1,3-环己二酮类化合物及其药物组合物和应用

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于药物化学和化学合成领域，具体而言，本发明涉及一种1,3-环己二酮类化合物及其药物组合物和应用。背景技术：2.1920年，德国科学家warburg提出肿瘤细胞有别于正常细胞，即使在有氧条件下，也主要通过糖酵解方式分解葡萄糖获能，肿瘤细胞的这种有氧糖酵解现象被称之为“warburg”效应。肿瘤细胞“warburg”效应一个重要的共性特征是产生大量的乳酸。其主要原因是肿瘤细胞对葡萄糖的利用增加以及主要通过糖酵解的方式代谢，导致糖酵解途径的终产物即乳酸的蓄积。乳酸具有多种生物学功能，它不仅促进肿瘤细胞的增殖与转移及新生血管的形成，而且与肿瘤细胞的免疫逃逸也密切相关，因此乳酸蓄积可以重塑肿瘤的微环境。由此可见，乳酸不仅影响化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，而且可影响免疫细胞的活性介导免疫抑制微环境，对肿瘤的免疫治疗也有重要的影响。3.乳酸脱氢酶(ldh)作为糖酵解过程中的关键酶之一，负责将丙酮酸与nadh转化为乳酸与nad+[pharmacology&therapeutics,2009,121(1):29)]。ldh是可逆性的催化酶，以四聚体形式存在，分别由两条肽链(ldha，ldhb)组合而成。mccleland等人[cancer research,2012,72(22):5812]采用综合基因分析方法，对三阴性乳腺癌的候选癌基因进行筛选和评估，确定ldhb是三阴性乳腺癌的重要基因，三阴性乳腺癌依赖糖酵解。ldha主要在低氧环境下如骨骼肌、肝脏和淋巴组织中表达，在常氧组织中几乎没有表达[current medicinal chemistry,2010,17(7)]。由于缺氧微环境和线粒体基因突变的结果，ldha表达在各种肿瘤细胞中也得到了上调[oncology,2009,77(5):285-292]。brand等人[cell metabolism,2016,24(5):657-671]通过对大量临床样本统计分析发现，肿瘤细胞中ldha表达与恶性程度呈正相关、与患者预后反相关趋势。同时，对完全缺乏ldha亚型的个体进行记录统计分析，认为除剧烈无氧运动下肌红蛋白尿外无其他明显疾病[internal medicine,1995,34(5):326]。因此，ldha具有成为肿瘤治疗的潜在分子靶点的潜力。le等人先前的研究已经证实[pnas,2010,107(5):2037-2042]，ldha沉默可能导致与氧化应激有关的淋巴瘤细胞的细胞凋亡率增加。在wang等人的研究中[breast cancer research&treatment,2012,131(3):791-800]，证明了ldha过表达与乳腺肿瘤大小密切相关，ldha抑制也导致在雌激素受体(er)阳性和阴性细胞系中通过ros产生，增加线粒体通路凋亡，以及对两种乳腺癌的异种移植肿瘤生长速度显著减慢。[0004]因此，具有抑制ldha活性的化合物具有成为抗肿瘤药物或是药物组合物的潜力。近年来，ldh的小分子抑制剂研究取得了一些发展。如化合物gne-140对ldha的ic50分为3nm[nature chemical biology,2016,12(10):779]。虽然该化合物对于ldha酶具有较高的抑制作用，但其在体内药效实验中抗肿瘤药效较低。[0005]鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：[0006]本发明的首要发明目的在于提出一种1,3-环己二酮类化合物。[0007]本发明的第二发明目的在于提出含有该化合物的药物组合物。[0008]本发明的第三发明目的在于提出上述化合物和药物组合物的应用。[0009]为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：[0010]本发明第一方面涉及一种1,3-环己二酮类化合物、其立体化学异构体或药学上可接受的盐，所述1,3-环己二酮类化合物的结构式如式i所示：[0011][0012]其中，[0013]ar为取代或未取代的苯基，所述取代的苯基为被1～3个取代基r’取代的苯基，取代基r’相同或不同，选自卤素、氰基、卤素取代的c1～c6烷基、c1～c6烷基或c1～c6烷氧基，优选为卤素、氰基、全卤素取代的c1～c3烷基、c1～c3烷基或c1～c3烷氧基，更优选为卤素、氰基、三氟甲基、甲基、甲氧基；[0014]x为氢或卤素，优选为氯；[0015]r1选自氢或c1～c3烷基；[0016]r2选自c1～c3亚烷基；[0017]r3选自取代或未取代的c6～c14芳基、c4～c12杂芳基，所述取代的取代基选自卤素、卤素取代的c1～c6烷基、c1～c6烷基，优选卤素或c1～c3烷基，更优选卤素或甲基。[0018]本发明第二方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的选自上述的1,3-环己二酮类化合物、其立体化学异构体或药学上可接受的盐，优选包含药学上可接受的载体或赋形剂。[0019]本发明第三方面涉及一种乳酸脱氢酶抑制剂，包含上述的1,3-环己二酮类化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐中的一种或多种，或者包含如权利要求6所述的药物组合物。[0020]本发明第四方面涉及上述1,3-环己二酮类化合物、其立体化学异构体或药学上可接受的盐或者上述药物组合物的应用，所述应用包括：在用于制备抗肿瘤药物中的应用、在用于制备治疗免疫逃逸导致的癌症的药物中的应用。[0021]本发明的技术方案至少具有以下技术效果：[0022]本发明的1,3-环己二酮类化合物不仅具有良好的水溶性和稳定性，在分子水平、细胞水平对ldha具有较好的抑制活性，并在体内体现出抗肿瘤活性的化合物。附图说明[0023]图1和图2为本发明化合物对hn12细胞乳酸分泌的影响的柱状图；[0024]图3为对黑色素移植瘤b16f10的体内抗肿瘤活性对比图。具体实施方式[0025]为使本领域具有普通知识的人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及申请专利范围中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，皆具有本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。[0026]在本文中，用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其他任何类似用语均属于开放性连接词(open-ended transitional phrase)，其意欲涵盖非排他性的包括物。举例而言，含有复数要素的一组合物或制品并不仅限于本文所列出的这些要素而已，而是还可包括未明确列出但却是该组合物或制品通常固有的其他要素。除此之外，除非有相反的明确说明，否则用语“或”是指涵盖性的“或”，而不是指排他性的“或”。用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”的解读应视为已具体公开并同时涵盖“由…所组成”及“实质上由…所组成”等封闭式或半封闭式连接词。[0027]以下具体实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明及其用途。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下具体实施方式或实施例中所描述的任何理论的限制。[0028]本发明中所述的“烷基”表示特定原子个数下的饱和的直链和支链烷基，具体地可列举如但不仅限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基等。所述“c1～c6烷基”表示碳原子数为1～6个的饱和直链或支链烷基，具体地可列举如但不仅限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。卤素取代的c1～c6烷基指c1～c6烷基上的至少一个氢原子被卤素取代，全卤素取代的c1～c3烷基指c1～c3烷基上的全部氢原子被卤素取代。[0029]本发明所述“c1～c3亚烷基”表示碳原子数为1～3个的饱和直链或支链亚烷基，具体地可列举如但不仅限于亚甲基(-ch2-)、亚乙基(-ch2-ch2-、)、亚丙基(-ch2-ch2-ch2-)。[0030]本发明所述的“c1～c6烷氧基”表示碳原子数为1～6个的所有直链或支链的烷氧基，具体地可列举如但不仅限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基等。[0031]术语“芳基”表示具有芳香环结构性质的取代基，优选为“c6～c14芳基”，其表示具有6～14个碳原子的芳基。例如，包含但不限于苯基、取代的苯基、萘基、取代的萘基、蒽基等；更优选为“c6～c8芳基”。[0032]术语“杂芳基”是指具有5～14个环原子的单环或多环基团，每个环含有4～6个原子，其中有一个或多个选自n、o或s的杂原子，其余为碳。“杂芳基”具有一定的芳香性。本文优选杂芳基为“c2～c9杂芳基”，其表示具有2～9个碳原子的杂芳基，例如包括但不限于，呋喃基、取代的呋喃基、苯并呋喃基、取代的苯并呋喃基、噻吩基、取代的噻吩基、苯并噻吩基、取代的苯并噻吩基、吲哚基、取代的吲哚基、异吲哚基、取代的异吲哚基、吡咯基、取代的吡咯基、噻唑基、取代的噻唑基、噁唑基、取代的噁唑基、吡唑基、取代的吡唑基、咪唑基、取代的咪唑基、吡喃基、取代的吡喃基、哒嗪基、取代的哒嗪基、吡嗪基、取代的吡嗪基、嘧啶基、取代的嘧啶基、吡啶基、取代的吡啶基、喹啉基、取代的喹啉基、异喹啉基、咔唑基、取代的咔唑基等。更优选杂芳基为“c2～c5杂芳基”，杂原子进一步优选为氮原子。[0033]本发明所述“卤素”表示氟、氯、溴、碘。[0034]“药学上可接受的盐”表示式(i)所示的化合物保持了期望的生物活性且具有最小的毒副作用。该药学上可接受的盐可以直接在化合物的制备和纯化过程中得到，也可以间接的通过该化合物的游离酸或游离碱与另外一种合适的碱或酸反应得到。[0035]本发明实施例第一方面提出一种1,3-环己二酮类化合物、其立体化学异构体或药学上可接受的盐，其结构式如式i所示：[0036][0037]其中，[0038]ar为取代或未取代的苯基，所述取代的苯基为被1～3个取代基r’取代的苯基，取代基r’相同或不同，选自卤素、氰基、卤素取代的c1～c6烷基、c1～c6烷基或c1～c6烷氧基，优选为卤素、氰基、全卤素取代的c1～c3烷基、c1～c3烷基或c1～c3烷氧基，更优选为卤素、氰基、三氟甲基、甲基、甲氧基；[0039]x为氢或卤素，优选为氯；[0040]r1选自氢或c1～c3烷基，优选为氢或甲基；[0041]r2选自c1～c3亚烷基；[0042]r3选自取代或未取代的c6～c12芳基、或取代或未取代的c4～c12杂芳基，所述取代的取代基选自卤素、卤素取代的c1～c6烷基、c1～c6烷基，优选卤素或c1～c3烷基，更优选卤素或甲基。[0043]在一个实施方式中，本发明的1,3-环己二酮类化合物、其立体化学异构体或药学上可接受的盐选自如ia所示的化合物中：[0044][0045]其中，r41、r42各自独立的选自卤素、氰基、全卤素取代的c1～c3烷基、c1～c3烷基或c1～c3烷氧基，优选为卤素、氰基、三氟甲基、甲基或甲氧基，更优选为氯；[0046]x、r1、r2、r3的定义如式i所述，优选r3选自取代或未取代的c6～c8芳基、或取代或未取代的c4～c8杂芳基，所述取代的取代基选自卤素、卤素取代的c1～c3烷基、c1～c3烷基，优选卤素或甲基；更优选r3选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的吡啶基或取代或未取代的吡嗪基，所述取代的取代基选自卤素、卤素取代的c1～c3烷基、c1～c3烷基，优选卤素或甲基。[0047]在一个实施方式中，本发明的1,3-环己二酮类化合物、其立体化学异构体或药学上可接受的盐选自如ia1所示的化合物中：[0048][0049]x、r1、r41、r42如式ia所述；[0050]r21选自氢或甲基；[0051]r31选自卤素、卤素取代的c1～c6烷基、c1～c6烷基；优选为卤素或c1～c3烷基，更优选为卤素或甲基；[0052]n为0～5的整数。[0053]在一个实施方式中，本发明的1,3-环己二酮类化合物、其立体化学异构体或药学上可接受的盐选自如ia2所示的化合物中：[0054][0055]x、r1、r41、r42如式ia所述；[0056]r21选自氢或甲基；[0057]r31选自卤素、卤素取代的c1～c6烷基、c1～c6烷基；优选为卤素或c1～c3烷基，更优选为卤素或甲基；[0058]m为0～4的整数。[0059]在一个实施方式中，本发明的1,3-环己二酮类化合物、其立体化学异构体或药学上可接受的盐选自如ia3所示的化合物中：[0060][0061]x、r1、r41、r42如式ia所述；[0062]r21选自氢或甲基；[0063]r31选自卤素、卤素取代的c1～c6烷基、c1～c6烷基；优选为卤素或c1～c3烷基，更优选为卤素或甲基；[0064]p为0～3的整数。[0065]在一个实施方式中，本发明的1,3-环己二酮类化合物、其立体化学异构体或药学上可接受的盐选自如ia4所示的化合物中：[0066][0067][0068]x、r1、r41、r42如式ia所述；[0069]r21选自氢或甲基；[0070]r31选自卤素、卤素取代的c1～c6烷基、c1～c6烷基；优选为卤素或c1～c3烷基，更优选为卤素或甲基；[0071]q为0～7的整数。[0072]在一个实施方式中，本发明的1,3-环己二酮类化合物、其立体化学异构体或药学上可接受的盐选自如ia4a或ia4b所示的化合物中：[0073][0074]x、r1、r41、r42、r21、r31、q如式ia4所述。[0075]在一个实施方式中，与r21连接的碳原子为r型或s型，并优选r型。[0076]在一个实施方式中，本发明式i所示的化合物选自以下结构式所示的化合物：[0077][0078]在一些实施方式中，本发明的1,3-环己二酮类化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐可以以结晶水合物或溶剂合物的形式存在。这些结晶水合物或溶剂合物也包括在本发明的范围内。[0079]根据本发明，立体异构体包括互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体。[0080]在获知本发明化合物的结构的基础上，本领域技术人员可以采用本领域中已知的反应设计并合成本发明的化合物。因此，对于合成本发明化合物的具体制备方法不做特别限制，只要能够得到本发明的化合物即可。可采用如下反应流程进行制备：[0081][0082]其中，x、r21、r22、r1、r2、r3的定义如前所述。[0083]本发明实施例的第二方面提出一种药物组合物，其包含治疗有效量的上述1,3-环己二酮类化合物、其立体化学异构体或药学上可接受的盐，优选包含药学上可接受的载体或赋形剂。[0084]经实验证实，本发明的化合物具有乳酸脱氢酶抑制活性，包括对ldha的抑制活性，因此，本发明实施例的第三方面提供一种乳酸脱氢酶抑制剂，其包含上述1,3-环己二酮类化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐中的一种或多种，或者包含上述药物组合物。[0085]本发明实施例的第四方面提出上述化合物或者药物组合物的应用，应用包括：在用于制备抗肿瘤药物中的应用、在用于制备治疗免疫逃逸导致的癌症的药物中的应用；[0086]具体的，肿瘤包括黑色素瘤和间皮瘤，癌症包括肺癌、肝癌、肾癌、急性白血病、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、骨髓增生异常综合症、食管癌和胃肠道癌。[0087]本发明实施例还提出抑制乳酸脱氢酶的方法，抗肿瘤的方法以及治疗免疫逃逸导致的癌症的方法。方法包括向需要上述处理的对象施用有效量的上述1,3-环己二酮类化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐或者上述药物组合物。[0088]制备实施例：[0089]下文所述的原料为市售产品，或者通过本领域已知的方法制备，或根据本文所述方法制备。[0090]化合物的结构通过质谱(ms)来确定。ms的测定用thermo finnigan lcq-deca xp型(esi)液相色谱-质谱联用仪。柱层析分离纯化产物使用的是iscorf 75快速制备色谱仪，载体采用青岛海洋化工厂的200-300目硅胶。[0091]化合物1的制备[0092]反应方程式如下：[0093][0094]步骤1：中间体1-1的制备[0095]将4-氯苯乙酸(50g，293.10mmol)溶于浓硫酸(250ml)中搅拌，在冰浴下加入硝酸钾固体(31.11g，307.75mmol)，移至室温搅拌1小时。薄层色谱监测反应结束后，将反应液倾倒入冰水混合物(300ml)边倒边搅拌，用乙酸乙酯(300ml)萃取两次，合并有机相，用饱和盐水(400ml)洗，分离有机相用无水硫酸钠干燥，过滤蒸干得中间体1-1(淡黄固体49g，收率77.55％)。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.83(m,1h),7.53(m,1h),7.45(m,1h),3.72(s,2h).[0096]步骤2：中间体2-1的制备[0097]将中间体1-1(49g，227.28mmol)溶于乙醇(500ml)中搅拌，在冰浴下滴加浓硫酸(50ml)。加热至回流，搅拌5小时。薄层色谱监测反应结束后，蒸干溶剂，用乙酸乙酯(300ml)萃取，分别用水(300ml)和饱和食盐水(300ml)洗一次，分离有机相用无水硫酸钠干燥，过滤蒸干得中间体2-1(黄色油状物46g，收率83.07％)。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.01(m,1h),7.73(m,1h),7.63(m,1h),4.11(q,j＝7.1hz,2h),3.85(s,2h),1.20(t,j＝7.1hz,3h)。[0098]步骤3：中间体3-1的制备[0099]将中间体2-1(44g，180.59mmol)溶于乙醇/水(v/v＝5:1,450ml)中搅拌，分别加入氯化铵(10.63g，198.65mmol)和铁粉(30.26g，541.78mmol)，加热至85摄氏度搅拌1小时。薄层色谱监测反应结束后，蒸掉大部分溶剂，用乙酸乙酯(400ml)萃取，分别用水(400ml)和饱和盐水(400ml)洗一次，分离有机相用无水硫酸钠干燥，过滤蒸干，用200-300目硅胶装载色谱柱，洗脱剂用石油醚/乙酸乙酯体系，极性梯度为石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝10:1-5:1过柱得中间体3-1(棕色油状物31g，收率83.34％)。ms(esi)214.04(m+h)。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.18(d,j＝8.1hz,1h),6.70(m,1h),6.60(dd,j＝8.1,2.1hz,1h),4.14(q,j＝7.1hz,2h),4.04(s,2h),3.49(s,2h),1.25(t,j＝7.1hz,3h)。[0100]步骤4：中间体4-1的制备[0101]将中间体3-1(10g，46.8mmol)溶于盐酸(6n，100ml)中搅拌，在冰浴下滴加亚硝酸钠溶液(3.55g，20ml，51.48mmol)，0摄氏度下搅拌30分钟，然后将混合溶液缓慢滴入乙基黄原酸钾溶液(9g，100ml，56.16mmol)中，体系温度不超过5摄氏度，反应30分钟。将反应液用乙醚(200ml)萃取，饱和食盐水(200ml)洗，分离有机相用无水硫酸钠干燥，过滤蒸干。[0102]将上述体系用乙醇(200ml)溶解，加热至回流，加入氢氧化钾(11.03g，196.57mmol)，反应30分钟。薄层色谱监测反应结束后，蒸干溶剂，加入水(100ml)，用盐酸(1n)中和至酸性，用乙酸乙酯(200ml)萃取，用饱和食盐水(200ml)洗一次，分离有机相用无水硫酸钠干燥，过滤蒸干。用200-300目硅胶装载色谱柱，洗脱剂用石油醚/乙酸乙酯体系，极性梯度为石油醚-石油醚/乙酸乙酯＝2：1，分离得中间体4-1(黄色固体6g，收率63.26％)。ms(esi)200.78(m-h)-。[0103]步骤4：中间体5-1的制备[0104]将2,6-二氯苯甲醛(50g，285.70mmol)溶于丙酮(250ml)中搅拌，冰浴下滴加氢氧化钠溶液(w/w＝8％,214ml,428.55mmol)，移至室温搅拌1小时。薄层色谱监测反应结束后蒸掉部分溶剂，加入二氯甲烷萃取(300ml)，用饱和食盐水(300ml)洗，分离有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干溶剂。用200-300目硅胶装载色谱柱，洗脱剂用石油醚/乙酸乙酯体系，极性梯度为石油醚-石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝50:1，分离得中间体5-1(40g黄色固体，收率65.1％)。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.61(d,j＝16.7hz,1h),7.37(d,j＝8.0hz,2h),7.21(t,j＝8.1hz,1h),6.82(d,j＝16.7hz,1h),2.43(s,3h)。[0105]步骤5：中间体6-1的制备[0106]将甲醇钠的甲醇溶液(28.18ml，147.86mmol)溶于甲醇(250ml)中搅拌，加入丙二酸二乙酯(20.67ml(135.54mmol)，常温搅拌30分钟，加入v(26.6g，123.21mmol)加热至回流搅拌3小时，然后加入的氢氧化钠溶液(2n，154ml，308.03mmol)继续回流1小时。冷却至室温，在冰浴下加入浓盐酸(46.21ml，554.46mmol)，再次加热至回流搅拌1小时冷却至室温。反应液用乙酸乙酯(300ml)萃取2次，合并有机相，饱和盐水(500ml)洗一次，分离有机相用无水硫酸钠干燥后蒸干，用乙酸乙酯(200ml)打浆30分钟，过滤得中间体6-1(白色固体28g收率88.39％)。ms(esi)257.07(m+h)；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.39(s,1h),7.50(s,2h),7.33(t,j＝8.1hz,1h),5.33(m,1h),4.27–4.16(m,1h),3.24(s,2h),2.23(s,2h)。[0107]步骤6：中间体7-1的制备[0108]将中间体6-1(6.34g，24.67mmol)溶于dmf(200ml)中搅拌，分别加入中间体4-1(5g，24.67mmol)和碳酸钾固体(8.52g，61.68ml)，加热至80摄氏度搅拌过夜。薄层色谱监测反应结束后，蒸干溶剂。反应体系用1n的稀盐酸溶液中和至ph＝4，用乙酸乙酯/异丙醇(v/v＝10:1，200ml)萃取两次，合并有机相，用饱和食盐水(300ml)洗，分离有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干，用石油醚/乙酸乙酯1：1溶剂打浆2小时，过滤得中间体7-1(白色固体10g，收率88.5％)。ms(esi)455.1(m-h)-；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.51(m,2h),7.39–7.26(m,2h),6.94(m,1h),6.75(m,1h),4.45–4.32(m,1h),3.59–3.44(m,4h),3.17(s,2h),2.55–2.44(m,2h)。[0109]步骤7：化合物1的制备[0110]将中间体7-1(1g，2.19mmol)溶于dmf(50ml)中搅拌，分别加入(r)-alpha-甲基苄胺(265.90mg，2.19mmol)，hatu(1g，2.63mmol)和diea(573μl，3.29mmol)，常温搅拌过夜。薄层色谱监测反应结束后将溶剂蒸干，用二氯甲烷(100ml)萃取，分别用水(100ml)，1n稀盐酸(100ml)和饱和食盐水(100ml)洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干，用200-300目硅胶装载色谱柱，洗脱剂用二氯甲烷/乙酸乙酯体系，极性梯度为二氯甲烷/乙酸乙酯(v/v)＝5:1～1:1，分离得化合物1(淡黄色固体860mg，收率为69.9％)。ms(esi)558.0473(m-h)-；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.48(d,j＝8.1hz,1h),7.52(m,2h),7.39–7.25(m,5h),7.25–7.17(m,1h),6.92(dd,j＝8.1,2.1hz,1h),6.79(m,1h),4.97–4.73(m,1h),4.50–4.35(m,1h),3.57(m,3h),3.47–3.30(m,4h),2.56(m,1h),1.34(d,j＝7.0hz,3h)。[0111]化合物2的制备[0112]与化合物1合成方法相同，以中间体7-1为共同原料与2-(氨甲基)-5-甲基吡嗪缩合得化合物2。ms(esi)560.0366(m-h)-。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.36(m,2h),7.42–7.27(m,3h),7.18(t,j＝8.0hz,1h),7.05(m,1h),6.64(m,1h),4.54–4.41(m,3h),3.69(m,2h),3.56(s,2h),2.67(dd,j＝17.5,4.7hz,2h),2.52(s,3h),1.43–1.23(m,2h)。[0113]化合物3的制备[0114]与制备化合物1方法相同，以中间体7-1为共同原料与2-吡啶甲胺缩合得化合物3。ms(esi)545.0273(m-h)-；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.65(m,1h),8.49(m,1h),7.74(m,1h),7.51(m,2h),7.34(m,2h),7.30–7.16(m,2h),6.99(m,1h),6.83(m,1h),4.36(d,j＝5.8hz,2h),3.66–3.43(m,6h),3.15(m,1h),2.58m,1h)。[0115]化合物4的制备[0116]与制备化合物1方法相同，以中间体7-1为共同原料与n-甲基苄胺缩合得化合物4。ms(esi)558.0466(m-h)-；1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.41–7.26(m,6h),7.22–7.08(m,3h),7.07–6.92(m,2h),4.57(s,1h),4.49–4.45(m,1h),3.66(m,4h),2.95(m,2h),2.87(s,2h),2.65(m,3h)。[0117]化合物5的制备[0118]与制备化合物1方法相同，以中间体7-1为共同原料与2-胺甲基吡嗪缩合得化合物5。ms(esi)546.0228(m-h)-；1h nmr(600mhz,chloroform-d)δ8.53–8.38(m,3h),7.40–7.30(m,2h),7.26(d,j＝7.9hz,1h),7.17(t,j＝8.0hz,1h),7.05–6.99(m,2h),6.83(m,1h),4.53(d,j＝5.5hz,2h),4.47(m,1h),3.74–3.63(m,2h),3.55(s,2h),3.13(q,j＝7.4hz,1h),2.66(dd,j＝17.5,4.7hz,2h)。[0119]化合物6的制备[0120]与制备化合物1方法相同，以中间体7-1为共同原料与(r)-1-(1-萘基)乙胺缩合得化合物6。ms(esi)608.0619(m-h)-；1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.03(d,j＝8.3hz,1h),7.84–7.80(m,1h),7.76(dd,j＝6.8,2.7hz,1h),7.55–7.27(m,7h),7.18(t,j＝8.0hz,1h),7.05(m,1h),7.00(dd,j＝8.0,2.2hz,1h),5.89(q,j＝7.1hz,1h),5.77(d,j＝8.3hz,1h),4.44(m,1h),3.67(s,2h),3.53–3.37(m,2h),2.63(s,2h),1.61(d,j＝6.7hz,3h),1.25(s,1h)。[0121]化合物7的制备[0122]与制备化合物1方法相同，以中间体7-1为共同原料与(r)-(+)-1-(2-萘基)乙胺缩合得化合物7。ms(esi)608.0617；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.60(d,j＝8.0hz,1h),7.86(m,3h),7.75(m,1h),7.48(m,5h),7.39–7.26(m,2h),6.96(m,1h),6.83(m,1h),5.07(m,1h),4.49–4.35(m,1h),3.59(m,2h),3.42(m,3h),2.65–2.53(m,2h),1.44(d,j＝7.0hz,3h).[0123]化合物8的制备[0124]与制备化合物1方法相同，以中间体7-1为共同原料与(r)-1-(3-溴苯基)乙胺缩合得化合物8。ms(esi)635.957(m-h)-；1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.41–7.28(m,5h),7.22–7.07(m,4h),7.01(m,1h),6.10(d,j＝7.8hz,1h),5.14–4.85(m,1h),4.60–4.34(m,1h),3.67(m,2h),3.46(m,2h),2.80(s,1h),2.65(m,2h),1.40(d,j＝7.0hz,3h)。[0125]化合物9的制备[0126]与制备化合物1方法相同，以中间体7-1为共同原料与(r)-1-(4-溴苯基)乙胺缩合得化合物9。ms(esi)635.9576(m-h)-；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.52(d,j＝7.8hz,1h),7.50(m,3h),7.40–7.28(m,2h),7.22(d,j＝8.2hz,2h),6.93(m,1h),6.80(m,1h),4.85(t,j＝7.2hz,1h),4.50–4.30(m,1h),3.70–3.50(m,3h),3.39(m,3h),2.66–2.52(m,2h),1.32(d,j＝7.0hz,3h)。[0127]药理实验实施例:[0128]实验例1:化合物对ldha酶抑制活性测定[0129]ldha分子酶活方法的建立是参考文献的报道[dragovich ps et al.bioorg med chem lett.2014,24(16):3764-71.384]，具体如下：孔板每孔10μl反应体系，包括50mm hepes(ph＝7.2)、0.01％(体积比)tritonx-100、0.1mg/ml牛γ球蛋白(bgg)、2mm dtt、50μm nadh、梯度稀释的ldha酶和50μm丙酮酸，避光配置好反应体系，通过测定nadh的含量改变来体现酶活。nadh的激发光波长340nm、发射波长480nm，使用bio-tek公司的synergy h1多功能酶标仪检测荧光，激发波长340nm、发射波长480nm，绘制10min内的荧光值变化曲线，取其中平直的一段计算斜率，用以表示酶催化反应速率，再绘制酶浓度-反应速率曲线，取线性区间中的最大酶浓度作为后续实验中ldha酶的最适浓度。[0130]ldha抑制剂的活性筛选：[0131]同样使用上述反应体系，设置空白组为不加ldha组，对照组为不加化合物组，阳性对照组为gne-140组，化合物组每个化合物从780nm，3倍梯度浓度稀释，检测在避光条件下，配制反应体系，在synergyh1荧光酶标仪中可进行测定(见公式1-1)。绘制10min内的荧光值变化曲线，取其中平直的一段计算斜率k，计算酶活抑制率：[0132]酶活抑制率＝[(k对照-k实验)/(k对照-k空白)]×100％[0133]以半数抑制率(ic50)表示化合物的抑制活性，10μm浓度抑制率小于50％的化合物表示为ic50＞10μm，测化合物的分子水平酶活抑制率，制作化合物浓度-酶活抑制率曲线，通过graphpad软件作图并拟合抑制率曲线求出ic50，化合物抑制率见表1。[0134]表1[0135][0136]根据表1的实验数据可知，本发明的化合物的ldha酶抑制活性低于阳性药物gne-140。[0137]实施例2:化合物对细胞乳酸分泌的影响[0138]步骤1：细胞培养[0139]选用前期工作已经确定对糖酵解敏感的人口腔鳞癌细胞株。细胞状态良好且处于对数生长期，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。所用的细胞培养基为：dmem(corning,usa)+10％胎牛血清(gibco,usa)。实验所用细胞均放置在5％co2，95％空气，37℃恒温培养箱中培养。[0140]步骤2：化合物对细胞乳酸分泌测定[0141]细胞乳酸分泌采用乳酸测定试剂盒(南京建成，南京，a019-2)进行检测。头颈癌细胞hn12以1.5×104/孔的密度接种于96孔板中，过夜贴壁，更换为180μl无血清培养基并加待测化合物处理12h(化合物浓度为50/25/12.5μm)，溶剂对照组含1％dmso。按试剂盒说明书提前配置好酶反应工作液与显色液，取新的96孔板，每孔加入2μl细胞培养基上清液、100μl酶反应工作液以及20μl显色液，37℃摇床孵育10min，加入200μl反应终止液，在酶标仪上测定530nm处的吸光度值，利用excel拟合标准曲线求出乳酸浓度，通过graphpad软件作图(*为p《0.05)。试验结果如图1和图2所示。[0142]由图1(由左到右依次对应gne-140，化合物1，化合物3，化合物4)和图2(由左到右依次对应gne-140，化合物6，化合物5，化合物7，化合物8，化合物9)可知，本发明的化合物对于头颈癌细胞hn12中乳酸分泌量具有显著的抑制作用，且以化合物4、6、7、8和9较佳，与阳性药物gne-140的抑制作用相似。[0143]实施例3:化合物对细胞增殖的影响[0144]将b16f10细胞以3×103/孔的密度接种于96孔板中，放入培养箱中过夜使细胞贴壁。用生理盐水配置药物至适当浓度，加药，20μl/well，放入培养箱中培养72h。加入cck-8染色液每孔20μl，放回培箱孵育1.5h后用酶标仪测量450nm处的od值，计算抑制率。[0145]抑制率＝[1－(od实验组/od对照组)]×100％[0146]通过graphpad软件作图并拟合抑制率曲线求出ic50，试验结果如表2所示。[0147]表2化合物对b16f10细胞的增殖抑制活性[0148]化合物gne-1406ic50(μm)22.8526.05[0149]由表2的实验数据可知，本发明的化合物对于b16f10细胞的增殖具有显著的抑制作用。[0150]实施例4:化合物体内抗肿瘤活性[0151]将b16f10细胞以1×105/只皮下接种于小鼠腋下，肿瘤长至约80～100mm3时分组开始给药，给药方式为每天瘤内注射给药，药物浓度为50mg/kg，每三天量瘤称重，待小鼠溶剂对照组平均瘤体积为2000mm3作为终点。通过graphpad软件作图(*为p《0.05)[0152]抑瘤率＝(对照组平均变化体积-实验组平均变化体积)/对照组平均变化体积×100％。[0153]实验结果如图3所示。[0154]由图3可知，相对于对照药物gne-140，本发明中化合物6具有较好的体内抗肿瘤活性，其抑瘤率达48％，而化合物gne140在相同的剂量下无明显的抗肿瘤活性。[0155]以上实施方式本质上仅为辅助说明，且并不欲用以限制申请目标的实施例或这些实施例的应用或用途。在本文中，用语“例示性”代表“作为一个实例、范例或说明”。本文中任一种例示性的实施形态并不必然可解读为相对于其他实施形态而言为优选或较有利者。[0156]此外，尽管已于前述实施方式中提出至少一例示性实施例或比较例，但应了解本发明仍可存在大量的变化。同样应了解的是，本文所述的实施例并不欲用以通过任何方式限制所请求的申请目标的范围、用途或组态。相反的，前述实施方式将可提供本领域具有普通知识人员一种简便的指引以实施所述的一种或多种实施例。再者，可对要素的功能与排列进行各种变化而不脱离申请专利范围所界定的范围，且申请专利范围包含已知的均等物及在本专利申请案提出申请时的所有可预见均等物。









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