包含达拉菲尼、ERK抑制剂和RAF抑制剂的三重药物组合的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术包含达拉菲尼、erk抑制剂和raf抑制剂的三重药物组合技术领域1.本发明涉及药物组合，该药物组合包含：2.(i).达拉菲尼或其药学上可接受的盐、erk抑制剂(erki)例如4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(“化合物a(compound a或compound a)”)或其药学上可接受的盐、和raf抑制剂例如n-(3-(2-(2-羟基乙氧基)-6-吗啉代吡啶-4-基)-4-甲基苯基)-2-(三氟甲基)-异烟酰胺(“化合物c”)或其药学上可接受的盐；或3.(ii).达拉菲尼或其药学上可接受的盐、erk抑制剂(erki)例如4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(“化合物a(compound a或compound a)”)或其药学上可接受的盐、和pd-1抑制剂例如斯巴达珠单抗；以及包含该药物组合的药物组合物；包含该药物组合的商业包装；以及在治疗或预防其中mapk途径抑制是有益的病症中、例如在治疗癌症中使用此类组合和组合物的方法。本发明还提供了此类组合，用于在此类病症或癌症(包括结直肠癌(crc)，例如braf功能获得性结直肠癌)的治疗中使用。背景技术：4.mapk途径是驱动细胞增殖、分化和存活的关键信号传导级联。此途径的失调是许多肿瘤发生实例的基础。mapk途径的异常信号传导或不当活化已显示于多种肿瘤类型中，并且可以通过几种不同的机制发生，包括活化ras和braf中的突变。mapk途径频繁在人类癌症中发生突变，其中kras突变和braf突变是最常见的(大约30％)。已在所有癌症的9％-30％中检测到ras突变，特别是功能获得性突变，其中kras突变的患病率最高(86％)。5.胞外信号调节激酶(erk)是一类涉及传送细胞外信号到细胞和亚细胞器的信号传导激酶。erk1和erk2参与调节大范围的活动，并且已知erk1/2级联的失调会导致多种疾病，包括神经变性疾病、发育疾病、糖尿病和癌症。erk1/2在癌症中的作用是被特别关注的，因为在erk1/2信号传导级联中活化其上游的突变被认为是所有癌症半数以上的原因。此外，过度的erk1/2活性也在癌症中被发现，其中上游组件没有突变，这表明erk1/2信号传导即使是在没有突变活化的癌症中也在致癌作用中起作用。erk途径也显示出控制肿瘤细胞的迁移和侵袭，并且因此与转移有关。6.程序性死亡1(pd-1)蛋白是t细胞调节子的扩展的cd28/ctla-4家族的抑制性成员。已经鉴定出pd-1的两种配体pd-l1(b7-h1)和pd-l2(b7-dc)，已经证实两者在结合pd-1时下调t细胞活化。pd-l1在多种人癌症中大量存在。pd-1被认为是负调节tcr信号的免疫抑制性蛋白。pd-1和pd-l1之间的相互作用可以充当免疫检查点，所述相互作用可以导致例如肿瘤浸润性淋巴细胞的减少、t细胞受体介导的增殖的减少和/或癌细胞的免疫逃避。通过抑制pd-1与pd-l1或pd-l2的局部相互作用可以逆转免疫抑制；当pd-1与pd-l2的相互作用被阻断时，效果也是累加的。7.鉴于免疫检查点途径在调节免疫应答中的重要性，需要开发新的活化免疫系统的组合疗法。患有某些癌症的患者的预后仍然差。对治疗的抗性经常发生，并且不是所有患者都对可用治疗有应答。例如，患有braf突变的晚期结直肠癌患者的中位生存期少于12个月。因此，重要的是为患有癌症的患者开发新的疗法以达到更好的临床结果。还需要具有更好的耐受性和/或提供持久的抗肿瘤应答的治疗选择。技术实现要素：8.本发明(i)达拉菲尼、erk-抑制剂(例如化合物a)、和raf-抑制剂(例如化合物c)；或(ii)达拉菲尼、erk-抑制剂(例如化合物a)、和pd-1抑制剂(例如斯巴达珠单抗)的三重组合可以用作用于治疗由mapk途径的异常活性引起的疾病或障碍的疗法，该疾病或障碍包括但不限于乳腺癌、胆管癌、唾液腺癌、结直肠癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和甲状腺癌。达拉菲尼、erk-抑制剂(例如化合物a)、和raf-抑制剂(例如化合物c)，或者达拉菲尼、erk-抑制剂(例如化合物a)、和pd-1抑制剂(例如斯巴达珠单抗)的三重组合特别是用于治疗braf功能获得性或brafv600e/d/k突变型结直肠癌(crc)，包括晚期或转移性结直肠癌。9.本发明提供了包含以下的药物组合：10.(a)n-(3-(5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-(叔丁基)噻唑-4-基)-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺(达拉菲尼)或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：[0011][0012](b)4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(化合物a)或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：[0013]和[0014](c)n-(3-(2-(2-羟基乙氧基)-6-吗啉代吡啶-4-基)-4-甲基苯基)-2-(三氟甲基)-异烟酰胺(化合物c)或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：[0015][0016]本发明提供了包含以下的药物组合：[0017](a)n-(3-(5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-(叔丁基)噻唑-4-基)-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺(达拉菲尼)或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：[0018][0019](b)4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(化合物a)或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：[0020]和[0021](c)pd-1抑制剂。[0022]在本发明的另一个方面，pd-1抑制剂选自pdr001(斯巴达珠单抗；诺华公司(novartis))、纳武单抗(百时美施贵宝公司(bristol-myers squibb))、派姆单抗(默克公司(merck&co))、匹地利珠单抗(医好科技公司(curetech))、medi0680(米迪缪尼公司(medimmune))、regn2810(再生元公司(regeneron))、tsr-042(泰萨罗公司(tesaro))、pf-06801591(辉瑞制药公司(pfizer))、bgb-a317(百济神州公司(beigene))、bgb-108(百济神州公司)、incshr1210(因赛特公司(incyte))、或amp-224(安普利穆尼公司(amplimmune))。[0023]在本发明的另一个方面，pd-1抑制剂是pdr001(斯巴达珠单抗)。[0024](i)达拉菲尼或其药学上可接受的盐、化合物a或其药学上可接受的盐、和化合物c或其药学上可接受的盐的药物组合，或者(ii)达拉菲尼或其药学上可接受的盐、化合物a或其药学上可接受的盐、和pd-1抑制剂例如斯巴达珠单抗的药物组合在本文中也称为“本发明的组合”。[0025]提供了本发明的组合，用于在癌症的治疗中使用，例如，用于在选自以下的癌症中使用：乳腺癌、胆管癌、唾液腺癌、结直肠癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和甲状腺癌。[0026]提供了(i)达拉菲尼或其药学上可接受的盐、化合物a或其药学上可接受的盐、和化合物c或其药学上可接受的盐的药物组合，或者(ii)达拉菲尼或其药学上可接受的盐、化合物a或其药学上可接受的盐、和pd-1抑制剂例如斯巴达珠单抗的药物组合，例如，用于在选自以下的癌症中使用：乳腺癌、胆管癌、唾液腺癌、结直肠癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和甲状腺癌。[0027]还提供了(i)达拉菲尼或其药学上可接受的盐、化合物a或其药学上可接受的盐、和化合物c或其药学上可接受的盐的组合，或者(ii)达拉菲尼或其药学上可接受的盐、化合物a或其药学上可接受的盐、pd-1抑制剂例如斯巴达珠单抗的组合，用于在braf功能获得性或brafv600e/d/k突变型结直肠癌(其包括晚期或转移性结直肠癌)的治疗中使用。[0028]本文还提供了本发明的组合，用于在braf功能获得性或brafv600e/d/k突变型结直肠癌(其包括晚期或转移性结直肠癌)的治疗中使用。[0029]在本发明的组合的另一个实施例中，达拉菲尼或其药学上可接受的盐、化合物a或其药学上可接受的盐、以及化合物c或其药学上可接受的盐是在同一配制品中。[0030]在本发明的组合的另一个实施例中，达拉菲尼或其药学上可接受的盐、化合物a或其药学上可接受的盐、以及化合物c或其药学上可接受的盐是在分开的配制品中。[0031]在另一个实施例中，本发明的组合用于同时或依序(以任何顺序)施用。[0032]在另一个实施例中，本发明提供了用于治疗有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本发明的组合。[0033]在所述方法的另一个实施例中，所述癌症选自乳腺癌、胆管癌、唾液腺癌、结直肠癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和甲状腺癌。[0034]在另一个实施例中，本发明提供了本发明的组合，用于在制造治疗选自以下的癌症的药物中使用：乳腺癌、胆管癌、唾液腺癌、结直肠癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和甲状腺癌。[0035]在另一个实施例中，提供了包含本发明的组合的药物组合物或商业包装(例如，成套试剂盒)。[0036]在另一个实施例中，药物组合物进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。附图说明[0037]图1：在ht29肿瘤细胞植入后第26天，将小鼠随机化到治疗组中。治疗在肿瘤细胞植入后第26天开始并持续至第39天。在随机分组时收集肿瘤尺寸和体重，之后在研究持续时间内每周收集两次。相对于随机化后天数，绘制的肿瘤体积(a)或从治疗组起始的体重变化百分比(b)。在第39天使用单因素方差分析(anova)tukey多重比较测验计算肿瘤体积变化的显著差异(n＝9只小鼠/组)(对于达拉菲尼+化合物a+曲美替尼治疗组相对于媒介物、单一药剂和双重组合，p《0.05)。[0038]图2：在ht29肿瘤细胞移植后第28天，将小鼠随机化到治疗组中。治疗在肿瘤细胞植入后第28天开始并持续至第52天。在随机分组时收集肿瘤尺寸和体重，之后在研究持续时间内每周收集两次。相对于随机化后天数，绘制的肿瘤体积(a)或从治疗组起始的体重变化百分比(b)。在第52天使用单因素方差分析(anova)tukey多重比较测验计算显著差异(n＝7只小鼠/组，除未经治疗对照组n＝4)(对于两种组合治疗组相对于非治疗对照组，p《0.0001)。[0039]图3：在hcox1329肿瘤植入后第12天，将小鼠随机化到治疗组中。治疗在肿瘤植入后第12天开始并持续至第38天(媒介物)、第62天(达拉菲尼+化合物a+曲美替尼)、或第67天(达拉菲尼+曲美替尼和达拉菲尼+曲美替尼+西妥昔单抗)。在随机分组时收集肿瘤尺寸和体重，之后在研究持续时间内每周收集两次。相对于随机化后天数，绘制的肿瘤体积(a)或从治疗组起始的体重变化百分比(b)。在第38天使用单因素方差分析(anova)tukey多重比较测验计算显著差异(n＝5只小鼠/组，除达拉菲尼+化合物a+曲美替尼组n＝4)(对于达拉菲尼+化合物a+曲美替尼相对于达拉菲尼+曲美替尼，p＝0.005；以及对于达拉菲尼+化合物a+曲美替尼相对于达拉菲尼+曲美替尼+西妥昔单抗p＝0.04)。[0040]说明书[0041]除非另外说明，否则上文和下文中使用的通用术语优选在本披露的上下文中具有以下含义，其中无论在什么情况下使用的更通用的术语可以彼此独立地由更具体的定义代替或保留，从而定义本发明的更详细实施例：[0042]“达拉菲尼”是n-(3-(5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-(叔丁基)噻唑-4-基)-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺，能够在v600抑制braf(v600e)、braf(v600k)和braf(v600g)突变的突变的braf的选择性抑制剂(也称为n-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺；和n-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺，甲磺酸盐)。[0043]“西妥昔单抗”是表皮生长因子受体(egfr)抑制剂用于治疗转移性结直肠癌、转移性非小细胞肺癌和头颈癌。西妥昔单抗是靶向表皮生长因子受体的igg1单克隆抗体，已批准与伊立替康组合使用或作为治疗转移性crc的单一疗法。西妥昔单抗是通过静脉内输注给予的嵌合(小鼠/人)单克隆抗体。[0044]化合物a是细胞外信号调节激酶(erk)1/2的抑制剂。“化合物a”是4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺。化合物a的特别优选的盐是其盐酸盐。[0045]“化合物c”(n-(3-(2-(2-羟基乙氧基)-6-吗啉代吡啶-4-基)-4-甲基苯基)-2-(三氟甲基)异烟酰胺)是braf和craf蛋白激酶的atp竞争性抑制剂。[0046]术语pd-1抑制剂包括pdr001。pdr001也称为斯巴达珠单抗(抗pd-1抗体分子)，如2015年7月30日公布的题为“antibody molecules to pd-1and uses thereof[pd-1的抗体分子及其用途]”的us 2015/0210769(将其通过引用以其全文并入)中所述的。[0047]另外的抗pd-1抗体分子包括以下：[0048]纳武单抗(百时美施贵宝公司)，也称为mdx-1106、mdx-1106-04、ono-4538、bms-936558或纳武单抗(克隆5c4)和其他抗pd-1抗体披露于us 8,008,449和wo 2006/121168(将其通过引用以其全文并入)中；[0049]派姆单抗(默克公司)，也称为帕博利珠单抗(lambrolizumab)、mk-3475、mk03475、sch-900475或派姆单抗和其他抗pd-1抗体披露于hamid,o.等人(2013)new england journal of medicine[新英格兰医学杂志]369(2):134–44；us 8,354,509和wo 2009/114335中，将其通过引用以其全文并入；[0050]匹地利珠单抗(医好科技公司),也称为ct-011。匹地利珠单抗和其他抗pd-1抗体披露于rosenblatt,j.等人,(2011)j immunotherapy[免疫疗法杂志]34(5):409-18，us 7,695,715，us 7,332,582和us 8,686,119(将其通过引用以其全文并入)中；[0051]medi0680(米迪缪尼公司)，也称为amp-514。medi0680和其他抗pd-1抗体披露于us 9,205,148和wo 2012/145493(将其通过引用以其全文并入)中；[0052]amp-224(b7-dcig(安普利穆尼公司))，例如，披露于wo 2010/027827和wo 2011/066342(将其通过引用以其全文并入)中；[0053]regn2810(再生元公司)；pf-06801591(辉瑞制药公司)；bgb-a317或bgb-108(百济神州公司)；incshr1210(因赛特公司)也称为incshr01210或shr-1210；tsr-042(泰萨罗公司)，也称为anb011；以及其他已知的抗pd-1抗体，包括描述于例如以下中的那些：wo 2015/112800、wo 2016/092419、wo 2015/085847、wo 2014/179664、wo 2014/194302、wo 2014/209804、wo 2015/200119、us 8,735,553、us 7,488,802、us 8,927,697、us 8,993,731、和us 9,102,727(将其通过引用以其全文并入)。[0054]如本文所用的，术语“受试者”或“患者”旨在包括易于患有癌症或任何障碍(直接或间接涉及癌症)或受其折磨的动物。受试者的实例包括哺乳动物，例如人、猿、猴、狗、乳牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在一个实施例中，受试者是人，例如患有癌症、具有患癌症的风险或可能易于患有癌症的人。[0055]如本文所用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括解除、减轻或缓解受试者的至少一种症状或者实现疾病进展延迟的治疗。例如，治疗可以是减弱障碍的一种或几种症状或者完全根除障碍(如癌症)。在本披露的含义范围内，术语“治疗”还表示阻止、延迟发作(即在疾病的临床表现之前的时间段)和/或降低疾病发展或疾病恶化的风险。[0056]除非另外指明，否则术语“包含”和“包括”在本文中以其开放式和非限制性的含义使用。[0057]除非本文另外指明或明显与上下文矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个”、“一种”和“所述”以及类似的指示词应当被解释为涵盖单数和复数这两者。当将复数形式用于化合物、盐等时，这也意指单一化合物、盐等。[0058]“组合”或“与……组合”或“与……共同施用”等并不旨在暗示必须物理混合或同时施用疗法或治疗剂和/或配制这些治疗剂用于一起递送，尽管这些递送方法在本文所述的范围内。这些组合中的治疗剂可以与一种或多种其他另外的疗法或治疗剂同时、在其之前或之后施用。这些治疗剂或治疗方案可以以任何顺序施用。通常，每种药剂将以针对所述药剂确定的剂量和/或日程表施用。还应理解，该组合中使用的另外的治疗剂可以按单一组合物一起施用或按不同组合物单独施用。通常，预期组合中使用的其他治疗剂的以不超过它们单独使用时的水平使用。在一些实施例中，组合中使用的水平将低于单一药剂疗法中使用的水平。[0059]当将本文中的剂量(dosage或dose)描述为“约”指定量时，实际剂量(dosage或dose)可以从所述量变化高达10％，例如5％：这种“约”的使用承认，给定剂量或剂型中的精确量可能由于多种原因而与预期量略有不同，但不会实质上影响所给予化合物的体内作用。技术人员将理解，当本文引用治疗化合物的剂量(dosage或dose)时，该量是指游离形式或非溶剂化形式的治疗化合物的量。[0060]如本文所用的短语“治疗有效量”是指包含本发明化合物的化合物、材料或组合物的量，其对于在动物(包括人)中的至少一个细胞亚群中以适用于任何医学治疗的合理的受益/风险比产生一些所期望的治疗效果是有效的。[0061]本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围，适合用于与人和动物的组织接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题或并发症，同时具有相称的合理受益/风险比的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。[0062]本发明的组合(达拉菲尼、化合物a和化合物c或斯巴达珠单抗)还旨在表示化合物的未经标记的形式以及化合物的同位素标记形式。同位素标记的化合物的一个或多个原子被具有选定原子质量或质量数的原子取代。可以掺入达拉菲尼、化合物a和化合物c或斯巴达珠单抗的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，例如，分别是2h、3h、11c、13c、14c、15n、18f、31p、32p、35s、36cl、123i、124i、125i。本发明包括同位素标记的达拉菲尼、化合物a和化合物c或斯巴达珠单抗，例如其中存在放射性同位素(如3h和14c)或非放射性同位素(如2h和13c)。同位素标记的达拉菲尼、化合物a和化合物c或斯巴达珠单抗可用于代谢研究(用14c)、反应动力学研究(例如用2h或3h)、检测或成像技术，例如正电子发射断层扫描(pet)或单光子发射计算机断层扫描(spect)，包括药物或底物组织分布测定，或用于患者的放射治疗。特别地，用18f标记的达拉菲尼、化合物a或化合物c或斯巴达珠单抗对于pet或spect研究可能是特别理想的。本发明的同位素标记的化合物通常可通过本领域技术人员已知的常规技术或与在使用适当的同位素标记的试剂的所附实例中所述的那些类似的方法来制备。[0063]此外，用较重的同位素，特别是氘(即，2h或d)取代可以提供来源于更大的代谢稳定性(例如，体内半衰期延长或剂量需求减少或治疗指数改善)的某些治疗优点。应当理解，在此上下文中，氘被认为是达拉菲尼、化合物a或化合物c或斯巴达珠单抗的取代基。这种较重的同位素(特别是氘)的浓度可以由同位素富集因子来定义。如本文所用的术语“同位素富集因子”是指同位素丰度与指定同位素的天然丰度之间的比率。如果达拉菲尼、化合物a或化合物c或斯巴达珠单抗中的取代基指示氘，这种化合物具有针对每个指定的氘原子的同位素富集因子为至少3500(在每个指定的氘原子上52.5％氘掺入)、至少4000(60％氘掺入)、至少4500(67.5％氘掺入)、至少5000(75％氘掺入)、至少5500(82.5％氘掺入)、至少6000(90％氘掺入)、至少6333.3(95％氘掺入)、至少6466.7(97％氘掺入)、至少6600(99％氘掺入)、或至少6633.3(99.5％氘掺入)。具体实施方式[0064]达拉菲尼是具有raf抑制活性的口服生物可利用的小分子。化合物a是具有erk抑制活性的口服生物可利用的小分子。其是细胞外信号调节激酶1和2(erk 1/2)的抑制剂。化合物c是具有b/c-raf抑制活性的口服生物可利用的小分子。斯巴达珠单抗是一种高亲和力的配体阻断人源化抗程序性死亡1(pd-1)igg4抗体，可阻断程序性死亡配体1(pd-l1)和程序性死亡配体2(pd-l2)与pd-1的结合。[0065]在一个实施例中，关于本发明的药物组合是包含以下的药物组合：n-(3-(5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-(叔丁基)噻唑-4-基)-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺(达拉菲尼)、或其药学上可接受的盐；4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(化合物a)、或其药学上可接受的盐；和n-(3-(2-(2-羟基乙氧基)-6-吗啉代吡啶-4-基)-4-甲基苯基)-2-(三氟甲基)-异烟酰胺(化合物c)、或其药学上可接受的盐。[0066]在另一个实施例中，将n-(3-(5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-(叔丁基)噻唑-4-基)-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺(达拉菲尼)或其药学上可接受的盐、4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(化合物a)或其药学上可接受的盐、和n-(3-(2-(2-羟基乙氧基)-6-吗啉代吡啶-4-基)-4-甲基苯基)-2-(三氟甲基)-异烟酰胺(化合物c)或其药学上可接受的盐分开地、同时地或以任何顺序依序地施用。[0067]在另一个实施例中，药物组合用于口服施用。[0068]在药物组合的另一个实施例中，n-(3-(5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-(叔丁基)噻唑-4-基)-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺(达拉菲尼)呈口服剂型。[0069]在药物组合的另一个实施例中，4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(化合物a)呈口服剂型。[0070]在药物组合的另一个实施例中，n-(3-(2-(2-羟基乙氧基)-6-吗啉代吡啶-4-基)-4-甲基苯基)-2-(三氟甲基)-异烟酰胺(化合物c)呈口服剂型。[0071]在另一个实施例中是一种药物组合物或商业包装，所述药物组合物或商业包装包含(上述实施例中任一项所述的)药物组合，和至少一种药学上可接受的载剂。[0072]在另一个实施例中是药物组合(如在上述实施例中任一项所述)或药物组合物或商业包装(如在上述实施例中所述)用于在治疗癌症中使用。[0073]在另一个实施例中，所述癌症选自乳腺癌、胆管癌、结直肠癌(crc)、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和甲状腺癌。[0074]在另一个实施例中，所述癌症是晚期或转移性结直肠癌。[0075]在另一个实施例中，所述癌症是braf功能获得性crc或braf v600e、v600d或v600k crc。[0076]在另一个实施例中是根据上述实施例中任一项所述的药物组合或根据上述实施例所述的药物组合物或商业包装用于制造治疗癌症的药物的用途。[0077]在另一个实施例中，所述癌症选自乳腺癌、胆管癌、结直肠癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和甲状腺癌，任选地其中所述癌症是晚期或转移性结直肠癌，任选地其中所述癌症是braf功能获得性crc或braf v600e、v600d或v600k crc。[0078]在另一个实施例中是治疗选自乳腺癌、胆管癌、结直肠癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和甲状腺癌的癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用上述实施例中任一项所述的药物组合或商业包装或根据上述实施例所述的药物组合物。[0079]在另一个实施例中，所述结直肠癌是晚期或转移性结直肠癌。[0080]在另一个实施例中，所述结直肠癌是braf功能获得性crc或braf v600e、v600d或v600k crc。[0081]在另一个实施例中，以约从约1至约150mg/天(例如，1、2、5、10、50、100或150mg/天)的剂量口服施用n-(3-(5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-(叔丁基)噻唑-4-基)-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺(达拉菲尼)。[0082]在另一个实施例中，以75mg bid的剂量口服施用n-(3-(5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-(叔丁基)噻唑-4-基)-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺(达拉菲尼)。[0083]在另一个实施例中，以从约50至约200mg/天的剂量(例如，以约50、75、100、125、150、175或200mg/天的剂量)口服施用4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(化合物a)。[0084]在另一个实施例中，以100mg qd的剂量口服施用4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(化合物a)。[0085]在另一个实施例中，以200mg qd的剂量口服施用4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(化合物a)。[0086]在另一个实施例中，以从约100mg/天、或200mg/天、或300mg/天至约400mg/天的剂量口服施用n-(3-(2-(2-羟基乙氧基)-6-吗啉代吡啶-4-基)-4-甲基苯基)-2-(三氟甲基)-异烟酰胺(化合物c)。[0087]在另一个实施例中，以200mg bid的剂量口服施用n-(3-(2-(2-羟基乙氧基)-6-吗啉代吡啶-4-基)-4-甲基苯基)-2-(三氟甲基)-异烟酰胺(化合物c)。[0088]在一个实施例中，关于本发明的药物组合是包含以下的药物组合：n-(3-(5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-(叔丁基)噻唑-4-基)-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺(达拉菲尼)、或其药学上可接受的盐；4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(化合物a)、或其药学上可接受的盐；和pd-1抑制剂、或其药学上可接受的盐。[0089]在另一个实施例中，将n-(3-(5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-(叔丁基)噻唑-4-基)-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺(达拉菲尼)或其药学上可接受的盐、4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(化合物a)或其药学上可接受的盐、和pd-1抑制剂或其药学上可接受的盐分开地、同时地或以任何顺序依序地施用。[0090]在另一个实施例中，pd-1抑制剂是抗pd-1抗体分子。[0091]在另一个实施例中，pd-1抑制剂是抗pd-1抗体分子，如2015年7月30日公布的题为“antibody molecules to pd-1and uses thereof[pd-1的抗体分子及其用途]”的us 2015/0210769(将其通过引用以其全文并入)中所述的。在一些实施例中，抗pd-1抗体分子是bap049-克隆e或bap049-克隆b。[0092]在另一个实施例中，抗pd-1抗体分子是斯巴达珠单抗(pdr001)。[0093]在一个实施例中，抗pd-1抗体分子包含来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个互补决定区(cdr)(或总体上全部cdr)，所述重链和轻链可变区包含表1(例如，来自表1中披露的bap049-克隆-e或bap049-克隆-b的重链和轻链可变区序列)中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施例中，cdr根据卡巴特(kabat)定义(例如，如表1中所列出的)。在一些实施例中，cdr根据乔西亚(chothia)定义(例如，如表1中所列出的)。在一些实施例中，cdr根据卡巴特和乔西亚两者的组合cdr定义(例如，如表1中所列出的)。在一个实施例中，vh cdr1的卡巴特和乔西亚cdr的组合包含氨基酸序列gytfttywmh(seq id no:541)。在一个实施例中，相对于表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，cdr中的一种或多种(或总体上全部cdr)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)或缺失。[0094]在一个实施例中，抗pd-1抗体分子包含：含有seq id no:501的vhcdr1氨基酸序列、seq id no:502的vhcdr2氨基酸序列、和seq id no:503的vhcdr3氨基酸序列的重链可变区(vh)；以及含有seq id no:510的vlcdr1氨基酸序列、seq id no:511的vlcdr2氨基酸序列、和seq id no:512的vlcdr3氨基酸序列的轻链可变区(vl)，各自披露于表1中。[0095]在一个实施例中，抗体分子包含：含有由seq id no:524的核苷酸序列编码的vhcdr1、由seq id no:525的核苷酸序列编码的vhcdr2、和由seq id no:526的核苷酸序列编码的vhcdr3的vh；以及含有由seq id no:529的核苷酸序列编码的vlcdr1、由seq id no:530的核苷酸序列编码的vlcdr2、和由seq id no:531的核苷酸序列编码的vlcdr3的vl，各自披露于表1中。[0096]在一个实施例中，抗pd-1抗体分子包含：含有seq id no:506的氨基酸序列、或与seq id no:506具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的vh。在一个实施例中，抗pd-1抗体分子包含：含有seq id no:520的氨基酸序列、或与seq id no:520具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的vl。在一个实施例中，抗pd-1抗体分子包含：含有seq id no:516的氨基酸序列、或与seq id no:516具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的vl。在一个实施例中，抗pd-1抗体分子包含：含有seq id no:506的氨基酸序列的vh和含有seq id no:520的氨基酸序列的vl。在一个实施例中，抗pd-1抗体分子包含：含有seq id no:506的氨基酸序列的vh和含有seq id no:516的氨基酸序列的vl。[0097]在一个实施例中，抗体分子包含：由seq id no:507的核苷酸序列、或与seq id no:507具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的vh。在一个实施例中，抗体分子包含：由seq id no:521或517的核苷酸序列，或与seq id no:521或517具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的vl。在一个实施例中，抗体分子包含由seq id no:507的核苷酸序列编码的vh和由seq id no:521或517的核苷酸序列编码的vl。[0098]在一个实施例中，抗pd-1抗体分子包含：含有seq id no:508的氨基酸序列、或与seq id no:508具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的重链。在一个实施例中，抗pd-1抗体分子包含：含有seq id no:522的氨基酸序列、或与seq id no:522具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，抗pd-1抗体分子包含：含有seq id no:518的氨基酸序列、或与seq id no:518具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，抗pd-1抗体分子包含：含有seq id no:508的氨基酸序列的重链和含有seq id no:522的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，该抗pd-1抗体分子包含：含有seq id no:508的氨基酸序列的重链和含有seq id no:518的氨基酸序列的轻链。[0099]在一个实施例中，抗体分子包含：由seq id no:509的核苷酸序列、或与seq id no:509具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的重链。在一个实施例中，抗体分子包含：由seq id no:523或519的核苷酸序列，或与seq id no:523或519具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的轻链。在一个实施例中，抗体分子包含由seq id no:509的核苷酸序列编码的重链和由seq id no:523或519的核苷酸序列编码的轻链。[0100]本文所述的抗体分子可以通过载体、宿主细胞、和在us 2015/0210769(将其通过引用以其全文并入)中所述的方法制得。[0101]表1.示例性抗pd-1抗体分子的氨基酸和核苷酸序列[0102][0103][0104][0105][0106][0107][0108][0109][0110][0111]在药物组合的另一个实施例中，n-(3-(5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-(叔丁基)噻唑-4-基)-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺(达拉菲尼)呈口服剂型。[0112]在药物组合的另一个实施例中，4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(化合物a)呈口服剂型。[0113]在另一个实施例中是一种药物组合物或商业包装，该药物组合物或商业包装包含(上述实施例中任一项所述的)药物组合，和至少一种药学上可接受的载剂。[0114]在另一个实施例中是药物组合(如在上述实施例中任一项所述)或药物组合物或商业包装(如在上述实施例中所述)用于在治疗癌症中使用。[0115]在另一个实施例中，该癌症选自乳腺癌、胆管癌、结直肠癌(crc)、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和甲状腺癌。[0116]在另一个实施例中，该癌症是晚期或转移性结直肠癌。[0117]在另一个实施例中，该癌症是braf功能获得性crc或braf v600e、v600d或v600k crc。[0118]在另一个实施例中是根据上述实施例中任一项所述的药物组合或根据上述实施例所述的药物组合物或商业包装用于制造治疗癌症的药物的用途。[0119]在另一个实施例中，该癌症选自乳腺癌、胆管癌、结直肠癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和甲状腺癌，任选地其中所述癌症是晚期或转移性结直肠癌，任选地其中所述癌症是braf功能获得性crc或braf v600e、v600d或v600k crc。[0120]在另一个实施例中是治疗选自乳腺癌、胆管癌、结直肠癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和甲状腺癌的癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用上述实施例中任一项所述的药物组合或商业包装或根据上述实施例所述的药物组合物。[0121]在另一个实施例中，该结直肠癌是晚期或转移性结直肠癌。[0122]在另一个实施例中，该结直肠癌是braf功能获得性crc或braf v600e、v600d或v600k crc。[0123]在另一个实施例中，以约从约1至约150mg/天(例如，1、2、5、10、50、100或150mg/天)的剂量口服施用n-(3-(5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-(叔丁基)噻唑-4-基)-2-氟苯基)-2,6-二氟苯磺酰胺(达拉菲尼)。[0124]在另一个实施例中，以从约50至约200mg/天的剂量(例如，以约50、75、100、125、150、175或200mg/天的剂量)口服施用4-(3-氨基-6-((1s,3s,4s)-3-氟-4-羟基环己基)吡嗪-2-基)-n-((s)-1-(3-溴-5-氟苯基)-2-(甲基氨基)乙基)-2-氟苯甲酰胺(化合物a)。[0125]在另一个实施例中，以约300-400mg的剂量施用pd-1抑制剂。[0126]在另一个实施例中，每3周一次或每4周一次施用pd-1抑制剂。[0127]在另一个实施例中，每3周一次以约300mg的剂量施用pd-1抑制剂。[0128]在另一个实施例中，每4周一次以约400mg的剂量施用pd-1抑制剂。[0129]药理学及效用[0130]ras/raf/mek/erk或有丝分裂原活化的蛋白激酶(mapk)途径是关键的信号传导级联，其整合上游细胞信号(例如来自生长因子受体酪氨酸激酶的信号)以协调细胞增殖、分化和存活。mapk信号传导通路在人类癌症中常常失调，最常见的是通过ras基因家族成员的突变。这些突变促进gtp结合状态，导致ras活性，进而导致raf、mek和erk蛋白活化。在多种癌症类型(包括结直肠癌、肺癌和胰腺癌)中发现了ras突变。[0131]raf(快速加速纤维肉瘤)是一种作为逆转录病毒致癌基因发现的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。raf蛋白家族(araf、braf、craf)在活化的ras下游发出信号。活化的与gtp结合的ras将胞浆失活的raf单体募集到质膜，在那里raf与gtp-ras结合，从而促进raf的同源二聚作用和异源二聚作用。raf的二聚化有助于构象变化，从而导致催化活化的raf。活化的raf二聚体磷酸化并活化mek1/2(也称为有丝分裂原活化的蛋白激酶)蛋白质，其随后磷酸化并活化细胞外信号调节激酶(erk1/2)。erk使多种底物(包括多个转录因子)磷酸化，从而调节数种关键的细胞活性(包括增殖、代谢、迁移、和存活)。erk1/2在癌症中的作用是被特别关注的，因为在erk1/2信号传导级联中活化其上游的突变被认为是所有癌症半数以上的原因。[0132]mapk途径中任何步骤的活化失调都有促成肿瘤发生。在大约7％的癌症中可以发现活化的braf突变，其中v600e占braf中观察到的突变的90％以上。v600e突变编码缬氨酸到谷氨酸的取代，从而暴露出braf的活性位点，从而使其能够独立于ras地作为单体或二聚体进行组成型活化。活性的raf抑制剂(例如维莫非尼、达拉菲尼和康奈非尼)已在braf v600e转移性黑色素瘤中显示出显著活性，总体应答率(orr)为50％-70％。在v600e黑色素瘤中，这些抑制剂的成功源自结合并抑制raf的突变单体形式的能力，raf是癌细胞的致癌驱动因子。然而，在表达野生型braf的癌细胞中，或在v600e驱动的癌症患者的正常细胞中，抑制剂(例如维莫非尼)反常活化raf信号传导。在braf v600e依赖性黑色素瘤细胞死亡而含有野生型braf的正常表皮细胞过度增殖的患者中，单体raf抑制剂存在时mapk途径信号传导的复杂性凸显出来。raf在野生型细胞中的这种反常活化是由于抑制剂与raf二聚体的一个原聚体结合而引起的。这导致构象变化，其阻止抑制剂结合至第二原聚体，并且随后发生二聚体的第二raf原聚体的反式活化。用raf和mek指导的组合疗法抑制mapk途径的顺序节点可减弱正常细胞中的raf二聚体信号传导，从而改善转移性braf v600黑色素瘤的安全性和临床活性。[0133]在braf v600e结直肠癌(crc)中，单一药剂raf抑制剂或组合raf/mek抑制显示出最小的活性；与黑色素瘤中观察到的活性相比，临床受益有限。对raf抑制剂和mek抑制剂的内源性和获得性抗性在mapk途径的多个水平上发展。绕过braf抑制的信号传导反馈和替代途径的复杂性是在crc中靶向活化braf的挑战的核心。在生理条件下，通过突变braf活化的mapk信号传导导致通过活化的ras产生的信号的erk依赖性负反馈。之所以表现出对raf抑制的内源性抗性，是因为例如维莫非尼或达拉菲尼的药物有效抑制了通过mek向erk的braf v600e信号传导；然而，这导致了将依赖erk的负反馈释放到ras信号传导中。因此，上游信号能够活化ras，从而导致braf v600e和野生型同二聚体和异二聚体的诱导。因为例如达拉菲尼和维莫非尼之类的药物会抑制braf依赖性crc细胞中v600e活化的单体，而不影响ras刺激的raf二聚体信号传导，导致erk的再活化程度高于braf v600e黑色素瘤中见到的，从而限制了在crc中疗法的有效性。[0134]在braf v600e crc中受到braf和mek抑制的压力下，获得性抗性迅速发展。例如，在对来自8位在mapk抑制后经历疾病进展的患者的9份肿瘤样品进行的分析中，未发现导致mapk再活化的基因改变。这些包括在kras或nras中的活化激活、野生型(wt)nras或kras或突变体braf v600e的扩增、和在braf v600e基因内缺失。还报道了获得性遗传改变，导致面对mapk抑制剂的erk信号传导再活化。获得性抗性也可能通过肿瘤微环境中的互补信号传导产生。[0135]尽管先前针对braf突变crc的治疗方法集中于化学疗法和/或靶向疗法，但是免疫疗法也起作用。在肿瘤发生期间，癌细胞利用免疫检查点途径来避免被适应性免疫系统检测到。程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)和程序性死亡配体1(pd-l1)免疫检查点的单克隆抗体(mab)抑制剂已在患有各种实体瘤的患者中显示出显著的抗肿瘤活性。pd-1是一个特别重要的免疫学靶标，其抑制剂如派姆单抗和纳武单抗在黑色素瘤、非小细胞肺癌(nsclc)和其他实体瘤中表现出单一药剂活性。[0136]然而，除了具有微卫星不稳定性的肿瘤外，crc通常对pd-1阻断无应答。然而，有理由使用小分子抑制剂来调节免疫反应。抑制癌细胞中mapk途径的遗传依赖性的相同疗法会抑制免疫细胞中的信号传导级联反应。例如，临床前研究表明，mapk通路抑制剂(例如braf和mek抑制剂)可以通过增加肿瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞来改善淋巴细胞归巢和功能。[0137]因此，raf和mek抑制剂可以调节对肿瘤的免疫应答，并且将这些药物与检查点阻断组合使用甚至可以提高“免疫冷(immune cold)”肿瘤(如crc)对pd-1抑制的敏感性。此外，约20％的braf突变crc具有遗传微卫星不稳定性(msi-h：微卫星不稳定性高)的特征。在msi-h crc中，无论braf的遗传状况如何，单一药剂抗pd-1疗法与30％-50％的应答率相关。此外，肿瘤免疫细胞中的靶向mapk抑制作用可能会补充微卫星稳定和错配修复缺陷的crc中抗pd-1抗体的作用机制，从而潜在地增加抗癌免疫调节。[0138]肺癌是影响全球男性和女性的常见癌症。nsclc是最常见的肺癌类型(大致85％)，其中近似70％的患者在诊断时呈现出疾病晚期(iiib期或iv期)。约30％的nsclc肿瘤含有活化的kras突变，并且这些突变与对egfr酪氨酸激酶抑制剂(tki)的抗性相关。在黑色素瘤、胰腺癌和卵巢癌中也经常发现活化的kras突变。在高达3％的nsclc中观察到braf突变，并且还被描述为egfr突变阳性nsclc中的抗性机制。[0139]crc是一种常见疾病，2018年全球估计有180万新病例，死亡人数》800,000(世界卫生组织，globocan 2018)。编码mapk途径成分的基因中的突变很常见，ras突变发生在大约50％的crc中。大约10％-15％的crc患者中存在编码braf v600e的基因中的活化突变，并且突变的braf导致不良预后。v600e突变发生在大约90％的braf突变crc中，尽管也可以看到其他突变，例如v600d或v600k突变。[0140]对于braf突变crc的有效治疗选择是有限的。与黑色素瘤(其中单一药剂braf抑制剂在转移环境中的应答率约为70％)不同，用维莫非尼的单一药剂抑制转移性braf突变crc与约5％的orr相关。尽管结果仍然很差，但是与靶向mapk途径的药物的组合疗法已改善了braf抑制的有效性。与mek抑制剂曲美替尼组合的达拉菲尼与12％的orr以及3.5个月的无进展生存期(pfs)相关。[0141]在crc中，通过生长因子介导的受体酪氨酸激酶活化来刺激ras支持致癌环境。在抑制braf的有效性后，egfr抑制剂会适度改善；与egfr抑制剂组合的braf抑制剂与4％-22％的orr以及3.2-4.2个月的pfs相关。用达拉菲尼+曲美替尼+帕尼单抗治疗的患者经历21％的orr以及4.2个月的pfs。在iii期beacon试验中，将患者随机化到第二线治疗或更高级别的治疗的三组中的一组：康奈非尼/比美替尼/西妥昔单抗、康奈非尼/西妥昔单抗、相对于伊立替康/西妥昔单抗或folfiri/西妥昔单抗(对照)。接受三重疗法的患者达到26％的orr、4.3个月的pfs以及9个月的总生存期(os)。康奈非尼加西妥昔单抗与20％的orr、4.2个月的pfs以及8.4个月的os相关。与伊立替康或folfiri/西妥昔单抗相比，两种方案均达到了统计学上的显著改善，与2％的orr、1.5个月的pfs以及5.4个月的os相关。通过组合抑制raf、mek和egfr信号传导显示出改善的结果，支持以下观点：braf v600e crc的治疗需要抑制mapk途径内的多个节点。[0142]达拉菲尼是口服生物可利用的、有效的和有选择性的raf激酶抑制剂，其作用机制与用结合三磷酸腺苷(atp)竞争性抑制相一致。达拉菲尼抑制braf激酶的某些突变形式的能力是浓度依赖性的，braf v600e、braf v600k和braf v600d酶的体外ic50值分别为0.65、0.5和1.84nm。抑制野生型braf和craf激酶需要更高的浓度，ic50值分别为3.2和5.0nm。其他激酶(例如sik1、nek11和limk1)也可以在较高浓度下被抑制。在体外和体内，达拉菲尼抑制各种braf v600突变阳性肿瘤的细胞生长。[0143]达拉菲尼于2013年首次获得fda批准，作为对于治疗患有braf v600突变的成年患者中不可切除或转移性黑色素瘤的单一药剂口服治疗，并在其他多个国家对于相同适应症获得了批准。达拉菲尼与曲美替尼的组合还被多个国家批准用于以下适应症(批准的适应症因国家而异)：患有brafv600突变的不可切除或转移性黑色素瘤患者的治疗；患有brafv600突变的iii期黑色素瘤(完全切除后)患者的辅助治疗；患有brafv600突变的晚期非小细胞肺癌(nsclc)患者的治疗；和患有brafv600e突变局部晚期或转移性间变性甲状腺癌(atc)患者的治疗。[0144]达拉菲尼的推荐剂量为150mg bid(相当于每日总剂量300mg)。[0145]化合物a是一种有效的、选择性的、口服生物可利用的atp竞争性erk1/2激酶抑制剂，其表现出能够与raf和mek抑制剂或其他靶向治疗剂组合使用的物理化学性质。化合物a有效抑制perk信号传导，并在多个mapk活化的癌细胞和异种移植模型中显示出肿瘤生长抑制。重要的是，化合物a表现出了靶向多种已知的对braf和mek抑制剂抗性的机制的广泛疗效，包括ras突变、braf剪接变体和mek1/2突变，如工程细胞系模型所示。化合物a的患者给药剂量为45mg至450mg qd。[0146]在braf v600e crc中进行的临床研究表明，单独的braf抑制剂或与mek±egfr抑制剂组合的活性会受到mapk途径抑制不足的限制，并且在患者中，即使在最初临床受益的情况下，抗性机制也会迅速出现。导致患者肿瘤中mapk通路再活化的获得性抗性机制主要涉及激活ras、braf或mek中的基因改变。这突显了braf v600e crc对mapk信号的依赖，并表明对erk(信号传导途径的最下游点)的抑制可能会规避上游节点发生的抗性。[0147]工程化为braf v600e细胞系的ras、raf或mek抗性突变的临床前模型支持这一概念。尽管亲代braf v600e细胞系对braf、mek、egfr和/或erk抑制剂的组合敏感，但引入kras、nras、mek1或mek2抗性突变导致工程化braf v600e细胞对所有抑制剂组合的敏感性降低，但含有erk抑制剂的除外。此外，与braf和mek抑制剂相比，通过使用含有braf和erk抑制剂的药物组合治疗，可以更有效地抑制小鼠异种移植物中先前存在的低频合并抗性克隆的生长。[0148]在braf突变人细胞系异种移植物ht29中体内测试了达拉菲尼+化合物a的组合。在临床相关剂量下，与达拉菲尼+曲美替尼相比，用达拉菲尼+化合物a治疗的小鼠获得了相似的抗肿瘤应答(分别为36％t/c相对于28％t/c)。单一药剂治疗导致疾病进展，化合物a达到54％t/c，达拉菲尼达到59％t/c，曲美替尼达到48％t/c。如通过缺少显著的体重减轻所判断的，所有方案具有良好的耐受性。这些数据表明，在患有braf突变的结直肠癌患者中，达拉菲尼+化合物a的组合可达到与达拉菲尼+曲美替尼相似的抗肿瘤活性，并为其在临床中的使用提供了依据。[0149]通过组合抑制braf、mek和egfr信号传导显示出改善的结果，支持以下观点：braf v600 crc的治疗需要抑制mapk途径内的多个节点。[0150]然而，对治疗的内源性和获得性抗性仍然是重要的挑战，并且临床结果仍然很差。组合疗法的作用是提供对mapk信号传导的更强大抑制，并解决mapk途径内外的抗性机制的复杂性。鉴于表征braf突变crc的信号转导的适应性复杂性，需要抑制除raf和erk的蛋白质。举例来说，一项针对218种braf-v600e突变crc肿瘤的研究鉴定了以高kras/mtor/akt/4ebp1/emt活化为特征的肿瘤的不同子集，而细胞周期失调则以其他子集为特征。[0151]尽管有靶向疗法组合已取得了进展，例如beacon试验中的研究(kopetz等人，2019)，但在癌细胞中关闭braf v600致癌驱动的能力受限于1.)无法完全抑制braf活性(由于raf激酶具有通过无效抑制的二聚体发出信号的适应能力)和2.)不仅通过mapk途径内的适应机制，而且还通过平行信号传导途径刺激正在进行的erk活化。达拉菲尼、威罗菲尼和康奈非尼有效地抑制braf在braf突变癌细胞中的活性，其中单体v600e是致癌驱动因子。然而，这些药物也可以通过几种机制导致erk的反常活化。[0152]braf和mek的组合抑制作用可通过抑制途径来改善；然而，erk信号传导的持久性是这种治疗方法的限制。阻断erk是mapk途径的最终信号，可以绕开自适应上游信号，并提供改善的疗效和对获得性抗性的恢复力。[0153]braf选择性抑制剂对组成型活化的单体braf v600有效；然而，对raf抑制剂的内源性和获得性抗性会在mapk途径的多个水平上发展。在稳态条件下，通过braf v600e活化的mapk信号传导导致通过活化的ras产生的信号的erk依赖性负反馈。在braf v600 crc中，之所以表现出对raf抑制的内源性抗性，是因为例如达拉菲尼的药物有效抑制了通过mek向erk的单体braf v600e信号传导；然而，这导致了将依赖erk的负反馈释放到ras信号传导中。因此，上游信号，例如通过表皮生长因子受体(egfr)，能够活化ras。反过来，这导致了braf v600e和野生型同二聚体和异二聚体的诱导，包括向mek提供信号的wt的同二聚体和异二聚体和braf-v600e、craf和braf-v600e和araf和braf-v600e。此外，raf抑制剂(例如达拉菲尼)会变构地促进raf家族成员的同源二聚作用和异源二聚作用，从而使抑制剂仅与一个raf伴侣结合，而另一个未结合的二聚体伴侣在刺激下游信号传导方面具有催化活性。[0154]因此，例如达拉菲尼的药物靶向braf依赖性crc细胞中的v600e单体，而不影响ras刺激的二聚体信号传导。这导致erk再活化程度超过braf v600e黑色素瘤中所见的，从而限制了crc中疗法的有效性。此外，craf在braf抑制剂治疗后介导反常活化中起重要作用。因此，有效抑制craf和braf活性的raf抑制剂(例如化合物c)可以有效地阻断braf突变的肿瘤和ras驱动的自适应mapk活化。craf在抗性中的作用是在三重组合中同时包含抑制b-和craf的药物的基本原理。[0155]达拉菲尼+化合物a+化合物c的三重组合可通过利用独特地靶向braf v600驱动的癌细胞内源性和获得性抗性机制的潜力来抑制braf v600e/k/d结直肠癌中的mapk途径。[0156]尽管单一药剂检查点阻断在微卫星稳定crc的治疗中无效，但用抗pd-1抗体的msi-h crc治疗与31％-50％的应答率相关。尽管大约有21％的braf v600e crc可能显示msi-h状态，但微卫星不稳定性似乎并未改变该疾病中对mapk靶向疗法的反应性。因此，患有msi-h braf v600e crc的受试者可能对raf/mek/erk靶向疗法或检查点阻断有应答。通过解决msi-h braf突变型crc中致癌性braf和免疫疗法应答性的共同特征，将mapk途径抑制与检查点阻断组合可以改善仅使用任一类疗法所达到的结果。[0157]此外，靶向的小分子抑制剂可以调节免疫微环境。例如，临床前研究表明，mapk途径抑制剂可通过增加肿瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞、减少上调的免疫抑制细胞因子来改善淋巴细胞的归巢和功能，并通常抵消癌症的免疫耐受性。此外，braf-mapk信号传导通路对于人黑素瘤细胞中的癌症免疫逃避至关重要。因此，raf和mek抑制剂可以调节对肿瘤的免疫应答，并且将这些药物与检查点阻断组合使用甚至可以提高“免疫冷”肿瘤(如微卫星稳定crc)对pd-1抑制的敏感性。[0158]达拉菲尼+化合物a+斯巴达珠单抗的三重组合可通过利用独特地靶向braf v600驱动的癌细胞内源性和获得性抗性机制的潜力来抑制braf v600e/k/d结直肠癌中的mapk途径。[0159]药物组合物[0160]在另一个方面，本发明提供了药学上可接受的组合物，该药学上可接受的组合物包含治疗有效量的达拉菲尼、化合物a或化合物c，其与一种或多种药学上可接受的载剂(添加剂)和/或稀释剂配制在一起。如下面详细描述的，本发明的药物组合物可特别配制用于固体或液体形式施用(包括适合口服施用的那些，例如浸液(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如，针对口腔、舌下和全身吸收的那些)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂(应用于舌))。[0161]如本文所用的短语“药学上可接受的载剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)或溶剂包封材料，参与将主题化合物从一个器官或身体的一部分运送或运输到另一个器官或身体的一部分。在与配制品的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载剂必须是“可接受的”。可用作药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括：(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油、大豆油等；(10)二醇类，如丙二醇；(11)多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)ph缓冲溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及(22)药物配制品中使用的其他无毒相容物质。[0162]如上文所述，本发明化合物的某些实施例可含有碱性官能团，例如氨基或烷基氨基，并且由此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过使纯化的游离碱形式的本发明化合物与合适的有机或无机酸分别反应，并在随后的纯化期间分离由此形成的盐来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐和月桂基磺酸盐等。[0163]主题化合物的药学上可接受的盐包括化合物的常规的无毒盐或季铵盐，例如来自无毒的有机酸或无机酸。例如，此类常规无毒盐包括衍生自无机酸的那些，该无机酸例如为盐酸、氢溴酸、硫酸、胺磺酸、磷酸、硝酸等；以及从有机酸制备的盐，该有机酸例如为乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、异硫磺酸等。[0164]在其他情况下，本发明的化合物可以含有一个或多个酸性官能团，并且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些例子中，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机和有机碱加成盐。这些盐也可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过使纯化的游离酸形式的化合物与合适的碱(例如，药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)与氨、或与药学上可接受的有机伯、仲或叔胺分别反应来制备。代表性的碱或碱土金属盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。[0165]达拉菲尼的特别优选的盐是其甲磺酸盐。化合物a的特别优选的溶剂化物是其盐酸盐。化合物c的特别优选的形式是游离碱晶体形式。[0166]在组合物中还可以存在润湿剂、乳化剂和润滑剂，如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。[0167]药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(bha)、丁羟甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。[0168]本发明的配制品包括适合于口服、鼻、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的那些。配制品可以方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主和特定的施用方式而变化。可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常为产生治疗效果的化合物的量。通常，在百分之百的范围内，量的范围为从约0.1％至约99％的活性成分，优选从约5％至约70％，最优选从约10％至约30％。[0169]在某些实施例中，本发明的配制品包含选自由以下组成的组的赋形剂：环糊精、纤维素、脂质体、胶束形成剂(例如胆汁酸)和聚合物载剂(例如聚酯和聚酸酐)；和本发明的化合物。在某些实施例中，前述配制品使得本发明化合物在口服方面是生物可利用的。[0170]制备这些配制品或组合物的方法包括将本发明的化合物与载剂和任选的一种或多种辅助成分结合的步骤。通常，通过将本发明的化合物与液体载剂或细碎固体载剂或两者均匀且紧密地结合，并且然后如果需要，使产物成形来制备配制品。[0171]适用于口服施用的本发明的配制品可以呈胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒剂的形式，或作为在水性或非水性液体中的溶液、悬浮液或固体分散体，或作为水包油或油包水液体乳剂，或作为酏剂或糖浆，或作为软锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)，和/或作为漱口水等等，每一形式含有预定量的本发明的化合物作为活性成分。本发明的化合物还能以大丸剂、药糖剂或糊剂形式施用。[0172]在本发明用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗粒剂、含片(trouches)等)中，将活性成分与以下混合：一种或多种药学上可接受的载剂，如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或以下任何一种：(1)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如像羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵化合物和表面活性剂，如泊洛沙姆和十二烷基硫酸钠；(7)润湿剂，例如像鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子表面活性剂；(8)吸收剂，如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、硬脂酸锌、硬脂酸钠、硬脂酸及其混合物；(10)着色剂；和(11)控释剂，如交聚维酮或乙基纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。还可以使用此类赋形剂，如乳糖(lactose或milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等，将相似类型的固体组合物用作软壳和硬壳明胶胶囊中的填料。[0173]片剂可以通过压缩或模制(任选地与一种或多种辅助成分一起)来制备。可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备压缩片剂。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物来制备。[0174]片剂和本发明的药物组合物的其他固体剂型(如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂)可任选地进行刻痕或制备有包衣和外壳，例如肠溶包衣和药物配制领域熟知的其他包衣。也可以使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素将它们配制成使其中的活性成分缓慢或受控释放以提供所需的释放曲线、其他聚合物基质、脂质体和/或微球。可以将它们配制用于快速释放，例如冷冻干燥。它们可以例如通过细菌截留过滤器滤过，或通过并入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，这些无菌固体组合物可以在使用前立即溶解于无菌水或一些其他无菌可注射介质中。这些组合物也可以任选地包含遮光剂并且可以是如下组合物，该组合物在胃肠道的某一部分中，任选地以一种延迟的方式仅或者优先释放一种或多种活性成分。可利用的嵌入式组合物的实例包括聚合物质以及蜡。活性成分还可以是微囊化形式，如果适当的话，可包含一种或多种上述赋形剂。[0175]用于口服施用本发明的化合物的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂(例如像水或其他溶剂)、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和脱水山梨醇脂肪酸酯，及其混合物。[0176]除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可包括辅助剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂以及防腐剂。[0177]除了含有活性化合物外，悬浮液还可以含有悬浮剂如，例如乙氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂-琼脂和黄芪胶，及其混合物。[0178]可以在本发明的药物组合物中使用的合适的水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。适当流动性可以例如通过以下方式来维持：通过使用包衣材料(如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂。[0179]这些组合物也可以含有辅助剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、山梨酸苯酚等)确保阻止微生物对主题化合物起作用。还令人希望的是在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。[0180]当将本发明的化合物作为药物向人和动物施用时，它们可以本身或作为药物组合物给予，该药物组合物含有例如与药学上可接受的载剂组合的0.1％至99％(更优选10％至30％)的活性成分。[0181]通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的化合物和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。[0182]可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，该活性成分的量有效地实现对于特定的患者、组合物和施用方式的所期望的治疗应答，而对患者没有毒性。[0183]选择的剂量水平将取决于各种因素，包括所使用的本发明的具体化合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，所采用的具体化合物的排泄率或代谢率，吸收的速度和程度，治疗的持续时间，与所采用的具体化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，正被治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和先前病史，以及在医学领域中熟知的类似因素。[0184]具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定并开出所需的药物组合物的有效量。例如，医生或兽医能以低于实现所期望的治疗效果所需的水平开始给药于药物组合物中使用的本发明的化合物，并逐渐增加剂量直至达到所期望的效果。[0185]通常，本发明的组合的合适日剂量将是每种化合物有效产生治疗效果的最低剂量的量。这样的有效剂量通常将取决于上述因素。[0186]在另一个方面，本发明提供了药学上可接受的组合物，所述药学上可接受的组合物包含治疗有效量的一种或多种上述主题化合物，其与一种或多种药学上可接受的载剂(添加剂)和/或稀释剂配制在一起。[0187]实例[0188]实例1[0189]达拉菲尼、化合物a和化合物c[0190]根据wo 2009/137391的实例58a合成达拉菲尼。根据wo 2015/066188的实例184合成化合物a。根据wo 2014/151616的实例1156合成化合物c。wo 2009/137391、wo 2015/066188和wo 2014/151616通过引用以其全文并入本文。本文所述的达拉菲尼、化合物a或化合物c的组合的效用可以通过以下实例中的测试来证明。[0191]实例2[0192]mapk途径抑制剂在裸鼠中人braf突变crc异种移植模型ht29中的组合功效[0193]达拉菲尼(drb436)：在v600的突变的braf的选择性抑制剂，能够抑制braf(v600e)、braf(v600k)和braf(v600g)突变。化合物a：选择性atp竞争性erk1和erk2激酶抑制剂。化合物c：braf和craf的atp竞争性抑制剂。将达拉菲尼在媒介物(在ph 8di水中0.5％hpmc+0.2％tween 80)中口服给药。将化合物a在媒介物(在ph 7.4磷酸盐缓冲液中0.5％hpc/0.5％普朗尼克(pluronic)f127(用酸调节至ph 4.0))中口服给药。将化合物c(游离碱结晶形式，呈粉末形式)在mepc4媒介物(45％cremophor rh40+27％peg400+18％capmul mcm c8+10％乙醇)中口服给药。[0194]ht29人结直肠癌(crc)肿瘤细胞系购自atcc，并已包括在诺华公司细胞系百科全书(cell line encyclopedia(cle))细胞系保藏中。在impact-viii pcr测定组中，该品系不含支原体和鼠类病毒(密苏里州哥伦比亚密苏里大学(university of missouri,columbia,mo)，动物研究诊断实验室(research animal diagnostic laboratory(radil)))中进行。将细胞在含有5％二氧化碳的湿润气氛中于37℃保持在emem(龙沙集团(lonza)#12-611f)加10％fbs(gibco#26140-079)(56℃持续30分钟，灭活的)中。将细胞在80％-95％汇合(用0.25％胰蛋白酶-edta(gibco#25200-056))时收获，在1200rpm离心5分钟后，用生长培养基中和，随后将细胞沉淀重悬于冷hbss(gibco#14175-095)中并且然后用等体积的matrigeltm基质(康宁公司(corning)#354234)混合以制备10x106个细胞/ml的终浓度。然后将200μl(2x106个细胞)肿瘤浆液皮下植入雌性裸小鼠的右侧。通过用卡尺测量并使用公式计算肿瘤体积，其中肿瘤体积(tv)(mm3)＝(l x w2)/2，其中l是肿瘤的最长轴并且w垂直于l。每周两次监测小鼠的肿瘤生长和体重。每周两次监测动物健康和行为，包括梳毛和移动。每天监测小鼠的总体健康状况。[0195]hcox1329 crc患者源性肿瘤异种移植物(pdx)通过肿瘤浆液的连续传代在裸鼠中繁殖。简而言之，使用温和的macs分离器(macs美天旎生物技术公司(macs miltenyi biotec)、#120-005-331)将先前传代的新鲜肿瘤片段匀浆，通过组织研磨机(chemglass生命科学公司(chemglass lifesciences)#cls-5020-085)，在pbs中稀释。然后将100μl肿瘤浆液中的4x10^6个细胞皮下植入雌性裸小鼠的右侧作为传代7代。通过用卡尺测量并使用公式计算肿瘤体积，其中肿瘤体积(tv)(mm3)＝(l x w2)/2，其中l是肿瘤的最长轴并且w垂直于l。每周两次监测小鼠的肿瘤生长和体重。每周两次监测动物健康和行为，包括梳毛和移动。每天监测小鼠的总体健康状况。[0196]表1、表2和表3描述了每个模型的功效研究设计。以根据体重调整的10ml/kg的剂量体积给予测试剂。在随机分组时收集肿瘤尺寸和体重，之后在研究持续时间内每周收集两次。[0197]表1[0198][0199]表2[0200][0201]表3[0202][0203][0204]p.o.：口服(口服灌胃)；i.p.：腹膜内；qd：每天一次；bid：一天两次；biw：每周两次。[0205]体重变化百分比计算为(bw当前-bw初始)/(bw初始)×100％。数据表示为相比处理开始日的体重变化平均百分比±sem。[0206]肿瘤体积：使用以下公式计算治疗/对照(％t/c)值百分比：如果δt≥0，则％t/c＝100×δt/δc；如果δt《0，则回归％＝100×δt/t初始；其中：[0207]t＝研究最后一天的药物治疗组的平均肿瘤体积；[0208]δt＝研究最后一天的药物治疗组的平均肿瘤体积-初始给药日的药物治疗组的平均肿瘤体积；[0209]t初始＝初始给药日的药物治疗组的平均肿瘤体积；[0210]c＝研究最后一天的对照组的平均肿瘤体积；和[0211]δc＝研究最后一天的对照组的平均肿瘤体积-初始给药日的对照组的平均肿瘤体积。[0212]所有数据均表示为平均值±平均值标准误差(sem)。肿瘤体积和体重的百分比变化用于统计分析。使用单因素anova和随后的tukey多重比较测验进行组间比较。对于所有统计评估，显著性水平设定为p《0.05。[0213]在两项研究中，使用在无胸腺裸鼠中braf突变ht29人crc异种移植模型检查了mapk途径抑制剂的抗肿瘤功效。在第一项研究(表1)中，用单一药剂或按表1所述mapk途径抑制剂组合治疗小鼠直到媒介物治疗的肿瘤在治疗开始后13天达到体积》1000mm3。通过评估移植后第39天(治疗开始后第13天)的％t/c或％消退来确定抗肿瘤活性。在表3中报道了在治疗开始后13天的抗肿瘤活性、平均肿瘤体积变化、平均体重变化和存活率。治疗后的肿瘤体积和体重变化绘制于图1中。与媒介物治疗组相比，每天用化合物a、达拉菲尼或曲美替尼单一药剂治疗分别达到54％t/c、59％t/c、或48％t/c。化合物a+达拉菲尼的组合的抗肿瘤活性(35％t/c)与曲美替尼+达拉菲尼组合达到的抗肿瘤活性(28％t/c)相似，且当与达拉菲尼治疗相比，两种组合的抗肿瘤活性显著不同(对于达拉菲尼+曲美替尼相对于达拉菲尼，p＝0.0037；对于达拉菲尼+化合物a相对于达拉菲尼，p＝0.03)，但与曲美替尼或化合物a治疗相比两种组合的抗肿瘤活性无显著差异。相比之下，当与媒介物、所有单一药剂、和每个双重组合组相比，化合物a+达拉菲尼+曲美替尼的三重组合达到了显著的(p《0.05)康肿瘤活性(3％t/c)(表1和图1)。在两周研究结束时，所有治疗组的耐受性良好，体重减轻最小(少于10％)；没有观察到毒性或死亡的迹象(图1)。[0214]在第二项研究中，将达拉菲尼+曲美替尼+化合物a的三重组合的活性与达拉菲尼+化合物a+化合物c的三重组合的活性进行了比较。用表2中所述的剂量和方案治疗小鼠，直到在开始治疗后24天用媒介物治疗的肿瘤达到体积》1000mm3。通过评估移植后第52天(治疗开始后第24天)的％t/c或％消退来确定抗肿瘤活性。在表4中报道了在治疗开始后24天的抗肿瘤活性、平均肿瘤体积变化、平均体重变化和存活率。[0215]表4[0216][0217][0218][0219]*由于肿瘤体积》1500mm3，在第49天处死2只小鼠，第45天处死1只小鼠[0220]治疗后的肿瘤体积和体重变化绘制于图2中。当与化合物a+化合物c+达拉菲尼达到的抗肿瘤活性(5％t/c)相比，化合物a+曲美替尼+达拉菲尼的组合抗肿瘤活性(14％t/c)相似且无显著差异(p＝0.38)。与未治疗对照组相比，两种组合的抗肿瘤活性均得到显著改善(两组相对于未治疗对照组，p《0.0001)(表4和图2)。在研究结束时，所有治疗组的耐受性良好，体重减轻最小(少于10％)；没有观察到毒性或死亡的迹象(图2)。[0221]接下来，使用在无胸腺裸鼠中braf突变患者源性crc异种移植模型hcox1329检查了mapk途径抑制剂的抗肿瘤功效。用媒介物或按表3所述mapk途径抑制剂组合治疗小鼠直到媒介物治疗的肿瘤达到体积》1000mm3、或mapk途径抑制剂治疗开始后62-67天。通过评估植入后38天(治疗开始后26天)的％t/c或％消退来确定抗肿瘤活性，在此时处死用媒介物治疗的小鼠，并且用mapk途径抑制剂治疗的小鼠再治疗24-29天并在植入后第62天(达拉菲尼+化合物a+曲美替尼)或第67天(达拉菲尼+曲美替尼和达拉菲尼+曲美替尼+西妥昔单抗)处死。在表4中报道了在治疗开始后26天的抗肿瘤活性、平均肿瘤体积变化、平均体重变化和存活率。治疗后26-55天的肿瘤体积和体重变化绘制于图3中。当与通过曲美替尼+达拉菲尼+西妥昔单抗达到的抗肿瘤活性(13％t/c)相比，达拉菲尼+曲美替尼的组合抗肿瘤活性(17％t/c)相似且无统计学意义(p＝0.68)。相比之下，化合物a+达拉菲尼+曲美替尼的三重组合达到了肿瘤消退(70％消退)，这与达拉菲尼+曲美替尼(p＝0.005)或达拉菲尼+曲美替尼+西妥昔单抗组合(p＝0.04)相比显著不同(表4和图3)。在两周研究结束时，所有治疗组的耐受性良好，体重减轻最小(少于10％)；没有观察到毒性或死亡的迹象(图3)。[0222]在braf突变crc肿瘤异种移植物中分析了mapk途径抑制剂组合的体内活性。在人braf突变细胞系来源的异种移植物ht29中，达拉菲尼+曲美替尼的组合活性类似于达拉菲尼+化合物a的组合活性，并且与每种单一药剂相比，所述活性适当地更好。相比之下，达拉菲尼+化合物a+曲美替尼的三重组合或达拉菲尼+化合物a+化合物c的三重组合在该异种移植模型中达到显著的抗肿瘤活性。在人类患者源性braf突变crc异种移植物hcox1329中，达拉菲尼+化合物a+曲美替尼的组合也比达拉菲尼+曲美替尼的组合和达拉菲尼+曲美替尼+西妥昔单抗的组合显著地活性更高。总的来说，这些数据表明，在braf突变crc患者中，达拉菲尼+化合物a+曲美替尼的三重组合或达拉菲尼+化合物a+化合物c的三重组合可达到更大和更持久的应答。[0223]应理解，本文所述的实例和实施例仅用于举例说明目的，其各种修饰或改变对于本领域技术人员将是明了的，并包括在本技术的精神和范围内和所附权利要求书的范围内。









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