作为骨结核诊断的生物标志物组合及其应用的制作方法

测量装置的制造及其应用技术1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及作为骨结核诊断的生物标志物组合及其应用。背景技术：2.结核病(tuberculosis,tb)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,mtb)感染引起，可侵入人体全身各种器官。目前结核病仍然是全球面临的重大公共卫生问题之一。虽然它最常影响肺部，但实际上也可以影响任何其他解剖部位，称之为肺外结核(extrapulmonary tuberculosis，eptb)。全球近10％的结核病病例是eptb病例，这给结核病控制工作带来了挑战。骨骼结核(skeletal tuberculosis，stb)是eptb最常见的部位之一，无论是在相对频率上，还是在永久残疾的巨大潜力方面都是如此。及时的诊断和治疗对于获得成功的结果和预防与stb相关的残疾至关重要。3.不幸的是，与其他形式的eptb相似，stb由于其极少的细菌载量而更难诊断，传统的病原学检测的敏感度不足50％，病理学检查的敏感度约为59-76％。因此，迫切需要在人体内识别新的生物标志物，以提高这种eptb的诊断和临床治疗水平。组学技术的广泛应用扩展了我们对新的传染病诊断和治疗策略的认识，包括结核病。代谢组学是组学革命的新成员之一，它在无偏见的条件下识别和量化特定生物系统的完整代谢组。然而，以前的研究大多是在血液样本中进行的，以确定肺结核的生物标志物；对直接来源于结核杆菌的代谢物，以及由于肺结核患者标本感染而在宿主中发生变化的代谢物知之甚少。技术实现要素：4.本发明旨在从骨结核相关标本中建立一种适用于stb诊断的代谢物生物标志物组合，将其用于人群中骨结核诊断相关产品的研发研究。5.第一方面，本发明要求保护磷脂酰胆碱(phosphatidylcholines，pc)、三酰基甘油(triacylglycerols，tg)和/或溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine，lpe)作为生物标志物在如下任一中的应用：6.p1、制备用于辅助诊断或筛查骨结核的产品，或辅助诊断或筛查骨结核；7.p2、制备用于区分骨结核和非骨结核的产品，或区分骨结核和非骨结核。8.第二方面，本发明要求保护pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和lpe(18:1)这五者中的全部或部分作为生物标志物在如下任一中的应用：9.p1、制备用于辅助诊断或筛查骨结核的产品，或辅助诊断或筛查骨结核；10.p2、制备用于区分骨结核和非骨结核的产品，或区分骨结核和非骨结核。11.第三方面，本发明要求保护用于检测磷脂酰胆碱(phosphatidylcholines，pc)、三酰基甘油(triacylglycerols，tg)和/或溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine，lpe)的物质在如下任一中的应用：12.p1、制备用于辅助诊断或筛查骨结核的产品，或辅助诊断或筛查骨结核；13.p2、制备用于区分骨结核和非骨结核的产品，或区分骨结核和非骨结核。14.进一步地，所述检测磷脂酰胆碱、三酰基甘油和/或溶血磷脂酰乙醇胺为检测受试者骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中磷脂酰胆碱、三酰基甘油和/或溶血磷脂酰乙醇胺的含量。15.第四方面，本发明要求保护用于检测pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和lpe(18:1)这五者中的全部或部分的物质在如下任一中的应用：16.p1、制备用于辅助诊断或筛查骨结核的产品，或辅助诊断或筛查骨结核；17.p2、制备用于区分骨结核和非骨结核的产品，或区分骨结核和非骨结核。18.进一步地，所述检测pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和lpe(18:1)这五者中的全部或部分为检测受试者骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和lpe(18:1)这五者中的全部或部分的含量。19.第五方面，本发明要求保护一种试剂盒。20.本发明所要求保护的试剂盒为具有如下(a1)和/或(a2)所示功能的试剂盒，含有用于检测pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和lpe(18:1)这五者中的全部或部分的物质。21.(a1)辅助诊断或筛查骨结核；22.(a2)区分骨结核和非骨结核。23.进一步地，所述检测pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和lpe(18:1)这五者中的全部或部分为检测受试者骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和lpe(18:1)这五者中的全部或部分的含量。24.进一步地，所述用于检测pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和lpe(18:1)这五者中的全部或部分的物质可为用于检测pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和lpe(18:1)这五者中的全部或部分的试剂和/或仪器。25.更进一步地，所述仪器可为液相色谱仪和/或质谱仪或液质联用仪。所述试剂可包括作为标准品的pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和/或lpe(18:1)。26.第六方面，本发明要求保护一种系统。27.本发明所要求保护的系统为具有如下(a1)和/或(a2)所示功能的系统：28.(a1)辅助诊断或筛查骨结核；29.(a2)区分骨结核和非骨结核。30.所述系统可包括：31.(a1)用于检测pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和lpe(18:1)这五者中的全部或部分的试剂和/或仪器；32.(a2)装置；33.所述装置包括数据接收模块、数据存储模块、数据比较模块和判断模块。34.所述数据接收模块被配置为接收受试者骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和/或lpe(18:1)的含量值。35.所述数据存储模块被配置为存储判断阈值1、判断阈值2、判断阈值3、判断阈值4和/或判断阈值5。36.其中，所述储判断阈值1用于判定检测指标pc(38:6)；所述判断阈值2用于判定检测指标pc(32:1e)；所述判断阈值3用于判定检测指标tg(18:1/18:1/18:2)；所述判断阈值4用于判定检测指标tg(18:1/18:2/18:2)；所述判断阈值5用于判定检测指标lpe(18:1)。37.所述数据比较模块被配置为接收所述数据接收模块发送的所述受试者骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和/或lpe(18:1)的含量值，并从所述数据存储模块中调用所述判断阈值1与所述受试者骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中pc(38:6)的含量值进行比较、调用所述判断阈值2与所述受试者骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中pc(32:1e)的含量值进行比较、调用所述判断阈值3与所述受试者骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中tg(18:1/18:1/18:2)的含量值进行比较、调用所述判断阈值4与所述受试者骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中tg(18:1/18:2/18:2)的含量值进行比较，和/或，调用所述判断阈值5与所述受试者骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中lpe(18:1)的含量值进行比较。38.所述判断模块被配置为接收由所述数据比较模块发送的比较结果，并根据预定判定条件对比较结果进行判定，判定符合所述预定判定条件的所述受试者为或候选为骨结核患者，判定不复合所述预定判定条件的所述受试者为或候选为非骨结核患者。39.进一步地，所述预定判定条件为：若所述受试者的骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中pc(38:6)的含量值小于所述判断阈值1、pc(32:1e)的含量值小于所述判断阈值2、tg(18:1/18:1/18:2)的含量值小于所述判断阈值3、tg(18:1/18:2/18:2)的含量值小于所述判断阈值4，和/或lpe(18:1)的含量值大于所述判断阈值5，则所述受试者为或候选为骨结核患者；否则，所述受试者为或候选为非骨结核患者。40.其中，所述判断阈值1为2.3e+07，或者为非骨结核患者的骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中pc(38:6)的含量值；所述判断阈值2为2.82e+07，或者为非骨结核患者的骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中pc(32:1e)的含量值；所述判断阈值3为0.966e+08，或者为非骨结核患者的骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中tg(18:1/18:1/18:2)的含量值；所述判断阈值4为0.626e+08，或者为非骨结核患者的骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中tg(18:1/18:2/18:2)的含量值；所述判断阈值5为5.98e+07，或者为非骨结核患者的骨关节和/或其相关附属组织的坏死组织标本或脓液或积液中lpe(18:1)的含量值。41.上述五个指标的含量值均可为绝对含量值、也可为相对含量值，还可以为能够表示含量值的其他参数，如质谱检测中的离子峰值。在本发明实施例中的判断阈值的具体数值为相对含量值，具体为质谱检测中的离子峰值。42.进一步地，所述仪器可为液相色谱仪和/或质谱仪或液质联用仪。所述试剂可包括作为标准品的pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和/或lpe(18:1)。43.本发明采用非靶向脂代谢组学方法，对stb和非骨结核患者脓肿标本的脂代谢产物进行了比较研究，发现pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)在stb组表达下调，lpe(18:1)在stb组表达上调，pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和/或lpe(18:1)可以作为潜在的脂类标记物来区分stb和非骨结核。44.在本发明中，所述非骨结核患者可为骨关节和/或其相关附属组织发生非结核分支杆菌感染所致病变的患者。45.在本发明的具体实施方式中，所述非骨结核患者为进行髋关节置换术后产生积液的患者、腰背部及腹部脓肿但非结核分支杆菌感染的患者、化脓性脊柱炎并右侧腰大肌脓肿患者，或者普蕾特菌感染所致胸椎脓肿患者。46.本发明具有以下优点：47.(1)本发明是通过直接检测受试者骨关节及其相关附属组织的坏死组织标本或脓液、积液的代谢物表达情况，对骨结核进行诊断的筛查方法，其敏感度较传统的病原学检测和病理学检查优越，特别是对于“病原学阴性患者”或“病理学不典型患者”的实验室诊断有重要意义。48.(2)本发明具有明显的创新性，运用生物标志物组合来辅助诊断结核病，通过本项目可开发具有广泛应用场景的结核病检测产品，研发的产品将对结核病的有效防控产生深远的影响。附图说明49.图1为基于lc-ms/ms的脂质组学技术路线。50.图2为差异代谢物火山图。51.图3为显著性差异代谢脂质层次聚类分析图。52.图4为生物标志物组合的受试者工作(roc)曲线和峰值强度分布箱型图。a为pc(38:6)；b为pc(32:1e)；c为tg(18:1/18:1/18:2)；d为tg(18:1/18:2/18:2)；e为lpe(18:1)；f为五指标联合。其中roc曲线左上角的点和箱型图中的贯穿横线均代表cutoff值(质谱检测中的离子峰值)。具体实施方式53.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。54.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。55.实施例1、作为骨结核诊断的脂质标志物的发现及其应用56.一、病例纳入57.1、人群纳入标准58.①stb：纳入患者10例，取病变部位坏死组织、脓液、积液行分枝杆菌培养和/或genexpert mtb/rif检测明确诊断为骨结核的患者。59.②非骨结核：纳入患者4例，取病变部位坏死组织、脓液、积液行分枝杆菌培养和genexpert mtb/rif检测均阴性，并经其他检测方法证明为其他病原体感染的患者(病例1：右髋关节置换术后并积液；病例2：腰背部及腹部脓肿：非结核分支杆菌感染；病例3：化脓性脊柱炎并右侧腰大肌脓肿；病例4：胸椎脓肿形成：普蕾特菌感染)。60.2、人群排除标准61.①合并结核分枝杆菌感染的混合感染；62.②hiv抗体阳性患者；63.③不同意参与本研究者。64.各组受试者的基本信息总结如表1.65.表1、临床病例的人口学和临床特征[0066][0067]二、仪器、材料[0068]1)质谱：q-exactive plus质谱仪(thermo scientific)。[0069]2)色谱：ultimate3000超高压液相色谱仪(thermo scientific)。[0070]3)色谱柱:hypersil gold c18(100×2.1mm,1.9μm)(thermo scientific)。[0071]4)试剂：乙腈(merck，1499230-935)、乙酸铵(sigma，70221)、甲醇(merck，144282)、氨水(merck，105426)、异丙醇(merck，1.01040.4)、甲基叔丁基醚(mtbe)。[0072]三、实验技术路线[0073]1、主要步骤：样品制备、qc制备、样品lc-ms/ms质谱分析、数据分析和实验报告等。[0074]2、技术路线如图1所示。[0075]四、样本采集与前处理[0076]通过外科手术的方式取得stb和非骨结核患者病变部位的标本(包括坏死组织标本、脓液或积液等)约5ml，所有样品在室温12,000g下离心15分钟，取上清经一次性0.22μm醋酸纤维素膜过滤后收集滤液立即在-80℃下低温保存备用。[0077]五、样本处理[0078]将每个样品1毫升放入2毫升离心管中，然后放入冷冻干燥器中冷冻干燥。然后将样品用400μl冰冷75％甲醇，冰浴超声15min。样品与1ml甲基叔丁基醚冰浴混合1h后，加入0.25ml去离子水，室温孵育10min。样品在4℃14000g下离心10min。根据最低重量样品取对应体积(最终每例样品取等量脂质)。在高速真空浓缩离心机挥发干燥。[0079]此外，为了确保新陈代谢谱的数据质量，质量控制(qc)样品是等量取各组样本中所有样本混合而成，qc样本用于测定进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统，并用于评价整个实验过程中系统稳定性。然后将干燥的提取物溶于50％的乙腈中。每个样品用一次性0.22μm醋酸纤维素膜过滤，转移到2ml高效液相色谱瓶中，储存在-80℃下低温保存备用。[0080]六、样本检测[0081]1、色谱条件[0082]样品采用uhplc system ultimate 3000(thermo scientific)超高效液相色谱系统进行分离。柱温45℃；流速300μl/min；进样量5μl。流动相组成a:0.77g甲酸铵、乙腈、水溶液(乙腈：水＝6:4,v/v)，b:乙腈、异丙醇溶液(乙腈:异丙醇＝1:9,v/v)。梯度洗脱程序如下：0-10.5min，b从30％线性变化至100％；10.5-12.5min，b维持在100％；12.5-12.51min，b从100％线性变化至30％；12.5-16min，b维持在30％(％表示体积百分含量)。整个分析过程中样品置于6℃自动进样器中。为了避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序，进行样本的连续分析。样本队列中每隔5-7个实验样本设置1个qc样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。[0083]2、质谱条件[0084]分别采用电喷雾电离(esi)正离子和负离子模式进行检测。样品经uhplc分离后采用q exactive plus质谱仪(thermo scientifictm)进行质谱分析。[0085]正模式：heater temp 300℃,sheath gas flow rate,45arb,aux gas flow rate,15arb,sweep gas flow rate,1arb,spray voltage,3.0kv,capillary temp,350℃,s-lens rf level,50％.scan ranges：200-1500。[0086]负模式：heater temp 300℃,sheath gas flow rate,45arb,aux gas flow rate,15arb,sweep gas flow rate,1arb,spray voltage,2.5kv,capillary temp,350℃,s-lens rf level,50％.scan ranges：200-1500。[0087]3、具体操作[0088]代谢组学uhplc-ms/ms分析在thermo(waltham ma，usa)ultra3000 uhplc系统与thermo q exactive orbitrap质谱仪上进行的。采用hypersil gold c18(100×2.1mm，1.9μm)(thermo science)色谱柱进行脂质分离。流动相a用0.77g醋酸铵溶解于400ml高效液相级水中，然后加入600ml高效液相级乙腈；流动相b的流速设定为0.3ml/min。梯度洗脱程序如下：0-10.5min，b从30％线性变化至100％；10.5-12.5min，b维持在100％；12.5-12.51min，b从100％线性变化至30％；12.5-16min，b维持在30。[0089]质谱数据采集采用电喷雾电离(esi)正模式和负模式。喷雾电压正模式为3.0kv，负模式为2.5kv。电喷射源条件设置如下：加热器温度300℃，鞘层气体流量45arb，辅助气体流量15arb，扫描气体流量1arb，毛细管温度350arb，s-lens rf电平，50％。在m/z 200下以70,000的分辨率采集全ms扫描，在m/z 200下以17,500的分辨率采集ms/ms扫描。ms的最大进样时间设置为50ms，ms/ms的最大进样时间设置为50ms。使用数据相关的top10方法从调查扫描(200-1500m/z)中动态选择最丰富的前体离子用于hcd碎裂，获得ms数据。阶跃归一化碰撞能量设置为15、25、35，隔离窗口设置为1.6th。空白样品(75％acn在水中)和qc样品每6个样品后进行检测，以进行质量控制。[0090]七、数据预处理和过滤[0091]用lipid search 4.1.30(thermo)对脂质进行鉴定和定量。前体离子和产物离子的质量公差分别为5ppm和10ppm。“对齐”时保留时间偏移0.25min。m评分和层析面积用于减少假阳性。质控样品中ms峰面积rsd小于30％的脂类留作进一步数据分析。[0092]其详细步骤包括：[0093]1、峰提取：使用lipid search软件，读取q exactive lc-ms/ms导出的raw格式原始数据，读取msn和母离子的精确质量数。[0094]2、鉴定：根据每个独立样本中的母离子和多级质谱数据，鉴定其中脂质分子结构及其正负离子的加合模式。[0095]3、峰对齐：对于每个独立样本的搜索结果按照一定保留时间时间范围对齐，并将结果被组合成一个单一的报告，整理出原始数据矩阵。这个三维矩阵包括的信息有：样品信息、各物质峰的鉴定结果、脂质类别、支链信息、保留时间、质荷比、质谱响应强度(峰面积)。[0096]对lipidsearch提取得到的数据进行总峰面积归一化，单维统计分析包括student‘s t-test和变异倍数分析，r软件绘制火山图、层次聚类分析等。[0097]八、数据分析[0098]运用单变量分析法中常用的变异倍数分析(fold change analysis，fc analysis)、t检验，以及综合前两种分析方法的火山图(图2)，可以直观地显示两组样本间代谢物变化的显著性，从而帮助我们筛选潜在的标志代谢物(本次实验以差异倍数1.5以上且p value《0.05作为筛选标准)。[0099]同时更全面直观地显示样本之间的关系以及脂质在不同样本中的表达模式差异，我们利用定性的显著性差异脂质的表达量对各组样本进行层次聚类(图3)，从而辅助我们准确地筛选标志脂质，并对相关代谢过程的改变进行研究。[0100]用auc值评价显著差异代谢物作为生物标志物对stb的诊断能力。在单变量分析水平上，使用metavarianalyst 5.0(http://www.metaboanalyst.ca)和双侧t检验(p值)的对变量投影重要度进行统计学分析，获得可区分的差异代谢物。磷脂酰胆碱(phosphatidylcholines，pc)、三酰基甘油(triacylglycerols，tg)和溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine，lpe)作为生物标志物显示出良好的潜在诊断能力，pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)和lpe(18:1)的曲线下面积分别为1.000、1.000、0.950、0.950、0.925，在多变量的roc分析中，联合变量的auc值为0.991(图4)。其中，pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)、tg(18:1/18:2/18:2)在stb组表达下调，lpe(18:1)在stb组表达上调。[0101]图4中roc曲线左上角的点和箱型图中的贯穿横线均代表cutoff值(质谱检测中的离子峰值)。可见：[0102]pc(38:6)的cutoff值为2.3e+07，即当受检者的样本中pc(38:6)的含量(质谱检测中的离子峰值)小于2.3e+07，则受试者最大可能为stb患者，否则最大可能为非stb患者。[0103]pc(32:1e)的cutoff值为2.82e+07，即当受检者的样本中pc(32:1e)的含量(质谱检测中的离子峰值)小于2.82e+07，则受试者最大可能为stb患者，否则最大可能为非stb患者。[0104]tg(18:1/18:1/18:2)的cutoff值为0.966e+08，即当受检者的样本中tg(18:1/18:1/18:2)的含量(质谱检测中的离子峰值)小于0.966e+08，则受试者最大可能为stb患者，否则最大可能为非stb患者。[0105]tg(18:1/18:2/18:2)的cutoff值为0.626e+08，即当受检者的样本中tg(18:1/18:2/18:2)的含量(质谱检测中的离子峰值)小于0.626e+08，则受试者最大可能为stb患者，否则最大可能为非stb患者。[0106]lpe(18:1)的cutoff值为5.98e+07，即当受检者的样本中lpe(18:1)的含量(质谱检测中的离子峰值)大于5.98e+07，则受试者最大可能为stb患者，否则最大可能为非stb患者。[0107]五指标联合使用时，当受检者的样本中pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)和tg(18:1/18:2/18:2)的含量(质谱检测中的离子峰值)均小于相应阈值，且lpe(18:1)的含量(质谱检测中的离子峰值)大于相应阈值，则受试者最大可能为stb患者。当受检者的样本中pc(38:6)、pc(32:1e)、tg(18:1/18:1/18:2)和tg(18:1/18:2/18:2)的含量(质谱检测中的离子峰值)均不小于相应阈值，且lpe(18:1)的含量(质谱检测中的离子峰值)不大于相应阈值，则受试者最大可能为非stb患者。[0108]以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。









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