(如kabat等人(1991)sequences of proteins of immunological interest,national institutes of health,马里兰州贝塞斯达中的eu索引；还参见美国专利申请公开号2008/0248028的图3c-3f)，除了特别提到序列表中的序列中的残基时，在这种情况下编号必须是相继的。例如，关于fc区中氨基酸取代作用的参考文献典型地将使用eu编号，所述编号允许以相同的编号提及抗体fc区中的任何给定残基，而与其附接的可变结构域的长度无关。在极少数情况下，可能有必要参考所引用的文件以证实所参考的确切fc残基。[0056]除非另有指示，“鼠李糖”是指d-鼠李糖。[0057]“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、兔、啮齿动物(诸如小鼠、大鼠和豚鼠)、禽类物种(诸如鸡)、两栖动物和爬行动物。在优选的实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、兔、雪貂或啮齿动物。在所公开的本发明的任何方面的更优选实施方案中，受试者是人。术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。[0058]受试者的“治疗”或“疗法”是指对受试者进行的任何类型的干预或处理，或者向受试者施用活性剂，目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防症状、并发症、病症的发作、进展、发展、严重程度或复发或者与疾病相关的生化指标。[0059]减少抗体的岩藻糖基化的传统方法[0060]抗体与fcγr的相互作用可以通过修饰在n297残基处附接至每个fc片段的聚糖部分来增强。特别地，核心岩藻糖残基的缺失经由改善igg与激活fcγriiia的结合而不改变抗原结合或cdc而强烈增强adcc。natsume等人(2009)drug des.devel.ther.3:7。有令人信服的证据表明，去岩藻糖基化肿瘤特异性抗体在体内小鼠模型中导致增强的治疗活性。nimmerjahn和ravetch(2005)science 310:1510；mossner等人(2010)blood 115:4393。[0061]抗体糖基化的修饰已传统地通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达所述抗体来实现。本领域已经描述了具有改变的糖基化机制的细胞。例如，细胞系ms704、ms705和ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因fut8(α-(1,6)岩藻糖基转移酶)(参见美国专利申请公开号20040110704；yamane-ohnuki等人(2004)biotechnol.bioeng.87:614)，使得在这些细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。ep 1176195也描述了具有功能破坏的fut8基因的细胞系，以及具有很小或没有将岩藻糖添加至与抗体的fc区结合的n-乙酰基葡糖胺的活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系yb2/0(atcc crl 1662)。pct公开案wo 03/035835描述了变体cho细胞系lec13，其具有降低的将岩藻糖附接至asn(297)连接的碳水化合物的能力，还导致了在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化。还参见shields等人(2002)j.biol.chem.277:26733。如pct公开号wo 2006/089231中所述，还可以在鸡蛋中产生具有修饰的糖基化特征的抗体。可替代地，可以在植物细胞(诸如浮萍属(lemna))中产生具有修饰的糖基化特征的抗体。参见例如，美国公开号2012/0276086。pct公开号wo 99/54342描述了这样的细胞系，其经工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1,4)-n-乙酰基葡糖胺转移酶iii(gntiii))，使得在工程化细胞系中表达的抗体展现出增加的二等分glcnac结构，这导致抗体的adcc活性增加。还参见等人(1999)nat.biotech.17:176。可替代地，可以使用岩藻糖苷酶切割掉抗体的岩藻糖残基。例如，α-l-岩藻糖苷酶从抗体去除岩藻糖基残基。tarentino等人(1975)biochem.14:5516。还可以在含有编码使用gdp-6-脱氧-d-来苏-4-己糖(hexylose)作为底物的酶(诸如gdp-6-脱氧-d-来苏-4-己糖还原酶(rmd))的重组基因的细胞中产生具有减少的岩藻糖基化的抗体，如美国专利号8,642,292所述。可替代地，细胞可以在含有岩藻糖类似物的培养基中生长，所述岩藻糖类似物阻止岩藻糖残基添加至n-连接聚糖或由在培养基中生长的细胞产生的糖蛋白，诸如抗体。美国专利号8,163,551；wo 09/135181。此类化合物包括但不限于全乙酰-岩藻糖、6,6,6-三氟岩藻糖全-o-乙酸酯、6,6,6-三氟岩藻糖(岩藻糖基化抑素i)和岩藻糖-1-磷酸酯类似物(岩藻糖基化抑素ii)。[0062]作为岩藻糖基化抑制剂的鼠李糖衍生物[0063]在一方面，本发明提供了鼠李糖衍生化合物，诸如gdp-d-鼠李糖及其衍生物，其抑制哺乳动物细胞培养物产生的蛋白质的岩藻糖基化。不旨在受理论的限制，此类化合物可以充当gdp-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)的抑制剂。本发明的示例性化合物包括gdp-d-鼠李糖(式i)、ac-gdp-d-鼠李糖(式ii)和鼠李糖磷酸钠(式iii)，其结构提供在图1中。本发明化合物的示例性合成方法提供在图4a和4b(对于ac-gdp-d-鼠李糖)以及图4a、4b和4c(gdp-d-鼠李糖)中并且在实施例1中更详细地讨论。本发明化合物的第二示例性合成方法提供在图5a和5b(对于ac-gdp-d-鼠李糖)以及图5a、5b和5c(gdp-d-鼠李糖)中。[0064]本发明还提供了通过以下方式产生岩藻糖基化降低的蛋白质以及低岩藻糖基化蛋白质和非岩藻糖基化蛋白质(诸如抗体)的方法：在包含例如浓度为6mm或更高或10mm或更高的本发明岩藻糖基化抑制剂(诸如gdp-d-鼠李糖、ac-gdp-d-鼠李糖和鼠李糖磷酸钠)的培养基中生长蛋白质生产细胞。[0065]本发明还提供了通过本发明方法制造的蛋白质诸如抗体以及用这些蛋白质(例如，抗体)治疗疾病(例如，癌症)的方法。[0066]因为与岩藻糖基化抗体相比，非岩藻糖基化抗体展现出大大增强的adcc，因此抗体制剂不必完全不含岩藻糖基化重链而在治疗上优于岩藻糖基化抗体。岩藻糖基化重链的残留水平将不显著干扰基本上非岩藻糖基化重链的制剂的adcc活性。然而，完全有能力将核心岩藻糖添加至n-聚糖中的常规cho细胞中产生的抗体可以包含百分之几至15％的非岩藻糖基化抗体。非岩藻糖基化抗体可以展现出高十倍的对cd16的亲和力，以及adcc活性的多达30至100倍增强，因此即使非岩藻糖基化抗体的比例的少量增加，也可以显著增加制剂的adcc活性。任何包含比在培养中的正常cho细胞中产生的更多的非岩藻糖基化抗体的制剂可以展现出一定水平的增强的adcc。此类抗体制剂在本文中称为具有“减少的岩藻糖基化”的制剂。根据从正常cho细胞获得的原始非岩藻糖基化水平，减少的岩藻糖基化的制剂可以包含少至40％、30％、20％、10％以及甚至5％的非岩藻糖基化抗体。减少的岩藻糖基化在功能上被定义为与在正常cho细胞中制备的抗体相比，展现出adcc的两倍或更多增强的制剂，而不是参考任何固定百分比的非岩藻糖基化种类。[0067]在其他实施方案中，非岩藻糖基化的水平在结构上是确定的。如本文所用，非岩藻糖基化抗体制剂是包含大于95％(包括100％)非岩藻糖基化抗体重链的抗体制剂。低岩藻糖基化抗体制剂是包含小于或等于95％缺乏岩藻糖的重链的抗体制剂，例如其中在50％与95％之间(诸如在75％与95％之间和在85％与95％之间)的重链缺乏岩藻糖的抗体制剂。除非另有指示，否则低岩藻糖基化是指其中50％至95％的重链缺乏岩藻糖的抗体制剂，非岩藻糖基化是指其中超过95％的重链缺乏岩藻糖的抗体制剂，并且“低岩藻糖基化或非岩藻糖基化”是指其中50％或更多的重链缺乏岩藻糖。[0068]抗体制剂中岩藻糖基化的水平可以通过本领域已知的任何方法测定，所述方法包括但不限于凝胶电泳、液相色谱法和质谱法。除非另有指示，否则出于本发明的目的，基本上如实施例2所述，抗体制剂中岩藻糖基化的水平通过亲水相互作用色谱法(或亲水相互作用液相色谱，hilic)测定。为了测定抗体制剂的岩藻糖基化水平，将样品用png酶f变性处理以切割n-连接聚糖，然后分析岩藻糖含量。全长抗体链的lc/ms是检测抗体制剂的岩藻糖基化水平的替代方法，但质谱法本身的定量性较差。[0069]本发明的治疗用途和方法[0070]在一些实施方案中，诸如癌症或感染的治疗，可能希望消耗免疫抑制细胞，诸如调节性t细胞(treg)，以允许更稳健的抗肿瘤或抗感染免疫反应，或消耗肿瘤感染的细胞本身。在这种情况下，针对优先或专门在免疫抑制细胞上表达的细胞表面蛋白或针对优先或专门在肿瘤细胞(例如，肿瘤抗原)或感染的细胞本身上表达的细胞表面蛋白而产生的抗体(或其抗原结合片段)在本发明的鼠李糖相关岩藻糖基化抑制剂的存在下生长的哺乳动物细胞系中产生，以产生具有增强的adcc活性的低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗体群体。在病理性炎症引起疾病诸如自身免疫性障碍的其他情况下，在本发明鼠李糖相关岩藻糖基化抑制剂的存在下生长的哺乳动物细胞系中产生的低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗体对优先或专门在炎症细胞本身上表达的细胞表面蛋白具有特异性。[0071]在本发明治疗方法的优选实施方案中，受试者是人。[0072]可以使用通过本发明方法产生的低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗体治疗的癌症的例子包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、肾癌、子宫癌、卵巢癌、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门区域癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、血液系统恶性肿瘤、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)、转移性癌症以及所述癌症的任何组合。在优选的实施方案中，所述癌症选自mel、rcc、鳞状nsclc、非鳞状nsclc、crc、crpc、头颈部鳞状细胞癌以及食道癌、卵巢癌、胃肠道癌和乳腺癌。本发明方法也适用于治疗转移性癌症。[0073]其他癌症包括血液系统恶性肿瘤，包括例如多发性骨髓瘤、b细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤/原发性纵隔b细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞性白血病、蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤和前体t淋巴母细胞性淋巴瘤以及所述癌症的任何组合。[0074]通过以下实施例进一步说明本发明，不应将所述实施例视为限制。本技术中引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。[0075]实施例1：[0076]岩藻糖基化抑制剂的示例性合成[0077]在此更详细地讨论了在图4a和4b中提供的用于制造本发明岩藻糖基化抑制剂的示例性合成方法。[0078]步骤1.[0079][0080]将化合物1(150g，772mmol，1当量)、2,2-二甲氧基丙烷(402g，3.86mol，473ml，5当量)和ptsa(6.65g，38.6mmol，0.05当量)在丙酮(750ml)中的溶液在20℃下搅拌2h。tlc(乙酸乙酯，sm(rf)＝0.01，产物(rf)＝0.38)显示反应完全。向混合物中添加水(150ml)。30min后，将ptsa用5％nahco3水溶液中和。在真空中除去丙酮，并且将水相用石油醚洗涤以去掉二异亚丙基，然后用dcm(3*200ml)洗涤。将有机层干燥(na2so4)并且在真空中浓缩以得到呈灰白色固体的化合物2(100g，55％)，其不经进一步纯化用于下一步骤。[0081]步骤2.[0082][0083]向化合物2(100g，426mmol，1当量)在dcm(700ml)中的溶液中添加tea(56.1g，554mmol，77.25ml，1.3当量)和toscl(105g，554mmol，1.3当量)。将混合物在20℃下搅拌16h。[0084]tlc(石油醚:乙酸乙酯＝1:1，产物(rf)＝0.43)表明化合物2已完全消耗。添加ch2cl2(200ml)，并且将溶液依次用饱和nahco3(5x300ml)和h2o(3x300ml)洗涤，干燥(mgso4)，并且蒸发至浆液。将残余物通过柱色谱法纯化(sio2，石油醚/乙酸乙酯＝5/1至2/1)以得到呈淡黄色油状物的化合物3(100g，60％产率)。[0085]步骤3.[0086][0087]平行进行两个反应。[0088]将在n2下的化合物3(45.0g，115mmol，1当量)在dmso(450ml)中的溶液冷却至20℃并且在搅拌下缓慢添加nabh4(21.9g，579mmol，5当量)。将混合物在80℃下搅拌2h。tlc(石油醚:乙酸乙酯＝2:1，产物(rf)＝0.43)表明化合物3已完全消耗。在此将两个反应合并。将混合物用冰h2o(1400ml)淬灭，将混合物搅拌15min，并且然后用etoac(1000ml)洗涤，干燥(na2so4)，并且蒸发。将残余物通过柱色谱法纯化(sio2，石油醚/乙酸乙酯＝5/1至2/1)以得到呈淡黄色油状物的化合物4(40g，79％产率)。[0089]步骤4.[0090][0091]向化合物4(40g，183mmol，1当量)在h2o(2000ml)中的溶液中添加dowex 50h+树脂(300g)。将混合物在80℃下搅拌24h。tlc(二氯甲烷:甲醇＝3:1，产物(rf)＝0.15)表明化合物4已完全消耗。将反应混合物过滤并且在减压下浓缩以得到呈淡黄色油状物的化合物5(30g，粗品)。[0092]步骤5.[0093][0094]向化合物5(30.0g，182mmol，1当量)在py(300ml)中的溶液中添加dmap(4.47g，36.5mmol，0.2当量)和ac2o(149g，1.46mol，136ml，8当量)，将混合物在20℃下搅拌12h。tlc(石油醚:乙酸乙酯＝3:1，产物(rf)＝0.43)表明化合物5已完全消耗。将反应混合物通过添加h2o(300ml)淬灭并且然后用etoac(500ml)稀释。将有机层用1n hcl(300ml x 2)洗涤，经na2so4干燥，过滤并且在减压下浓缩以得到残余物。将残余物通过柱色谱法纯化(sio2，石油醚/乙酸乙酯＝10/1至5/1)以得到呈淡黄色油状物的化合物6(30g，49％产率)。[0095]步骤6.[0096][0097]将化合物6(20.0g，60.1mmol，1当量)溶解在dmf(110ml)中。添加乙酸肼(8.31g，90.2mmol，1.5当量)并且将混合物在25℃下在n2下搅拌3h。tlc(石油醚:乙酸乙酯＝1:1，产物(rf)＝0.24)表明化合物6已完全消耗。将反应混合物通过添加在0℃下的300ml h2o淬灭并且然后用etoac(200ml x 2)萃取。将合并的有机层用盐水(100ml x 3)洗涤，经na2so4干燥，过滤并且在减压下浓缩以得到残余物。获得呈淡黄色油状物的化合物7(12.0g，粗品)，其不经进一步纯化而用于下一步骤。[0098]步骤7.[0099][0100]将化合物7(12.0g，41.3mmol，1当量)与约30ml acn共蒸发两次，并且然后添加50ml acn。添加在40ml acn中的7a(15.7g，45.4mmol，15ml，1.1当量)。将混合物冷却至0℃。在0℃-5℃下逐滴添加tfa.py(1m，74ml，1.8当量)。将混合物在25℃下搅拌1h。冷却至0℃并且在0℃下逐滴添加在40ml acn中的m-cpba(15.1g，74.4mmol，85％纯度，1.8当量)。将混合物在25℃下搅拌1h。tlc(石油醚:乙酸乙酯＝2:1，产物(rf)＝0.24)表明化合物7已完全消耗。添加饱和na2so3(400ml)和etoac(600ml)并且将混合物在25℃下搅拌20min。将有机相分离并且用饱和na2so3(300ml*2)和盐水(300ml)洗涤，经na2so4干燥，过滤。将残余物通过柱色谱法纯化(sio2，石油醚/乙酸乙酯＝2/1)以得到呈淡黄色油状物的化合物8(10.0g，43％产率)。[0101]步骤8.[0102][0103]在n2气氛下，向化合物8(4.00g，7.27mmol，1当量)在meoh(200ml)中的溶液中添加pd/c(10％，4.0g)、3.63ml tea。将悬浮液脱气并且用h2吹扫3次。将混合物在25℃下在h2(30psi)下搅拌3h。tlc(石油醚:乙酸乙酯＝1:1，产物(rf)＝0.05)表明化合物8已完全消耗。将混合物通过硅藻土过滤，将滤饼用meoh(30ml)洗涤，并且在减压下浓缩以得到呈淡黄色油状物的化合物9(1.5g，55.7％产率)。[0104]步骤9.[0105][0106]向化合物8(1.5g，4.05mmol，1当量)的溶液中添加nh3/meoh(7m，70ml，120当量)。将混合物在25℃下搅拌12h。lcms(et14769-65-p1a，rt＝0.235min)显示检测到希望的ms。将反应混合物过滤，并且将滤饼在减压下浓缩以得到残余物。将产物冻干。获得呈淡黄色油状物的化合物d-rha-磷酸盐(0.6g，61％产率)。[0107]步骤10.[0108][0109]将化合物9(0.1g，270umol，1当量)与py(1ml×2)共蒸发。添加化合物9_a(98.0mg，135umol，0.5当量)并且将混合物与py(1ml×2)共蒸发。添加四唑(0.45m，1.20ml，2当量)并且将混合物与py(1ml×2)共蒸发。添加py(2ml)并且用n2脱气。将混合物在25℃下搅拌40h。lcms(et14769-78-p1d，rt＝1.157min)显示反应物1剩余。lc-ms上显示出几个新峰，并且检测到所希望的化合物。将反应混合物在减压下浓缩以得到残余物。将残余物通过制备型hplc(中性条件)纯化。冻干得到呈淡黄色油状物的化合物10和化合物9的混合物(20mg，61％产率)。[0110]步骤11.[0111][0112]将化合物10和化合物9(20mg)的混合物溶解在h2o(0.5ml)中。添加meoh/h2o/tea溶液(0.5ml)。将混合物在30℃下搅拌20min。lcms(et14769-83-p1a)显示检测到希望的ms。向所得混合物中添加h2o(6ml)并且冻干3次。获得呈淡黄色油状物的化合物11和化合物11_a的混合物(20mg)。[0113]步骤12.[0114][0115]将化合物11和化合物11_a的混合物(20mg)通过dowex 5wx8-100(na+形式)用非离子h2o(300ml)洗脱。将洗脱液冻干。获得呈淡黄色固体的化合物gdp-d-鼠李糖和化合物11_b的混合物(15mg)。[0116]实施例2：[0117]确定样品中非岩藻糖基化抗体百分比的测定[0118]可以分析非岩藻糖基化抗体制剂以基本上如下确定岩藻糖基化重链的百分比。[0119]首先使用脲将抗体变性，并且然后使用dtt(二硫苏糖醇)还原。然后将样品用png酶f在37℃下消化过夜以去除n-连接聚糖。收集释放的聚糖，过滤，干燥并且用2-氨基苯甲酸(2-aa)或2-氨基苯甲酰胺(2-ab)衍生化。然后在hilic柱上分辨所得的标记聚糖，并且将洗脱部分通过荧光定量并且干燥。然后将级分用外切糖苷酶(诸如α(1-2,3,4,6)岩藻糖苷酶(bkf))处理，释放核心α(1,6)-连接岩藻糖残基。然后通过液相色谱法分析未处理的样品和bkf处理的样品。包含α(1,6)-连接岩藻糖残基的聚糖在bkf处理后展现出改变的洗脱，而非岩藻糖基化聚糖没有变化。还通过质谱法确认寡糖组成。参见例如，zhu等人(2014)mabs 6:1474。[0120]非岩藻糖基化百分比计算为一百乘以(在抗体重链n297处的n-连接聚糖处缺少α1,6-连接至第一个glcnac残基的聚糖的岩藻糖聚糖)与(在该位置处的所有聚糖的总和，包括缺少岩藻糖的聚糖和具有α1,6-连接岩藻糖的聚糖两者)的摩尔比。[0121]表7[0122]序列表总结[0123][0124]等效方案：[0125]本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所公开的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案旨在被以下权利要求所涵盖。









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