具有降低血氨数值效能的菌株及包含其的用于保护神经细胞的组合物的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及具有降低血氨数值效能的菌株及包含其的用于保护神经细胞的组合物，更详细地，涉及一种通过在体内具有除氨效能来降低血氨数值而具有神经细胞保护功能的单一菌株，或与之为互利共生关系的菌株组合(symbiotic pair)及包含其的用于保护神经细胞的组合物。背景技术：2.在我们人体中，不断发生通过食物摄入的蛋白质的新陈代谢，在蛋白质分解过程中会产生氨。氨是一种非常强的神经毒性物质，因而通过肝脏的尿素循环(urea cycle)转化为尿素并随尿液排出体外。然而，当由于肝功能异常导致体内氨水平异常升高时，神经毒性强的氨起到成为如痴呆、帕金森病等退行性神经系统疾病或如中风、昏迷、意识突然丧失而导致死亡的脑病(encephalopathy)等多种神经系统疾病的致病物质的作用。3.迄今为止，已经开发了多种旨在去除体内氨的方法。作为用于去除血氨的方法，正在实施血液透析、血浆去除、肠道清洗等，但这些方法仅在体内氨数值非常高的紧急情况下具有缓解症状的效果，而治疗效果微乎其微。另外，乳果糖(lactulose)、拉克替醇(lactitol)、木二糖(xylobiose)等非吸收性糖类，新霉素(neomycin)、巴罗霉素(paromycin)、利福昔明(rifaximin)等非吸收性抗生素，以及用于促进体内氨排出的精氨酸(arginine)、苯甲酸钠(sodium benzoate)、苯乙酸钠(sodium phenylacetate)等正在用作药物，但与副作用相比，效果不大。另外，还开发了利用转基因微生物菌株缓解高氨血症的技术(wo/2016/090343、wo/2016/200614、us9487764、us9688967)，但这些都不能实际定居于肠道中，无法在体内降低氨数值，因此需要开发一种高效去除体内氨的技术。4.在人的肠道中，营养成分从肠内腔移动到毛细血管和淋巴管而被吸收。与营养成分不同，就代谢产物情形而言，从肠内腔移动到肠毛细血管/淋巴管或从肠毛细血管/淋巴管移动到肠内腔，即进行双向移动。在可双向移动的代谢产物中，尤其需要排出体外的重要的代谢产物是氨。肠是氨运输非常重要的器官，氨通过在肠内腔诸如被动扩散(passive diffusion)和rhbg等特定运输物而被吸收到肠毛细血管/淋巴管内。然后，如果肠内腔中的氨数值降低，则氨从肠毛细血管/淋巴管移动到肠内腔以维持化学平衡。5.氨作为氨基酸代谢过程的副产物，是不可避免地会在体内产生的神经毒性物质，如果血氨数值升高，就会发生各种神经系统疾病，但尚未开发出一种能有效地降低血氨的治疗方法。6.现在，虽然非吸收性糖类、非吸收性抗生素以及促进体内氨排出的物质均被用作药物，但与副作用相比，他们的效果不大。利用经基因编辑的微生物开发降低血氨数值的治疗剂的尝试均未能成功，存在的问题，①作为用所投入的单一种类微生物在去除该微生物周围氨的功能有限，并且②单一种类的微生物不能高效定值于肠道内并生长。7.因此，本研究人员为了解决上述问题，经过研究确认，“在有效去除氨的肠道内微生物菌株中混合相互促进生长的互利共生(symbiotic)关系的菌株而制成的互利共生组合(symbiotic pair)”由于相互间促进生长的积极相互作用，在非常有效地定居于肠道并增殖的同时有效去除氨，因而最终能够极大降低血氨数值，从而完成了本发明。技术实现要素：8.技术问题9.本发明目的在于提供一种利用有效去除氨的菌株来减小哺乳动物的血氨数值而具有神经细胞保护效能的单一菌株或包含与其为互利共生关系的菌株组合的用于保护神经细胞的组合物。10.本发明另一目的在于提供一种通过减小血氨数值而具有神经细胞保护效能的单一菌株或含有与其为互利共生关系的菌株组合或其培养物作为有效成分，从而具有预防或治疗高氨血症及因其导致的神经系统疾病效果的组合物。11.技术方案12.为了实现所述目的，本发明提供一种乳杆菌属(lactobacillus sp.)菌株，其为通过减小哺乳动物的血氨数值而具有神经细胞保护效能的乳杆菌属(lactobacillus sp.)菌株，其特征在于，所述菌株选自由罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)jbd301(kctc 12606bp)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)jbd400(kacc 81122bp)、食淀粉乳杆菌(lactobacillus amylovorus)jbd401(kacc 81052bp)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)jbd402(kacc 81121bp)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)jbd406(kacc 81123bp)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)jbd410(kctc 11515bp)和棒状乳杆菌(lactobacillus coryniformis)jbd411(kacc 81053bp)菌株所组成的组。13.本发明还提供一种链球菌属(streptococcus sp.)菌株，其为通过减小哺乳动物的血氨数值而具有神经细胞保护效能的链球菌属(streptococcus sp.)菌株，其特征在于，所述菌株选自由鲁布纳链球菌(s.lubneri)jbd420(kacc 81124bp)、巴黎链球菌(s.lutetiensis)jbd421(kacc 81054bp)、澳大利亚链球菌(s.australis)jbd422(kacc 81055bp)、变形链球菌(streptococcus mutans)jbd423(kacc 81056bp)、前庭链球菌(s.vestibularis)jbd424(kacc 81057bp)、血链球菌(s.sanguinis)jbd425(kacc 81058bp)、副溶血链球菌(s.parasanguinis)jbd426(kacc 81059bp)和鸡链球菌(s.gallinaceus)jbd427(kacc 81060bp)菌株所组成的组。14.本发明还提供一种用于保护神经细胞的组合物，包含选自由具有降低血氨数值效能的乳杆菌属(lactobacillus sp.)菌株、具有降低血氨数值效能的链球菌属(streptococcus sp.)菌株和所述菌株的培养物所组成的组的一种以上作为有效成分。15.在本发明中，所述用于保护神经细胞的组合物的特征在于，具有高氨血症及由此导致的神经系统疾病的预防或治疗效能。16.发明效果17.本发明的菌株和组合物由于作为神经毒性物质的氨的去除效能优异，因而具有神经细胞保护效能。附图说明18.图1和2是根据本发明的实验例1将用放射性同位素标记的氨注入鼠血液中，然后通过lc-ms/ms测量各个时间的鼠血液、胃、小肠、大肠、尿液和粪便中的氨(14nh4和15nh4)数值的结果。19.图3是在摄入根据本发明实施例1筛选发现的菌株或互利共生组合菌株的动物中诱导高氨血症后测量血氨浓度的结果(1:对照组、2:jbd301、3:jbd301+jbd421、4:jbd301+jbd422、5:jbd401、6:jbd401+jbd421、7:jbd401+jbd424、8:jbd410、9:jbd410+jbd421、10:jbd410+jbd424、11:jbd411、12:jbd411+jbd421、13:jbd411+jbd424)。20.图4是在摄入根据本发明实施例1筛选发现的菌株或互利共生组合菌株的动物中诱发高氨血症后测量脑组织中氨浓度的结果(1:对照组、2:jbd301、3:jbd301+jbd421、4:jbd301+jbd422、5:jbd401、6:jbd401+jbd421、7:jbd401+jbd424、8:jbd410、9:jbd410+jbd421、10:jbd410+jbd424、11:jbd411、12:jbd411+jbd421、13:jbd411+jbd424)。21.图5是在摄入根据本发明实施例1筛选发现的菌株或互利共生组合菌株的动物中诱发高氨血症后测量血液(a)和脑组织(b)中氨浓度的结果(a:对照组、b:jbd400、c:jbd400+jbd420、d:jbd402、e:jbd402+jbd421、f:jbd406、g:jbd406+jbd420)。22.图6的a是在本发明的[jbd411+jbd421]摄入组和[jbd301+jbd422]摄入组动物中诱发高氨血症后在脑组织内测量caspase-9/dapi染色比率(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9/dapi染色比率)并测量神经细胞凋亡程度的结果，b是示出在[jbd411+jbd421]摄入组和[jbd301+jbd422]摄入组动物中诱发高氨血症后在脑组织内进行caspase 9/dapi染色以示出神经细胞凋亡程度的代表图像(a:非处理对照组、b:高氨血症、c:高氨血症+[jbd411+jbd421]、d:高氨血症+[jbd301+jbd422])。[0023]最佳实施方式[0024]由作为神经毒性物质的氨在体内积聚而引发神经系统疾病时，使用物理方式的血液透析方法或氨吸收抑制药物，但实际上难以有效治疗。另外，这些疗法存在的问题是即无法预防在发病之前减少或调节体内的作为神经毒性物质的氨。[0025]本发明认识到现有氨去除技术的局限，如果利用去除氨功能优异的肠道内微生物来减少体内氨，则预测可以预防或治疗神经系统疾病。作为神经毒性物质的氨是氮化合物在体内代谢过程的副产物，从肠内腔被吸收进入肠毛细血管/淋巴管，然后在肝脏中转化为尿素，随尿液排出体外。与营养成分不同，氨可从肠内腔移动到肠毛细血管/淋巴管或从肠毛细血管/淋巴管移动到肠内腔，即能够进行双向移动。[0026]因此，本发明着眼于若去除肠内腔的氨则体内氨移动到肠内腔以维持化学平衡，因而体内氨数值减小这一事实，尝试了确认当摄入去除氨的肠道内微生物时可以减少体内氨以预防或治疗神经系统疾病的事实。[0027]另外，在本发明中，尝试了确认当组合使用作为除氨效能优异的菌株的同时具有相互生长促进效果的互利共生菌株(symbiotic partner)时，除氨效能增大的事实。微生物由于单细胞生物的这种特征，基因与多细胞生物相比非常小。实际上每个细菌的平均基因组大小仅不过于哺乳动物的1/1000。微生物在仅凭自身基因组来灵活适应周边环境并繁殖方面存在局限，大多数微生物偏好相互共生生活。根据本假设，本发明人首先利用超高速方法检索人体来源肠道内微生物，发掘除氨效能优异的候选菌株，然后发掘这些候选菌株的互利共生菌株(symbiotic partner)，并基于互利共生组合(symbiotic pair)饲喂各微生物，结果确认了乳杆菌属(lactobacillus sp.)除氨菌株和链球菌属(streptococcus sp.)除氨菌株的特定互利共生组合(symbiotic pair)能够具有显著优异的除氨效能。[0028]即，在本发明中，(1)通过体外(in vitro)筛选方法发掘了除氨效能优异的菌株和具有与之相互促进生长效果的互利共生菌株(symbiotic partner)，(2)当使用除氨效能优异的互利共生组合(symbiotic pair)时，极大减小了宿主体内氨浓度，(3)可以确认除氨菌株的互利共生组合(symbiotic pair)通过降低血氨来保护宿主的神经细胞，从而具有高氨血症及由此导致的神经系统疾病的预防和治疗效果。[0029]因此，本发明一方面涉及一种通过在哺乳动物体内减少氨而具有神经细胞保护效能的菌株。[0030]在本发明中，所述具有神经细胞保护效能的菌株为哺乳动物的胃肠道(gastrointestinal tract)来源微生物，只要是减小体内氨浓度而具有神经细胞保护效能的肠道内微生物，则没有被特别限制地均可包含在内，特别是可以例如作为互利共生组合(symbiotic pair)而具有优异效果的乳杆菌属(lactobacillus sp.)和链球菌属(streptococcus sp.)。[0031]所述乳杆菌属(lactobacillus sp.)可以例如但不限于棒状乳杆菌(l.coryniformis)、嗜酸乳杆菌(l.acidophilus)、食淀粉乳杆菌(l.amylovorus)、罗伊氏乳杆菌(l.reuteri)、植物乳杆菌(l.plantarum)、鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus)等，所述链球菌属(streptococcus sp.)可以例如但不限于鲁布纳链球菌(s.lubneri)、巴黎链球菌(s.lutetiensis)、澳大利亚链球菌(s.australis)、变形链球菌(s.mutans)、前庭链球菌(s.vestibularis)、血链球菌(s.sanguinis)、副溶血链球菌(s.parasanguinis)、鸡链球菌(s.gallinaceus)等。[0032]更详细地，其特征在于，所述乳杆菌属(lactobacillus sp.)菌株选自由罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)jbd301(kctc 12606bp)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)jbd400(kacc 81122bp)、食淀粉乳杆菌(lactobacillus amylovorus)jbd401(kacc 81052bp)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)jbd402(kacc 81121bp)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)jbd406(kacc 81123bp)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)jbd410(kctc 11515bp)和棒状乳杆菌(lactobacillus coryniformis)jbd411(kacc 81053bp)菌株所组成的组，所述链球菌属(streptococcus sp.)菌株选自由鲁布纳链球菌(s.lubneri)jbd420(kacc 81124bp)、巴黎链球菌(s.lutetiensis)jbd421(kacc 81054bp)、澳大利亚链球菌(s.australis)jbd422(kacc 81055bp)、变形链球菌(streptococcus mutans)jbd423(kacc 81056bp)、前庭链球菌(s.vestibularis)jbd424(kacc 81057bp)、血链球菌(s.sanguinis)jbd425(kacc 81058bp)、副溶血链球菌(s.parasanguinis)jbd426(kacc 81059bp)和鸡链球菌(s.gallinaceus)jbd427(kacc 81060bp)菌株所组成的组。[0033]所述具有神经细胞保护效能的菌株是生物制剂菌株，与现有神经细胞保护组合物相比，具有如下四种优势。[0034]第一，其为天然肠道内微生物组成，完全没有化学物质基治疗剂的副作用问题，安全性突出且有效。第二，肠道内微生物不会吸收进入体内，而是在肠内腔停留且形成菌落进行作用，因而不同于体内吸收并代谢的原有医药品，长期服用时也完全不用担心副作用从而安全性突出。第三，治疗容易且有效而不同于血液透析或肠道清洗。第四，可以安全地去除体内不断生成的作为神经毒性物质的氨，因而可以保护神经细胞来预防神经系统疾病和神经系统相关疾病。[0035]所述神经系统疾病和神经系统相关疾病可以例如但不限定于高氨血症、脑毒性、神经毒性、神经损伤、呼吸性碱血症、昏迷、呕吐、癫痫发作、肝病、脑发育障碍、智力低下、发育迟缓、脑病(encephalopathy)等。[0036]本发明另一方面涉及一种包含选自由具有降低血氨数值效能的乳杆菌属(lactobacillus sp.)菌株、具有降低血氨数值效能的链球菌属(streptococcus sp.)菌株及所述菌株的培养物所组成的组中的一种以上作为有效成分的用于保护神经细胞的组合物。[0037]优选所述乳杆菌属(lactobacillus sp.)菌株和链球菌属(streptococcus sp.)菌株为具有相互促进生长效果的互利共生菌株组合(symbiotic pair)。[0038]优选所述用于保护神经细胞的组合物包含乳杆菌属(lactobacillus sp.)菌株和链球菌属(streptococcus sp.)菌株，其中，乳杆菌属(lactobacillus sp.)菌株选自由罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)jbd301(kctc 12606bp)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)jbd400(kacc 81122bp)、食淀粉乳杆菌(lactobacillus amylovorus)jbd401(kacc 81052bp)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)jbd402(kacc 81121bp)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)jbd406(kacc 81123bp)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)jbd410(kctc 11515bp)和棒状乳杆菌(lactobacillus coryniformis)jbd411(kacc 81053bp)菌株所组成的组，所述链球菌属(streptococcus sp.)菌株选自由鲁布纳链球菌(s.lubneri)jbd420(kacc 81124bp)、巴黎链球菌(s.lutetiensis)jbd421(kacc 81054bp)、澳大利亚链球菌(s.australis)jbd422(kacc 81055bp)、变形链球菌(streptococcus mutans)jbd423(kacc 81056bp)、前庭链球菌(s.vestibularis)jbd424(kacc 81057bp)、血链球菌(s.sanguinis)jbd425(kacc 81058bp)、副溶血链球菌(s.parasanguinis)jbd426(kacc 81059bp)和鸡链球菌(s.gallinaceus)jbd427(kacc 81060bp)菌株所组成的组。[0039]在本发明中，用于保护神经细胞的组合物可以用作药学组合物或功能性食品。[0040]所述药学组合物或功能性食品中含有的菌株或所述菌株的培养物可以将体内氨浓度，即血氨浓度最大降低90％以上，所述体内可以例示血液、胃、小肠、大肠、大脑等。[0041]另外，所述药学组合物或功能性食品不特别限定，优选包含103～1012cfu/g的菌株。[0042]在本发明中，所述药学组合物可以在减小体内氨浓度而具有神经细胞保护效能的菌株或所述菌株的培养物之外进一步包括一种以上药剂学上可接受的载体并优选地制剂成药学组合物，但不限于此。[0043]在本发明中，功能性食品是在食品原目的之外附加了特定功能性的食品，保健食品、保健功能性食品、膳食补充剂等均包括在内。本发明的功能性食品所希望的功能性是神经细胞保护功能。[0044]所述功能性食品可以例如但不限于乳制品(牛奶、豆奶、加工乳)、发酵乳(液态酸奶、糊状酸奶)、补液、饮料等，所述功能性食品除所述有效成分外，还可以根据需要进一步含有多样的辅助成分。另外，在本发明的功能性食品中，饮料像通常的饮料一样，可以含有多种香味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。[0045]本发明的药学组合物或功能性食品由于含有具有除氨效能的菌株，摄入时可以减少宿主的体内氨，因而具有神经细胞保护功能性，可以预防或治疗神经系统疾病。[0046]本发明的技术思想在于，哺乳动物摄入时减小宿主体内氨浓度，只要是具有神经细胞保护功能的菌株，则均可应用，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员是不言而喻的。具体实施方式[0047]下面通过具体实验例描述本发明的基本原理和概念，通过实施例更详细描述本发明。但这些实验例和实施例只用于更具体描述本发明，本发明的范围不由这些实验例和实施例限定。[0048]实验例1：确认血氨经肠内腔排出体外而血氨是否减少的实验[0049]经消化的营养成分从肠内腔通过毛细血管和淋巴管被吸收进入人的肠道，但人的代谢产物从肠内腔移动到肠毛细血管/淋巴管或从肠毛细血管/淋巴管移动到肠内腔，即进行双向移动。特别是本发明人推测，作为体内代谢过程的副产物而生成的氨具有亲水性和疏水性这两种特性，因此可以通过被动扩散(passive diffusion)而在肠内腔与肠毛细血管/淋巴管之间相互移动。即，如果降低肠内腔中的氨数值，则体内血氨从肠毛细血管/淋巴管移动到肠内腔以维持化学平衡，这最终导致了减小血氨数值的结果。[0050]因此，本发明人通过动物实验，将用放射性同位素标记的氨注射到血液内来确认了该氨是否实际移动到肠内并排出体外。首先，将在0.9％的生理食盐水中按10mg/ml浓度溶解的15nh4cl，按250mg/kg的体重的剂量分别静脉注射到小鼠的尾部。既定时间后采集鼠血液、胃、小肠、大肠、尿液和粪便，并通过lc-ms/ms测量了每个样品中存在的氨(14nh4和15nh4)(图1和2)。[0051]上述实验显示，静脉注射到小鼠体内的血氨15nh4移动到消化器官后，随粪便和小便排出体外。即，该实验结果证明，如果去除消化器官肠内腔氨，则血氨向肠内腔移动，因而可以降低血氨数值。[0052]实验例2：与lactobacillus乳酸菌处于互利共生关系的肠道内微生物的发掘[0053]lactobacillus是人类摄入的代表性乳酸菌，具有有益人类健康的多种功能。其中之一是去除氨的功能。但是，对于普通lactobacillus菌株，降低血氨的功能非常有限，无法实际将lactobacillus用作血氨去除目的。为了解决这种问题，本发明人试图探索发掘氨去除功能优异的lactobacillus并发掘与之处于互利共生关系的微生物，并制作将这些微生物与具有氨去除功能的lactobacillus一起组合的互利共生组合(symbiotic pair)，从而可以有效降低血氨数值与脑氨数值的可能性。[0054]因此，本发明人进行了将构建于gut microbiota bank(www.gutmicrobiotabank.com)的多样种类肠道内微生物与lactobacillus菌株共同培养的实验。本发明人首先将l.acidophilus在mrs media中，在37℃/无氧条件下培养24小时，然后利用0.1od600新鲜mrs培养基稀释。将经稀释的l.acidophilus以每孔150μl分注于96孔板，然后向孔中添加多样种类的肠道内微生物24小时培养液10μl。将该混合微生物培养液在37℃/厌氧条件下培养2小时，然后测量od600，测量各肠道内微生物对l.acidophilus生长有何影响。本发明人将307种肠道微生物(species)与l.acidophilus共同培养并同时测量生长率，表1只示出该实验的一部分。其实验结果值显示，属于streptomyces属的微生物充分表现出与l.acidophilus处于互利共生关系。将表1中记述的实验，与lactobacillus属的多样species，即，l.amylovorus、l.casei、l.paracasei、l.fermentum、l.plantarum、l.reuteri、l.crispatus、l.gallinarum、l.ultunensis、l.intestinalis、l.kalixensis、l.jensenii、l.delbruecki、l.bulgaricus、l.iners、l.johnsonii、l.gasseri、l.gastricus、l.vaginalis、l.oris、l.antri、l.amylophilus、l.bifermentans、l.dextrinicus、l.farciminis、l.alimentarius、l.collinoides、l.brevis、l.parabuchneri、l.kefiri、l.buchneri、l.lindneri、l.fructivorans、l.sakei、l.graminis、l.coryniformis、pediococcus acidilactici、l.pantheri、l.rhamnosus、l.zeae、l.casei、l.mali、l.saerimneri、l.salivarius、l.agilis、l.ruminis等一同培养，然后测量生长率，结果如表1所示，排名高的值均属于streptococcus species(*标记)。该结果显示出lactobacillus与streptococcus的互利共生关系(symbiotic relationship)。[0055]【表1】[0056][0057][0058]实验例3：除氨效能优异的lactobacillus和streptococcus菌株筛选[0059]用于寻找具有优异神经细胞保护效能的互利共生组合(symbiotic pair)的筛选实验是如下实施的。以jinis有限公司旗下研究所和旗下gut microbiota bank(www.gutmicrobiotabank.com)保管的人肠道内微生物菌株库(library)中的lactobacillus和streptococcus为对象筛选体外(in vitro)除氨效能。为此，将250μl的mrs肉汤置于96孔板，然后接种试验菌株，将厌氧培养获得的新鲜培养液接种于mrs琼脂(mrs agar)，然后在37℃下厌氧培养。培养48小时后，将mrs agar中生长的菌落(colony)接种于mrs broth，然后在37℃下厌氧培养。将500μl的od600值为0.45～1的培养液移到微量离心管，然后添加10μl的氢氧化铵(30μg/ml)，在37℃下厌氧培养30分钟，然后以7000rpm在4℃下离心分离5分钟而获得上清液。对于上清液中的氨量，利用氨测定试剂盒aa0100(ammonia assay kit aa0100，sigma-aldrich公司)测量吸光度，然后将其计算为氨浓度。结果，发掘出乳杆菌和链球菌菌株中的s.lubneri jbd420、s.lutetiensis jbd421、s.australis jbd422、s.mutans jbd423、s.vestibularis jbd424、s.sanguinis jbd425、s.parasanguinis jbd426、s.gallinaceus jbd427和l.reuteri jbd301、l.reuteri jbd400、l.amylovorus jbd401、l.plantarum jbd402、l rhamnosus jbd406、l.acidophilus jbd410、l.coryniformis jbd411作为优异除氨菌株。[0060]实施例1：利用互利共生关系放大除氨效能的“降氨剂微生物新药”开发[0061]将在所述实验例2～3中通过除氨效能筛选而选拔的除氨菌株为对象，以体外(in vitro)单一菌株或互利共生组合实施了除氨效能实验。为此，将在mrs agar中生长的streptococcus候选菌株和lactobacillus候选菌株接种于mrs broth，然后在37℃下共同培养(co-culture)厌氧培养。培养至od600值达到0.45～1之间后，在250μl的streptococcus组菌株培养液和250μl的lactobacillus组菌株培养液中添加10μl的氢氧化铵(30μg/ml)，在37℃下厌氧培养30分钟，然后按7000rpm，在4℃下离心分离5分钟，获得上清液。对于氨量，利用氨测定试剂盒测量吸光度，将其计算为氨浓度。将只添加氢氧化铵且无接种培养基作为对照组，将各试验组的氨浓度计算为对照组的％，将其结果显示于表2～5中。[0062]【表2】[0063][0064][0065]在表2中，对于l.coryniformis jbd411菌株，单一菌株饲喂时，氨减少至对照组的27％，而在作为互利共生组合的[jbd411+jbd421]、[jbd411+jbd422]、[jbd411+jbd426]中显著减少至对照组的3.19％、9.17％、9.07％，表现出非常优异的除氨效能(*标识)。[0066]【表3】[0067] 氨浓度(mm)对照组的％对照组mrs103.6100.0jbd41033.232.0jbd42129.728.7jbd410+jbd4212019.3jbd42236.435.1jbd410+jbd42213.312.8jbd42322.321.5jbd410+jbd42344.242.7jbd42484.181.2jbd410+jbd42417.917.3jbd42587.784.7jbd410+jbd42532.431.3jbd42631.930.8jbd410+jbd42615.815.3jbd42737.135.8jbd410+jbd427*12.512.1[0068]在表3中，对于l.acidophilus jbd410菌株，单一菌株喂食时，氨减少至对照组的32％，而在作为互利共生组合的[jbd410+jbd422]、[jbd410+jbd427]中显著减少至对照组的12.8％和12.1％，表现出非常优异的除氨效能(*标识)。[0069]【表4】[0070][0071][0072]在表4中，对于l.amylovorus jbd401菌株，单一菌株喂食时，氨减少至对照组的38％，而在作为互利共生组合的[jbd401+jbd421]、[jbd401+jbd422]、[jbd401+jbd424]中显著减少至对照组的8.2％、14.19％、9.46％，表现出非常优异的除氨效能(*标识)。[0073]【表5】[0074] 氨浓度(mm)对照组的％对照组mrs103.6100jbd30127.226.25jbd42129.728.67jbd301+jbd42117.416.80jbd42236.435.14jbd301+jbd422*8.58.25jbd42322.321.53jbd301+jbd42320.119.45jbd42484.181.18jbd301+jbd42442.040.54jbd42587.784.65jbd301+jbd42537.936.58jbd42631.930.79jbd301+jbd42627.326.35jbd42737.135.81jbd301+jbd42722.822.01[0075]在表5中，对于l.reuteri jbd301菌株，单一菌株喂食时，氨减少至对照组的26％，而在作为互利共生组合的[jbd301+jbd421]、[jbd301+jbd422]、[jbd301+jbd423]中显著减少至对照组的16.8％、8.25％和19.45％，表现出非常优异的除氨效能(*标识)。[0076]另外，在jinis有限公司旗下研究所和gut microbiota bank中继续筛选的结果，作为具有与已发掘jbd菌株同样地优异除氨效能的乳杆菌和互利共生组合，进一步发掘出除氨效能得到提高的链球菌候选菌株。进一步发掘的菌株也以与所述实验例相同方法进行除氨效能实验，结果如下。[0077]【表6】[0078][0079]在表6中，对于l.reuteri jbd400、l.plantarum jbd402、l.rhamnosus jbd406菌株，单一菌株喂食时，氨分别减少至对照组的35％、37％、40％，而在作为互利共生组合的[jbd400+jbd420]、[jbd402+jbd421]、[jbd406+jbd420]中分别显著减少至对照组的11.6％、26.7％和18.0％，表现出非常优异的除氨效能(*标识)。[0080]实施例2：具有除氨效能的菌株的鉴定和保藏[0081]针对在实施例1中确认为除氨效能优异的lactobacillus菌株，实施精密的16s rrna基因分析。为此，从在mrs培养基中厌氧培养的菌株培养液中提取dna后，为了16s rdna扩增，在pcr中在95℃下变性(denaturation)5分钟后，按95℃30秒、52℃45秒、72℃2分钟的条件扩增30次，然后在72℃下处理10分钟，测序来进行确认。pcr引物使用通用引物(序列号1和2)。[0082][序列号1]27f:5'-aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3'[0083][序列号2]1492r:5'-ggt tac ctt gtt acg act t-3'[0084]利用测序确认的菌株的16s rdna序列来检索ncbi genbank、dna data bank of japan、european nucleotide archive，结果确认了食淀粉乳杆菌(l.amylovorus)jbd401菌株(kacc 81052bp)和棒状乳杆菌(l.coryniformis)jbd411菌株(kacc 81053bp)为新种，于2017年8月25日送交国立农业科学院韩国典型培养物保藏中心保藏。[0085]另外，对于在实施例1中确认为除氨效能优异的streptococcus菌株，也通过如上方法实施了精密的16s rrna基因分析。利用测序确认的菌株的16s rdna序列来检索ncbi genbank、dna data bank of japan、european nucleotide archive，结果确认巴黎链球菌(s.lutetiensis)jbd421菌株(kacc 81054bp)、澳大利亚链球菌(s.australis)jbd422菌株(kacc 81055bp)、变形链球菌(s.mutans)jbd423菌株(kacc 81056bp)、前庭链球菌(s.vestibularis)jbd424菌株(kacc 81057bp)、血链球菌(s.sanguinis)jbd425菌株(kacc 81058bp)、副溶血链球菌(s.parasanguinis)jbd426菌株(kacc 81059bp)、鸡链球菌(s.gallinaceus)jbd427菌株(kacc 81060bp)为新种，于2017年11月30日送交国立农业科学院韩国典型培养物保藏中心(kacc)保藏。[0086]另外，进一步发掘的罗伊氏乳杆菌(l.reuteri)jbd400(kacc 81122bp)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)jbd402(kacc 81121bp)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)jbd406(kacc 81123bp)、鲁布纳链球菌(s.lubneri)jbd420(kacc 81124bp)也确认为新种，于2020年7月7日送交国立农业科学院韩国典型培养物保藏中心(kacc)保藏。[0087]实施例3：通过动物实验评价具有除氨效能菌株的神经细胞保护效能[0088]为了评价通过除氨效能筛选得到的候选菌株的神经细胞保护效能而实施了动物实验。为了准备用于动物实验的菌体粉，将候选菌株的mrs培养液离心分离而得到菌体，然后在其中添加脱脂奶粉和蔗糖各10％，经冻干而制备菌体粉。[0089]所有动物实验均按照动物管理和利用委员会(institutional animal care and use committee)规定实施。将每10只4周龄icr雄性小鼠放入一个笼子(cage)，第一周期间自由喂食饲料(10％脂肪；d12450b；research diets公司，美国新泽西州新不伦瑞克)和水。在实验期间，间隔12小时变换昼夜照明，一定地保持温度22℃、湿度55±5％。一周后随机将鼠分成对照组或实验组。对照组喂食普通饲料，实验组是将除氨菌株作为单粉或互利共生组合，按1×107cfu/天，追加喂食7天的。最后一天，鼠尾静脉注射15nh4cl，剂量为100mg/kg，诱发高氨血症(hyperammonemia)。1小时后采集血液并分离大脑。血液离心后，取上清液，测定氨浓度，将结果显示于表7和图3。[0090]【表7】[0091]no菌株血氨(μg/ml)对照组的％1对照组5.32±0.97100.02jbd3012.69±1.0650.63jbd301+jbd4210.88±0.6416.5*4jbd301+jbd4220.79±0.7214.8*5jbd4012.91±0.5954.76jbd401+jbd4210.75±0.2514.1*7jbd401+jbd4240.43±0.248.1*8jbd4102.49±0.3446.89jbd410+jbd4211.27±0.3223.910jbd410+jbd4241.19±0.4222.411jbd4112.26±0.3242.512jbd411+jbd4210.37±0.117.0*13jbd411+jbd4240.84±0.4615.8[0092]如表7和图3所示，摄入乳杆菌jbd301、乳杆菌jbd401、乳杆菌jbd410、乳杆菌jbd411菌株的鼠的血氨减小为对照组42％～50％水平。与试管实验一样，在体内(in vivo)动物实验中也可以确认，乳杆菌/链球菌互利共生组合(symbiotic pair)中的血内除氨效能非常优异，在[jbd301+jbd421]、[jbd301+jbd422]、[jbd411+jbd421]、[jbd401+jbd424]摄入组中血氨相比对照组减少80～90％以上。[0093]另外，为了定量分析脑组织内的氨，将分离的脑进行粉碎，离心分离，然后取上清液，测量氨浓度，将其结果显示于表8和图4。[0094]【表8】[0095]no菌株脑中氨(μg/g)对照组的％1对照组2.65±0.56100.02jbd3011.35±0.3350.93jbd301+jbd4210.64±0.4624.24jbd301+jbd4220.26±0.479.8*5jbd4011.00±0.4637.76jbd401+jbd4210.42±0.2315.87jbd401+jbd4240.38±0.2414.3*8jbd4101.74±0.6365.79jbd410+jbd4210.43±0.1918.1*10jbd410+jbd4241.05±0.6439.611jbd4111.55±0.2058.512jbd411+jbd4210.22±0.188.3*13jbd411+jbd4240.65±0.5424.5[0096]如表8和图4所示，摄入乳杆菌jbd301、乳杆菌jbd401、乳杆菌jbd410、乳杆菌jbd411菌株时，脑组织内氨浓度减少为对照组的16％～65％水平。在脑组织除氨效能方面，也可以确认乳杆菌/链球菌互利共生组合(symbiotic pair)非常优异，在[jbd301+jbd422]、[jbd401+jbd424]、[jbd410+jbd421]、[jbd411+jbd421]摄入组中脑组织内氨相对于对照组减少80～90％以上。[0097]另外，针对进一步发掘的乳杆菌jbd400、乳杆菌jbd402、乳杆菌jbd406及分别与他们互利共生的链球菌jbd420、链球菌jbd421菌株后，也以与所述描述相同的方法，通过体内(in vivo)动物实验进行了神经细胞保护效能评价，并将血液和脑组织中的氨测量结果显示于图5。同样地，相比于乳杆菌菌株和链球菌菌株单一培养，再互利共生(symbiotic pair)组合表现出优异的除氨效能。尤其是可以确认，对于最优异的[jbd400+jbd420]摄入组，血液和脑组织内氨相比于对照组减少80％以上。[0098]为了对除氨菌株的神经细胞保护效能进行图像分析，使用冷冻切片机(cryotome，thermo scientific公司)制备脑组织片段，用dapi染色后，用caspase试剂盒(flicatm，荧光标记的caspase抑制剂)进行分析，并利用荧光显微镜(尼康公司)进行观察，将其部分结果显示于表9和图6。[0099]【表9】[0100][0101]如表9和图6所示，相比于正常对照组(a)，在高氨血症对照组(b)中caspase 9染色的细胞比率相比于dapi染色的正常细胞显著增加，由此可知由于氨神经毒性而发生细胞凋亡(apoptosis)。但是，可以确认，在摄入[jbd411+jbd421]的实验组(c)中，相比于高氨血症对照组，caspase 9染色的细胞比率减少80％以上，在摄入[jbd301+jbd422]的实验组(d)中，相比于高氨血症诱导组，caspase 9染色的细胞比率减少70％以上。[0102]因此，确认了本发明的菌株可以减少哺乳动物体内氨，因而可以预防或治疗高氨血症，具有神经细胞保护效能，因而可以有用地用于神经系统疾病的预防和治疗。[0103]【工业实用性】[0104]本发明的菌株和组合物由于作为神经毒性物质的氨的去除效能优异，因而具有神经细胞保护效能，可以广泛用于高氨血症及由此导致的神经系统疾病的预防或治疗剂。[0105][0106][0107][0108][0109][0110][0111][0112][0113][0114][0115][0116][0117][0118][0119][0120][0121][0122][0123]









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