用于递送修饰的淋巴细胞聚集体的方法和组合物与流程

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术用于递送修饰的淋巴细胞聚集体的方法和组合物1.相关申请案的交叉引用2.本技术要求以下的优先权：2020年3月5日提交的美国临时申请第62/985,741号；2020年8月31日提交的国际申请第pct/us2020/048843号；2021年1月11日提交的美国临时申请第63/136,177号；和2021年3月1日提交的美国临时申请第63/200,329号；2020年8月31日提交的国际申请第pct/us2020/048843号是2019年9月2日提交的国际申请第pct/us2019/049259号的部分继续申请；并且要求2019年9月1日提交的美国临时申请第62/894,849号；2019年9月1日提交的美国临时申请第62/894,852号；2019年9月1日提交的美国临时申请第62/894,853号；2019年9月2日提交的美国临时申请第62/894,926号；2019年12月3日提交的美国临时申请第62/943,207号；2020年3月5日提交的美国临时申请第62/985,741号的权益；国际申请第pct/us2019/049259号是2018年9月17日提交的国际申请第pct/us2018/051392号的部分继续申请；并且要求2018年9月2日提交的美国临时申请第62/726,293号；2018年9月2日提交的美国临时申请第62/726,294号；2018年9月6日提交的美国临时申请第62/728,056号；2018年9月17日提交的美国临时申请第62/732,528号；2019年3月20日提交的美国临时申请第62/821,434号；和2019年9月1日提交的美国临时申请第62/894,853号的权益；并且国际申请第pct/us2018/051392号是2018年3月3日提交的国际申请第pct/us2018/020818号的部分继续申请；并且要求2017年9月18日提交的美国临时申请第62/560,176号；2017年9月27日提交的美国临时申请第62/564,253号；2017年9月28日提交的美国临时申请第62/564,991号；和2018年9月6日提交的美国临时申请第62/728,056号的权益；国际申请第pct/us2018/020818号是2017年3月19日提交的国际申请第pct/us2017/023112号的部分继续申请；2017年7月8日提交的国际申请第pct/us2017/041277号的部分继续申请；2017年3月19日提交的美国申请第15/462,855号的部分继续申请；以及2017年7月8日提交的美国申请第15/644,778号的部分继续申请；并要求2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号；2017年9月18日提交的美国临时申请第62/560,176号；2017年9月27日提交的美国临时申请第62/564,253号；和2017年9月28日提交的美国临时申请第62/564,991号的权益；国际申请第pct/us2017/023112号要求2016年3月19日提交的美国临时申请第62/390,093号；2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号；和2017年3月3日提交的美国临时申请号62/467,039号的权益；国际申请第pct/us2017/041277号要求2017年3月19日提交的国际申请第pct/us2017/023112号；2017年3月19日提交的美国专利申请第15/462,855号；2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号；和2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号的权益；美国申请第15/462,855号要求2016年3月19日提交的美国临时申请第62/390,093号；2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号；和2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号的权益；并且美国申请第15/644,778号是2017年3月19日提交的国际申请第pct/us2017/023112号的部分继续申请；以及2017年3月19日提交的美国专利申请第15/462,855号的部分继续申请；并要求2016年7月8日提交的美国临时申请第62/360,041号和2017年3月3日提交的美国临时申请第62/467,039号的权益。这些申请通过引用以其整体并入本文。这些申请案以全文引用的方式并入本文中。3.序列表4.本技术案在此以引用的方式并入与本技术案一起提交的电子序列表的材料。电子序列表中的材料以于2021年3月3日创建的标题为“f1_003_wo_02_sequence_listing”的文本(.txt)文件(其文件大小是454kb)形式提交且以全文引用的方式并入本文中。技术领域5.本公开涉及免疫学领域或更具体地说，涉及t淋巴细胞或其它免疫细胞的基因修饰，以及控制这类细胞的增殖的方法。背景技术：6.自受试者(例如，患者)分离的淋巴细胞可在活体外活化且经基因修饰以表达合成蛋白，所述合成蛋白能够基于所并入的基因程序而与其它细胞及环境再定位结合。这类合成蛋白质的实例包括经工程改造的t细胞受体(tcr)和嵌合抗原受体(car)。目前使用的一种car是胞外识别结构域(例如，抗原结合结构域)、跨膜结构域及由复制缺陷型重组反转录病毒编码的一个或多个胞内信号传导结构域的融合物。7.尽管重组反转录病毒已在感染非分裂细胞上显示出功效，但静息cd4及cd8淋巴细胞对这些载体的基因转导不敏感。为了克服这些困难，通常在可出现对car基因载体的基因修饰之前使用刺激剂在活体外活化这些细胞。在刺激和转导之后，经基因修饰的细胞在活体外扩增且随后再引入到淋巴去除的患者中。在体内抗原接合之后，car的细胞内信号传导部分可以在免疫细胞中起始活化相关的反应且释放细胞溶解分子以诱导靶细胞死亡。8.这类目前方法需要广泛的操纵及在t细胞再输注至患者中之前在活体外制造增殖性t细胞，以及淋巴去除化学疗法以释放细胞因子及去除竞争性受体以有助于t细胞移植。一旦引入至身体中，这类car疗法另外不能控制体内传播速率，也不能安全地定向也在肿瘤外表达的目标。因此，现今car疗法一般由使用1×105至1×108个细胞/千克的剂量离体扩增12至28天的细胞输注，且针对目标(例如，肿瘤目标)，对于所述car疗法，偏离肿瘤的目标毒性上一般是可接受的。这些相对较长离体扩增时间产生细胞存活性及无菌性问题，以及除可调性的挑战以外的样品一致性问题。因此，显著需要一种更安全、更有效的可调t细胞或nk细胞疗法。非常需要进一步降低这类方法的复杂性和所需的时间，特别是如果这类方法允许受试者例如在输注中心内采集血液且接着在同一天将其再引入到受试者中，那么将是非常理想的。此外，单独的更简单且更快速的方法或需要较少的专业仪器的方法可能会使这些目前仅在高度专业化的医疗中心定期进行的细胞疗法过程大众化。9.由于我们对驱动淋巴细胞的转导、增殖和存活的过程的理解是涉及免疫过程的各种潜在商业用途的核心，因此需要经改善的方法及组合物以用于研究淋巴细胞。举例来说，其将有助于识别可用于更好的表征及理解淋巴细胞可如何经基因方式修饰的方法及组合物以及影响其存活及增殖的因素。此外，其将有助于识别驱动淋巴细胞增殖及存活的组合物。这些组合物可以用于研究对这类过程的调节。除用于研究淋巴细胞的方法及组合物以外，需要经改善的病毒包装细胞系以及其制造和使用方法。举例来说，这些细胞系和方法将适用于分析重组病毒(如重组反转录病毒颗粒)的不同组分，以及用于使用包装细胞系产生重组反转录病毒颗粒的方法。10.此外，仍然需要用于诱导血液、器官和组织，并且优选地和特别是肿瘤微环境中的淋巴细胞的增殖和/或存活的经改善的组合物和方法。以前的方法使用了具有组成型表达car的细胞，这些细胞在结合靶抗原时，在car刺激的诱导型启动子的控制下诱导分泌的细胞因子的表达。这些分泌的细胞因子非特异性地结合至t细胞和nk细胞并对其进行刺激，从而减少了可用于刺激car t细胞或nk细胞的细胞因子的量。细胞因子也可以扩散，进一步减少可用于刺激car t细胞或nk细胞的细胞因子。这些现有方法通常需要在单独的载体上对转录单元进行多次转导，并且需要较长的血细胞处理时间，因此需要癌症患者在其血液被采集后等待数天、数周、并且甚至数月，以接收其经基因工程改造的血细胞。在使用编码多于一个转录单元的载体的一个步骤中进行car-t细胞转导的现有方法产生低病毒滴度和/或导致一个或多个转录单元的低表达，每一个转录单元都是作为一般治疗方法的商业化的主要障碍。因此，仍然需要更有效的方法来产生car-t细胞，该car-t细胞在血液、器官和组织，并且优选地且特别地在抑制性肿瘤微环境中存活和增殖。技术实现要素：11.本文中提供简化和加速以基因方式修饰淋巴细胞(在说明性实施例中为t细胞和/或nk细胞)的过程的方法、用途、组合物和试剂盒。本文提供的一些方面和实施例非常适合于护理点细胞处理，并且不需要将细胞运输到专门的处理设施。此外，本文提供的方法、用途、组合物和试剂盒帮助克服关于用于转导和/或修饰并且在说明性实施例中以基因方式修饰淋巴细胞(如t细胞和/或nk细胞)的方法的有效性及安全性的问题。这类方法的某些实施例适用于用这些细胞进行过继性细胞疗法。因此，在一些方面中，本文中提供用于修饰淋巴细胞(尤其t细胞和/或nk细胞)和/或用于调节被转导的、被基因修饰的和/或被修饰的t细胞和/或nk细胞的方法、组合物和试剂盒。与当前技术相比，尤其与表达经工程改造的t细胞受体(tcr)、嵌合抗原受体(car)和在说明性实施例中，微环境受限生物(“mrb”)car的t细胞和/或nk细胞相比，这类方法、组合物和试剂盒提供改善的功效和安全性。在经由反转录病毒(例如，慢病毒)颗粒自反转录病毒(例如，慢病毒)基因组递送的说明性实施例中，由本文中所提供的方法产生和/或用于本文中所提供的方法中的被转导的和/或被修饰的和在说明性实施例中被基因修饰的t细胞和/或nk细胞包括提供这类细胞和利用这类细胞的方法(如研究方法、商业生产方法和过继性细胞疗法)的改善的特征的官能团和官能团的组合。举例来说，这类细胞可离体在较短时间内产生，且所述细胞具有可被更好调节的改善的生长特性。在说明性实施例中，这类方法、用途、组合物和试剂盒包括或适于肌内或在另外的说明性实施例中皮下递送至受试者。12.在一些方面中，提供用于转导和/或修饰和在说明性实施例中基因修饰淋巴细胞(如t细胞和/或nk细胞)的方法，且在说明性实施例中，提供用于转导、基因修饰和/或修饰静息t细胞和/或nk细胞的离体方法。这些方面中的一些可比先前方法更快速地执行，这可有助于更有效的研究、更有效的商业生产以及改善的患者护理方法。本文中所提供的方法、用途、组合物和试剂盒可以用作研究工具、用于商业生产以及用于由表达tcr或car的被转导的和/或被修饰的和在说明性实施例中被基因修饰的t细胞和/或nk细胞进行的过继性细胞疗法中。13.关于本文中所提供的与淋巴细胞(如t细胞和/或nk细胞)的转导相关的方法、用途和组合物，本文中提供方法以及相关用途和组合物，其包括被富集的pbmc、tnc的转导反应或未进行预先细胞富集的转导反应，如在全血中，其是用于进行离体细胞处理(例如car-t疗法)的简化和更快速的方法。这类方法需要较少的专业仪器和培训。此外，与体内转导方法相比，这类方法降低了非靶细胞转导的风险。此外，本文中提供方法、用途和组合物，其包括上述方法的实施例，所述方法、用途和组合物包括可以任选地与本文中所提供的任何其它方面组合以提供用于体外、离体和体内驱动淋巴细胞(尤其t细胞和/或nk细胞)的扩增的有效方法、用途和组合物的某些目标抑制性rna、活化元件、多肽淋巴增生性元件、假型化元件和人工抗原呈递细胞。在一些实施例中，被修饰的淋巴细胞能够在淋巴丰富的环境中移植。在一些实施例中，患者或受试者在用被修饰的和/或被基因修饰的t细胞和/或nk细胞再输注之前不是淋巴耗尽的。14.在一些方面和实施例中，本文提供了基因构建体，其特别适于为被基因修饰的t细胞和/或nk细胞提供以更可控的方式存活和增殖的能力。与可操作地连接到淋巴增生性元件的组成型启动子或可操作地连接到分泌的细胞因子的诱导型启动子相反，这类方面和实施例提供可操作地连接到膜结合的淋巴增生性元件的诱导型启动子，当通过car结合到其靶标而诱导时，所述启动子可以诱导t细胞和/或nk细胞的增殖，诸如，例如存在于肿瘤微环境中的那些。15.贯穿本专利申请案提供关于本公开的方面和实施例的其它细节。章节及章节标题是为了易于阅读且并不意图限制整个章节中的本公开的组合，如方法、组合物和试剂盒或其中的功能元件。附图说明16.图1a-1g是非限制性例示性细胞处理工作流程的流程图。图1a是使用在pbmc中的t细胞和nk细胞与反转录病毒颗粒接触之前进行pbmc分离的系统的方法的流程图。在pbmc分离之前，可以启动任选的步骤来耗尽不需要的细胞。图1b是在总有核细胞(tnc)中的t细胞和nk细胞与反转录病毒颗粒接触之前进行总有核细胞分离的过程的流程图。可以在tnc分离之后和在任选的pbmc分离之前，启动任选的步骤以耗尽不需要的细胞。图1c是其中在全血中的t细胞和nk细胞与反转录病毒颗粒接触之前不进行血细胞分级分离或富集，并且在接触和任选的培育之后进行pbmc分离的过程的流程图。在pbmc分离之前，可以启动任选的步骤来耗尽不需要的细胞。图1d是其中在全血中的t细胞和nk细胞与反转录病毒颗粒接触之前不进行血细胞分级分离或富集，并且在接触和任选的培育之后进行tnc分离/浓缩的过程的流程图，在说明性实施例中使用过滤，例如使用白细胞减少过滤器总成进行。在tnc分离/浓缩步骤之前，可以进行任选的步骤以耗尽不需要的细胞，然后进行过滤过程。图1e是在总有核细胞中的t细胞和nk细胞与反转录病毒颗粒“冷接触”之前进行tnc分离的过程的流程图。可以在分离tnc之前启动任选的步骤以耗尽不需要的细胞。另一任选的步骤是二次培育，其任选地与粗过滤结合以捕获淋巴细胞聚集体和/或去除不需要的细胞。图1f是在总有核细胞中的t细胞和nk细胞与反转录病毒颗粒“冷接触”之前进行tnc分离的过程的流程图。可以在分离tnc之前启动任选的步骤以耗尽不需要的细胞。另一任选的步骤是二次培育。图1g是一个过程的流程图，其中在全血中的t细胞和nk细胞与反转录病毒颗粒接触之前不进行血细胞分级分离或富集，并且使用粗滤器来捕获将包含t细胞和/或nk细胞的聚集体。任何一个或多个清洗步骤都是任选的。这些细胞处理工作流程中的每一个都可以用于rpoc细胞疗法。17.图2是非限制性例示性白细胞减少过滤器总成(200)的图，所述白细胞减少过滤器总成具有相关血液处理袋、管、阀门和包含白细胞减少过滤器集合的过滤器壳体(210)。18.图3是具有相关管、注射器和培育袋(314)的非限制性例示性转导总成(301)的图。19.图4是非限制性例示性白细胞减少过滤器总成(400)的图，所述白细胞减少过滤器总成具有相关血液处理袋、管、阀门和包含白细胞减少过滤器集合的过滤器壳体(410)。20.图5展示在用f1-3-23gu转导全血4小时后第7天cd3和etag在活淋巴细胞群体上的表达的轮廓facs图，随后通过使用说明性的白细胞减少过滤器总成通过tnc过滤分离总有核细胞。21.图6展示在静脉内car-t给药后第7、14和21天的个体小鼠中，每60μl外周血中的cd3+etag+car-t细胞的数量。给药的细胞是未转导的，或者是用f1-3-247gu以指定的moi转导的。22.图7展示皮下car-t给药后第8、14和21天的个体小鼠中，每60μl外周血中的cd3+etag+car-t细胞的数量。给药的细胞是未转导的，或者是用f1-3-247gu以指定的moi转导的。23.图8展示在第0天静脉内给药pbmc的b-ndg小鼠中raji肿瘤的平均肿瘤体积的图，所述pbmc未被转导(unt)或通过以指定的moi暴露于f1-3-247gu 4小时而被转导(trnsd)。如所指示的，每组中的小鼠被给药100万或500万pbmc。24.图9展示在第0天皮下给药pbmc的b-ndg小鼠中raji肿瘤的平均肿瘤体积的图，所述pbmc未被转导(unt)或通过以指定的moi暴露于f1-3-247gu 4小时而被转导(trnsd)。如所指示的，每组中的小鼠被给药100万或500万pbmc。25.图10展示具有发散的转录单元的说明性双顺反子慢病毒基因组载体的示意图。在nfat应答性最小il-2启动子(6x nfat)的转录控制下，包含e标签化的淋巴增生性元件(etag:le)和随后的聚腺苷酸化序列(polya)的第一转录单元以相反方向编码。任选地，隔离子元件(ins)将第一转录单元和第二转录单元分开。第二转录单元在组成型启动子(启动子)的转录控制下编码car(car)，并以正向方向编码。以虚线所示的三角形代表3个可能的位置，在其中任何一个或多个位置中，一个或多个mirna可以被任选地插入到载体中。以点线所示的三角形表示启动子(如例如ef1-a)内的外显子的1个可能位置，其中一个或多个mirna可以被任选地插入到载体中。“sa”和“sd”对应于剪接供体和剪接受体位点。26.图11展示表达etag的cd3+car+pmbc的百分比的图。用指定的双顺反子慢病毒基因组构建体转导pbmc，并从第7天开始每隔一天用表达cd19的raji细胞喂养，或在不存在外源性细胞因子的情况下保持不喂养。如所指示的，通过流式细胞术每天测定cd3+car+细胞的etag表达。27.图12a-d展示cd3+car+pmbc的扩增倍数的图。用慢病毒基因组构建体f1-3-635(图12a)、f1-3-637(图12b)、f1-3-23(图12c)或f1-3-247(图12d)转导pbmc，并从第7天开始每隔一天用表达cd19的raji细胞喂养，或在不存在外源性细胞因子的情况下保持不喂养。通过流式细胞术检测cd3+car+细胞。28.图13展示cd3+car+pmbc的扩增倍数的图。用慢病毒基因组构建体f1-3-635、f1-3-637、f1-3-23或f1-3-635转导pbmc，并在第7天之后在没有细胞因子的情况下保持不喂养和培养。29.图14展示cd3+car+pmbc的生存力百分比的图。用慢病毒基因组构建体f1-3-635、f1-3-637、f1-3-23或f1-3-635转导pbmc，并在第7天之后在没有细胞因子的情况下保持不喂养和培养。30.图15展示在第0天皮下给药pbmc的nsg-(kbdb)缺陷型(ia)缺陷型小鼠中raji-萤光素酶播散性肿瘤负荷的总通量[p/s]的图，所述pbmc未被转导(g1)或通过将全血暴露于f1-3-637gu(g2)或f1-4-713gu(g3)慢病毒颗粒4小时然后进行pbmc富集程序转导的。g4中的小鼠用来自g2和g3的半剂量pbmc治疗。f1-3-637gu和f1-4-713gu的基因组载体分别将自驱动car编码为cd19和cd22。[0031]图16展示图23中的小鼠存活8周的概率的图。[0032]图17展示在补充有rhil-2的cts培养基中培养6天后，经f1-3-637gu转导的tnc的总细胞回收率和细胞表面标记物表达。rpoc细胞过程中的接触步骤如图1d(全血)或图1b(在过滤器上)中所示地执行。[0033]图18展示在细胞保持未处理(na)或用cho-s、raji或pma+离子霉素处理16小时后，如通过elisa测定的通过来自图25的细胞的ifnγ产生(pg/ml)的图。[0034]图19示出了在第0天皮下给药pbs(g1)、tnf(g2)、pbmc(g3)或通过将全血暴露于f1-3-637gu慢病毒颗粒4小时随后进行如图1d所示的tnf富集程序(g4)或如图1c所示的pbmc富集程序(g5)而转导的细胞的nsg小鼠中raji-萤光素酶播散性肿瘤负荷的总通量[p/s]的图。[0035]图20示出了代表性的facs等高线图，其显示了在与浓度增加的f1-3-247gu rip接触后的cd3变暗的细胞，所述f1-3-247gu rip在其表面上展示cd3 t细胞活化元件。将全血与病毒接触4小时，然后裂解rbc并为fac准备细胞。图20a示出了fsc-h相对于ssc-h，图20b示出了cd3相对于cd4，图20c示出了cd3相对于cd8。[0036]图21是示出具有如从针对图20描述的实验相同的实验所示的表面表型的细胞的百分比的表。[0037]图22是示出了在使全血与在其表面上显示cd3 t细胞活化元件的f1-3-247gu rip接触后，然后进行pbmc或tnf分离后，具有如所示的表面表型的细胞百分比的表。[0038]图23示出了在从已经与f1-3-748gu接触4小时的全血中分离细胞并注射到小鼠中之后，tnf的生物分布。图23a示出了这些细胞在它们被皮下注射后的生物分布。图23b示出了这些细胞在它们被静脉内注射后的生物分布。[0039]图24a示出了在静脉内用人pbmc重建nsg-mhc1/2-dko小鼠27天后，小鼠血液中人cd45和鼠cd45表达的斑点印迹。[0040]图24b示出了在小鼠被静脉内和/或皮下注射如所示的测试制品后27天，小鼠中每ml血液cd4+car+和cd8+car+细胞的数目的图。该图表示在每组中来自5只小鼠的平均值。[0041]图25示出了在小鼠被静脉内和/或皮下注射如所示的测试制品后21天小鼠中每ml血液cd19+靶细胞的数目的图。该图表示在每组中来自5只小鼠的平均值。[0042]图26示出了皮下注射pbmc后来自小鼠的h&e染色的皮肤和皮下组织的显微照片，所述pbmc通过用f1-3-247gu的rpoc细胞处理方法修饰并皮下注射。示出了第1天(图26a)、第7天(图26b)、第14天(图26c)和第21天(图26d)的代表性字段。[0043]图27示出了通过暴露于f1-6-744gu 4小时，在第0天皮下施用了100万或500万tnc的b-ndg小鼠中n87肿瘤的平均肿瘤体积的图。[0044]定义[0045]如本文中所使用，术语“嵌合抗原受体”或“car”或“cars”是指经工程改造的受体，其将抗原特异性移植至细胞上，例如t细胞、nk细胞、巨噬细胞和干细胞。本发明的car包括至少一个抗原特异性靶向区(astr)、跨膜结构域(tm)及胞内活化结构域(iad)，且可以包括柄和一个或多个共刺激结构域(csd)。在另一实施例中，car是对两种不同抗原或抗原决定基具有特异性的双特异性car。在astr与目标抗原特异性结合之后，iad活化细胞内信号传导。举例来说，iad可以非mhc限制的方式将t细胞特异性及反应性再引导至所选择的目标，从而利用抗体的抗原结合特性。非mhc限制的抗原识别赋予表达car的t细胞不依赖于抗原处理而识别抗原的能力，因此绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在t细胞中表达时，car有利地不与内源性t细胞受体(tcr)α链和β链发生二聚。[0046]如本文所用，术语细胞“聚集体”是指彼此粘附的细胞簇。[0047]如本文中所使用，术语“组成型t细胞或nk细胞启动子”是指当与编码或指定基因产物的聚核苷酸可操作地连接时，在细胞的大部分或所有生理条件下使基因产物在细胞中产生的启动子。[0048]如本文中所使用，术语“诱导型启动子”或“活化型启动子”是指当与编码或指定基因产物的聚核苷酸可操作地连接时，基本上仅当启动子特异性诱导剂存在于细胞中时，导致基因产物在细胞中产生的启动子。诱导型启动子没有基础转录活性或具有较低水平的基础转录活性，但在诱导信号存在的情况下，转录活性会增加，有时会大幅增加。[0049]如本文中所使用，术语“隔离子”是指介导染色体内相互作用和染色体间相互作用并且可以阻断增强子与启动子之间的相互作用的顺式调节元件。通常，隔离子的长度为200至2000个碱基对，并且包含序列特异性dna结合蛋白的聚集结合位点。[0050]如本文中所使用，术语“微环境”意谓与其它组织区域或身体区域具有恒定或时间上、物理上或化学上的差异的组织或身体的任何部分或区域。举例来说，如本文中所使用的“肿瘤微环境”是指其中存在肿瘤的环境，所述环境是肿瘤内的非细胞区域和刚好位于肿瘤组织外部，但与癌细胞本身的细胞内腔室无关的区域。肿瘤微环境可以指肿瘤环境的任何和所有条件，所述条件包括为恶化过程创建结构性和/或功能性环境以存活和/或扩增和/或扩散的条件。举例来说，肿瘤微环境可以包括条件的变化，所述条件如(但不限于)：压力、温度、ph值、离子强度、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧化应激、一种或多种溶质的浓度、电解质的浓度、葡萄糖的浓度、玻尿酸的浓度、乳酸或乳酸盐的浓度、白蛋白的浓度、腺苷的水平、r-2-羟基戊二酸的水平、丙酮酸的浓度、氧的浓度和/或氧化剂、还原剂或辅助因子的存在，以及所属领域的技术人员将理解的其它条件。[0051]如本文中可互换地使用，术语“聚核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，此术语包括(但不限于)：单股、双股或多股的dna或rna、基因组dna、cdna、dna-rna杂交体，或包含嘌呤碱基和嘧啶碱基或其它天然、经化学方式或生物化学方式修饰的非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。[0052]如本文中所使用，术语“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体，所述多克隆抗体和单克隆抗体包括完整的抗体及保留与抗原特异性结合的抗体片段。抗体片段可以是(但不限于)：片段抗原结合片段(fab)片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、fab'-sh片段、(fab')2fv片段、fd片段、重组igg(rigg)片段、单链抗体片段，包括单链可变片段(scfv)、二价scfv、三价scfv及单结构域抗体片段(例如，sdab、sdfv、纳米抗体)。所述术语包括免疫球蛋白的经基因工程改造和/或以其它方式修饰的形式，如胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、单链抗体、完全人类抗体、人类化抗体、包括抗体及非抗体蛋白质的抗原特异性靶向区的融合蛋白质、杂结合抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双功能抗体、三功能抗体及四功能抗体)、串联二-scfv及串联三-scfv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。所述术语还包括完整或全长抗体，包括任何类别或子类别的抗体，包括igg及其子类别、igm、ige、iga及igd。[0053]如本文中所使用，术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2及fv片段；双功能抗体；线性抗体(zapata等人,《蛋白质工程(protein eng.)》8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“fab”片段，各自具有单个抗原结合位点)及残余“fe”片段(一种反映容易结晶的能力的指示)。胃蛋白酶处理产生f(ab')2片段，所述片段具有两个抗原组合位点并且仍然能够交联抗原。[0054]如本文中可互换地使用，术语“单链fv”、“scfv”或“sfv”抗体片段包括抗体的vh结构域及vl结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施例中，fv多肽进一步包括在vh结构域与vl结构域之间的多肽连接子或间隔子，其使得sfv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于sfv的综述，参见《单克隆抗体药理学中的固定式多价型分子(pluckthun in the pharmacology of monoclonal antibodies)》，第113卷,rosenburg和moore编辑,纽约斯普林格出版社(springer-verlag,new york),第269-315页(1994)。[0055]如本文中所使用的，“天然存在”的vh结构域和vl结构域是指已经从宿主分离而未进一步分子进化以改变其在特殊条件下以scfv形式产生时的亲和力的vh结构域和vl结构域，如在美国专利案8709755b2及申请案wo/2016/033331a1中所公开的vh结构域和vl结构域。[0056]如本文所使用的，“抗体模拟物”是指特异性地结合靶序列并且具有不同于天然存在的抗体的结构的有机化合物。抗体模拟物可以包括蛋白质、核酸或小分子，并且熟练的技术人员可以理解每种类型何时相关。本公开的抗体模拟特异性结合至其的靶序列可以是抗原。抗体模拟物可以提供优于抗体的优异的性能，包含但不限于优异的溶解度、组织渗透、针对热和酶的稳定性(例如，对酶促降解的抗性)以及较低的生产成本。抗体模拟物包含但不限于亲和体、亲和(afflilin)、亲和聚体(affimer)、亲和丁(affitin)、阿尔法体(alphabody)、alphamab、抗运载蛋白(anticalin)、armadillo重复蛋白、三聚体、亲和多聚体(avimer)(也被称为亲合力多聚体)、c型凝集素结构域、半胱氨酸结微蛋白、环肽、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白-4、darpin(设计的锚蛋白重复蛋白(designed ankyrin repeat protein))、纤维蛋白原结构域、纤连蛋白结合结构域(fn3结构域)(例如，附着蛋白或单克隆抗体(monobody))、fynomer、扭结菌(knottin)、kunitz结构域肽、富含亮氨酸的重复结构域、脂质运载蛋白结构域、mab 2或fcabtm、纳米抗体、纳米钳、obody、pronectin、单链tcr、三角形四肽重复结构域(tetratricopeptide repeat domain)或v样结构域。[0057]如本文中所使用，术语“亲和力”是指两种试剂的可逆结合的平衡常数，且被表示为解离常数(kd)。亲和力可比抗体针对不相关氨基酸序列的亲和力高至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍或更高。抗体对于目标蛋白质的亲和力可以是例如约100纳摩尔(nm)至约0.1nm、约100nm至约1皮摩尔(pm)，或约100nm至约1飞摩尔(fm)或更高。如本文中所使用，术语“亲合力(avidity)”是指两种或更多种试剂的复合物在稀释后对解离的抗性。关于抗体和/或抗原结合片段，术语“免疫反应性”及“优先结合”在本文中可互换地使用。[0058]如本文中所使用，术语“结合(binding)”是指归因于(例如)共价相互作用、静电相互作用、疏水性相互作用及离子相互作用和/或氢键相互作用(包括如盐桥键及水桥键的相互作用)而在两个分子之间的直接缔合。非特异性结合是指亲和力小于约10-7m的结合，例如亲和力小于10-6m、10-5m、10-4m等的结合。[0059]如本文中所使用，提及“细胞表面表达系统(cell surface expression system)”或“细胞表面呈现系统(cell surface display system)”是指蛋白质或其部分在细胞表面上的呈现或表达。通常，产生表达与细胞表面蛋白质融合的相关蛋白质的细胞。举例来说，蛋白质表达为具有跨膜结构域的融合蛋白质。[0060]如本文中所使用，术语“元件”包括多肽(包括多肽的融合物、多肽的区及其功能性突变体或片段)及聚核苷酸(包括微型rna及shrna，以及其功能性突变体或片段)。[0061]如本文中所使用，术语“区”是多肽或聚核苷酸的任何区段。[0062]如本文中所使用，“结构域”是具有功能性和/或结构性特性的多肽或聚核苷酸的区。[0063]如本文中所使用，术语“柄”或“柄结构域”是指提供结构性柔性且与侧接多肽区间隔的灵活的多肽连接区，且可由天然或合成的多肽组成。柄可衍生自免疫球蛋白(例如，iggl)的铰链或铰链区，其一般被定义为自人类iggl的glu216拉伸至pro230(burton(1985)《分子免疫学(molec.immunol.)》,22:161-206)。可以通过使第一个半胱氨酸残基与最后一个半胱氨酸残基在相同位置形成重链间二硫键(s-s)来将其它igg同型的铰链区与igg1序列进行比对。柄可以是天然存在或非天然存在的，其包括(但不限于)经改变的铰链区，如美国专利胺第5,677,425号所公开。柄可包括衍生自任何类别或子类别的抗体的完整铰链区。柄还可以包括衍生自cd8、cd28或在提供柔性且与侧接区间隔上提供类似功能的其它受体的区。[0064]如本文中所使用，术语“(经)分离”意谓材料是自其原始环境(例如，当其为天然存在时，则是自天然环境)移出。举例来说，存在于活体动物中的天然存在的聚核苷酸或多肽是未经分离的，但自天然系统中的共存材料的一些或全部分离的相同聚核苷酸或多肽则是经分离的。这类聚核苷酸可以是载体的一部分，和/或这类聚核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是经分离的，这因为这类载体或组合物不是其自然环境的一部分。[0065]如本文中所使用，“多肽”是由肽键连接的单链氨基酸残基。多肽既不折叠成固定结构，也不具有任何翻译后修饰。“蛋白质”是折叠成固定结构的多肽。“多肽”及“蛋白质”在本文中可互换地使用。[0066]如本文中所使用，多肽可经“纯化”以去除多肽的天然环境的杂质组分，例如，将干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，如酶、激素及其它蛋白质或非蛋白质溶质。可以将多肽纯化达到(1)按劳里法(lowry method)测定的以抗体重量计的大于90％、大于95％或大于98％，例如超过99重量％，(2)使用旋转杯测序仪足以获得至少15个n末端或内部氨基酸序列残基的程度，或(3)使用考马斯蓝(coomassie blue)或银染色，在还原或非还原条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)达到均质。[0067]如本文中所使用，术语“免疫细胞”一般包括衍生自骨髓中产生的造血干细胞(hsc)的白血细胞(白细胞)。“免疫细胞”包括例如淋巴细胞(t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞)及骨髓衍生的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。[0068]如本文中所使用，“t细胞”包括表达cd3的所有类型的免疫细胞，包括辅助t细胞(cd4+细胞)、细胞毒性t细胞(cd8+细胞)、调节性t细胞(treg)及γ-δt细胞。为cd3+、cd56+和cd4+或cd8+的nkt细胞被认为是本文的t细胞的类型。cd3的表面表达可以在t细胞中瞬时减少或消除，如本文公开的用于修饰t细胞的一些方法所观察到的。在本公开中，具有瞬时减少的/不存在的cdcd3表面表达的此类修饰的cdcd4+或cdcd8+淋巴细胞仍被认为是t细胞。本文中提及“cd”或分化标记物的簇(例如cd3+、cd4+、cd8+、cd56+)涉及此类多肽的表面表达。应当理解，表面表达是阳性和阴性之间的连续体，并且可以通过facs分析来评估，其中基于本领域已知的用户截止，确定细胞是阳性的阴性的。通过facs分析确定的表面标记物的低和中等表达(例如cd3lo或cd3int)在本文中被认为是表面标记物阴性的(例如cd3-)。[0069]如本文所使用的，“nk细胞”包含在其表面上表达cd56的淋巴细胞(cd56+淋巴细胞)。为cd3+、cd56+和cd4+或cd8+的nkt细胞被视为本文的nk细胞的类型。[0070]如本文中所使用，“细胞毒性细胞”包括cd8+t细胞、自然杀伤(nk)细胞、nk-t细胞、γδt细胞(一种cd4+细胞的子群)及嗜中性粒细胞(其为能够介导细胞毒性反应的细胞)。[0071]如本文中所使用，术语“干细胞”一般包括分化多能或多潜能干细胞。“干细胞”包括例如胚胎干细胞(es)；间充质干细胞(msc)；诱导型分化多能性干细胞(ips)；和定型祖细胞(造血干细胞(hsc)、骨髓衍生细胞等)。[0072]如本文中所使用，术语“治疗(treatment/treating)”等是指获得所需药理学和/或生理学作用。所述作用就完全或部分地预防疾病或其症状来说可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良影响来说可以是治疗性的。如本文中所使用的“治疗”涵盖哺乳动物中的(例如，人类中的)疾病的任何治疗，且包括：(a)预防在易患疾病但尚未被诊断为患有疾病的受试者中发生疾病；(b)抑制疾病，即遏止其发展；和(c)减轻疾病，即引起疾病消退。[0073]如本文中互换地使用，术语“个体”、“受试者”、“宿主”及“患者”是指哺乳动物，包括(但不限于)人类、鼠类(例如，大鼠、小鼠)、兔类(例如，兔)、非人类灵长类动物、人类、犬、猫、有蹄类动物(例如，马、牛、绵羊、猪、山羊)等。[0074]如本文中所使用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指在向哺乳动物或其它受试者施用以用于治疗疾病时足以影响疾病的这类治疗的试剂的量或两种试剂的组合量。“治疗有效量”将视试剂、疾病及其严重程度以及所治疗的受试者的年龄、体重等而变化。[0075]如本文中所使用，术语“进化(evolution/evolving)”是指使用一种或多种突变方法以产生编码不同多肽的不同聚核苷酸，所述多肽本身是经改善生物分子和/或有助于产生另一经改善生物分子。“生理学”或“正常”或“正常生理学”条件是如(但不限于)以下的条件：压力、温度、ph值、离子强度、渗透压、重量渗透摩尔浓度、氧化应激、一种或多种溶质的浓度、电解质的浓度、葡萄糖的浓度、玻尿酸的浓度、乳酸或乳酸盐的浓度、白蛋白的浓度、腺苷的水平、r-2-羟基戊二酸的水平、丙酮酸的浓度、氧的浓度和/或氧化剂、还原剂或辅助因子的存在，以及将被视为在施用位点处或在作用位点处的组织或器官处对于受试者是在正常范围内的其它条件。[0076]如本文中所使用，“转导的细胞”或“稳定转染的细胞”是含有整合到细胞基因组中的外源核酸的细胞。如本文中所使用，“基因修饰的细胞”是含有外源核酸的细胞，而与是否将外源核酸整合到细胞的基因组中无关，并且与用于将外源核酸引入到细胞中的方法无关。细胞内的未整合到细胞基因组中的外源核酸在本文中可以被称为“染色体外的”。如本文中所使用，“修饰的细胞”是与重组核酸载体(本文中也被称为“基因载体”)相关的细胞，在说明性实施例中，重组核酸载体是含有外源核酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(本文中也被称为“rir反转录病毒颗粒”或“rip”)，或者是已经被外源核酸基因修饰的细胞。通常，在包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的组合物和方法中，修饰的细胞通过细胞的表面上的蛋白质与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的蛋白质(包括假型化元件和/或t细胞活化元件)之间的相互作用与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒缔合。在包括在脂质基试剂如脂质体试剂内转染核酸的组合物和方法中，含有核酸的脂质基试剂(其是一种类型的重组核酸载体)在融合或被修饰的细胞内化之前与修饰的细胞的脂质双层缔合。类似地，在包括基于化学品的核酸的转染(例如基于聚乙烯亚胺(pei)或磷酸钙的转染)的组合物和方法中，核酸通常与带正电荷的转染试剂缔合以形成重组核酸载体，该重组核酸载体在复合物被修饰的细胞内化之前与修饰的细胞的带负电荷的膜缔合。稳定地转染或基因修饰细胞的其它手段或方法包括电穿孔、弹道递送和显微注射。如本文中所使用的“多肽”可以包括蛋白质分子的部分或完整蛋白质分子以及任何翻译后或其它修饰。[0077]如本文中所使用的假型化元件可以包括“结合多肽”，其包括识别且结合目标宿主细胞的一种或多种多肽(通常糖蛋白)，和一种或多种“促融合多肽”，其介导反转录病毒与目标宿主细胞膜融合，从而使反转录病毒基因组进入目标宿主细胞。如本文中所使用的“结合多肽”也可以被称为“t细胞和/或nk细胞结合多肽”或“目标接合元件”，且“促融合多肽”也可以被称为“促融合元件”。[0078]“静息”淋巴细胞(例如，静息t细胞)为细胞周期的不表达活化标记物(如ki-67)的g0阶段中的淋巴细胞。静息淋巴细胞可以包括从未接触特异性抗原的原生t细胞及已由与抗原的先前接触而更改的记忆t细胞。“静息”淋巴细胞也可以被称为“静态”淋巴细胞。[0079]如本文中所使用，“淋巴细胞耗减”涉及(例如通过施用淋巴细胞耗减试剂)减少受试者中的淋巴细胞的数目的方法。部分身体或全身分级放射疗法也可以引起淋巴细胞耗减。淋巴细胞耗减试剂可以是能够在将其向哺乳动物施用时减少所述哺乳动物中的功能性淋巴细胞的数目的化学化合物或组合物。这类试剂的一个实例是一种或多种化疗剂。这类试剂及剂量是已知的，且可由治疗医师视所治疗的受试者来选择。淋巴细胞耗减试剂的实例包括(但不限于)氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺、克拉屈滨(cladribine)、地尼介白素迪夫托斯(denileukin diftitox)、alemtizumab或其组合。[0080]rna干扰(rnai)是一种生物学过程，其中rna分子通过中和目标rna分子来抑制基因表达或翻译。rna目标可以是mrna，或其可以是对rnai的功能性抑制敏感的任何其它rna。如本文中所使用，“抑制性rna分子”是指其存在于细胞内产生rnai且引起抑制性rna分子所靶向的转录物的表达降低的rna分子。如本文中所使用的抑制性rna分子具有能够形成rna双螺旋的5'茎及3'茎。抑制性rna分子可为例如mirna(内源性或人工的)或shrna、mirna的前体(即pri-mirna或pre-mirna)或shrna，或作为经分离核酸直接转录或引入细胞或受试者的dsrna。[0081]如本文中所使用，“双股rna”或“dsrna”或“rna双螺旋”是指包含两个股的rna分子。双股分子包括由杂交以形成双螺旋rna结构的两个rna股组成的分子，或其自身折叠以形成双螺旋结构的单rna股。双螺旋区中的大多数但未必所有碱基是碱基配对的。双螺旋区包含与目标rna互补的序列。与目标rna互补的序列为反义序列，且通常为18至29、19至29、19至21或25至28个核苷酸长，或在一些实施例中在作为低端的18、19、20、21、22、23、24、25个与作为高端的21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个之间，其中给定范围通常具有低于高端的低端。这类结构通常包括5'茎、环及由与各茎相邻的环(其并非双螺旋的部分)连接的3'茎。在某些实施例中，环包含至少3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在其它实施例中，环包含2至40、3至40、3至21或19至21个核苷酸，或在一些实施例中，在作为低端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与作为高端的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40个之间，其中给定范围通常具有低于高端的低端。[0082]如本文中所使用的术语“微型rna侧接序列”是指包括微型rna处理元件的核苷酸序列。微型rna处理元件为有助于由前体微型rna产生成熟微型rna的最小核酸序列。这些元件通常位于侧接微型rna茎-环结构的40个核苷酸序列之内。在一些情况下，在侧接微型rna茎-环结构的长度在5与4,000个核苷酸之间的核苷酸序列的延伸内发现微型rna处理元件。[0083]术语“连接子”在用于提及多重抑制性rna分子时是指加入两个抑制性rna分子的连接构件。[0084]如本文中所使用，除非将其明确地指出为可复制反转录病毒，否则“重组反转录病毒”是指不可复制的或“复制缺陷型”反转录病毒。术语“重组反转录病毒”及“重组反转录病毒颗粒”在本文中可互换地使用。这类反转录病毒/反转录病毒颗粒可以是任何类型的反转录病毒颗粒，包括例如γ反转录病毒及(在说明性实施例中)慢病毒。众所周知，这类反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)通常是在包装细胞中通过用质体(其包括如gag、pol及rev等包装组分)及包膜或假型化质体(其编码假型化元件)及转移的、基因组的或反转录病毒(例如慢病毒)表达载体(其通常为在其上编码基因或其它相关编码序列的质体)转染所述包装细胞来形成。因此，反转录病毒(例如慢病毒)表达载体包括在转染至细胞中后促进表达及包装的序列(例如，侧接例如psi包装元件及目标异源编码序列的5'ltr及3'ltr)。术语“慢病毒”及“慢病毒颗粒”在本文中可互换地使用。[0085]mirna的“构架”由围绕mirna的“5'微型rna侧接序列”和/或“3'微型rna侧接序列”及(在一些情况下)将mirna中的茎-环结构的茎隔开的环序列组成。在一些实例中，“构架”来源于天然存在的mirna，例如mir-155。术语“5'微型rna侧接序列”及“5'臂”在本文中可互换地使用。术语“3'微型rna侧接序列”及“3'臂”在本文中可互换地使用。[0086]如本文中所使用，术语“mirna前体”是指可以酶促方式加工成mirna的任何长度的rna分子，如初级rna转录物、pri-mirna或pre-mirna。[0087]如本文中所使用，术语“构建体”是指经分离多肽或编码多肽的经分离聚核苷酸。聚核苷酸构建体可以编码多肽，例如淋巴增生性元件。所属领域的技术人员将理解，视上下文而定，构建体是指经分离聚核苷酸或经分离多肽。[0088]如本文中所使用，“moi”是指感染倍率，其中moi等于用于感染的病毒颗粒的数目与细胞数目的比率。作为非限制性实例，可以使用facs和报导子表达来进行病毒颗粒的数目的功能性滴定。[0089]“周边血液单核细胞”(pbmc)包括具有圆形细胞核的末梢血液细胞且包括淋巴细胞(例如t细胞、nk细胞和b细胞)和单核细胞。一些不是pbmc的血细胞类型包括红血球、血小板和粒细胞(即，嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)。[0090]应理解，本公开和本文提供的方面和实施例并不限于所公开的具体实例，因此当然可能有变化。亦应理解，本文中所使用的术语仅是出于公开具体实例及实施例的目的，且并不意图为限制性的，这是由于本公开的范围将仅由随附权利要求书所限定。[0091]当提供值的范围时，应理解，在所述范围的上限与下限之间的各中间值(除非上下文另外明确指示，否则为下限单位的十分之一)与所述陈述范围中的任何其它值或中间值皆涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括于较小范围中并且也涵盖于本发明内，在所述范围内受到任何特定排他性限制。在所陈述的范围包括一个或两个限值时，排除了那些被包括的限值的任一个或两个的范围也被包括在本发明之内。当针对范围给定重叠的多个低值及多个高值时，所属领域的技术人员应认识到，所选择范围将包括低于高值的低值。本说明书中的所有标题皆为易于阅读起见，且并非为限制性的。[0092]除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语皆具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中还可以使用与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。本文中提及的所有公开案皆以引用的方式并入本文中，以公开和描述与所列公开案相关的方法和/或材料。[0093]必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所使用的单数形式“一(a/an)”和“所述”包括多个指示物。因此，举例来说，提及“嵌合抗原受体”包括多个这类嵌合抗原受体和所属领域的技术人员已知的其等效物等。应进一步注意，权利要求书可经起草而排除任何任选的要素。因此，此陈述意图充当使用与权利要求书要素的引用相关的如“单独”、“仅”等排他性术语或使用“阴性”限制的前提基础。[0094]应了解，为了清楚起见而在分开的实施例的情况下描述的本发明的某些特征还可以组合形式提供于单个实施例中。相反地，为简洁起见而在一个单一实施例的背景下所描述的本发明的不同特征还可以分开地或以任何适合的子组合形式提供。属于本发明的实施例的所有组合皆特异性地包涵在本发明中，且正如各组合及每一组合单独及清楚地公开一样公开于本文中。此外，各种实施例及其要素的所有子组合也都特异性地包涵在本发明中，且正如各子组合及每一这类子组合单独及清楚地公开一样公开于本文中。具体实施方式[0095]本公开通过提供用于修饰和在说明性实施例中基因修饰淋巴细胞(例如nk细胞，且在说明性实施例中，t细胞)的经改善方法及组合物来克服先前技术挑战。本文中的一些方法和组合物提供简化的和更快速的用于转导或转染淋巴细胞的方法，其避免一些需要特殊装置的步骤。因此，所述方法提供实现细胞疗法方法的大众化的重要步骤。与现有方法相比，以更少的时间进行用于修饰淋巴细胞(例如nk细胞且在说明性实施例中，t细胞)的说明性方法和组合物，并且实际上在一些实施例中，提供快速护理点方法。此外，提供具有许多用途(包括其在这些经改善方法中的用途)的组合物，包括适于皮下施用的细胞制剂组合物。这些组合物中的一些包括修饰的和在说明性实施例中基因修饰的淋巴细胞，其具有经改善的增殖及存活质量，包括在体外培养时，例如在缺失生长因子的情况下。这类修饰的和在说明性实施例中基因修饰的淋巴细胞将具有例如以下的用途：作为研究工具，以更好的理解影响t细胞增殖及存活的因素；及商业生产，例如可经采集及测试或用于商业产品的某些因子(如生长因子及免疫调节剂)的生产。并且，这类修饰的和基因修饰的淋巴细胞在癌症的治疗中具有效用。[0096]本文中用于免疫细胞疗法的说明性方法和组合物包括皮下或肌内递送和皮下或肌内细胞制剂，与皮下或肌内递送和皮下或肌内细胞制剂相容，对皮下或肌内递送和皮下或肌内细胞制剂有效，和/或甚至适于皮下或肌内递送和皮下或肌内细胞制剂。这些递送方法和细胞制剂(即递送组合物)中的一些促进细胞聚集。这类细胞聚集促进细胞增殖和存活，在一些实施例中，通过向细胞制剂或细胞制剂的施用位点添加抗原、生长因子和免疫调节剂来进一步增强细胞增殖和存活。[0097]本文还提供了克服与通过car-癌细胞对car疗法的抗性相关的挑战的方法和组合物，所述挑战为例如通过恶性细胞的基因修饰而丧失靶抗原可用性(例如表位或抗原掩蔽)。[0098]用于在存在血液或其组分的情况下基因修饰t细胞和/或nk细胞的说明性细胞处理方法[0099]本文在说明性的方面中提供的方法包括用于修饰t细胞和/或nk细胞的方法，或制备细胞制剂的相关方法，其包括使反应混合物中包含淋巴细胞(例如nk细胞和/或t细胞)的血细胞与重组载体离体接触，所述重组载体例如是或包括编码car的聚核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在说明性实施例中，反应混合物在溶液中或在重组反转录病毒颗粒的表面上包含t细胞活化元件，以促进反应混合物中t细胞的基因修饰。在本文的实例中证明了这类反应混合物可以包括未分级的全血或者可以包括在全血中发现的所有或多种细胞类型，包括总有核细胞(tnc)，并且在说明性实施例中，修饰的t细胞被皮下递送。图1提供了这类方法的多个非限制性例示性工作流程。[0100]如图1所示，本文提供的一些方法包括其中从受试者采集血液的任选步骤(110)。可以通过本领域已知的任何合适的方法从受试者采集或获得血液，如本文更详细讨论的。例如，可以通过静脉穿刺、单采血液成分术或采集血液的样品的任何其它采血方法来采集血液。在一些实施例中，所采集的血液的体积为1ml至120ml。在说明性实施例中，特别是在其中从其获取血液的受试者具有正常水平的nk细胞并且在说明性实施例中具有正常水平的t细胞的那些实施例中，所采集的血液的体积为1ml至25ml。[0101]值得注意的是，本文提供的用于修饰并且在说明性实施例中用于基因修饰的方法的一些实施例中不包括从受试者采集血液的步骤。与是否从受试者采集血液无关，在本文中所提供的用于修饰淋巴细胞(例如，t细胞和/或nk细胞)的说明性方法方面中，使淋巴细胞与封装的核酸载体(例如复制缺陷型反转录病毒颗粒)在反应混合物中接触。在说明性实施例中，这类接触和其中发生接触的反应混合物在封闭式细胞处理系统中进行，如本文更详细讨论的。在本文提供的系统和方法的一些方面和实施例中使用的这类封闭式处理系统和方法可以是本领域已知的任何系统和方法。作为非限制性示例，该系统或方法可以是传统的封闭式细胞处理系统和方法，或者是本文被称为“较新的”方法或系统的系统或方法(参见例如wo2018/136566和wo2019/055946)。在涉及离体淋巴细胞基因修饰和/或转导的传统封闭式细胞处理方法中，尤其是在用于自体细胞疗法的方法中，许多步骤在数天内进行，例如pbmc富集、洗涤、细胞活化、转导、扩增、收集和任选地再引入。在最新的方法中，已缩减这种离体细胞处理涉及的一些步骤和时间(参见例如wo2018/136566)。在其它最新的方法中(参见图1a)，已进一步缩减或与例如离体扩增步骤一样消除该离体细胞处理中涉及的一些步骤和时间(参见例如wo2019/055946)。这些最新的方法(以及本文中所提供的其它改善的细胞处理方法)还使用快速离体转导过程，例如不包括或包括最少量的预活化的过程(例如，在淋巴细胞(如t细胞和/或nk细胞)与反转录病毒颗粒接触之前，使淋巴细胞与活化剂接触小于30、15、10或5分钟)。在这类方法的某些实施例中，t细胞和/或nk细胞活化元件存在于进行接触步骤的反应混合物中。在说明性实施例中，t细胞和/或nk细胞活化元件与反应混合物中存在的反转录病毒颗粒的表面缔合。在说明性实施例中，这类使用快速离体基因修饰而无需离体扩增步骤的方法用于快速护理点(rpoc)自体细胞疗法方法中。然而，这类最新的方法仍涉及pbmc富集步骤/程序(120a)，其通常在封闭系统内耗费至少约1小时，随后进行细胞计数、转移和培养基添加，其又至少耗费约45分钟，然后使淋巴细胞与反转录病毒颗粒接触以形成转导反应混合物(130a)。在“病毒转导”步骤(其通常是如本文详细讨论的接触步骤与培育)之后，淋巴细胞通常例如使用sepax从保留在悬浮液中的反转录病毒颗粒中洗去(140a)，并且通过将pbmc再悬浮在递送溶液中以形成细胞制剂而收集(150a)，所述细胞制剂通常在用于再输注的输注袋、用于注射的注射器或用于储存的低温保存小瓶中(160a)。如本文进一步详细讨论的，传统的pbmc富集程序通常涉及菲科尔(ficoll)密度梯度和离心(例如离心作用)或向心(例如sepax)力或使用白细胞透入(leukophoresis)来富集pbmc。[0102]在某些子实施例中，在pbmc分离之前，将针对不需要的细胞的表面上的抗原的抗体添加到血液(170a或170c)或tnc(170b)中，并培育有效的时间段以结合至不需要的细胞，如本文更详细讨论的。在某些子实施例中，在tnc分离之前，将针对不需要的细胞的表面上的抗原的抗体添加到血液(170d、170e或170f)中，并培育有效的时间段以结合至不需要的细胞，如本文更详细讨论的。抗体可以与珠粒偶联，或者如本文更详细描述的，在培育中可以包括额外的抗体以将不合需要的细胞玫瑰花结(rosette)至红细胞。然后在pbmc分离步骤中耗尽不需要的细胞，在pbmc分离步骤中不需要的细胞与红细胞一起沉淀。[0103]如本文中所提供的实例中表明，意外发现淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)可以在任选地含有抗凝血剂的未分级的全血的反应混合物中与复制缺陷型反转录病毒颗粒接触，且可以修饰、基因修饰和/或转导显著百分比的淋巴细胞。因此，发现通过重组反转录病毒颗粒进行的淋巴细胞的有效基因修饰可以在存在除pbmc和tnc以外的血液组分和血细胞的情况下进行。[0104]因此，在一些实施例中，t细胞或nk细胞的修饰(其是或导致t细胞和/或nk细胞的基因修饰)在除pbmc外还包含血液组分和血细胞的反应混合物中进行，其中这类基因修饰通过使反应混合物中的t细胞和nk细胞与重组核酸载体接触而发生，所述重组核酸载体在说明性实施例中是重组反转录病毒颗粒。在本文提供的某些说明性实施例中(参见图1b、图1d、图1e和图1f)，代替pbmc富集程序(例如，使用密度梯度)，使用在至少一种或一些其它血细胞类型上富集淋巴细胞的细胞处理过滤器或过滤器集合(例如，可配置为用于用过滤器集合进行反向灌注的白细胞减少过滤器总成，通过反向灌注可以从所述过滤器集合去除白细胞)(120b、135d、120e和120f)，其还富集非pbmc的细胞类型。在某些实施例中，在淋巴细胞与重组反转录病毒颗粒接触以形成转导反应混合物(130b、130e和130f)之前，或在某些实施例中，在淋巴细胞与重组反转录病毒颗粒(135d)接触之后，该步骤富集和浓缩淋巴细胞。在某些实施例中，过滤器除富集pbmc外还富集血细胞，例如过滤器可以富集tnc。如图1b所示，例如，在“病毒转导”步骤(其通常是如本文详细讨论的接触步骤与任选的培育)之后，淋巴细胞通常例如使用sepax或通过使洗涤缓冲液经过白细胞减少过滤器上的细胞而从保留在悬浮液中的反转录病毒颗粒上洗去，并且通过将pbmc或tnc再悬浮在递送溶液(150b)中以形成细胞制剂而收集，其中最终细胞制剂产品通常在用于再输注的输注袋、用于注射的注射器或用于储存的低温保存小瓶中(160b)。[0105]在本文提供的方法的说明性实施例中，在32℃至42℃之间的温度下，例如在37℃下进行“病毒转导”步骤的接触步骤与任选培育。在其它说明性实施例中，在低于37℃的温度下，例如在4℃至室温下进行“病毒转导”步骤的接触步骤与任选培育(本文被称为“冷接触”步骤)(参见图1e和图1f)。与冷接触步骤相关的任选培育可以进行本文所讨论的任何时间长度。在说明性实施例中，与冷接触步骤相关的任选培育进行1小时或更少。在冷接触和任选的培育步骤之后，在一些实施例中，通过使洗涤缓冲液经过白细胞减少过滤器上的细胞，将淋巴细胞从保留在过滤器上的反转录病毒颗粒上洗去(140e，140cf)，并且通过将tnc再悬浮在递送溶液(150e，150bf)中以形成细胞制剂来收集淋巴细胞，其中最终产物通常在用于再输注的输注袋、用于注射的注射器或用于储存的低温保存小瓶中(160e，160f)。不受理论的限制，据信将tnc与在其表面上表达活化元件的病毒颗粒冷接触一段时间，例如12、10、8、6、4或2小时或更短时间，或在一些实施例中，1小时或更短，将导致病毒颗粒与t和/或nk细胞结合，但几乎没有病毒的内化。这也将导致t和/或nk细胞聚集体，其被病毒颗粒交联。此外，对于接触4小时、2小时或1小时或更短时间(例如15分钟至4小时、2小时或1小时)的实施例，由于较低的温度且较短的培育时间，与培育较长的时间段和/或接近37℃的温度的细胞相比，将存在细胞的更少的活化。据信，t细胞和/或nk细胞的活化会导致其粘附分子的表达和与白细胞减少过滤器的结合，从而阻碍通过反向灌注过滤器来回收这些细胞的能力。[0106]在包括冷接触步骤的某些实施例中，“病毒转导”步骤还包括在细胞已经从白细胞减少过滤器中去除之后的二次培育(190e，190f)。在一些实施例中，通过将细胞悬浮在培养基如完全optmizertm ctstm t细胞扩增培养基中进行二次培育。在一些实施例中，在递送溶液中进行二次培育。在说明性实施例中，在递送溶液中进行二次培育，但缺乏任何低温保存剂。在说明性实施例中，二次培育在32℃与42℃之间的温度下(例如在37℃下)进行。任选的二次培育可以进行本文所述的任何时间长度。在说明性实施例中，任选的二次培育进行少于4小时。不受理论的限制，据信tnc与在其表面上表达活化元件的病毒颗粒的二次培育将导致细胞的活化。t细胞和/或nk细胞的活化将导致细胞聚集。[0107]因此，在图1中描述的工作流程中存在至少两种机制，通过这些机制，t和/或nk细胞可以形成聚集体。(1)表面结合的病毒颗粒交联细胞，该活动在4℃和室温之间的温度下增强，和(2)t和/或nk细胞的活化导致它们的聚集，这在32℃和42℃之间的温度下增强。这些在不同条件下由任一机制形成的聚集体可以被粗滤器捕获，而其它碎片、单细胞(包括淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，大约14μm)以及小于所用粗滤器孔径的细胞聚集体通过粗滤器进入废物。在一些实施例中，转导反应(其包括在接近37℃的温度下培育)通过粗过滤器以捕获聚集的t和/或nk细胞(200e、200g)。在一些实施例中，使处于或接近4℃至室温之间的温度的转导反应通过粗过滤器以捕获聚集的t和/或nk细胞(200f、200g)。粗过滤器上的细胞被收集在递送溶液中以形成细胞制剂，细胞制剂通常在用于再输注的输注袋、用于注射的注射器或用于储存的低温保存小瓶中(160f、160g)。在其中使用粗过滤器收集t和/或nk细胞聚集体的说明性实施例中，递送溶液的细胞组成大于40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％t细胞。[0108]在本文提供的反应混合物、用途、修饰的和在说明性实施例中基因修饰的t细胞或nk细胞或用于修饰和/或基因修饰t细胞和/或nk细胞的方法的某些实施例中，血液样品和因此待修饰的、基因修饰的和/或转导的淋巴细胞在与重组反转录病毒颗粒接触之前不经受pbmc富集程序。在一些这类实施例中，将血液样品(例如抗凝全血液样品)应用于过滤器(例如白细胞减少过滤器总成，也被称为白细胞耗尽(leukodepletion)过滤器总成)，以在这类包含来自血液样品的淋巴细胞的tnc与重组载体例如重组反转录病毒颗粒接触之前获得总有核细胞(tnc)。白细胞减少过滤器总成可以包含本领域已知的任何过滤器，例如收集总有核细胞(tnc)的过滤器。在一些实施例中，过滤器可以包括含有聚氨酯、醋酸纤维素、聚酯、精梳棉、ptfe或ghp的膜。在一些实施例中，白细胞减少过滤器总成可以包括例如hematratetm过滤器、acrodisctm过滤器、neo1过滤器、terumo过滤器或可从pall获得的任何白细胞减少过滤器(例如leukotraptm过滤器)或可从获得的过滤器。在一些实施例中，白细胞减少过滤器是第三代或第四代或更高级的白细胞减少过滤器，并且可以是深度过滤器或筛网式型白细胞减少过滤器(sharma等人，《亚洲输血科学杂志(asian j transfus sci.)》2010年1月；4(1):3–8)。[0109]在一些实施例中，施加到白细胞减少过滤器的血液样品的体积为2ml至12ml、10ml至30ml、20ml至50ml或40ml至120ml(对于使用hematrate过滤器的非限制性实例；cook regentec)或2ml至12ml(对于使用acrodisc的非限制性实例；pall,ap-4952)。在一些实施例中，白细胞减少过滤器总成中的过滤器的孔径小于10μm、7.5μm、5μm、4μm或3μm或为0.5μm至4μm。在一些实施例中，白细胞减少过滤器总成可以收集和/或保留血液样品中至少75％、80％、90％或95％的白细胞，并且至少75％、80％、85％或90％的非白细胞细胞通过过滤器并且未被收集。在一些实施例中，白细胞减少过滤器具有2cm2与5cm2或3cm2与5cm2的有效过滤面积。在一些实施例中，粗过滤器可以被物理地附接到白细胞减少过滤器总成。粗过滤器通常具有比白细胞减少过滤器总成中的过滤器更大的孔径。在一些实施例中，粗过滤器的孔径为至少15μm，并且在说明性实施例中为15至60μm。在一些实施例中，可以在接触步骤之前不使用白细胞减少过滤器总成而使用粗过滤器。除了在用于修饰和/或基因修饰t细胞和/或nk细胞的方法的接触步骤之前使用之外，粗过滤器也可以在接触步骤之后使用。在一些实施例中，粗过滤器可以用于捕获t和/或nk细胞聚集体。当细胞被活化和/或当它们被病毒颗粒交联时，形成这类聚集体。在一些实施例中，粗过滤器用于去除通常穿过滤器的单线态血细胞，包括嗜中性粒细胞。在一些实施例中，粗过滤器可以在二次培育后使用，如图1e所示。在这类实施例中，过滤的细胞可以被收集并引入或再引入到受试者中。如本文其它处所讨论的，据信作为聚集体的一部分的被修饰的和/或被基因修饰的细胞有利地在体内更有效，特别是在皮下施用的情况下。[0110]此外，基于以上讨论的关于即使当在未分级的全血(在本文中也被称为“全血”)中进行接触时通过反转录病毒颗粒对t细胞和任选的nk细胞的有效基因修饰的令人惊讶的发现，在说明性实施例中，本文提供了进一步简化的方法，其中通过直接向全血中添加复制缺陷型反转录病毒颗粒以形成反应混合物来修饰、基因修饰和/或转导淋巴细胞(130c)，并且使全血中的细胞与复制缺陷型反转录病毒颗粒接触一定时间且进行本文中所提供的任选的培育。因此，此说明性实施例中的这类进一步简化的方法不包括在全血中的淋巴细胞(通常含有抗凝血剂)与反转录病毒颗粒接触之前的淋巴细胞富集步骤。此进一步简化的方法，与本文中的其它细胞处理方法一样，通常在封闭式细胞处理系统内进行并且在淋巴细胞与反转录病毒颗粒接触之前可以不包括或包括最少量的预活化。在这些进一步简化的方法中，可以在血液袋中使全血中的淋巴细胞直接与反转录病毒颗粒接触。在这类方法中的接触步骤(130c)之后，将与反转录病毒颗粒接触的淋巴细胞洗涤且使用pbmc富集程序(135c)浓缩。因此，在这类实施例中，在全血中的细胞(通常包含抗凝血剂)与重组反转录病毒颗粒接触之前，不进行pbmc富集程序且不进行淋巴细胞富集过滤。然而，在图1c的实施例中，在进行接触和任选的培育(130c)之后，例如使用sepax和菲科尔梯度进行这类pbmc富集方法(135c)。在pbmc富集之后，可以任选地从与细胞保持不缔合的任何反转录病毒颗粒进一步洗去淋巴细胞(140c)，例如使用sepax，并且通过将pbmc重悬于递送溶液(150c)中以形成细胞制剂而收集，其中最终产物通常在用于再输注的输注袋、用于注射的注射器或用于储存的低温保存小瓶中(160c)。[0111]在另外的说明性实施例(图1d)中，其中在将重组反转录病毒颗粒添加到血液中以接触淋巴细胞如t细胞和/或nk细胞之前不对血液样品进行pbmc富集程序，在工艺的任何步骤中不使用pbmc富集程序，甚至在接触步骤之后(即，在反应混合物中通过重组反转录病毒颗粒接触淋巴细胞如t细胞和/或nk细胞并任选培育本文提供的任何接触和培育时间的步骤)。与本文的其它细胞处理方法一样，该进一步简化的方法通常在封闭式细胞处理系统中进行，并且在淋巴细胞与反转录病毒颗粒接触以形成转导反应混合物(130d)之前可以不包括或包括最小的预活化，因此在一些子实施例中提供了有力的护理点方法。在这类进一步说明性实施例的实例中，在包括任选培育的接触步骤(130d)之后，可以进行一次或多次白细胞减少细胞处理过滤(135d)，例如使用hematrate过滤器或acrodisc过滤器。在使用白细胞减少过滤器进行白细胞富集过滤之后，可以任选地进一步将淋巴细胞从残留的任何反转录病毒颗粒上洗去(140d)，例如通过使具有2％hsa的pbs通过过滤器，并且收集(150d)，例如使用具有递送溶液的再灌注来洗脱和再悬浮tnc以收集细胞制剂中保留在白细胞减少过滤器上的淋巴细胞，其中最终产物通常在用于注射的注射器中或在用于递送至受试者的输注袋中或在用于储存的低温保存小瓶中(160d)。[0112]在另外简化的实施例中(图1g)，在该过程的任何步骤中，血液样品不经历pbmc或tnc富集程序。在该方法中，使血液中的淋巴细胞与反转录病毒颗粒接触以形成转导反应混合物(130g)，并且任选地在约4℃与42℃之间的任何温度下培育持续本文提供的任何接触时间和培育时间。然后使反应混合物通过粗过滤器以捕获聚集的淋巴细胞，例如t细胞和/或nk细胞。在任选的洗涤之后，例如使用再灌注用递送溶液收集细胞(150g)，以洗脱和重悬细胞聚集体，其中最终产物通常为用于注射的注射器或用于递送至受试者的输液袋或用于储存的冷冻保存小瓶(160g)。[0113]如上所述，图1所示的方法实施例工作流程提供悬浮在细胞制剂中的修饰的t细胞和/或nk细胞。在其中过滤pbmc或淋巴细胞的方法中和/或特别是其中在过滤器的顶部进行修饰、基因修饰和/或转导的方法中，如本文提供的递送溶液可以用于洗脱、再悬浮和收集来自过滤器的细胞，以形成具有适合于施用(特别是如本文提供的皮下或肌内施用)于受试者的体积的细胞制剂。在细胞被重悬、洗脱和/或以其它方式收集以用于施用之前，这类递送溶液也可以用于如上所述的任选洗涤。最后，可以在图1的任何方法工作流程实施例中执行额外的任选步骤，例如通过如本文更详细公开的封闭式系统内的阴性选择来去除不合需要的细胞类型(例如，除t细胞和/或nk细胞之外的任何细胞类型)，例如b细胞和/或癌细胞。可以使用抗体(例如抗cd19抗体)进行ea玫瑰花结疗法(ea-rosetting)，以将b细胞复合到红细胞(170a、170b或170c)，所述红细胞将在密度梯度pbmc分离步骤中从pbmc中沉淀出来，如本文更详细描述的。包被有抗体(例如cd19抗体)的珠粒可以类似地用于将b细胞复合到珠粒(170a、170b或170c)，珠粒将在密度梯度pbmc分离步骤中从pbmc中沉淀出来。可替代地，可以使用过滤步骤。这类过滤步骤可以用于除去与珠粒(180d)复合的细胞或捕获聚集的淋巴细胞，例如被本文所述的重组反转录病毒颗粒活化和/或交联的t和/或nk细胞。在一些实施例中，可以执行额外的清洗步骤。在一些实施例中，可以省略图1中所示的或针对细胞处理工作流程描述的洗涤步骤中的任何一个或多个。[0114]由于使用类似于图2的白细胞减少过滤总成的细胞过滤过程比pbmc富集程序(特别是包括密度梯度离心(ficoll-paque)的传统pbmc富集程序)更快速，图1d-g的任何实施例提供了从全血获得修饰的、基因修饰的和/或转导的淋巴细胞的富集制剂的甚至更快速的方法，因为在这类方法的任何步骤中，在转导之前或之后不进行耗时的pbmc富集程序。在说明性实施例中，所述方法在封闭式细胞处理系统中进行，因此提供了用于非常快速、相对简单的淋巴细胞处理的强大方法，例如作为护理点car-t方法，其克服了当前方法的许多并发症和过度时间限制。[0115]如本文实例中所提供的，皮下施用已经显示出令人惊讶的结果，其中相对于通过静脉内输注引入的被修饰和/或被基因修饰的淋巴细胞，被修饰的和/或被基因修饰的淋巴细胞的植入增加。这导致在动物中更有效的car依赖性肿瘤减少和消除。在说明性实施例中，溶液中的修饰的淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)被引入，并且在说明性实施例中通过皮下施用、递送或注射再引入到受试者中。在涉及使反应混合物中的淋巴细胞与反转录病毒颗粒接触的这些实施例的一些实例中，例如在图1中举例说明的那些，包括那些包括在pbmc富集程序中分离淋巴细胞之后通常不存在的至少一些其它血液组分的说明性实施例中，任选地将作为本文提供的单独方面的所得的细胞制剂施用(例如再施用)到受试者中。在其中在淋巴细胞与反转录病毒颗粒接触后不使用pbmc富集程序的说明性实施例中(图1d)，在那里产生的细胞制剂可以使用皮下或肌内施用被再引回到受试者中。因此，如本文更详细讨论的，本文提供的一些方面是细胞制剂，以及用于制备这类细胞制剂的递送溶液(即赋形剂)，其在说明性实施例中与适于皮下递送的细胞制剂相容且在进一步说明性实施例中对其有效。不受理论的限制，据信在仅使用细胞处理过滤器(例如hematrate过滤器)来浓缩和/或洗涤淋巴细胞的过程中存在额外的血细胞(特别是嗜中性粒细胞)，使得细胞制剂更易于皮下递送，以避免如果将这些其它血细胞类型，特别是嗜中性粒细胞或聚集的t细胞直接输注回患者的血液中存在的一些额外风险。例如，在淋巴细胞减少过滤器上用总有核细胞重构的反转录病毒的皮下制剂，除淋巴细胞外，还可以包含嗜中性粒细胞(或更一般地粒细胞)。在说明性实施例中，细胞制剂包含嗜中性粒细胞、b细胞、单核细胞、红细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或巨噬细胞以及修饰的t细胞(car-t细胞)和/或nk细胞(car-nk细胞)。皮下或肌内制剂和施用优于静脉内制剂和施用，因为用淋巴细胞重构的反转录病毒的制剂(悬浮液)可以进一步包含细胞聚集体并表达可以通过静脉内递送引入肺充血的粘附受体。[0116]用于皮下施用的方法是本领域公知的，并且通常包括向皮肤下的脂肪层中施用。应当注意，预期本文中涉及皮下递送的任何实施例可以替代地为肌内递送(其为递送到肌肉中)、皮内递送或肿瘤内递送。在一些实施例中，皮下施用可以在受试者的大腿上部、上臂、腹部或臀部上部进行。皮下施用与腹膜内施用不同，腹膜内施用穿透在皮下施用中使用的脂肪层，并将制剂或药物递送到受试者的腹膜中。[0117]在其中通过皮下施用较大体积的赋形剂(本文也被称为皮下注射或递送)将细胞引入或再引入(本文也被称为递送)到受试者中的这类实施例中，为了促进这类皮下施用，可以将透明质酸酶添加到分离的修饰的、基因修饰的和/或转导的淋巴细胞制剂中，所述淋巴细胞制剂包含已经与重组反转录病毒接触，或者在分离的修饰的、基因修饰的和/或转导的淋巴细胞制剂的顺序递送的相同位置处或附近皮下注射的淋巴细胞。在说明性实施例中，使用有效量的透明质酸酶，特别是在将超过1或2ml(例如2-1,000ml、2-500ml、2-100ml、2-50ml、2-10ml、2-5ml、5-1,000ml、5-500ml、5-100ml、5-50ml或5-10ml)的已经与反转录病毒颗粒接触的淋巴细胞的细胞制剂(例如包含修饰的nk细胞和在说明性实施例中t细胞的细胞制剂)皮下再引入到受试者中的实施例中。不受理论的限制，透明质酸酶(例如重组人透明质酸酶)通过实现大体积皮下递送，特别是超过通常施用的2ml或更少体积，促进其它注射治疗剂的分散和吸收，并且潜在地增强共注射治疗剂的药代动力学概况(参见例如，bookbinder lh等人，“一种用于治疗剂的增强的间质转运的重组人类酶(a recombinant human enzyme for enhanced interstitial transport of therapeutics)”《受控释放杂志(j.control release)》(2006年8月28日；114(2):230-41).2006年6月7日电子公布(通过引用以其整体并入本文)；以及frost,gi等人，“重组人透明质酸酶(rhuph20):皮下给药和流体施用的支持平台(recombinant human hyaluronidase(rhuph20):an enabling platform for subcutaneous drug and fluid administration)”《专家意见药物递送(expert opinion drug delivery)》2007年7月；4(4)；427-440(通过引用以其整体并入本文)。流体在细胞混合物中的分散可以通过更大的体积来促进，同时使注射位点处的血管压迫最小化。透明质酸酶(例如，重组人透明质酸酶ph20酶(rhuph20)或150usp单位)可从halozyme therapeutics,inc.(加利福尼亚州圣地亚哥(san diego,ca))获得。在一些实施例中，50至5000；或1,000至3,000个单位/ml的rhuph20可以与修饰的、基因修饰的和/或转导的淋巴细胞一起以例如1至50ml、2至25ml、2至20ml、2至10ml、2至5ml、2至4ml、2.5至25ml、2.5至20ml、2.5至10ml、2.5至5ml、5至20ml或5至10ml递送，或透明质酸酶和淋巴细胞的这类递送可以是顺序的。例如，可以在美国专利7,767,429中找到另外的透明质酸酶，其通过引用以其整体并入本文。[0118]图2提供细胞处理白细胞减少过滤总成(200)的非限制性说明性实例，其富集有核细胞，所述有核细胞可以用作图1的方法中的白细胞减少过滤器。说明性白细胞减少过滤总成(200)，其在说明性实施例中是单次使用式过滤总成，包含过滤器壳体(210)内的白细胞耗减培养基(例如过滤器集合)，其具有入口(225)和出口(226)，以及袋、阀门和/或通道/管的配置，其提供使用灌注和反灌注来浓缩、富集、洗涤和收集保留的白细胞或有核血细胞的能力(参见例如ep2602315a1，其以全文引用的方式并入本文中)。在说明性实施例中，白细胞减少过滤总成(200)是可商购的hematrate过滤器(cook regenetec,indianapolis,in)。白细胞减少过滤总成可以用于浓缩全部有核细胞(tnc)，包括粒细胞，其中在封闭式细胞处理系统中的pbmc富集程序中将所述细胞去除。因为ep2602315a1的包含白细胞耗减培养基的过滤器总成(如hematrate过滤器)和图2的说明性白细胞减少过滤器总成不去除粒细胞，它们在本文中不被视为pbmc富集总成或过滤器，且合并它们的方法在本文中不被视为pbmc富集程序或步骤。[0119]图2的白细胞减少过滤器总成(200)是单次使用式无菌总成，其包括各种管和阀门，通常是无针阀门，其允许从全血和包括白细胞的血细胞制剂分离白细胞以及快速洗涤和浓缩白细胞。在此说明性总成中，在反应混合物经历接触步骤和任选的培育之后，在入口管(255)的第一总成开口(217)处将反应混合物收集容器(215)连接至总成(200)，所述血液袋是例如含有约120ml转导/接触反应混合物的500ml pvc袋，所述反应混合物包含全血、抗凝血剂和反转录病毒颗粒，如本文中详细公开的。当释放第一入口管(255)上的夹具时，淋巴细胞，包括一些具有相关反转录病毒颗粒的修饰的t细胞和/或nk细胞，以及一些此时可被基因修饰的细胞，以及全血反应混合物中的其它血细胞和组分以及抗凝血剂借助于重力通过第一总成开口(217)进入入口管(255)。修饰的和/或基因修饰的t细胞和/或nk细胞通过入口阀(247)和收集阀(245)，通过过滤器壳体入口(225)进入过滤器壳体(210)，以与过滤器壳体(210)内的白细胞减少iv过滤器集合(例如sku j1472a jorgensen labs)接触。过滤器保留包括白细胞的有核血细胞，但其它血液组分通过过滤器且离开过滤器壳体出口(226)，进入出口管(256)，接着通过出口阀(246)且在废弃物收集袋(216)中被收集，所述废弃物收集袋例如可以是2l pvc废弃物收集袋。[0120]可以通过将入口阀(247)切换至洗涤位置来进行任选的缓冲液洗涤步骤。在此任选的洗涤步骤中，将缓冲液容器(219)，例如500ml盐水洗涤袋，连接至入口管(255)的第二总成开口(218)。当释放入口管(255)上的夹具时，缓冲液借助于重力通过第二总成开口(218)移动到入口管(255)中。缓冲液通过入口阀(247)和收集阀(245)，通过过滤器壳体入口(225)进入过滤器壳体(210)且通过过滤器壳体(210)内的白细胞减少过滤器集合以冲洗保留在过滤器上的细胞。缓冲液移出过滤器壳体出口(226)，进入出口管(256)，接着通过出口阀(246)且在废弃物收集袋(216)中被收集，所述废弃物收集袋可以与用于收集通过先前步骤中的过滤器的反应混合物组分的废弃物收集袋相同，或是在允许缓冲液进入第二总成开口(218)之前更换的用于代替第一废弃物收集袋的新的废弃物收集袋。可以任选地通过用额外的缓冲液重复以上过程来多次进行任选的洗涤步骤。此外，在一些实施例中，任选的洗涤步骤至少部分地使用洗脱/递送溶液进行。[0121]在反应混合物收集容器(215)中的全部或基本上全部体积的反应混合物通过过滤器(210)且任选地进行任选的清洗步骤之后，起始反灌注过程以使流体在总成(200)中沿相反方向移动，以收集保留在过滤器壳体(210)内的过滤器集合上的淋巴细胞。本文中的白细胞减少过滤器总成的说明性实施例适用于再灌注。在说明性总成(200)中起始反灌注过程之前，将出口阀(246)切换至再灌注位置且将收集阀(245)切换至收集位置。为了起始再灌注，使用注射器(266)通过注射来将注射器(266)中的递送溶液传送到出口管(256)，所述递送溶液在一些实施例中可以是缓冲液(例如pbs)，所述缓冲液可以具有如本文提供的另外的组分，并且可以是洗脱溶液，所述注射器例如可以是25ml注射器。然后，递送溶液通过过滤器壳体出口(226)进入过滤器壳体(210)，并将保留在过滤器集合上的淋巴细胞悬浮成细胞制剂，并使细胞制剂通过过滤器壳体入口(225)离开过滤器壳体(210)并进入入口管(255)。接着，在通过收集阀(245)之后，在细胞样品收集袋(265)中收集含有被修饰的淋巴细胞的细胞制剂，所述被修饰的淋巴细胞包括一些具有相关反转录病毒颗粒的t细胞和/或nk细胞，所述反转录病毒颗粒中的一些可在此时被基因修饰和/或转导，所述细胞样品收集袋可以是例如25ml低温保存袋。所收集的细胞制剂然后可以任选地被施用给受试者，例如通过皮下施用。[0122]图3的转导总成(301)是单次使用的无菌总成，其包括管和阀(通常是无针阀)，其允许对包含淋巴细胞的全血中的细胞进行修饰和转导，并且通常还包含例如50u/ml的抗凝血剂，例如肝素。在某些实施例中，包含淋巴细胞的全血不包含红细胞，所述红细胞可以在血液采集后通过已知方法去除。在说明性实施例中，包含淋巴细胞的全血确实包含红细胞。在说明性实施例中，包含淋巴细胞的全血确实包含红细胞。本身任选地包含本文公开的反应混合物中的任何一种的转导总成(诸如图3中的转导总成)形成本公开的方面和实施例，并且也可以用于本文提供的包括接触步骤的任何方面和方法。在图3的说明性总成中，将含有0.5ml至20ml的载体、0.5ml至2.5ml以及在说明性实施例中2ml至5ml的在溶液(例如含有4％乳糖的pbs)中的载体的载体容器(311)附接到管道(354)的第一总成开口(317)。在说明性实施例中，第一总成开口(317)是无菌的无针阀连接器。任选地，使用本文提供的用于确定滴度的任何方法(包括例如通过确定变暗单元)，基于待递送的载体的滴度来选择载体的体积，例如在复制缺陷型反转录病毒颗粒(“rip”)的情况下。然后施加力(例如正压力)以使载体容器(311)的内容物通过第一总成开口(317)转移到管道(354)中，然后转移到培育袋(314)中。任选地，第一总成开口(317)直接位于培育袋(314)上，并且没有管道(354)。培育袋(314)可以具有10ml至200ml，例如15ml至100ml、15ml至50ml或15ml至30ml的容量，并且可以任选地是允许气体交换的袋，例如血液袋。载体容器(311)任选地也包含一定体积的空气，例如足以帮助将载体容器(311)的内容物推动通过管道(354)并进入培育袋(314)的空气。在本文的任何步骤中，内容物正在转移的容器可以被定位成使得容器中的气泡在转移期间位于容器的顶部。对于本文其中施加力的任何步骤，力可以是使用本领域已知的任何方法(例如重力进料、手动力)，例如通过按压或拉动注射器、蠕动泵和/或注射器泵的柱塞产生的正压力或负压力。在一些实施例中，使用除重力进料之外的方法来转移内容物。[0123]在将载体容器(311)的内容物转移到第一总成开口(317)中之后，将载体容器(311)从第一总成开口(317)分离。将全血容器(313)附接到第一总成开口(317)，所述全血容器包含5ml-100ml、5ml-50ml、5ml-25ml和在说明性实施例中5ml-20ml或5ml-15ml的全血，并且任选地包含额外体积的空气，例如足以帮助将全血容器的内容物推动通过管道(354)并进入培育袋(314)的体积的空气。施加正力以将全血通过第一总成开口(317)转移通过管道(354)并且进入培育袋(314)中，以形成包括全血和载体的反应混合物。任选地，在全血容器(313)被连接到第一总成开口(317)之前，将全血容器(313)中的全血从受试者收集到全血容器(313)中，并且任选地经受红细胞耗尽程序。[0124]在形成反应混合物之后，然后将培育袋(314)培育15分钟至12小时，其在说明性实施例中可以为2小时至8小时，或本文提供的用于使淋巴细胞与载体接触和任选培育的任何时间。培育通常在37℃和5％co2下进行，在任何时间或在整个培育过程中具有一个或多个任选的混合步骤。任选的混合步骤可以例如在开始时执行，并且可以包括手动按摩培育袋(314)或者通过摇动或旋转来搅动培育袋(314)。在其内容物被转移到转导总成(301)中之后，将全血容器(313)从第一总成开口(317)分离，并且将反应混合物收集容器(315)附接到第一总成开口(317)。然后施加力以将反应混合物从培育袋(314)转移通过管道(354)和第一组成开口(317)并进入反应混合物收集容器(315)，例如使用来自反应混合物收集容器(315)的负压。[0125]图4的白细胞减少过滤器总成(400)是单次使用的无菌组成，其包括各种管和阀(通常为无针阀)，其允许从包含白细胞的全血和血细胞制剂中分离总有核细胞，以及快速洗涤和浓缩总有核细胞。白细胞减少过滤器总成(例如图4中的白细胞减少过滤器总成)本身可以形成本公开的方面和实施例，任选地包括本文提供的包含修饰的淋巴细胞的任何溶液(例如，反应混合物)，并且也可以用于本文提供的包括反应混合物的任何方面和方法。在此说明性总成中，在反应混合物经历接触步骤和任选的培育之后，在入口管道(455)的第一总成开口(417)处将反应混合物收集容器(315)连接至总成(400)，所述反应混合物收集容器是例如含有约5ml-25ml、5ml-20ml、7.5ml-20ml或10ml-15ml的转导/接触反应混合物的30ml注射器，所述反应混合物包含全血和载体以及在说明性实施例中抗凝血剂，如上文针对图3和本文其它地方详细公开的。在说明性实施例中，第一总成开口(417)是无菌的无针阀连接器。反应混合物收集容器(315)任选地包含一定体积的空气，例如足以帮助确保反应混合物收集容器(315)的内容物完全移动通过入口管道(455)穿过过滤器壳体入口并到达过滤器壳体(410)中的过滤器上的体积的空气。在一些实施例中，在转移时，反应混合物收集容器(315)和入口管道(455)在80°与90°之间。在说明性实施例中，在转移时，反应混合物收集容器(315)和入口管道(455)之间的角度小于或约为80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°或45°，其在说明性实施例中可以为约45°。在说明性实施例中，细胞在白细胞减少过滤器总成(400)中不以大于70°、75°或80°的角度移动穿过任何接合部(junction)。[0126]通过向反应混合物收集容器(315)的内容物施加力，淋巴细胞，包括例如具有相关载体的修饰的t细胞和/或nk细胞，和/或基因修饰的t细胞和/或nk细胞，以及其它血细胞(例如嗜中性白细胞)和反应混合物中的组分(例如抗凝血剂)，被转移通过第一总成开口(417)并进入到入口管道(455)中。在用于转移内容物的任何方法的一些实施例中，包括例如将修饰的细胞诸如修饰的t细胞和/或nk细胞从反应混合物收集容器(315)转移到过滤器壳体(410)中的过滤器上，流速小于或约为5ml/min、4ml/min、3ml/min、2.5ml/min、2ml/min、1ml/min、0.75ml/min、0.5ml/min或0.25ml/min，其在说明性实施例中可以在0.25ml/min至5ml/min之间，在0.5ml/min至2.5ml/min之间，或者在0.75ml/min至1.5ml/min之间。此外，其内容物正在被转移的容器可以被定位成使得容器中的气泡在转移期间处于容器的顶部。修饰的和/或基因修饰的细胞穿过第一总成开口(417)以进入入口管道(455)，然后穿过过滤器壳体入口(425)进入过滤器壳体(410)，以接触过滤器壳体(410)内的白细胞减少iv过滤器(例如，acrodisc wbc 25mm psf(产品id:ap-4952))。白细胞减少iv过滤器具有1至10cm2的有效过滤面积，并且在说明性实施例中，具有3至5cm2的有效过滤面积。有核血细胞(包括白细胞)，例如修饰的t细胞和/或nk细胞，被过滤器壳体(410)中的过滤器保留，而其它血液组分和反应混合物中的组分穿过过滤器并流出过滤器壳体出口(426)进入出口管道(456)，然后穿过出口阀(446)并被收集在废物收集袋(416)中，废物收集袋例如可以是2l pvc废物收集袋。[0127]任选的缓冲液洗涤步骤可以通过将缓冲液容器(419)连接到入口管道(455)的第二总成开口(418)来进行，所述缓冲液容器例如是包含反应混合物体积的0.25倍至2倍体积的注射器，在说明性实施例中，所述体积可以是5ml至30ml、5ml至25ml、5ml至20ml或5ml至15ml缓冲液，例如约10ml缓冲液。在说明性实施例中，第二总成开口(418)是无菌的无针阀连接器。可以施加力以将缓冲液通过第二总成开口(418)转移到入口管道(455)中并且通过所述入口管道以通过过滤器壳体入口(425)进入过滤器壳体(410)并通过过滤器壳体(410)内的白细胞减少过滤器以冲洗保留在过滤器上的细胞。在一些实施例中，缓冲液在过滤器壳体(410)上的流速小于或约为5ml/min、4ml/min、3ml/min、2.5ml/min、2ml/min、1ml/min、0.75ml/min、0.5ml/min或0.25ml/min，其在说明性实施例中可以在0.25ml/min至5ml/min、0.5ml/min至2.5ml/min，或0.75ml/min至1.5ml/min之间。缓冲液和剩余的血液组分以及未保留在过滤器上的反应混合物中的组分穿过过滤器并从过滤器壳体出口(426)出来进入出口管道(456)，然后穿过出口阀(446)并被收集在废物收集袋(416)中，该废物收集袋可以是与用于收集在先前步骤中穿过过滤器的反应混合物组分的废物收集袋相同的废物收集袋，或者是在允许缓冲液进入第二总成开口(418)之前代替第一废物收集袋交换的新废物收集袋。通过在多次洗涤中使用相同或不同的缓冲液容器，用额外的缓冲液重复上述过程，可以任选地多次进行任选的洗涤步骤。此外，在一些实施例中，任选的洗涤步骤至少部分地使用洗脱/递送溶液进行。在一些实施例中，当使用不同的缓冲液容器时，相同或不同的缓冲液可以用于不同的洗涤中。在说明性实施例中，任选的洗涤步骤执行一次。在一些实施例中，在具有或不具有任选的洗涤步骤的情况下，通过使用过滤，在说明性实施例中通过使用白细胞减少过滤器，至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的未结合的基因载体(例如基因载体颗粒)，以及在说明性实施例中不与修饰的淋巴细胞的群体缔合的rip被除去。[0128]一旦反应混合物收集容器(315)中的整个或基本上整个体积的反应混合物经过过滤器(410)，并且任选地执行任选的一个或多个洗涤步骤，则通过施加力以使流体在白细胞减少过滤器总成(400)中沿相反方向移动来启动反向灌注过程，以收集保留在过滤器壳体(410)内的过滤器集合(filter set)上的淋巴细胞，其中任选的步骤是将白细胞减少过滤器总成(400)定位成使得过滤器壳体入口(425)指向下方并且重力便于洗脱。本文中的白细胞减少过滤器总成的说明性实施例适用于反向灌注(再灌注)。在说明性的白细胞减少过滤器总成(400)中开始反向灌注过程之前，将出口阀(446)切换至再灌注位置并且将收集阀(445)切换至收集位置。为了开始再灌注，通过经由出口阀(446)注射，例如通过压下注射器(466)的柱塞，将注射器(466)中的一定体积的洗脱溶液(例如递送溶液)传递到出口管道(456)中，如本文所公开的，所述洗脱溶液在一些实施例中可以是例如在盐水或勃脉力(plasmalyte)中的人血清白蛋白，其可以具有如本文所提供的额外组分。在一些实施例中，递送溶液或洗脱溶液的体积可以为例如0.5ml至20ml、1ml至10ml或2ml至7ml。递送溶液通常快速地被转移到出口管道(456)中以帮助洗脱，例如，以至少或约5ml/min、10ml/min、20ml/min或60ml/min的流速或通过立即插入注射器(466)的柱塞。然后，递送溶液通过过滤器壳体出口(426)进入过滤器壳体(410)，并将保留在过滤器集合上的淋巴细胞悬浮成细胞制剂，并使细胞制剂通过过滤器壳体入口(425)离开过滤器壳体(410)并进入入口管道(455)。然后，在通过收集阀(445)后，将含有修饰的淋巴细胞的细胞制剂收集在细胞样品收集袋(465)中，所述修饰的淋巴细胞包括一些具有相关载体的t细胞和/或nk细胞，其中一些可以在此时被基因修饰和/或转导，所述细胞样品收集袋例如可以具有5ml至50ml、10ml至40ml、15ml至35ml或约25ml的最大体积、容量或体积容量，并且可以是冷冻保存袋。然后可以将所收集的细胞制剂任选地施用于受试者，例如通过皮下施用或与本文公开的其它组分组合或补充。收集的细胞制剂通常在施用之前被转移到注射器中。例如，细胞样品收集注射器(467)可以被附接到第三总成开口(420)。在说明性实施例中，第三总成开口(418)是无菌的无针阀连接器。然后施加力以将收集的细胞制剂从细胞样品收集袋(465)转移通过第三总成开口(420)并进入细胞样品收集注射器(467)，例如使用来自细胞样品收集注射器(467)的负压。[0129]自驱动car方法和组合物[0130]本文在某些方面中提供了在本文中被称为“自驱动car”的聚核苷酸，其编码膜结合的淋巴增生性元件，所述淋巴增生性元件在t细胞或nk细胞中的表达受诱导型启动子的控制，所述诱导型启动子通过抗原与胞外结合对成员多肽的结合而被诱导，所述胞外结合对成员多肽由t细胞或nk细胞表达并在功能上连接到胞内活化结构域，例如cd3ζ胞内活化结构域或本文其它处公开的任何胞内活化结构域。在说明性实施例中，这类结合对成员多肽是car。在其它实施例中，这类结合对成员多肽是tcr。因此，在某些实施例中，本文提供了包含可操作地连接到编码膜结合的淋巴增生性元件的核酸的诱导型启动子的聚核苷酸，所述膜结合的淋巴增生性元件通过car结合至其靶标而被诱导。淋巴增生性元件的表达可以诱导t细胞或nk细胞的增殖。本文在某些方面中提供了基因修饰的或转导的t细胞，本文被称为“自驱动car-t细胞”，其包括自驱动car。任何包括自驱动car-t细胞的实施例都可以包括“自驱动car nk细胞”，其是包括自驱动car的基因修饰的或转导的nk细胞。在一些实施例中，除了自驱动car-t细胞外，还存在自驱动car nk细胞。在其它实施例中，存在自驱动car nk细胞而不是自驱动car-t细胞。包括自驱动car的各种实施例在本文的示例性实施例章节中公开并且可以与该章节的任何实施例或细节相结合。[0131]因此，本文在某些实施例中提供了一种分离的聚核苷酸，其包括第一序列，所述第一序列包含一个或多个第一转录单元，所述第一转录单元可操作地连接到在t细胞或nk细胞中的至少一种中可诱导的诱导型启动子，其中所述一个或多个第一转录单元中的至少一个包含编码包含淋巴增生性元件的第一多肽的第一聚核苷酸序列；并且在说明性实施例中编码嵌合抗原受体(car)的第二转录单元，其中所述car包含抗原特异性靶向区(astr)、跨膜结构域和胞内活化结构域。在某些说明性实施例中，淋巴增生性元件在t细胞或nk细胞中的至少一种中具有组成型活性，并且淋巴增生性元件包含跨膜结构域。在说明性实施例中，自驱动car的所述一个或多个第一转录单元不编码包含信号肽序列的多肽，所述信号肽序列包含信号肽酶切割位点，或其它序列，所述其它序列将导致所编码的多肽一旦被表达，就被分泌或以其它方式从t细胞或nk细胞释放。[0132]本文在另一个自驱动car实施例中提供了一种分离的聚核苷酸，其包括在反向方向上的第一序列，所述第一序列包含一个或多个可操作地连接到在t细胞或nk细胞中的至少一种中可诱导的诱导型启动子的第一转录单元；并且进一步包括在正向方向上的第二序列，所述第二序列包含一个或多个可操作地连接到组成型t细胞或nk细胞启动子的第二转录单元，其中所述一个或多个第一转录单元的5'端与所述一个或多个第二转录单元的5'端之间的核苷酸的数目小于所述一个或多个第一转录单元的3'端与所述一个或多个第二转录单元的3'端之间的核苷酸的数目，其中所述一个或多个第一转录单元中的至少一个编码淋巴增生性元件，并且其中所述一个或多个第二转录单元中的至少一个编码嵌合抗原受体(car)，其中所述car包含抗原特异性靶向区(astr)、跨膜结构域和胞内活化结构域。一个或多个第一转录单元的5'端与一个或多个第二转录单元的5'或3'端之间的距离可以被测量，例如，作为一个或多个第一转录单元的5'核苷酸与一个或多个第二转录单元的5'或3'核苷酸之间的核苷酸的数目。在一些实施例中，一个或多个第一转录单元和一个或多个第二转录单元被发散地转录，并且这类转录单元被认为是发散地排列，即在相反的方向上，其中一个或多个第一转录单元和一个或多个第二转录单元的3'端比一个或多个第一转录单元和一个或多个第二转录单元的5'端彼此更远离。含有两种转录单元，即第一和第二一个或多个转录单元的聚核苷酸或载体在本文中可以被称为双顺反子聚核苷酸或载体。发散的双顺反子聚核苷酸可以编码2、3、4或更多个多肽和/或抑制性rna。[0133]在另一个实施例中，本文提供了基因修饰的淋巴细胞，在说明性实施例中基因修饰的t细胞和/或nk细胞，其已被上文公开的聚核苷酸转导和/或基因修饰。在另一个实施例中，本文提供了复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制备用于基因修饰和/或转导受试者的淋巴细胞(在说明性实施例中t细胞和/或nk细胞)的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒的用途包括在体内或体外用上述公开的聚核苷酸转导和/或基因修饰t细胞或nk细胞。在另一个实施例中，本文提供了用于将基因修饰的淋巴细胞施用于受试者的方法，其中所述经基因修饰的淋巴细胞通过用在该自驱动car章节中公开的聚核苷酸转导和/或基因修饰淋巴细胞而产生。在本文任何方面的一些实施例中，基因修饰的淋巴细胞或复制缺陷型反转录病毒颗粒的施用可以通过静脉内注射、腹膜内施用、皮下施用或肌内施用来进行。在一些实施例中，引入到受试者中的修饰的淋巴细胞可以是同种异体淋巴细胞。在这类实施例中，淋巴细胞来自不同的人，并且来自受试者的淋巴细胞未被修饰。在一些实施例中，不从受试者采集血液以收获淋巴细胞。[0134]在用于用自驱动car转导淋巴细胞的任何组合物和方法实施例的说明性实施例中，所述聚核苷酸可以包括组成型t细胞或nk细胞启动子。在t细胞或nk细胞中组成型表达聚核苷酸的组成型t细胞或nk细胞启动子是本领域已知的并且在本文其它地方公开。在一些实施例中，转录单元是组成型表达单元或构建体，其在自驱动car实施例的说明性实施例中编码car。在一些实施例中，组成型表达构建体是本文所述重组表达载体或是本文所述重组表达载体的一部分。[0135]在一些实施例中，转录单元是诱导型表达单元或构建体，其在自驱动car实施例的说明性实施例中可以编码淋巴增生性元件。诱导型表达构建体可以包含调控序列，例如转录和翻译起始和终止密码子。在一些实施例中，这类调节序列对待引入诱导型启动子的细胞的类型(即t细胞和/或nk细胞)具有特异性。诱导型表达构建体可以包含与感兴趣的核苷酸序列可操作连接的天然或非天然启动子。在一些实施例中，诱导型或活化型启动子可以是nfat应答启动子、atf2应答启动子、ap-1应答启动子或nf-κb应答启动子。在t细胞活化时被诱导并可以在本文的实施例中，特别是用于自驱动car的实施例中用作诱导型启动子的其它启动子包括il-2、ifng、cd25、cd40l、cd69、cd107a、tnf、vla1启动子或lfa1启动子，或这些启动子中任一种的功能性和诱导性片段。如本文所讨论的，这类诱导性可以由一种或多种nfat结合元件的存在产生。[0136]在用于用自驱动car转导淋巴细胞的组合物和方法实施例的任一个的说明性实施例中，第一序列可以处于反向方向，并且第二序列可以处于正向方向。当存在于能够基因修饰t细胞或nk细胞的重组反转录病毒颗粒中时，第一序列和第二序列的方向是相对于由聚核苷酸的5'ltr和3'ltr确定的5'至3'方向。因此，其5'端距5'ltr比其3'端距5'ltr更近的序列(例如转录单元、启动子、编码序列、mirna)位于正向方向，而其3'端距5'ltr比其5'端距5'ltr更近的序列位于反向方向。序列的任一端与5'ltr之间的距离通常被测量为，例如，序列的5'或3'核苷酸与5'ltr的3'核苷酸之间的核苷酸的数量。在一些实施例中，所述聚核苷酸进一步可以包括如本文其它处公开的反向方向的核糖开关。在一些实施例中，一个或多个第一转录单元的5'端与一个或多个第二转录单元的5'端之间的核苷酸数目小于一个或多个第一转录单元的3'端和一个或多个第二转录单元的3'端之间的核苷酸数目。[0137]仅通过具有活性car信号传导的car-t细胞表达非分泌和组成型活性淋巴增生性元件(如在自驱动car中)，可以在缺乏抗原结合的情况下限制car-t细胞的扩增。此外，在成功治疗肿瘤后，在无抗原的情况下，自驱动car-t细胞增殖更少。[0138]在自驱动car实施例的说明性实施例中，诱导型启动子是nfat应答启动子。在一些实施例中，诱导型或活化型启动子可以是nfat应答启动子，并且包括一个或多个nfat结合位点。在一些实施例中，一个或多个nfat结合位点可以源自本领域已知为nfat应答启动子的启动子。在一些实施例中，一个或多个nfat结合位点可以衍生自il-2、il-4和/或il-8启动子。在说明性实施例中，一个或多个nfat结合位点可以衍生自il-2启动子。在一些实施例中，nfat应答启动子可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个nfat结合位点。在说明性实施例中，nfat应答启动子可以包括4、6或9个nfat结合位点。在一些实施例中，nfat应答启动子的nfat结合位点可以包括保留结合nfat的能力的功能性序列变体，以避免精确的重复。在一些实施例中，nfat应答启动子对nfatc1、nfatc2、nfatc3、nfatc4和/或nfatc5应答。在一些实施例中，nfat应答启动子包括seq id no:352的一个或多个nfat结合位点。在一些实施例中，nfat结合位点的拷贝之间的间隔可以在3至60个核苷酸之间或6至20个核苷酸之间。在说明性实施例中，nfat应答启动子包含6个nfat结合位点，并且核苷酸序列包含seq id no:353或其功能部分或功能变体或者上述组成。[0139]在一些实施例中，编码淋巴增生性元件的转录单元包括具有上游nfat结合位点的最小组成型启动子，以产生具有低水平转录的诱导型或活化型启动子，即使在没有诱导信号的情况下。在一些实施例中，在没有诱导信号的情况下，来自这类诱导型启动子的淋巴增生性元件的低转录水平可以小于来自组成型启动子的car的转录水平的1/2、1/4、1/5、1/10、1/25、1/50、1/100、1/200、2/250、1/500或1/1,000。在一些实施例中，最小组成型启动子可以包括最小il-2启动子、最小cmv启动子或最小mhc启动子。在说明性实施例中，最小启动子可以是最小il-2启动子(seq id no:354)或其功能部分或功能变体。在说明性实施例中，nfat应答启动子包括最小il-2启动子上游的六个nfat结合位点，并且核苷酸序列包括seq id no:355、或其功能部分或功能变体或者由上述组成。[0140]具有在反向方向的第一序列和在正向方向的第二序列的上述公开的聚核苷酸中的诱导型和组成型启动子可以以不可预测的方式相互干扰，特别是在存在强组成型启动子如ef1-a、cmv和cag启动子的情况下。启动子干扰可以导致来自一种或两种启动子的转录增加或减少。启动子干扰也可以导致诱导型启动子的动态范围减小。在一些实施例中，隔离子位于发散的转录单元之间。在一些实施例中，隔离子位于诱导型启动子与组成型启动子之间。在一些实施例中，隔离子可以是本领域已知的鸡hs4隔离子、kaiso隔离子、sar/mar元件、嵌合鸡隔离子-sar元件、ctcf隔离子、gypsy隔离子或β-珠蛋白隔离子或其片段。在一些实施例中，隔离子可以是b-珠蛋白polya间隔子b(seq id no:356)、b-珠蛋白polya间隔子a(seq id no:357)、250chs4隔离子v1(seq id no:358)、250chs4隔离子v2(seq id no:359)、650chs4隔离子(seq id no:360)、400chs4隔离子(seq id no:361)、650chs4隔离子和b-珠蛋白polya间隔子b(seq id no:362)，或b-珠蛋白polya间隔子b和650chs4隔离子(seq id no:3)。在一些实施例中，隔离子可以处于正向方向。在其它实施例中，隔离子可以处于反向方向。本领域技术人员将理解如何在启动子之间引入隔离子以防止或减少启动子干扰。[0141]在一些实施例中，所述聚核苷酸可以包括许多腺苷核苷酸，其被称为聚腺苷酸化序列，在编码反向方向的淋巴增生性元件的序列的3'端之后。在一些实施例中，聚腺苷酸化序列可以与隔离子一起使用。在其它实施例中，聚腺苷酸化序列可以在没有隔离子的情况下使用。在一些实施例中，聚腺苷酸化序列可以衍生自β-珠蛋白聚腺苷酸化序列或hgh聚腺苷酸化序列。在一些实施例中，聚腺苷酸化序列可以是合成的。在一些实施例中，聚腺苷酸化序列可以包括选自hgh polya(seq id no:316)、spa1(seq id no:317)或spa2(seq id no:318)的序列中的一种或多种。在一些实施例中，聚核苷酸不包括外源性剪接位点。在说明性实施例中，聚核苷酸不包括正向方向或反向方向的外源剪接位点。[0142]在用于用自驱动car转导淋巴细胞的组合物和方法实施例的任何一个中，聚核苷酸可以包括一种或多种抑制性rna分子，如例如mirna或shrna，如本文其它处所公开的。在一些实施例中，抑制性rna分子可以在内含子(包括例如ef1-a内含子)内编码。在说明性实施例中，抑制性rna分子可以靶向在本文(包括但不限于本文的抑制性rna分子章节)中鉴定的任何靶标。[0143]在用于用自驱动car转导淋巴细胞的组合物和方法实施例的任何一个中，诱导型启动子可以驱动淋巴增生性元件的表达，如本文其它处所公开的。在说明性实施例中，淋巴增生性元件是非分泌的和组成型活性淋巴增生性元件。[0144]细胞制剂和施用方法[0145]在一些实施例(例如其中样品不经历pbmc分离或粒细胞耗尽程序的那些实施例)中，经受本文的用于修饰的方法的血液样品中存在的嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％存在于细胞制剂中，包括在任选递送(即施用)步骤时。在一些实施例(例如其中样品不经受b细胞耗尽程序的那些实施例)中，经受本文的用于修饰的方法的血液样品中存在的b细胞的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％存在于细胞制剂中，包括在任选的递送步骤时。在一些实施例(例如其中样品不经历单核细胞耗尽程序的那些实施例)中，经受本文的用于修饰的方法的血液样品中存在的单核细胞的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％存在于细胞制剂中，包括在任选的递送步骤时。[0146]在一些实施例中，以及在其中细胞制剂经皮下或肌内施用的说明性实施例中，包括修饰的淋巴细胞的细胞制剂的体积小于传统的car-t方法(其通常为输注-递送方法)，并且可以小于或小于约1ml、约2ml、约3ml、约4ml、约5ml、约10ml、约15ml、约20ml或约25ml。[0147]在抽取(收集)血液和将修饰的淋巴细胞再引入到受试者之间有利地短的时间意味着在一些实施例中，一些淋巴细胞与重组核酸载体缔合，在说明性实施例中与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒缔合，并且还未被基因修饰。在一些实施例中，至少5％的修饰的淋巴细胞不是基因修饰的。在一些实施例中，修饰的淋巴细胞是基因修饰的，并且含有染色体外的或整合到基因组中的聚核苷酸。在一些实施例中，聚核苷酸可以在至少5％的修饰的淋巴细胞中是染色体外的。在一些实施例中，至少5％的修饰的淋巴细胞未被转导。[0148]在某些实施例中，短的接触时间还导致本文的细胞制剂中的许多修饰的淋巴细胞在其表面上具有结合多肽、促融合多肽，并且在一些实施例中通过与重组反转录病毒颗粒缔合或者通过反转录病毒包膜与质膜融合，包括在任选的递送步骤时，具有起源于反转录病毒颗粒的表面上的t细胞活化元件。在一些实施例中，细胞制剂中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的修饰的淋巴细胞包括假型化元件和/或t细胞活化元件，例如t细胞活化抗体。在一些实施例中，假型化元件和/或t细胞活化元件可以通过例如t细胞受体cd28、ox40、4-1bb、icos、cd9、cd53、cd63、cd81、cd82被结合到修饰的淋巴细胞的表面，和/或假型化元件和/或t细胞活化元件可以存在于修饰的淋巴细胞的质膜中。[0149]本文提供了细胞制剂，其包括例如t细胞和/或nk细胞。在说明性实施例中，这类制剂通过本文提供的方法提供。本文提供的任何细胞制剂均可以包括自驱动car-t细胞。在一个方面中，本文提供了一种细胞制剂，其包含递送溶液中的自驱动car-t细胞的群体，例如修饰的、基因修饰的、转录的、转染的和/或稳定整合的自驱动car-t细胞。[0150]由于淋巴细胞与重组核酸载体接触的时间有利地短，并且在本文提供的一些说明性实施例中这类接触后修饰的淋巴细胞是离体的，在这些实施例中，在用于或被包括在本文提供的任何方法或组合物中之前，包括但不限于被引入或再引入回受试者中，或在用于制备细胞制剂之前，一些或全部的t细胞和nk细胞尚未表达重组核酸或尚未将重组核酸整合到细胞的基因组中，并且在包括这些的实施例中的一些反转录病毒颗粒可以与靶细胞膜缔合，但可能尚未与靶细胞膜融合。因此，本文提供了各种细胞制剂方面和实施例，其可以例如由本文提供的这些说明性方法产生，例如在说明性实施例中涉及皮下施用的快速护理点方法。这类细胞制剂，包括但不限于下文和本文的例示性实施例章节中所述的那些，可以在细胞与重组反转录病毒载体接触并任选地冲洗后的细胞收集时存在，并且在说明性实施例中，可以直到并包括皮下施用于受试者时存在。[0151]在一些实施例中，本文提供了包含t细胞和/或nk细胞的细胞制剂，其中所述细胞制剂中少于90％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、10％或5％的细胞是t细胞和/或nk细胞。在一些实施例中，提供了包含淋巴细胞、nk细胞和/或t细胞的细胞制剂，其中所述细胞制剂中至少4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的淋巴细胞、nk细胞和/或在说明性实施例中t细胞是修饰的细胞。在一些实施例中，作为该范围的低端的4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％和70％的淋巴细胞被修饰，并且作为该范围的高端的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％的淋巴细胞被修饰，例如，5％至95％、10％至90％、25％至75％和25％至95％。在一些实施例中，细胞制剂内的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的修饰的淋巴细胞不是基因修饰的、转导的或稳定转染的。在一些实施例中，作为该范围的低端的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％和70％的修饰的淋巴细胞未被基因修饰、转导或稳定转染，并且作为该范围的高端的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％或全部的修饰的淋巴细胞未被基因修饰、转导或稳定转染，例如5％至95％、10％至90％、25％至75％和25％至95％。在一些实施例中，基因修饰的淋巴细胞的聚核苷酸可以是染色体外的或被整合到这些细胞制剂中的基因组中，所述细胞制剂在接触和培育之后，并且在任选施用时形成。在这些细胞制剂的一些实施例中，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的经基因修饰的淋巴细胞具有染色体外聚核苷酸。在一些实施例中，作为该范围的低端的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％和70％的修饰或基因修饰的淋巴细胞具有染色体外聚核苷酸，并且作为该范围的高端的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％或全部的修饰或基因修饰的淋巴细胞具有染色体外聚核苷酸，例如，5％至95％、10％至90％、25％至75％和25％至95％。在一些实施例中，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％或全部的修饰或基因修饰的淋巴细胞在这些细胞制剂中未被转导或稳定转染，例如作为本文提供的用于基因修饰t细胞和/或nk细胞的方法的结果。在一些实施例中，作为该范围的低端的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％和70％的修饰或基因修饰的淋巴细胞未被转导，并且作为该范围的高端的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％或全部的修饰或基因修饰的淋巴细胞未被转导或未被稳定转导，例如，5％至95％、10％至90％、25％至75％和25％至95％。[0152]在本文公开的包括溶液的皮下递送和适于皮下递送的细胞制剂的某些实施例中，与当皮下递送时相比，如果静脉内递送，则较少的修饰的或基因修饰的淋巴细胞可以植入。在一些实施例中，与当皮下递送时相比，当静脉内递送时植入少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的淋巴细胞。[0153]在一些实施例中，细胞制剂(包括在细胞与重组反转录病毒载体接触并任选地冲洗后在细胞收集时存在的、以及直至并包括施用于受试者时存在的这类制剂)包含未修饰的淋巴细胞、修饰的淋巴细胞和基因修饰的淋巴细胞中的至少两种。在一些实施例中，这类细胞制剂包含比修饰的淋巴细胞更多的未修饰的淋巴细胞。在通过本文提供的方法产生的此类细胞制剂的一些实施例中，被修饰的、被基因修饰的、转导的和/或稳定转染的t细胞和nk细胞的百分比为至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。如本文实例所述，在本文提供的用于转导全血中淋巴细胞的例示性方法中，加入到反应混合物中或用于产生反应混合物的全血中淋巴细胞以及在一些实施例中t细胞和/或nk细胞的1％至20％、或5％至20％、或1％至15％、或5％至15％、或7％至12％或约10％被基因修饰和/或转导并存在于所得到的细胞制剂中。在一些实施例中，淋巴细胞不与重组核酸载体如复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，并且未被修饰。在某些说明性实施例中，淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施例中，淋巴细胞是在肿瘤浸润淋巴细胞与重组核酸载体接触之前或之后的肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施例中，淋巴细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞和在t细胞和/或nk细胞接触重组核酸载体之前或之后的t细胞和/或nk细胞。[0154]在一些实施例中，本文提供了细胞制剂，其中所述细胞制剂中的至少25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的修饰的t细胞和/或nk细胞不表达car，或在某些实施例中不表达转座酶，和/或不具有与其细胞膜相关的car。在其它实施例中，本文提供了细胞制剂，其中所述细胞制剂中至少25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的修饰的t细胞和/或nk细胞包含重组病毒反转录酶或整合酶。不受理论的限制，与传统的car-t细胞处理方法不同，在传统的car-t细胞处理方法中，细胞被离体培养数天或数周并且许多细胞分裂，在本文提供的说明性方法中，其中t细胞和/或nk细胞在递送的数小时内与反转录病毒颗粒接触，反转录病毒颗粒内存在的一些或大部分反转录酶和整合酶在它与反转录病毒颗粒融合之后移动到t细胞和/或nk细胞中，在递送时将仍然存在于修饰的t细胞和/或nk细胞中。在一些实施例中，本文提供了细胞制剂，其中所述细胞制剂中的至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的修饰的t细胞和nk细胞不表达重组mrna(例如，编码car和/或重组转座酶)。在一些实施例中，本文提供了细胞制剂，其中这类细胞制剂中的至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的修饰的t细胞和nk细胞不具有稳定整合到其基因组中的重组核酸。在一些实施例中，细胞制剂中大于50％、60％、70％、75％、80％或90％的细胞、nk细胞和/或t细胞是活的。[0155]在另外的实施例中，包括可以在本文的方法中引入或再引入的修饰的淋巴细胞的细胞制剂包括单核细胞和/或b细胞。在一些实施例中，当一些b细胞与重组核酸载体(例如裸dna载体)或在说明性实施例中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触时，它们在接触步骤期间被修饰。在一些实施例中，至少一些但不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的b细胞在细胞制剂中被修饰，所述细胞制剂可以任选地施用或再施用。在说明性实施例中，一些b细胞在这类制剂和方法中未被修饰。在另外的说明性实施例中，在这类制剂和方法中，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的b细胞未被修饰。因此，在一些实施例中，修饰的淋巴细胞与未修饰的淋巴细胞一起存在于细胞制剂中，所述未修饰的淋巴细胞任选地被肌内或皮下递送至受试者。在一些实施例中，细胞制剂中的修饰的淋巴细胞和任选地引入到受试者中的修饰的淋巴细胞可以是同种异体淋巴细胞。在这类实施例中，淋巴细胞来自不同的人，并且来自受试者的淋巴细胞未被修饰。在一些实施例中，不从受试者采集血液以收获淋巴细胞。[0156]在说明性实施例中，嗜中性粒细胞存在于细胞制剂中，作为用于皮下递送修饰的t细胞和/或nk细胞的细胞制剂的非限制性实例，当考虑到施用所述细胞制剂的受试者的安全性时，所述嗜中性粒细胞的浓度对于静脉内递送而言太高。不受理论的限制，并且如本文其它部分所述，静脉内注射或递送嗜中性粒细胞可能导致肺损害，例如，由于输血相关急性肺损伤(trali)和/或急性呼吸窘迫综合征(ards)。例如，当用于产生修饰的淋巴细胞的方法不包括在制备包含修饰的淋巴细胞的细胞制剂之前和在将溶液任选地皮下递送至受试者之前的pbmc富集步骤时，可能出现这种情况。因此，在一些实施例中，嗜中性粒细胞存在于细胞制剂中，例如在任选的递送步骤时。更具体地，在一些实施例中，经受本文的用于修饰的方法的血液样品中存在的嗜中性粒细胞的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％存在于细胞制剂中，包括在任选的递送步骤时。在一些实施例中，存在于细胞制剂中的细胞的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少75％是嗜中性粒细胞，包括在任选的递送步骤时。在一些实施例中，存在于细胞制剂中的细胞的5％、10％、15％、20％、25％、30％或40％作为该范围的低端是嗜中性粒细胞，并且存在于细胞制剂中的细胞的30％、40％、50％、60％、70％或75％作为该范围的高端是嗜中性粒细胞，包括在任选的递送步骤时，例如存在于细胞制剂中的细胞的5％至50％、20％至50％、30％至75％、或50％至75％是嗜中性粒细胞，包括在任选的递送步骤时。[0157]在一些实施例中，在经受本文用于修饰的方法的血液样品中存在的单核细胞的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％存在于细胞制剂中，包括在任选的递送步骤时。在一些实施例中，在经受本文用于修饰的方法的血液样品中存在的b细胞的至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％存在于所得的细胞制剂中，包括在任选的递送步骤时。在一些实施例中，细胞制剂可以包括pbmc级分，其包括修饰的t细胞和nk细胞。在一些实施例中，细胞制剂中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、80％、85％、90％或95％、或1％至95％、5％至95％、5％至50％、或10％至50％的被修饰的t和nk细胞是被基因修饰的。[0158]施用的细胞制剂或其它溶液的体积根据施用途径而变化，如本文其它地方所述。皮下或肌内注射的细胞制剂通常比通过输注递送的细胞制剂具有更小的体积。在一些实施例中，细胞制剂或其它溶液(包括被修饰的且在说明性实施例中被基因修饰的淋巴细胞的悬浮液)的体积不超过1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、45ml或50ml。在一些实施例中，细胞制剂或包括被修饰的淋巴细胞的悬浮液的其它溶液的体积可以为作为该范围的低端的0.20ml、0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、10ml、15ml、20ml或25ml至作为该范围的高端的0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、45ml或50ml、30ml、35ml、40ml、45ml、50ml、75ml、100ml、125ml、250ml、500ml或1000ml。因此，作为非限制性实例，体积可以为0.2ml至10ml、0.5ml至10ml、0.5至2ml、1ml至250ml、1ml至100ml、10ml至100ml或1ml至10ml。在某些说明性实施例中，皮下或肌内施用少于10ml、1ml至25ml，并且在说明性实施例中1ml至3ml、1ml至5ml或1ml至10ml的细胞制剂，其包含在递送溶液中的被修饰的淋巴细胞。在说明性实施例中，包含被修饰的淋巴细胞的溶液的体积可以在作为范围的低端的0.20ml、0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml和5ml与作为该范围的高端的0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、45ml和50ml之间。在一个例示性实施例中，通过皮下施用1ml的7.0×107个细胞/ml的t细胞递送制剂，以1.0×106个t细胞/kg对70kg受试者进行给药。在一些实施例中，当溶液的体积为至少2ml、3ml、4ml、5ml、10ml、15ml、20ml或25ml时，溶液可以包含透明质酸酶。在本文的其中淋巴细胞特别是在它们被修饰后被过滤，和/或特别是其中转导是在过滤器顶部进行的实施例中，递送溶液可以用于以可以是上述那些的体积从过滤器再悬浮和/或洗脱细胞。因此，在一些实施例中，本文提供的递送溶液是洗脱溶液。[0159]在一些实施例中，通过皮内、瘤内或肌内施用并且在说明性实施例中使用存在于皮下递送装置(例如适于皮下递送溶液的无菌注射器)中的细胞制剂的皮下施用，将修饰的和在说明性实施例中基因修饰的淋巴细胞引入或再引入到受试者中。在一些实施例中，使用皮下递送装置，该皮下递送装置保持溶液(例如，本文的细胞制剂)并且具有开放或可打开的端部，该端部在说明性实施例中是针的开放端部，用于从装置的液体保持部分皮下施用溶液(例如，细胞制剂)。这类皮下递送装置对于皮下递送是有效的并且在说明性实施例中适于皮下递送，或者对于皮下注射是有效的，或者适于皮下注射。适于皮下递送溶液的皮下递送装置的非限制性实例包括皮下导管，例如留置皮下导管，例如如(becton dickinson)和不必要的闭合留置皮下导管系统，例如带翼，例如如(becton dickinson)。在一些实施例中，递送装置可以包括泵，例如输注泵或蠕动泵。在一些实施例中，细胞制剂与本文公开的任何针(例如与皮下递送相容、对皮下递送有用、对皮下递送适用或适于皮下递送或可有效用于皮下递送的针)流体连接。在说明性实施例中，针可以具有26至30的规格。在一些实施例中，皮下递送装置是皮下递送笔。这类笔可以包括有效地皮下递送或适于皮下递送的注射器，该注射器被封闭在壳体内，并且可以包括针护套。这类笔的实例包括用于递送舒马曲坦的笔。在一些实施例中，所述细胞制剂存在于皮下递送装置(例如注射器)中，其中所述皮下递送装置具有已经穿透受试者的皮肤的针，所述受试者的修饰的t细胞和/或nk细胞是注射器中存在的修饰的细胞(即接受皮下注射的受试者是被注射的自体细胞的来源)，并且在一些实施例中以其开口端位于受试者的皮下组织中。在说明性实施例中，皮下递送装置(例如注射器)可以包括适于皮下施用的针。皮下施用通常使用直径小于用于血液输注的静脉内导管的直径的针，例如可以使用16号针。与肌内递送相容并且在说明性实施例中与皮下递送相容的递送装置(例如注射器)是可以成功地用于肌内或皮下递送的任何递送装置(例如注射器)，并且包括那些对于肌内或皮下递送有效并且适于肌内或皮下递送的递送装置(例如注射器)，加上通用注射器和在至少一些实施例中可以成功地用于肌内或皮下递送的专门设计用于其它目的注射器。如所已知的，对于皮下注射，在使用注射器的说明性实施例中，针以45°至90°角插入穿过皮肤。因此，一些实施例包括以相对于皮肤成45°至90°的角度皮下注射细胞制剂，以及包含在注射器或其它皮下递送装置内的细胞制剂，所述注射器或其它皮下递送装置具有与受试者的皮肤成45°至90°的角度的针。对肌内递送和在说明性实施例中皮下递送有效或可有效用于肌内或皮下注射的注射器是具有通常对肌内或皮下递送有效的参数的注射器，例如，规格在20至22之间且长度在1英寸至1.5英寸之间的针通常对肌内递送有效，并且规格在26至30之间且长度在0.5英寸至0.625英寸之间的针通常对皮下递送有效。适于皮下递送或适于皮下注射的注射器是专门为皮下递送制造的任何注射器。一种适于皮下递送的这类注射器使用芯环形流，其允许皮下递送通常不能皮下递送的高度浓缩的生物药物制剂(jayaprakash v等人，《先进医疗材料(adv healthc mater.)》2020年8月24日；e2001022)。另一种适于皮下递送的注射器使用比通常使用的更短的针头(pager a,《关于药物递送的专家意见(expert opin drug deliv.)》2020年8月9日；1-14)。另一种适于皮下递送的注射器使用29g/5斜面针头，其具有热塑性弹性体(tpe)针头护套(jaber a等人.《bmc神经学(bmc neurol.)》2008年10月10日；8:38)。在说明性实施例中，针的外径小于0.026"。在一些实施例中，针的外径为至多0.01625"、0.01865"、0.01825"、0.02025"、0.02255"或0.02525"。在一些实施例中，针是17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、26s、27、28、29或30规格的针。在一些实施例中，针的长度不超过1英寸或0.5英寸。在说明性实施例中，针是26、26s、27、28、29或30规格的针，并且针的长度在0.5英寸至0/625英寸之间。在一些实施例中，针可以是带翼的输注集合，也被称为蝴蝶针或头皮静脉针。在一些实施例中，引入或再引入可以使用皮下导管进行。[0160]不受理论的限制，与其中细胞和细胞制剂的其它组分快速分散的静脉内递送相反，本文提供的皮下和肌内递送方法允许细胞和细胞制剂的组分在受试者体内保持紧密接近，例如在说明性实施例中作为受控释放持续几天、几周或者甚至几个月，同时产生用于t细胞和/或nk细胞活化和扩增的局部环境，保持与t细胞和nk细胞在淋巴器官如脾或淋巴结中遇到的性质相似的性质。虽然超过20kda的大蛋白分子(例如来自皮下位点的抗体)的吸收在24小时至72小时内通过淋巴管吸收到血液中，但是发现使用本文提供的皮下和肌内方法从局部注射位点受控释放t细胞或nk细胞涉及在至少一些且通常大多数修饰的细胞通过血管和淋巴管迁移到靶表达的位点(例如肿瘤)之前在注射的位点处的初始扩增阶段，然后可通过身体检测到。在一些实施例中，局部注射受控释放将导致经基因修饰的细胞在皮下施用的位点处扩增持续数天(例如，持续高达5天、7天、14天、17天、21天或28天)或数个月(例如，持续高达1个月、2个月、3个月、6个月、12个月或24个月)，其中经基因修饰的car-t细胞或car-nk细胞从皮下施用的位点转移到身体的其它位点，例如肿瘤(参见，例如图26)。因此，在将修饰的t细胞和/或nk细胞经皮下注射到受试者中后数天(例如，1、2、3、4、5、6或7天)、数周(例如，1、2、3或4周)、并且甚至数月(例如，1、2、3、6、12或24个月)之后，经基因修饰的car-t细胞可以出现在迁移离开皮下施用位点的淋巴管或循环中。[0161]经基因修饰的t细胞和/或nk细胞(例如car-t细胞)在皮下的这种持久性提供了有利的局部环境，在所述局部环境中，可以在修饰的car-t细胞的递送位点处或附近皮下募集或递送受试者天然或非天然的其它组分，例如分子(离子)、大分子(例如，dna、rna、肽和多肽)和/或可以影响修饰的car-t细胞的其它细胞。实际上，在递送修饰的t细胞和/或nk细胞之后已经观察到包含淋巴脉管系统的三级淋巴样结构。不受理论的限制，据信此类淋巴脉管系统为皮下施用的修饰的t细胞和/或nk细胞提供了进入局部淋巴循环的场所，之后，它们可以进入全身循环并且例如进入血液。已经观察到此类三级淋巴样结构包含活化的淋巴细胞。因此，本文提供了淋巴样结构，所述淋巴样结构包含主动分裂的基因修饰的t细胞和/或nk细胞的聚集体和在此类聚集体附近的淋巴脉管系统。在一些实施例中，三级淋巴样结构和/或经基因修饰的car-t细胞可以在皮下施用位点附近保持持续至少1、2、3、4、5、6或7天，1、2、3、4、5、6、7或8周，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或24个月。在说明性实施例中，三级淋巴样结构和/或经基因修饰的car-t细胞在皮下施用位点附近保持持续至少1、2、3、4、5、6或7天、1、2、3或4周、或1、2或3个月。在一些实施例中，三级淋巴样结构和/或经基因修饰的car-t细胞可以在皮下施用位点附近保持持续1天至24个月、7天至12个月、2周至6个月、3周至8周、或4周至6周。在说明性实施例中，在一些实施例中，三级淋巴样结构和/或经基因修饰的car-t细胞可以在皮下施用位点附近保持持续1周至3、4、5、6、7、8、9或10周，例如1周至8周、1周至7周，或1周至6周。在一些实施例中，三级淋巴样结构和/或基因修饰的细胞中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞可以保持定位在施用位点的1cm、2cm、3cm、4cm或5cm内。[0162]本文更详细地公开了可以与修饰的淋巴细胞一起递送的其它组分，并且可以以与修饰的t细胞和/或nk细胞相同的制剂或不同的一种或多种制剂被递送。此外，这些其它组分可以与修饰的t细胞和/或nk细胞一起递送，或者可以在修饰的t细胞和/或nk细胞之前或之后数天(例如，1、2、3、4、5、6或7天)、数周(例如，1、2、3或4周)或甚至数月(例如，1、2、3、6、12或24个月)内被递送。此外，经基因修饰的car-t细胞在皮下施用位点附近的持续存在进一步展示了本文所提供的某些实施例的优点，其中所述皮下施用在肿瘤(例如癌性)细胞的位点附近(例如，在1cm、1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、10cm、20cm或30cm内)进行，所述肿瘤细胞例如肿瘤或包括肿瘤的器官，在血液癌症的情况下包括例如脾或淋巴结。[0163]在一些实施例中，细胞制剂与皮下或肌内递送相容或甚至适于皮下或肌内递送，以保持细胞局部聚集，从而能够将细胞控释到循环中。在一些实施例中，用于皮下或肌内递送的细胞制剂中的细胞的浓度高于通常静脉内递送的细胞浓度。在一些实施例中，用于皮下或肌内递送的细胞制剂中白细胞的浓度大于或大于约1.5×108个细胞/ml、约5×108个细胞/ml、约1×109个细胞/ml至1.2×109个细胞/ml。[0164]在说明性实施例中，将细胞(例如本文所述的被修饰和未被修饰的淋巴细胞的混合物)配制在递送溶液中，使得它们能够皮下或肌内施用、对皮下或肌内施用有效且适于皮下或肌内施用。实际上，本文提供的商业容器和试剂盒方面的某些实施例是或包括无菌皮下和/或肌内递送溶液的容器，在一些实施例中，其被冷藏储存。此类递送溶液能够并且在说明性实施例中有效地并且在进一步说明性实施例中适用于皮下或肌内施用，并且在说明性实施例中皮下施用。为了实现这一点，此类递送溶液和所得细胞制剂通常具有提供环境的ph和离子组成，在该环境中待施用的细胞可以存活直到它们被施用，例如至少1小时，并且通常可以存活至少4小时。这类ph通常为ph 6.5至8.0、或7.0至8.0、或7.2至7.6，并且可以通过缓冲剂如磷酸盐缓冲剂或碳酸氢盐来维持，所述缓冲剂以有效维持ph在目标范围内的浓度存在。在一些实施例中，例如，当复制缺陷型重组反转录病毒颗粒具有编码mrb-car的聚核苷酸时，ph可以在ph 6.0至ph 7.0之间，例如ph 6.2至ph 7.0，或ph 6.4至ph 7.0，或ph 6.4至ph 6.8。这类制剂的离子组合物可以例如包括包含盐(例如0.8至1.0或约0.9或0.9％的盐，如氯化钠)的盐水组合物。在一些实施例中，递送溶液是pbs或包括pbs。在本文的递送溶液和所得的细胞制剂的一些实施例中，na+的浓度在110mm至204mm之间，cl-的浓度在98mm至122mm之间，和/或k+的浓度在3mm至6mm之间。在说明性实施例中，递送溶液和包含该递送溶液的细胞制剂含有钙和/或镁。钙的浓度可以例如在0.5mm至2mm之间。镁的浓度可以例如在0.5mm至2mm之间。在一些实施例中，递送溶液不含钙和镁。在一些实施例中，递送溶液可以是林格氏乳酸盐溶液，也被称为乳酸钠溶液和哈特曼氏溶液。在说明性实施例中，林格氏乳酸盐溶液可以含有约130–131mm钠、109–111mm氯化物、28–29mm乳酸盐、4-5mm钾和1-1.5mm钙，并且通常通过混合氯化钠(nacl)、乳酸钠(ch3ch(oh)co2na)、氯化钙(cacl2)和氯化钾(kcl)来制备。在一些实施例中，递送溶液可以是plasma-lyte。在说明性实施例中，plasma-lyte可以含有约150mm钠、5mm钾、1.5mm镁、98mm氯化物、27mm乙酸盐和23mm葡糖酸盐。在一些实施例中，递送溶液可包括右旋糖。在一些实施例中，右旋糖的浓度可为至少或约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在说明性实施例中，递送溶液为0.9％nacl中的5％右旋糖。在一些实施例中，递送溶液为0.9％nacl(d5ns)中的5％右旋糖。[0165]在一些实施例中，递送溶液和细胞制剂含有人血清白蛋白和/或肝素。在一些实施例中，递送溶液和细胞制剂含有高达5％的hsa。在一些实施例中，递送溶液含有至少或约10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。在一些实施例中，递送溶液含有10mg/ml至30mg/ml、10mg/ml至100mg/ml、20mg/ml至80mg/ml、或40mg/ml至60mg/ml。在一些实施例中，递送溶液是包含2％hsa的pbs。在一些实施例中，递送溶液是包含浓度为10、20、30、40、50、60、70或80mg/ml的hsa的盐水。在一些实施例中，递送溶液是包含2％hsa(w/v，即2g/100ml)的dpbs。在一些实施例中，递送溶液包含30-100u/ml、40-100u/ml、30-60u/ml或60-80u/ml肝素。在一些实施例中，递送溶液是包含30-100u/ml、40-100u/ml、30-60u/ml或60-80u/ml肝素的盐水溶液，含有或不含0.5-5％、1-5％或1-2.5％hsa。本文关于反应混合物方面中肝素的浓度的讨论同样适用于递送溶液和细胞制剂方面。在一些实施例中，递送溶液包含约ph 7.4的盐水溶液，还包含hsa和碳酸氢钠。[0166]在一些实施例中，递送溶液为或包括适合于注射到受试者中的多电解质溶液。例如，递送溶液可以是或包括在容器(例如单剂量容器)中的无菌的、无热原的等渗溶液。在某些实施例中，这类溶液适合于或适于静脉内施用或腹膜内施用以及皮下和/或肌内施用。在一些实施例中，递送溶液可以包括用于注射到受试者中的多分析物溶液，其中每100ml含有526mg的氯化钠，usp(nacl)；502mg的葡萄糖酸钠c6h11nao7)；368mg的醋酸钠三水合物，usp(c2h3nao2·3h2o)；37mg的氯化钾，usp(kcl)；和30mg的氯化镁，usp(mgcl2·6h2o)，其中ph被调节至7.4(6.5至8.0)。在说明性实施例中，递送溶液不含抗微生物剂。用氢氧化钠调节ph。作为一个实例，多电解质注射溶液可以是可从各种商业供应商获得的ph 7.4的plasma-lyte a注射液。[0167]在说明性实施例中，细胞制剂从不冷冻。在说明性实施例中，细胞制剂含有少于或少于约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的dmso(v/v)。在另外的说明性实施例中，细胞制剂不包含dmso。[0168]均匀的单细胞悬浮液非常适合静脉递送，但不需要皮下或肌内施用。在一些实施例中，用于皮下或肌内递送的细胞制剂是促进细胞聚集的细胞的贮库制剂或乳液，并且本文用于制备这类贮库细胞制剂的递送溶液包括提供贮库性质的辅助组分。在一些实施例中，细胞可以在制剂中聚集，例如在其被施用于受试者之前，或者例如在细胞(例如如本文提供的修饰的淋巴细胞)在递送溶液(所述递送溶液例如包含聚集剂以产生所述制剂)中被配制的1小时、45分钟、30分钟、15分钟、10分钟、5分钟或1分钟内。在一些实施例中，聚集本文提供的细胞制剂中至少10％、20％、25％、50％、75％、90％、95％或99％的细胞。这类聚集可以例如使用个体细胞相对于与至少一个其它细胞相关联的细胞的显微镜计数来确定，或者通过平均计数与制剂内的细胞相关联的细胞的数目来确定。在一些实施例中，细胞制剂被设计用于与组织扩增一起被控制或延迟释放以适应细胞扩增。[0169]在一些实施例中，本文提供的用于皮下或肌内递送的递送溶液是贮库制剂。贮库(即持续释放)制剂通常是含水或含油悬浮液或溶液。[0170]因此，在一些实施例中，递送溶液或细胞制剂包括形成人工胞外基质如水凝胶的组分。在一些实施例中，贮库递送溶液包含有效量的藻酸盐、胶原和/或葡聚糖以形成贮库制剂。可以用于制备形成凝胶的生物材料并可以被包括在本文提供的递送溶液和细胞制剂中的一类聚合物由聚(乙二醇)(peg)及其与脂族聚酯的共聚物组成，所述脂族聚酯为例如聚(乳酸)(pla)、聚(d,l-乳酸-共-羟基乙酸)(plga)、聚(ε-己内酯)(pcl)和聚膦腈。可以使用的其它聚合物包括基于聚(n-(2-羟丙基甲基丙烯酰胺乳酸酯)和聚(乙二醇)(p(hpmam-lac)-peg)的热敏三嵌段共聚物，其能够在生理环境中自发自组装(vermonden等人，2006,langmuir 22:10180-10184)。[0171]在一些实施例中，在本文的递送溶液或细胞制剂中使用的水凝胶含有透明质酸(ha)。这类ha可以具有可被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-1-碳二亚胺盐酸盐修饰的羧酸基团，以优选在n-羟基琥珀酰亚胺的存在下与蛋白质、肽、聚合物和连接子上的胺基团反应，如在本文提供的被修饰的淋巴细胞上发现的那些。在本文提供的一些细胞制剂实施例中，抗体、细胞因子和肽可以使用这类方法与ha化学缀合以产生作为细胞乳剂共注射的水凝胶。此外，在一些实施例中，递送溶液和细胞制剂中的ha是聚合物(例如，healon)和/或被交联(例如瑞蓝玻尿酸(restylane)(abbive/allergan))，例如通过其-oh基团与试剂(例如戊二醛)轻度交联，以减少在皮下注射后材料的局部分解代谢。在本文的递送溶液和细胞制剂中使用的ha可以具有可变的长度和粘度。在本文的递送溶液和细胞制剂中使用的ha可以进一步与其它糖胺聚糖如硫酸软骨素(例如viscoat)或聚合物或表面活性剂交联。本领域技术人员将认识到，可以调节基质的孔隙率和交联度，以确保细胞(例如本文中的修饰的淋巴细胞)能够迁移通过水凝胶。因此，当在本文的细胞制剂中使用时，基质如水凝胶基质可以被配置为用于或适于允许细胞迁移通过基质。水凝胶的取代度和交联时的浓度将影响孔隙率溶胀率和杨氏模量(或刚度)。当随后在过氧化物的存在下交联时，用例如1mg/ml的酪胺对ha的初始1％取代将导致比3％取代和5mg/ml溶液具有较高的孔隙率和较低的刚度的水凝胶。在一些情况下，需要降低剪切模量，以降低注射期间的剪切力，并确保足够的孔隙率和细胞在1至2周内皮下膨胀到基质中的半衰期。在一些实施例中，剪切模量为或为约2.5kpa、约3kpa、约3.5kpa或约4kpa。[0172]在一些实施例中，递送溶液、试剂盒中的组合物或细胞制剂包括一种或多种细胞因子(如il-2、il-7、il-15或il-21)和/或细胞因子受体激动剂(如il-15激动剂)。在一些实施例中，细胞因子不结合至包含在递送溶液、试剂盒或细胞制剂中的细胞因子受体；和/或不结合至在递送溶液、细胞制剂或试剂盒中由多核苷酸编码的细胞因子受体。在一些实施例中，细胞因子可以是修饰的细胞因子，其不受理论限制地选择性地活化驱动增殖的复合物。在说明性实施例中，修饰的细胞因子是修饰的il-2，例如具有循环置换的il-2和il-2rα的胞外结构域的融合蛋白(参见，例如lopes等人,《癌症免疫治疗杂志(j immunather cancer)》2020年4月；8(1):e000673)。在一些实施例中，细胞因子、修饰的细胞因子或细胞因子受体激动剂也可以在包括递送溶液或细胞制剂的施用之前、同时或之后，在一次或与细胞制剂分开的施用中施用。在一些实施例中，两次或更多次单独的施用可以以递增剂量。在一些实施例中，两次或更多次施用可以以相同剂量。在一些实施例中，两次或更多次施用可以包括相同或不同的细胞因子、修饰的细胞因子和/或细胞因子受体激动剂。在一些实施例中，分开的施用可以是一系列2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21次施用。在一些实施例中，分开的施用在连续几天发生。[0173]在一些实施例中，细胞制剂包括能够结合cd2、cd3、cd28、ox40、4-1bb、icos、cd9、cd53、cd63、cd81和/或cd82的抗体或多肽。edc-nhs反应可以用于将这类蛋白与ha连接或通过上述其它中间体连接。在一些实施例中，这些细胞因子、抗体或多肽与水凝胶的组分交联。可以在注射前使用注射器连接器和两个注射器将水凝胶与细胞悬浮液混合。在其它实施例中，这些细胞因子、抗体或多肽在溶液中。在一些实施例中，递送溶液或细胞制剂包括编码这些细胞因子、抗体或多肽的rna。[0174]表达car的基因修饰的t细胞和/或nk细胞的增殖和存活通过当car在适当的背景下结合其同源抗原时通过car的信号传导来促进。在一些实施例中，抗原可以被添加到修饰的和/或基因修饰的t细胞和/或nk细胞中或与修饰的和/或基因修饰的t细胞和/或nk细胞共同施用。在一些实施例中，抗原是蛋白质、糖蛋白、碳水化合物或其片段，例如肽、糖肽或官能团。在一些实施例中，抗原可以是可溶性的。在一些实施例中，抗原来自非人类来源。在一些实施例中，抗原可以被固定在人工基质(例如水凝胶)的表面上。在一些实施例中，抗原是核酸，例如dna或rna。在一些实施例中，核酸编码蛋白质或肽抗原，所述蛋白质或肽抗原是被car识别的抗原。在说明性实施例中，抗原可以在包含编码蛋白质或肽抗原的核酸的细胞的表面上表达，使得细胞是靶细胞，在本文中称为饲养细胞。在一些实施例中，这类靶细胞大量存在于全血中，并且天然存在于细胞制剂中而不必添加。例如，b细胞存在于全血、分离的tnc和分离的pbmc中，并且将天然存在于细胞制剂中，并且可以作为表达针对cd19或cd22的car的t细胞和/或nk细胞的靶细胞，作为在b细胞上均表达的非限制性实例。在其它实施例中，这类靶细胞不存在于全血中或不大量存在于全血中，因此是外源添加的，例如饲养细胞。在一些实施例中，可以使用本领域中已知的方法从受试者(例如从肿瘤样品)中分离或富集靶细胞。在其它实施例中，来自受试者或来自受试者以外的来源的细胞，包括细胞系，被修饰以表达适当的抗原。在一些实施例中，在将靶细胞施用于受试者之前，通过例如辐射或化学治疗剂处理所述靶细胞以降低其增生能力。在说明性实施例中，在靶细胞上表达的抗原可以包括含有该抗原的全部或部分蛋白质。在另外的说明性实施例中，在靶细胞上表达的抗原可以包括包含该抗原的蛋白质的全部或部分胞外结构域。在一些实施例中，抗原是识别car的astr的抗体，例如针对car的scfv结构域的抗独特型抗体。在一些实施例中，在靶细胞上表达的抗原可以是与将它锚定到细胞表面的跨膜结构域的融合物。可以使用本文其它处公开的任何跨膜结构域。在一些实施例中，在靶细胞上表达的抗原可以是与柄结构域的融合物。可以使用本文其它处公开的任何柄结构域。在说明性实施例中，抗原可以是与cd8柄和跨膜结构域的融合物(seq id no:24)。[0175]在说明性实施例中，用编码靶抗原的重组核酸载体修饰第一细胞混合物中的细胞(例如从受试者获得的细胞)，所述靶抗原在本文中可以被称为“人工抗原呈递细胞”或“aapc”，并且修饰来自相同受试者的分离的第二细胞混合物中的细胞以表达结合抗原的car。在一些实施例中，其中用编码靶抗原的载体修饰的被修饰的细胞是t细胞，该细胞在本文中可以被称为“t-apc”。作为非限制性实例，此类修饰的t-apc可以包括b细胞、树突细胞和巨噬细胞，并且在说明性实施例中，树突细胞和巨噬细胞，例如其中相应的car-t靶标是b细胞癌靶标，并且可以使用本文提供的方法产生，其中用于修饰(例如，转导)的反应混合物包括t细胞结合多肽，例如针对cd3的多肽。在另外的说明性实施例中，细胞混合物是全血、分离的tnc、分离的pbmc。例如，第一细胞混合物可以用编码her2的胞外结构域和pdgf的跨膜结构域的融合蛋白的重组核酸载体来修饰，并且第二细胞混合物可以用编码针对her2的car的重组核酸载体来修饰。然后，可以将细胞配制到递送溶液中，或以不同的car效应细胞与靶细胞的比率施用于受试者。在一些实施例中，在配制或施用时效应子与靶标的比率为或为约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2；1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。在说明性实施例中，靶细胞与修饰的t细胞和/或nk细胞皮下或肌内共同施用。[0176]表达car的基因修饰的t细胞和/或nk细胞的增殖和存活也可以通过car信号传导来促进，该信号传导是通过car通过相互作用交联而启动的，而不是通过car的astr与其同源抗原的结合而启动的。在一些实施例中，小分子或蛋白质可以交联并活化细胞的表面上的car。在说明性实施例中，抗体可以交联并活化细胞的表面上的car。在另外的说明性实施例中，抗体识别car的胞外结构域中的表位，例如柄或间隔子结构域中的表位。在一些实施例中，表位可以是表位标签，例如his5(hhhhh；seq id no:76)、hisx6(hhhhhh；seq id no:77)、c-myc(eqkliseedl；seq id no:75)、flag(dykddddk；seq id no:74)、strep tag(wshpqfek；seq id no:78)、ha tag(ypydvpdya；seq id no:73)、ryirs(seq id no:79)、phe-his-his-thr(seq id no:80)或weaaareaccreccara(seq id no:81)。在说明性实施例中，表位是对胞外受体无反应的细胞内抗原共有的。在一些实施例中，表位标签是hisx6 tag(seq id no:77)。在一些实施例中，可以通过添加结合表位标签的可溶性抗体来交联和活化car。在说明性实施例中，可以通过添加表达结合表位标签的抗体或抗体模拟物的细胞(在本文中也被称为通用饲养细胞)来交联和活化car。在一些实施例中，抗体或抗体模拟物通过gpi锚与细胞膜缔合。在说明性实施例中，抗体或抗体模拟物通过跨膜结构域与细胞膜缔合。在另外的说明性实施例中，柄或间隔子将抗体或抗体模拟物与跨膜结构域分开。在一些实施例中，相同的通用饲养细胞(例如表达附着于cd8a柄和跨膜结构域的抗hisx6 scfv的通用饲养细胞)可以与表达car的细胞一起使用，所述car具有结合至不同抗原但在其柄中包括hisx6表位标签的astr。这些通用饲养细胞可以与表达含有共同表位标签的不同car的细胞一起使用。对于通用饲养细胞，只要car含有表位标签，就不需要为含有不同astr的car产生表达同源抗原的不同饲养细胞。表达car的细胞上的表位标签将被通用饲养细胞交联，以参与car的聚集和增殖。例如，抗hisx6通用饲养细胞可以与表达与her2结合并包括hisx6表位标签的car的细胞一起使用，并且也可以与表达与axl结合并包括hisx6表位标签的car的细胞一起使用。通用饲养细胞和car的组合能够在细胞接合其同源抗原之前实现car-t增殖。此外，如果car的astr微环境受限，则使用与抗原结合的通用饲养细胞可以使细胞在受限环境之外扩增。[0177]在另一方面中，本文提供的递送溶液或细胞制剂包括合成rna。在一些实施例中，合成rna包括抑制性rna，如针对一个或多个靶标的sirna。用于这些抑制性rna的靶标可以是本文其它地方公开的sirna或mirna的任何靶标。在一些实施例中，合成rna包括编码一种或多种蛋白质或肽的mrna。在一些实施例中，mrna编码一个或多个car。car可以是本文公开的任何car组合物。在一些实施例中，mrna编码一种或多种细胞因子。在一些实施例中，mrna编码il-2或其功能变体。在一些实施例中，mrna编码il-7或其功能变体。在一些实施例中，mrna编码il-15或其功能变体。在一些实施例中，mrna编码il-21或其功能变体。在一些实施例中，mrna编码结合和活化car的一种或多种蛋白质或多肽。在一些实施例中，mrna编码由car的astr识别的抗原。在一些实施例中，mrna编码her2或her2的胞外结构域。在一些实施例中，mrna编码egfr或egfr的胞外结构域。在一些实施例中，mrna编码axl或axl的胞外结构域。在一些实施例中，mrna编码cd19或cd19的胞外结构域。在一些实施例中，mrna编码cd22或cd22的胞外结构域。在一些实施例中，mrna编码由car的astr识别的抗体。在一些实施例中，编码由car的ast识别的抗体的mrna是针对ast的抗体或scfv的抗同种型抗体(anti-ideotype antibody)。在一些实施例中，mrna编码结合car的表位标签并且可以如本文其它地方所述使两个car交联的抗体。在一些实施例中，mrna编码一种或多种t和/或nk细胞共刺激蛋白。此类共刺激蛋白可以包含针对t细胞和/或nk细胞上的共刺激受体的一种或多种配体或抗体。在一些实施例中，共刺激受体是cd28。在一些实施例中，共刺激受体为4-1bb。在一些实施例中，mrna编码可溶的蛋白质或多肽。在一些实施例中，mrna编码膜结合的蛋白质或多肽。在一些实施例中，膜结合的蛋白质或多肽可操作地连接到跨膜结构域。在一些实施例中，合成rna包括针对一个或多个靶的抑制性rna(如sirna)以及编码一种或多种蛋白质或肽的mrna。[0178]用于产生用于递送溶液或细胞制剂的mrna的方法可以包括用特别设计的引物体外转录模板，随后添加polya，以产生包含3'和5'非翻译序列、5'帽和/或ires、待表达的核酸和polya尾(通常长度为50-200个碱基)的构建体。在一些实施例中，合成rna是感兴趣的核酸的天然存在的内源性rna。在一些实施例中，rna不是感兴趣的核酸的天然存在的内源性rna。在一些实施例中，rna被修饰以改变rna的稳定性和/或翻译效率。在一些实施例中，5'utr、3'utr、kozak序列、polya尾被修饰。在一些实施例中，rna包括5'帽。在一些实施例中，rna被包封在基于脂质的载体媒介物中。一种用于组装脂质纳米载体的方法包括将脂质在乙醇中的溶液与核酸的水溶液直接混合，以获得脂质纳米颗粒(lnp)。在一些实施例中，lnp包含peg缀合的脂质。peg缀合的脂质防止在颗粒形成期间的聚集，并且允许具有在大约50nm与150nm之间的范围内的限定直径的颗粒的受控制造。纳米颗粒的聚乙二醇化可以具有关于安全性和活性的显著缺点。与聚乙二醇化的纳米颗粒的使用相关的缺点已经刺激peg替代物的开发。在一些实施例中，lnp不包含peg。在一些实施例中，lnp包含聚(甘油)(pg)、聚(噁唑啉)、基于糖的系统和聚(肽)。在一些实施例中，多肽包括聚肌氨酸(psar)。在一些实施例中，lnp包含树突状细胞靶向部分。在一些实施例中，树突状细胞靶向部分包含甘露糖。[0179]在一些实施例中，在本文提供的细胞制剂和方法中，可以将rna添加到包含修饰的和/或基因修饰的t细胞和/或nk细胞的细胞制剂中，或与它们共同施用。在一些实施例中，将rna添加到受试者的分离的血液中，并且与t细胞和/或nk细胞并行处理。在一些实施例中，rna可以与修饰的和/或基因修饰的t细胞和/或nk细胞分开配制。合成rna可以通过本领域已知的用于治疗性递送rna的任何手段递送。在一些实施例中，rna被静脉内递送。在一些实施例中，rna被腹膜内递送。在一些实施例中，rna被肌内递送。在一些实施例中，rna被肿瘤内递送。在一些实施例中，rna被皮内递送。在示例性实施例中，rna被皮下递送。在一些实施例中，rna在与修饰的和/或基因修饰的t细胞和/或nk细胞的施用位点相同的位点处递送。在一些实施例中，rna在邻近修饰的和/或基因修饰的t细胞和/或nk细胞的施用位点的位点处递送。在一些实施例中，rna被施用一次。在一些实施例中，rna被施用2、3、4、5、6次或更多次。[0180]在另一方面中，本发明提供了一种细胞制剂，其包含t细胞和/或nk细胞的聚集体，其中在说明性实施例中，所述t细胞和/或nk细胞用包含一个或多个转录单元的多核苷酸修饰，其中每个转录单元与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接，并且其中所述一个或多个转录单元在溶液(在说明性实施例中为递送溶液)中编码包含嵌合抗原受体(car)的第一多肽；并且进一步其中所述聚集体包括至少4、5、6或8个t细胞和/或nk细胞，其中所述细胞聚集体的最小尺寸为至少15μm，和/或其中所述细胞聚集体被直径为至少15μm的粗滤器或直径为15μm至60μm的粗滤器保留或能够被其保留。约大于》40μm的大的细胞聚集体对静脉内注射是危险的，因为它们可能例如导致微血管阻塞(truter等人，1981.《重症监护医学(intensive care med)》7，115-119)。在一些实施例中，细胞聚集体具有小于40μm的直径。在一些实施例中，细胞制剂中至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞聚集体具有小于40μm的直径。在说明性实施例中，细胞制剂中至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞聚集体具有小于40μm的直径，并且细胞制剂被静脉内施用。[0181]重组反转录病毒颗粒[0182]重组反转录病毒颗粒公开于本文提供的方法和组合物中，例如用以修饰t细胞和/或nk细胞以制备基因修饰的和/或转导的t细胞和/或nk细胞。重组反转录病毒颗粒本身为本发明的方面。通常，包括在本文提供的方面中的重组反转录病毒颗粒是复制缺陷型的，意味着重组反转录病毒颗粒在其离开包装细胞时即无法复制。事实上，除非本文另有说明，否则反转录病毒颗粒是复制缺陷型的，并且如果这类反转录病毒颗粒在其基因组中包括不是反转录病毒天然的核酸，则它们是“重组反转录病毒颗粒”。在说明性实施例中，重组反转录病毒颗粒为慢病毒颗粒。[0183]在一些方面中，本文提供了用于转导细胞，通常是淋巴细胞并且在说明性实施例中t细胞和/或nk细胞的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以包括包膜蛋白。在一些实施例中，包膜蛋白可以是假型化元件。在一些实施例中，包膜蛋白可以是活化元件。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括假型化元件和活化元件两者。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以包括本文其它处讨论的假型化元件中的任何一个。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以包括本文其它处讨论的活化元件中的任何一个。在一个方面中，本文提供了一种包括聚核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，所述聚核苷酸包括：a.一个或多个可操作地连接到在t细胞和/或nk细胞中具有活性的启动子的转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码经工程改造的t细胞受体或嵌合抗原受体(car)；和b.假型化元件和其表面上的t细胞活化元件，其中所述t细胞活化元件不由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的聚核苷酸编码。在一些实施例中，t细胞活化元件可以为本文其它处论述的活化元件中的任一个。在说明性实施例中，t细胞活化元件可以为抗cd3 scfvfc。在另一个方面中，本文提供一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包括聚核苷酸，所述聚核苷酸包括可操作地连接到在t细胞和/或nk细胞中具有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包括经工程改造的t细胞受体或嵌合抗原受体(car)的第一多肽及包括淋巴增生性元件的第二多肽。在一些实施例中，淋巴增生性元件可为嵌合淋巴增生性元件。在说明性实施例中，淋巴增生性元件不包含连接至il-7受体α链或其片段的il-7。在一些实施例中，淋巴增生性元件不包含连接至il-2/il-15受体β链的il-15。在本文提供的任何反转录病毒颗粒方面或实施例的一些实施例中，或在包括反转录病毒颗粒的任何其它方面中，与当转基因从ef1-a或pgk启动子表达时并且在说明性实施例中，当转基因在缺乏减少这种表面表达的额外的元件(例如降解决定子或抑制性rna)的情况下从ef1-a或pgk启动子表达时相比，经工程改造的t细胞受体、car或其它转基因以低于表面表达的70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％的降低水平表达、展示和/或以其它方式并入到复制缺陷型反转录病毒颗粒的表面中。在本文提供的任何基因载体(例如rip)方面或包括基因载体的任何其它方面的说明性实施例中，基因载体基本上不含由基因载体的核酸编码的蛋白转录物，和/或rip在其表面上不表达或不包含可检测量的工程化t细胞受体或car，或在其表面上表达或包含减少量的经工程改造的t细胞受体或car。[0184]在一些方面中，本文中提供了一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个可操作地连接到在t细胞和/或nk细胞中具有活性的启动子的转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含嵌合抗原受体(car)的第一多肽和包含嵌合淋巴增生性元件(例如组成性活性嵌合淋巴增生性元件)的第二多肽。在说明性实施例中，嵌合淋巴增生性元件不包含连接至其同源受体或连接至其同源受体的片段的细胞因子。[0185]在一些方面中，本文中提供一种重组反转录病毒颗粒，其包括(i)假型化元件，其能够结合于t细胞和/或nk细胞且促进重组反转录病毒颗粒与其的膜融合；(ii)聚核苷酸，其具有一个或多个可操作地连接到在t细胞和/或nk细胞具有活性的启动子的转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码具有嵌合抗原受体的第一经工程改造的信号传导多肽和第二经工程改造的信号传导多肽，所述第一经工程改造的信号传导多肽包括抗原特异性靶向区、跨膜结构域和胞内活化结构域，所述第二经工程改造的信号传导多肽包括至少一个淋巴增生性元件；其中第一经工程改造的信号传导多肽和/或第二经工程改造的信号传导多肽的表达由体内控制元件调节；和(iii)其表面上的活化元件，其中活化元件能够结合于t细胞和/或nk细胞且不由重组反转录病毒颗粒中的聚核苷酸编码。在一些实施例中，在t细胞和/或nk细胞中具有活性的启动子在包装细胞系中不具有活性，或仅以可诱导的方式在包装细胞系中具有活性。在本文公开的实施例中的任一个中，第一经工程改造的信号传导多肽和第二经工程改造的信号传导多肽中的任一个可以具有嵌合抗原受体并且另一经工程改造的信号传导多肽可以具有至少一种淋巴增生性元件。[0186]在一些方面中，本文提供了复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包括编码自驱动car的聚核苷酸。关于这类复制缺陷型重组反转录病毒颗粒以及包括自驱动car的组合物和方法方面的细节在本文中被更详细地公开，例如在自驱动car方法和组合物章节中和在例示性实施例章节中被更详细地公开。[0187]贯穿本公开提供了在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中所包括的各种元件和元件组合，例如如假型化元件、活化元件和膜结合细胞因子，以及复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组中所包括的核酸序列，如(但不限于)编码car的核酸；编码淋巴增生性元件的核酸；编码控制元件(如核糖开关)的核酸；启动子，尤其在t细胞中具有组成性活性或可诱导的启动子；和编码抑制性rna分子的核酸。此外，本文提供的各种方面(如制备重组反转录病毒颗粒的方法、用于执行过继细胞疗法的方法，以及用于转导t细胞的方法)产生和/或包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在这类方法中产生和/或包括的复制缺陷型重组反转录病毒自身形成作为本发明的独立方面的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒组合物，所述组合物可以呈分离的形式。这类组合物可以呈干燥(例如冻干)形式，或者可以呈所属领域中已知的合适的溶液或介质形式以用于储存且使用反转录病毒颗粒。[0188]因此，作为非限制性实例，在另一个方面中，本文中提供了一种复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其在其基因组中具有聚核苷酸，所述聚核苷酸具有一个或多个可操作性地连接至在t细胞和/或nk细胞中具有活性的启动子的核酸序列，其在一些情况下包括编码一个或多个(例如两个或更多个)针对一个或多个rna靶标的抑制性rna分子的第一核酸序列和编码如本文中所描述的嵌合抗原受体或car的第二核酸序列。在其它实施例中，存在编码本文先前所描述的不为抑制性rna分子的至少一种淋巴增生性元件的第三核酸序列。在某些实施例中，聚核苷酸包括如本文所提及的一个或多个核糖开关，所述核糖开关可操作地连接到第一核酸序列、第二核酸序列和/或第三核酸序列(如果存在)。在此构建体中，一种或多种抑制性rna、car和/或不为抑制性rna的一种或多种淋巴增生性元件的表达由核糖开关控制。在一些实施例中，两种至10种抑制性rna分子由第一核酸序列编码。在另外的实施例中，两种至六种抑制性rna分子由第一核酸序列编码。在说明性实施例中，4种抑制性rna分子由第一核酸序列编码。在一些实施例中，第一核酸序列编码一种或多种抑制性rna分子且位于内含子内。在某些实施例中，内含子包括启动子的全部或部分。启动子可以为pol i、pol ii或pol iii启动子。在一些说明性实施例中，启动子为pol ii启动子。在一些实施例中，内含子邻近在t细胞和/或nk细胞中具有活性的启动子且位于所述启动子的下游。在一些实施例中，内含子为ef1-α内含子a。[0189]本文的重组反转录病毒颗粒实施例包括其中反转录病毒颗粒包含基因组的那些，genether)》5:1088 1097,1999；wo 94/12649、wo 93/03769；wo 93/19191；wo 94/28938；wo 95/11984和wo 95/00655)；腺相关病毒(参见，例如ali等人,《人类基因疗法(humgenether)》9:8186,1998，flannery等人,《美国国家科学院院刊(pnas)》94:6916 6921,1997；bennett等人,《眼科与视觉科学研究(investopthalmolvissci)》38:28572863,1997；jomary等人,《基因疗法(genether)》4:683 690,1997，rolling等人,《人类基因疗法(humgenether)》10:641 648,1999；ali等人,《人类分子遗传学(hummolgenet)》5:591 594,1996；srivastava,wo 93/09239，samulski等人,《病毒学杂志(j.vir.)》(1989)63:3822-3828；mendelson等人,《病毒学(virol.)》(1988)166:154-165；和flotte等人,《美国国家科学院院刊(pnas)》(1993)90:10613-10617)；sv40；单纯疱疹病毒；或反转录病毒载体(例如，鼠类白血病病毒、脾坏死病毒及衍生自如劳氏肉瘤病毒(rous sarcoma virus)、哈维肉瘤病毒(harvey sarcoma virus)、禽白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒及乳腺肿瘤病毒的反转录病毒的载体)，例如γ反转录病毒；或人类免疫缺陷病毒(参见，例如miyoshi等人,《美国国家科学院院刊(pnas)》94:10319 23,1997；takahashi等人,《病毒学杂志(jvirol)》73:7812 7816,1999)等。[0193]如本文所公开，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒为用于基因递送的常用工具(miller，《自然》(1992)357:455-460)。复制缺陷型重组反转录病毒颗粒将未经排列的核酸序列递送到广泛范围的啮齿动物、灵长类动物及人类体细胞中的能力使得复制缺陷型重组反转录病毒颗粒较适用于将基因转移至细胞。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以衍生自α反转录病毒属(alpharetrovirus genus)、β反转录病毒属(betaretrovirus genus)、γ反转录病毒属(gammaretrovirus genus)、δ反转录病毒属(deltaretrovirus genus)、ε反转录病毒属(epsilonretrovirus genus)、慢病毒属或泡沫病毒属。存在许多种适用于本文中所公开的方法的反转录病毒。例如，可以使用鼠白血病病毒(mlv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、马感染性贫血病毒(eiav)、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、劳氏肉瘤病毒(rsv)、富士纳肉瘤病毒(fusv)、莫罗尼鼠白血病病毒(mo-mlv)、fbr鼠骨肉瘤病毒(fbr msv)、莫罗尼鼠肉瘤病毒(mo-msv)、艾贝森鼠白血病病毒(abelson murine leukemia virus)(a-mlv)、禽骨髓细胞病变病毒-29(mc29)和禽红细胞增生病毒(aev)。反转录病毒的详细列表可以在coffin等人(《反转录病毒(retroviruses)》，1997，冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)编辑：j m coffin,s m hughes,h e varmus，第758-763页)中找到。可以在本领域中找到关于一些反转录病毒的基因组结构的细节。举例来说，可以从ncbi genbank(即genome登录号af033819)中找到关于hiv的细节。[0194]在说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以衍生自慢病毒属。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以衍生自hiv、siv或fiv。在另外的说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以衍生自慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒(hiv)。慢病毒为复杂的反转录病毒，其除常见的反转录病毒基因gag、pol及env外还含有具有调节或结构功能的其它基因。较高的复杂性使得慢病毒能够调节其生命周期，如在潜伏感染过程中。典型的慢病毒为人类免疫缺陷病毒(hiv)，aids的病原体。在体内，hiv可以感染极少分裂的终末分化的细胞，如淋巴细胞和巨噬细胞。[0195]在说明性实施例中，本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒含有vpx多肽。[0196]在一些实施例中，本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含和/或含有vpu多肽。[0197]在说明性实施例中，反转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。这类反转录病毒颗粒通常包括位于病毒包膜内的衣壳内的反转录病毒基因组。[0198]在一些实施例中，使用含dna的病毒颗粒代替重组反转录病毒颗粒。这类病毒颗粒可以是腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、痘病毒、牛痘病毒、流感病毒、水泡性口炎病毒(vsv)或辛德毕斯病毒(sindbis virus)。所属领域的技术人员将理解如何修改本文公开的用于不同病毒和反转录病毒或反转录病毒颗粒的方法。在使用包括dna基因组的病毒颗粒的情况下，所属领域的技术人员将理解，在这些基因组中可以包括功能单元以诱导将病毒颗粒的全部或部分dna基因组整合到用这类病毒转导的t细胞的基因组中。[0199]在一些实施例中，hiv rre及编码hiv rev的聚核苷酸区可以由n端rgg盒rna结合模体及编码icp27的聚核苷酸区替代。在一些实施例中，编码hiv rev的聚核苷酸区可以用编码腺病毒e1b 55-kda和e4 orf6的一个或多个聚核苷酸区替代。[0200]在某些方面中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以包括编码自驱动car的核酸，如本文其它处所公开的。作为非限制性实例，这类实施例是反转录病毒颗粒，其基因组包含可操作地连接到在t细胞或nk细胞中的至少一种中可诱导的诱导型启动子的一个或多个第一转录单元，和可操作地连接到组成型t细胞或nk细胞启动子的一个或多个第二转录单元，其中所述一个或多个第一转录单元的5'端与所述一个或多个第二转录单元的5'端之间的核苷酸的数目小于所述一个或多个第一转录单元的3'端与所述一个或多个第二转录单元的3'端之间的核苷酸的数目，[0201]a.其中所述一个或多个第一转录单元中的至少一个编码淋巴增生性元件，[0202]b.并且其中所述一个或多个第二转录单元中的至少一个编码第一嵌合抗原受体(car)，其中car包括抗原特异性靶向区(astr)、跨膜结构域和胞内活化结构域。[0203]在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以进一步显示t细胞活化元件。[0204]不受理论的限制，与包括编码自驱动car的核酸的这些复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触和用其转导的t细胞可以从car刺激的诱导型启动子接收转录的初始增强，因为t细胞活化元件可以刺激car刺激的诱导型启动子的诱导信号。t细胞活化元件的结合可以诱导钙离子内流，从而导致nfat的脱磷酸化及其随后的核易位，并与nfat应答启动子结合。由这些car刺激的诱导型启动子转录和翻译的淋巴增生性元件可以使这些细胞的增殖最初增加。在说明性实施例中，t细胞活化元件可以是膜结合的抗cd3抗体，并且可以是gpi连接的或以其它方式显示在病毒上。在一些实施例中，膜结合的抗cd3抗体可以与病毒包膜蛋白如mulv、vsv-g、亨尼帕病毒(henipavirus)-g如niv-g、或其变体和片段融合。[0205]在一些实施例中，分离的复制缺陷型反转录病毒颗粒是包含在大规模容器中的大规模批次。这类大规模批次可以具有例如106-108tu/ml的滴度以及1×1010tu至1×1013tu、1×1011tu至1×1013tu、1×1012tu至1×1013tu、1×1010tu至5×1012tu、或1×1011tu至5×1012tu的总批次大小。在说明性实施例中，本文提供的任何方面或实施例的反转录病毒颗粒基本上是纯的，如本文更详细讨论的。[0206]反转录病毒基因组大小[0207]在本文提供的方法和组合物中，重组反转录病毒基因组(在非限制性说明性实例中为慢病毒基因组)对可以被包装到病毒颗粒中的聚核苷酸的数量具有限制。在本文提供的一些实施例中，由聚核苷酸编码区编码的多肽可以为保留功能活性的截短或其它缺失，使得聚核苷酸编码区由比野生型多肽的聚核苷酸编码区更少的核苷酸编码。在一些实施例中，由聚核苷酸编码区编码的多肽可以为可以由一个启动子表达的融合多肽。在一些实施例中，融合多肽可以具有裂解信号以由一个融合多肽和一个启动子产生两个或更多个功能性多肽。此外，在初始离体转导之后不需要的一些功能不包括在反转录病毒基因组中，而经由包装细胞膜存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。这些不同策略在本文用于使包装在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒内的功能性元件最大化。[0208]在一些实施例中，待包装的重组反转录病毒基因组可以在作为范围的低端的1,000个、2,000个、3,000个、4,000个、5,000个、6,000个、7,000个和8,000个核苷酸与作为范围的高端的2,000个、3,000个、4,000个、5,000个、6,000个、7,000个、8,000个、9,000个、10,000个和11,000个核苷酸之间。待包装的反转录病毒基因组包括编码如本文所详细公开的第一经工程改造的信号传导多肽和第二经工程改造的信号传导多肽的一个或多个聚核苷酸区。在一些实施例中，待包装的反转录病毒基因组可以少于5,000个、6,000个、7,000个、8,000个、9,000个、10,000个或11,000个核苷酸。本文其它处所论述的可以包装的功能包括用于反转录病毒组装及包装所需的反转录病毒序列，如反转录病毒rev、gag和pol编码区，以及5'ltr和3'ltr或其活性截短片段，编码反转录病毒顺式作用rna包装元件的核酸序列和cppt/cts元件。此外，在说明性实施例中，本文中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以包括以下中的任一种或多种或全部，在一些实施例中，相对于由反转录病毒5'ltr和3'ltr建立的5'至3'定向以反向定向(如作为非限制性实例的wo2019/055946中所说明)：一个或多个编码第一经工程改造的信号传导多肽和第二经工程改造的信号传导多肽的聚核苷酸区，其中至少一个包括至少一个淋巴增生性元件；第二经工程改造的信号传导多肽，其可以包括嵌合抗原受体；mirna、控制元件，如核糖开关，其通常调节第一经工程改造的信号传导多肽和/或第二经工程改造的信号传导多肽的表达；安全开关多肽、内含子、启动子(其在靶细胞如t细胞中具有活性)、2a裂解信号和/或ires。[0209]试剂盒和商业产品[0210]在一个方面中，本文提供了一种容器(如商业容器或包装)或包含其的试剂盒，包含根据本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面和实施例中的任一个的反转录病毒颗粒。作为非限制性实例，反转录病毒颗粒可以在其基因组中包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个可操作地连接到在t细胞和/或nk细胞中具有活性的启动子的核酸序列。在一些实施例中，一种或多种核酸序列的核酸序列可以编码淋巴增生性元件和/或嵌合抗原受体(car)，所述嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(astr)、跨膜结构域和胞内活化结构域。在一些实施例中，一种或多种核酸序列的核酸序列可以编码一个、两个或更多个针对一个或多个rna靶标的抑制性rna分子。[0211]在任何方面或实施例中含有重组反转录病毒颗粒的容器(包括商业容器以及试剂盒)可以是管、小瓶、板的孔或用于储存反转录病毒颗粒的其它容器。事实上，本文提供的一些方面包括含有反转录病毒颗粒的容器，其中这类反转录病毒颗粒包括本文公开的任何核酸或其它组分。在说明性实施例中，这类容器包括基本上纯的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其有时在本文中被简称为基本上纯的反转录病毒颗粒。通常，基本上纯的反转录病毒颗粒的制剂和/或容器是无菌的，并且根据标准方案，对于支原体、相同类型的具有复制能力的反转录病毒和外来病毒(adventitious viruses)是阴性的(参见，例如，“病毒载体表征：查看分析工具(viral vector characterization:a look at analytical tools)”；2018年10月10日(可在https://cellculturedish.com/viral-vector-characterization-analytical-tools/获得))。在本文的实例中提供了用于产生基本上纯的反转录病毒颗粒的例示性方法。对于这类方法，通过深度过滤、tff、benzonase处理、渗滤和调配的组合来纯化病毒上清液。在某些说明性实施例中，基于质量控制测试结果，基本上纯的反转录病毒颗粒满足所有以下特征：[0212]a.对于支原体为阴性；[0213]b.内毒素低于25eu/ml，并且在某些另外的说明性实施例中，低于10eu/ml；[0214]c.不存在与在所检测的容器中有目的地检测到的相同类型的具有复制能力的反转录病毒(例如慢病毒)；[0215]d.没有检测到外来病毒；[0216]e.小于1pg宿主细胞dna/病毒tu，并且在某些另外的说明性实施例中，小于0.3pg/tu；[0217]f.小于100个残余质体拷贝/病毒tu，并且在某些另外的说明性实施例中，小于10个拷贝/病毒tu的任何用于制备重组反转录病毒颗粒的质体；[0218]g.小于1ng hek蛋白/tu，并且在某些另外的说明性实施例中，小于50pg hek蛋白/tu；[0219]h.大于100tu/ng p24蛋白，并且在某些另外的说明性实施例中，大于10,000tu/ng p24蛋白。[0220]在反转录病毒颗粒被发放给客户之前，它们通常针对包括上述部分或全部内容的发放规格进行测试。每种颗粒的效价可以通过elisa根据p24病毒衣壳蛋白、通过q-rt pcr根据病毒rna基因组拷贝数、通过基于qpcr的产物增强的rt(pert)测定根据反转录酶活性的测量来确定，但都可以通过在生物测定法中测量功能性基因转移转导单元(tu)被转化为感染性滴度。[0221]通过生物测定法和qpcr测定纯化的大量反转录病毒材料和最终产品的感染滴度是用于测定反转录病毒的感染滴度的例示性分析测试方法。指示细胞库(如f1xt)可以在例如无血清培养基中生长，以每孔150,000个细胞接种，然后暴露于反转录病毒产物的系列稀释液。在指示细胞上稀释纯化的反转录病毒颗粒，例如从1:200稀释至1:1,600。可以添加参考标准病毒以用于系统适用性。在用反转录病毒培育4天后，收获细胞，提取并纯化dna。使用人类基因组的标准曲线(例如100-10,000,000个拷贝/孔)和独特的反转录病毒基因组序列质体pdna扩增子，然后加入暴露于反转录病毒颗粒的细胞样品的基因组dna。对于每个pcr反应，反转录病毒扩增子和内源对照(如人类rnasep)的cq值均外推回到每个反应的拷贝数。根据这些值计算整合的基因组拷贝数。在一些情况下，指示细胞如293t已被表征为三倍体，因此在计算中应使用每个细胞3拷贝的单拷贝基因。使用每个孔的初始活细胞计数，可以确定被加入到细胞中的反转录病毒的体积和基因组拷贝数比率，即每ml反转录病毒颗粒的转导单元(tu)。[0222]效力测试可以包括针对具有纯度和比活性的释放规格的效力测试。例如，最终产物的效力释放测试可以包括测量可以与病毒颗粒量相比较的转导单元(tu)的数量，例如，通过针对病毒蛋白进行elisa，例如针对慢病毒，通过进行截止值为至少100、1,000、2,000或2,500tu/ng p24的p24衣壳蛋白elisa，以及car功能性，例如，通过测量由暴露于基因修饰的细胞的报告细胞系的干扰素γ释放。[0223]在本文的任何试剂盒或分离的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面中，其包括这类反转录病毒颗粒的容器，在容器中存在足够的重组反转录病毒颗粒以在使用反转录病毒颗粒制备的反应混合物中获得0.1至50、0.5至50、0.5至20、0.5至10、1至25、1至15、1至10、1至5、2至15、2至10、2至7、2至3、3至10、3至15或5至15或至少0.1、0.5、1、2、2.5、3、5、10或15的moi(转导单元的数量，或每个细胞使用的tu)，或者获得至少0.1、0.5、1、2、2.5、3、5、10或15的moi。试剂盒中提供的病毒颗粒的转导单元应能够使用moi，该moi可防止在个体细胞中产生过多整合子，平均每个细胞基因组少于3个慢基因组拷贝，并且更优选地每个细胞1个拷贝。对于试剂盒和分离的反转录病毒颗粒实施例，这类moi可以基于1、2.5、5、10、20、25、50、100、250、500或1,000ml的反应混合物，假定1×106个靶细胞/ml，例如在全血的情况下，假定1×106pbmc/ml血液。因此，反转录病毒颗粒的容器可以包括1×105至1×109、1×105至1×108、1×105至5×107、1×105至1×107、1×105至1×106；5×105至1×109；5×105至1×108、5×105至5×107、5×105至1×107、5×105至1×106、或1×107至1×109、1×107至5×107、1×106至1×107、至1×106至5×106tu。在某些说明性实施例中，容器可以包含1×107至1×109、5×106至1×108、1×106至5×107、1×106至5×106、或5×107至1×108的反转录病毒转导单元。不受理论的限制，在moi为1至10的情况下，这类数量的颗粒将支持1至100ml的血液。在一些说明性实施例中，如本文所述，可以处理少至10ml、5ml、3ml或甚至2.5ml的血液，用于t细胞和/或nk细胞修饰和任选地本文提供的皮下和/或肌内施用方法。因此，本方法的优点在于，在一些说明性实施例中，它们比涉及编码car的核酸的现有方法(例如car-t方法)需要少得多的反转录病毒颗粒转导单元。[0224]每个包含反转录病毒颗粒的容器可以例如具有0.05ml至5ml、0.05ml至1ml、0.05ml至0.5ml、0.1ml至5ml、0.1ml至1ml、0.1ml至0.5ml、0.1ml至10ml、0.5ml至10ml、0.5ml至5ml、0.5ml至1ml、1.0ml至10.0ml、1.0ml至5.0ml、10ml至100ml、1ml至20ml、1ml至10ml、1ml至5ml、1ml至2ml、2ml至20ml、2ml至10ml、2ml至5ml、0.25ml至10ml、0.25至5ml或0.25至2ml的体积。[0225]在某些实施例中，容器中的反转录病毒颗粒是gmp级或cgmp级反转录病毒颗粒(即根据监管机构的gmp或当前gmp要求生产的)，或使用gmp系统进行的反转录病毒生产过程的产物。这类反转录病毒颗粒通常使用美国fda(即美国gmp或美国cgmp)、ema(即ema gmp或ema cgmp)或中国国家医药产品管理局(nmpa)(即中国fda)(即nmpa gmp或nmpa cgmp)的良好生产规范(gmp)制备，例如使用gmp质量体系和gmp程序控制。这些产品通常在符合gmp或cgmp要求的工厂中生产。这类产品通常在基于gmp或cgmp法规的严格质量管理体系下生产。gmp级反转录病毒颗粒通常是无菌的。这可以通过例如用0.45μm或0.22μm过滤器过滤反转录病毒颗粒(例如基本上纯的反转录病毒颗粒)来实现。gmp级反转录病毒颗粒通常基本上是纯的，并按照效力、质量和安全性的对照生产测试规范进行制备。[0226]在一些实施例中，容器中包含反转录病毒颗粒的溶液不含可检测的牛蛋白，其可以被称为“不含牛的”。例如，这类反转录病毒颗粒的溶液可以是不含牛的，因为在反转录病毒生产期间，在培养包装细胞时不使用牛蛋白(例如牛血清蛋白)。在一些实施例中，反转录病毒颗粒的溶液是gmp级的并且是不含牛的。基本上纯的核酸溶液通常是不含牛的，并且是在不含牛的液体培养基中制备的。[0227]在一些方面中，本文提供了一种用于修饰nk细胞和/或在说明性实施例中修饰t细胞的试剂盒。在某些实施例中，这类试剂盒包括一个或多个含有聚核苷酸的容器，所述聚核苷酸通常是基本上纯的聚核苷酸，所述基本上纯的聚核苷酸包含可操作地连接到在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子的一个或多个第一转录单元，其中所述一个或多个第一转录单元编码第一多肽，所述第一多肽包含第一嵌合抗原受体(car)，有时被称为第一car；以及附件部件的一个或多个容器，本文中也被称为附件试剂盒部件。聚核苷酸(例如反转录病毒颗粒)可以冷冻储存，例如在-70℃或更低温度(例如-80℃)下储存。[0228]在说明性实施例中，根据本文提供的任何复制缺陷型重组反转录病毒颗粒方面和实施例，编码car的聚核苷酸位于反转录病毒颗粒(通常是基本上纯的反转录病毒颗粒)的基因组中。在说明性实施例中，根据本文提供的任何实施例，试剂盒中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含可操作地连接到在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子的一个或多个转录单元，其中所述一个或多个第一转录单元编码包含第一嵌合抗原受体(car)的第一多肽，并且任选地编码包含淋巴增生性元件的第二多肽。[0229]附件试剂盒部件可包括以下一项或多项：[0230]a.一个或多个包含递送溶液的容器，所述递送溶液与如本文提供的皮下和/或肌内施用相容，对说明性实施例中如本文提供的皮下和/或肌内施用有效，并且在另外的说明性实施例中适于如本文提供的皮下和/或肌内施用；[0231]b.一个或多个如本文提供的透明质酸酶的容器；[0232]c.一个或多个血液袋，例如血液收集袋，在说明性实施例中，包括袋中或单独容器中的抗凝血剂、血液处理缓冲袋、血液处理废物收集袋和血液处理细胞样品收集袋；[0233]d.一个或多个无菌注射器，其与皮下或肌内递送t细胞和/或nk细胞相容，在说明性实施例中对皮下或肌内递送t细胞和/或nk细胞有效，并且在另外的说明性实施例中适于皮下或肌内递送t细胞和/或nk细胞；[0234]e.如本文详细公开的t细胞活化元件，例如在含有反转录病毒颗粒的容器中的溶液中提供的、或在单独的容器中提供的、或在说明性实施例中与复制缺陷型反转录病毒颗粒的表面缔合的抗cd3；[0235]f.一个或多个白细胞减少过滤总成；[0236]g.一个或多个容器，所述容器包含与t细胞和/或nk细胞的转导相容，在说明性实施例中对所述t细胞和/或nk细胞的转导有效，并且在另外的说明性实施例中适于所述t细胞和/或nk细胞的转导的溶液或介质；[0237]h.一个或多个容器，所述容器包含与冲洗t细胞和/或nk细胞相容、在说明性实施例中对冲洗t细胞和/或nk细胞有效、和/或在另外的说明性实施例中适于冲洗t细胞和/或nk细胞的溶液或介质；[0238]i.一个或多个含有ph调节药物药剂的容器；[0239]j.一个或多个含有聚核苷酸的容器，所述聚核苷酸通常为基本上纯的聚核苷酸(例如，在根据本文任何实施例的重组反转录病毒颗粒中发现的)，所述容器包含可操作地连接到在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子的一个或多个第二转录单元，其中所述一个或多个第二转录单元编码多肽，所述多肽包含针对不同靶表位的第二car，并且在某些实施例中为不同抗原，在说明性实施例中为在相同靶癌细胞(例如b细胞)上发现的抗原；[0240]k.一个或多个容器，其含有由核酸(例如反转录病毒颗粒)编码的第一car和/或第二car的同源抗原；和[0241]l.与其它试剂盒部件物理或数字相关的说明书，用于其使用，例如用于修饰t细胞和/或nk细胞，用于将修饰的t细胞和/或nk细胞经皮下或肌内递送至受试者，和/或用于治疗受试者的肿瘤生长或癌症。[0242]在一些实施例中，血液袋可以容纳5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400或500ml或更少的血液。在一些实施例中，血液袋可以容纳至少5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400或500ml的血液。在一些实施例中，血液袋可以容纳作为范围的低端的1、2、3、4、5、10、15、20、25和50ml血液至作为范围的高端的10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400和500ml的血液。在一些实施例中，血液袋可以容纳作为范围的低端的1、2、3、4、5、10、15、20、25和50ml的血液至作为范围的高端的10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400和500ml的血液。例如，血液袋可以容纳1至10ml、5至25ml、10至50ml、25至100ml、50至200ml或100至500ml的血液。在一些实施例中，血液袋可以包括肝素。在其它实施例中，血液袋不包括肝素。[0243]在包括抗原或同源抗原的本文中的任何试剂盒方面和实施例中，试剂盒中少于50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的多肽是非人类的，即由非人类来源产生的。[0244]在一些实施例中，试剂盒可以是单包装/单次使用试剂盒，但在其它实施例中，试剂盒是用于处理来自与编码car的核酸接触的多于一种血液样品的多包装或多次使用试剂盒，任选通过皮下施用。通常，试剂盒中编码car的核酸的容器(和在某些实施例中任选的编码第二car的核酸的成对的容器)用于修饰t细胞和/或nk细胞和任选的皮下施用的方法的一次实施。含有编码car和任选的第二car的核酸的容器通常冷冻储存和运输。因此，试剂盒可以包括足够的编码car的核酸的容器(例如小瓶)(和在某些实施例中任选的编码第二car的成对的容器)用于本文提供的修饰t细胞和/或nk细胞的方法的1、2、3、4、5、6、10、12、20、24、50和100次实施，因此可以包括1、2、3、4、5、6、10、12、20、24、50和100个编码car的核酸(如反转录病毒颗粒)的容器(如小瓶)，并且类似地分别被认为是1、2、3、4、5、6、10、12、20、24、50和100个包装、实施、给药或x试剂盒。类似地，将提供试剂盒中的附件部件以用于使用试剂盒修饰t细胞和/或nk细胞以及任选皮下施用的方法的类似数量的实施。[0245]如果存在于这类试剂盒中，则一个或多个白细胞减少过滤总成通常包括一个或多个白细胞减少过滤器或白细胞减少过滤器集合，其每个通常位于过滤器壳体内，如图2的说明性总成所示例的，以及连接到或适于连接到其上的多个连接的无菌管，以及连接到或适于连接到其上的多个阀，其适于在单次使用的封闭式血液处理系统中使用。通常，对于在试剂盒中编码car的核酸的每个容器，存在一个白细胞减少过滤总成。因此，在说明性实施例中，20包试剂盒包括20小瓶的编码car的核酸和20个白细胞减少过滤总成。在一些实施例中，本文的试剂盒包含一个或多个含有核酸的容器和一个或多个白细胞减少过滤总成。这类试剂盒可以任选地旨在用于通过任何途径施用于受试者，所述途径包括例如输注或在说明性实施例中肌内和/或在另外的说明性实施例中皮下递送。因此，这类试剂盒任选地包括旨在与这类施用途径一起使用的其它附件部件。皮下或肌内递送溶液的一个或多个容器在本文中更详细地讨论，通常是无菌的，并且可以包括100ml至5l、1ml至1l、1ml至500ml、1ml至250ml、1ml至200ml、1ml至100ml、1ml至10ml或1ml至5ml；5ml至1l、5ml至500ml、5ml至250ml、5ml至100ml、5ml至10ml或约5ml的总的组合体积，或每个容器单独地该体积。在一些说明性实施例中，试剂盒包含多个皮下递送溶液的容器，其中每个容器具有10ml至200ml、10ml至100ml、1ml至20ml、1ml至10ml、1ml至5ml、1ml至2ml、2ml至20ml、2ml至10ml、2ml至5ml、0.25ml至10ml、0.25至5ml或0.25至2ml的体积。在说明性实施例中，对于在试剂盒中编码car的核酸的每个容器，存在一个递送溶液的容器。因此，在说明性实施例中，20包试剂盒包括20小瓶的编码car的核酸和20个容器的无菌递送溶液。[0246]在某些试剂盒方面，本文提供了实施例，其中含有编码第一car的核酸和任选的编码第二car的核酸的容器之一或两者是根据本文提供的任何自驱动car实施例的核酸。在这类实施例中，试剂盒的附件部件可以进一步包括以下的一种或多种：[0247]a.一个或多个容器，其含有适合于如本文提供的静脉内施用、与如本文提供的静脉内施用相容和/或对如本文提供的静脉内或腹膜内施用有效的递送溶液；和[0248]b.与其它试剂盒部件物理或数字相关的说明书，用于其使用，例如向受试者静脉内或腹膜内递送修饰的t细胞和/或nk细胞。[0249]在某些方面中，本文提供了复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制备用于修饰t细胞或nk细胞的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒的用途包括：使t细胞或nk细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒离体接触，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括表面上的假型化元件和表面上的t细胞活化元件，其中所述接触促进通过所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒对所述t细胞或nk细胞的转导，从而产生被修饰的和在说明性实施例中被基因修饰的t细胞或nk细胞。[0250]在一些方面中，本文提供了这样的方面，其包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制备用于修饰t细胞或nk细胞的试剂盒中的用途。关于聚核苷酸和含有这类聚核苷酸的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的细节在本文和例示性实施例章节中更详细地公开。在一些实施例中，t细胞或nk细胞可以来自受试者。在一些实施例中，t细胞活化元件可以是膜结合的。在一些实施例中，接触可以进行作为范围的低端的1、2、3、4、5、6、7或8小时至作为范围的高端的4、5、6、7、8、10、12、15、18、21和24小时，例如1至12小时。用于制造试剂盒的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以包括本文其它处讨论的方面、实施例或子实施例中的任一个。[0251]此外，在另一个方面中，本文提供了一种容器(例如商业容器或包装)或包含所述容器的试剂盒，包含根据本文提供的包装细胞和/或包装细胞系方面中的任一个的分离的包装细胞，在说明性实施例中，来自包装细胞系的分离的包装细胞。在一些实施例中，试剂盒包括额外容器，所述额外容器包括额外试剂，例如用于本文提供的方法中的缓冲液或试剂。此外，在某些方面中，本文提供了本文在任何方面提供的任何复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制备用于修饰根据本文提供的任何方面的t细胞或nk细胞并且在说明性实施例中基因修饰根据本文提供的任何方面的t细胞或nk细胞的试剂盒中的用途。此外，在某些方面中，本文提供了本文在任何方面提供的任何包装细胞或包装细胞系在制备用于生产根据本文提供的任何方面的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的试剂盒中的用途。[0252]在另一个方面中，本文提供了一种用于治疗或预防癌症或肿瘤生长的药物组合物，其包含复制缺陷型重组反转录病毒颗粒作为活性成分。在另一个方面中，本文提供了一种用于治疗或预防癌症或肿瘤生长的输注组合物或其它细胞制剂，其包含复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。药物组合物或输注组合物的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以包括上文或本文其它地方讨论的方面、实施例或子实施例中的任一个。[0253]用于转导额外血液组分中的淋巴细胞的组合物和方法[0254]在某些方面中，本文提供了一种在包含血液或其组分和/或抗凝血剂的反应混合物中转导、基因修饰和/或修饰外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞(通常是t细胞和/或nk细胞，并且在某些说明性实施例中静息t细胞和/或静息nk细胞)的方法，该方法包括使淋巴细胞与反应混合物中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触。这类反应混合物本身代表了本文提供的单独的方面。在说明性实施例中，反应混合物包含淋巴细胞和复制缺陷型重组反转录病毒颗粒、t细胞活化元件和一种或多种在说明性实施例中呈现的在下文阐述的附加血液组分，因为反应混合物包含至少10％的全血，其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒通常包含结合多肽和促融合多肽，并且在说明性实施例中在其表面上包含假型化元件。在这类方法中，接触(和在接触条件下培育)有助于淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的缔合，其中重组反转录病毒颗粒基因修饰和/或转导淋巴细胞。这些方法或反应混合物方面的反应混合物包含至少10％未分级的全血(例如至少10％、20％、25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％全血)和任选的有效量的抗凝血剂；或反应混合物进一步包含至少一种其它血液或血液制剂组分，其不是pbmc，例如反应混合物包含有效量的抗凝血剂和一种或多种非pbmc型血液制剂组分。全血的百分比是使用未分级的全血制备的反应混合物的体积百分比。例如，在通过将复制缺陷型重组反转录病毒颗粒添加到全血，并且在说明性实施例中为未分级的全血中形成反应混合物的情况下，反应混合物中全血的百分比是全血的体积除反应混合物的总体积乘以100。在说明性实施例中，这类非pbmc型血液或血液制剂组分是以下其它组分中的一种或多种(例如至少一种、两种、三种、四种或五种)或全部：[0255]a)红细胞，其中红细胞占反应混合物的体积的1％至60％；[0256]b)嗜中性粒细胞，其中嗜中性粒细胞占反应混合物中的白细胞的至少10％，或其中反应混合物包含至少10％的嗜中性粒细胞和相同量的t细胞；[0257]c)嗜碱性粒细胞，其中嗜碱性粒细胞占反应混合物中的白细胞的至少0.05％；[0258]d)嗜酸性粒细胞，其中反应混合物占反应混合物中的白细胞的至少0.1％；[0259]e)血浆，其中血浆占反应混合物的体积的至少1％；和[0260]f)抗凝血剂[0261](以上这类血液或血液制剂组分a-f在本文中称为(“值得注意的非pbmc血液或血液制剂组分”))。[0262]在本文公开的包括全血的百分比的任何方面中，所述百分比基于体积。例如，在某些实施例中，反应混合物的体积的至少25％可以是全血。因此，在这类实施例中，100ml这类反应混合物中的至少25ml将是全血。[0263]在反应混合物的某些说明性实施例中存在一种或多种在本文的某些实施例中发现的不是pbmc的其它血液组分(包括本文中提供的相关用途、细胞制剂、修饰的并且在说明性实施例中基因修饰的t细胞或nk细胞或用于修饰t细胞和/或nk细胞方面的方法)，因为在这些说明性实施例中，反应混合物包含至少10％全血且在某些说明性实施例中，至少25％、50％、75％、90％或95％全血，或例如25％至95％全血。在这些说明性实施例中，这类反应混合物是通过组合全血与抗凝血剂(例如通过将全血收集至包含抗凝血剂的血液收集管中)且向具有抗凝血剂的血液中添加重组反转录病毒的溶液而形成。因此，在说明性实施例中，反应混合物包含抗凝血剂，如本文中更详细阐述，例如在例示性实施例章节中更详细阐述。在一些实施例中，全血不是或不包含脐带血。[0264]在这些方面的说明性实施例中的反应混合物通过将一定体积的全血直接加入到其它反应混合物组分中以形成反应混合物而形成。因此，在这类实施例中，反应混合物通过通常不包括pbmc富集程序的方法形成。因此，这类反应混合物通常包括以上a)-f)中列出的其它组分，其不是pbmc。此外，在说明性实施例中，反应混合物包含以上a)至e)中列出的所有其它组分，因为反应混合物包含基本上全血或全血。“基本上全血”是从个体分离、尚未经历pbmc富集程序且用其它溶液稀释小于50％的血液。举例来说，此稀释可以通过添加抗凝血剂以及添加一定体积的包含反转录病毒颗粒的液体来进行。本文中提供与转导全血中的淋巴细胞相关的方法和组合物的其它反应混合物实施例。[0265]在另一方面中，本文中提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制造用于修饰受试者的淋巴细胞，在说明性实施例中，t细胞和/或nk细胞的试剂盒的用途，其中试剂盒的用途包含以上用于转导、基因修饰和/或修饰全血中的淋巴细胞的方法。在另一方面中，本文中提供用于向受试者施用修饰的淋巴细胞的方法，其中所述修饰的淋巴细胞是通过以上用于转导、基因修饰和/或修饰全血中的淋巴细胞的方法产生。本文中所提供的各方面在本文中被称为“用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面”，所述方面包括这类用于转导、基因修饰和/或修饰全血中的淋巴细胞的方法、这类方法在制造试剂盒中的用途、这类方法中形成的反应混合物、通过这类方法制备的细胞制剂、通过这类方法制备的修饰的淋巴细胞和用于施用通过这类方法制备的修饰的淋巴细胞和在说明性实施例中基因修饰的淋巴细胞的方法。应注意，尽管这类方面的说明性实施例涉及使t细胞和/或nk细胞与反转录病毒颗粒在全血中接触，但这类方面也包括其它实施例，其中以上其它组分a-f中的一种或多种以比pbmc富集程序之后的典型浓度更高的浓度存在于转导反应混合物中。例如，当使用将血液分离成包括t细胞和/或nk细胞的组分以及在pbmc制剂中不存在的其它血液组分的过滤器对血液进行分级时，例如使用白细胞减少过滤器以及由过滤器保留的包括t细胞和nk细胞的细胞级分中嗜中性粒细胞的所得的存在，出现了这类方面。[0266]本文中提供用于转导全血和包括全血或其一种或多种组分的反应混合物中的淋巴细胞的这类方法方面的各种元素或步骤，例如在此章节和例示性实施例章节中，且这类方法包括在本说明书通篇中提供的实施例，如本文进一步论述。所属领域的技术人员将认识到，本文在本说明书中的任何地方提供的许多实施例可以应用于用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面的任何方面。举例来说，例如在此章节和/或例示性实施例章节中提供的用于转导全血中的淋巴细胞的任何组合物和方法方面的实施例可以包括本文中所提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例，包括有包含一种或多种多肽淋巴增生性元件、抑制性rna、car、假型化元件、核糖开关、活化元件、膜结合细胞因子、mirna、克扎克类序列、wpre元件、三终止密码子和/或本文中所公开的其它元件的实施例，并且可以与本文中的方法组合以使用包装细胞来产生反转录病毒颗粒。此外，用于转导全血中的淋巴细胞的组合物(例如反应混合物)的任何方面和实施例以及方法方面可以与本文提供的包括自驱动car的任何组合物和方法方面组合。关于包括自驱动car的任何组合物和方法方面的细节在本文中更详细地公开，例如在自驱动car方法和组合章节和例示性实施例章节中更详细地公开。[0267]在某些说明性实施例中，反转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。这类用于修饰和在说明性实施例中基因修饰全血中的淋巴细胞，如t细胞和/或nk细胞的方法可以体外或离体进行。[0268]对于本文中所提供的用于转导全血中的淋巴细胞的组合物(例如，反应混合物)和方法方面的某些实施例，反应混合物中包括抗凝血剂。在一些说明性实施例中，用具有抗凝血剂的收集容器(例如试管或袋子)收集血液，例如使用所属领域中已知的标准血液收集方案。可以用于本文中所提供的用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面中的抗凝血剂包括阻断或限制凝血酶凝血级联反应的化合物或生物制剂。抗凝血剂包括：金属螯合剂，优选钙离子螯合剂，如柠檬酸盐(例如含有游离柠檬酸根离子)，包括含有一种或多种如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸盐、腺嘌呤和单糖或多糖(例如右旋糖)、草酸盐和edta等组分的柠檬酸盐溶液；肝素和肝素类似物，如未被部分分离的肝素、低分子量肝素和其它合成糖；以及维生素k拮抗剂，如香豆素。例示性柠檬酸盐组合物包括：柠檬酸葡萄糖(acd)(也被称为抗凝血剂柠檬酸盐右旋糖溶液a和溶液b(《美国药典(united states pharmacopeia)》26,2002,第158页))；和柠檬酸盐磷酸右旋糖(cpd)溶液，其也可以制备为cpd-a1，如所属领域中已知。因此，抗凝血剂组合物还可以包括磷酸根离子或磷酸二氢根离子、腺嘌呤和单糖或多糖。[0269]如所属领域中已知，这类抗凝血剂可以按有效防止血液凝结的浓度(即，有效量)或按有效浓度的例如2倍、1.5倍、1.25倍、1.2倍、1.1倍或9/10、4/5、7/10、3/5、1/2、2/5、3/10、1/5或1/10的浓度存在于反应混合物中。已知许多不同的抗凝血剂的有效浓度且可以通过分析不同浓度的防止血液凝结的能力(其可以物理方式观察)来容易地凭经验确定。许多测量凝血的血凝度计是可商购的且可以使用各种传感器技术，例如qcm传感器(参见例如yao等人,《使用石英晶体微天平耗散方法的凝血测试智能电话平台(blood coagulation testing smartphone platform using quartz crystal microbalance dissipation method)》,《传感器(sensors)》(basel),2018年9月；18(9):3073)。有效浓度包括在意图用于试管或袋子的体积的血液中稀释抗凝血剂之后，任何可商购的抗凝血剂在可商购的试管或袋子中的浓度。举例来说，在本文中所提供的用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面的某些实施例中，反应混合物中的柠檬酸右旋糖(acd)的浓度可以是可商购的acd血液收集管或袋子中的acd的浓度的0.1至5倍，或0.25至2.5倍、0.5至2倍、0.75至1.5倍、0.8至1.2倍、0.9至1.1倍、约1倍或1倍。举例来说，在标准过程中，可以按9份血液和1份抗凝血剂的比率将血液收集到含有3.2％(109mm)柠檬酸钠(109mm)的试管或袋子中。因此，在某些说明性实施例中，在通过向1份抗凝血剂与9份血液的此混合物中添加1-2份反转录病毒颗粒溶液而制备的反应混合物的情况下，柠檬酸盐浓度可以是例如25％至0.4％，或0.30％至0.35％。在说明性标准血液收集实施例中，血液袋中存在15ml acd溶液a以用于收集100ml血液。在添加血液之前的acd含有7.3g/l(0.73％)的柠檬酸(无水)、22.0g/l(2.2％)的柠檬酸钠(二水合物)和24.5g/l的右旋糖(单水合物)[usp](2.4％)。在向含有acd的袋子中添加100ml血液后，添加例如5至20ml的体积的反转录病毒颗粒。因此，在一些实施例中，反应混合物中的acd组分的浓度可以是0.05％至0.1％，或0.06％至0.08％柠檬酸(无水)；0.17％至0.27％，或0.20％至0.24％柠檬酸钠(二水合物)；0.2％至0.3％，或0.20％至0.28％，或0.22％至0.26％右旋糖(单水合物)。在某些实施例中，反应混合物中使用0.001至0.02m的浓度的柠檬酸钠。[0270]在一些实施例中，肝素以例如可商购的肝素血液收集管中的肝素的浓度的0.1至5倍，或0.25至2.5倍、0.5至2倍、0.75至1.5倍、0.8至1.2倍、0.9至1.1倍、约1倍或1倍的浓度存在于反应混合物中。肝素是葡糖胺聚糖抗凝血剂，其分子量在5,000-30,000道尔顿范围内。在一些实施例中，肝素是以约1.5至45、5至30、10至20或15usp单位/毫升反应混合物的浓度使用。在一些实施例中，本文中的反应混合物中的edta，例如k2edta的有效浓度可以是0.15至5mg/ml、1至3mg/ml、1.5-2.2mg/ml或1至2mg/ml或约1.5mg/ml血液。本文中所提供的用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面中的反应混合物可以包括两种或更多种抗凝血剂，其组合有效剂量可以防止在形成反应混合物之前血液和/或反应混合物本身的凝血。[0271]在一些实施例中，可以在从受试者收集血液以用于离体转导之前向受试者施用抗凝血剂，使得在收集时至少部分且至少在接触步骤和随后任选的培育期内抑制血液的凝结。在这类实施例中，举例来说，可以按80毫克/千克/天至5毫克/千克/天(毫克是指柠檬酸的毫克数且千克是用于所治疗的哺乳动物)来向受试者施用柠檬酸右旋糖。可以按例如5单元/千克/小时至30单元/千克/小时的剂量递送肝素。[0272]在本文的某些说明性实施例中的反应混合物可以包括如本文所提供的不是pbmc的血液或血液制剂组分。这类组分的非限制性例示性浓度在以下段落中提供。应当理解，在说明性实施例中，由使用这些反应混合物的方法得到的细胞制剂将包括这些额外的组分，并且在一些实施例中，以相对于其它细胞相同的比率或百分比，在下文中为反应混合物提供。[0273]关于红细胞，在一些实施例中，红细胞存在于本文的反应混合物和细胞制剂中，在一些实施例中，以相对于t细胞的量大于典型pbmc分离后的量存在，并且在一些实施例中，红细胞可以占作为范围的低端的反应混合物的体积的0.1、0.5、1、5、10、25、35或40％至作为范围的高端的反应混合物的体积的25、50、60或75％。在说明性实施例中，红细胞占反应混合物的1至60％、10至60％、20至60％、30至60％、40至60％、40至50％、42至48％、44至46％、约45％或45％。在一些实施例中，在反应混合物或细胞制剂中，与t细胞相比，存在更多的红细胞。[0274]关于嗜中性粒细胞，在一些实施例中，嗜中性粒细胞存在于本文提供的反应混合物和细胞制剂中，在一些实施例中，以相对于t细胞的量大于典型pbmc分离后的量存在，并且在一些实施例中，嗜中性粒细胞可以占作为范围的低端的反应混合物或细胞制剂中的白细胞的0.1、0.5、1、5、10、20、25、35或40％至作为范围的高端的反应混合物或细胞制剂中的白细胞的25、50、60、70、75和80％，例如反应混合物或细胞制剂中的白细胞的25％至70％，或30％至60％，或40％至60％。在一些实施例中，在本文中的反应混合物和细胞制剂中，与t细胞和/或nk细胞相比，存在更多的嗜中性粒细胞。[0275]关于嗜酸性粒细胞，嗜酸性粒细胞存在于反应混合物或细胞制剂中，在一些实施例中，以相对于t细胞的量大于典型pbmc分离后的量存在，并且在一些实施例中，嗜酸性粒细胞可以占作为范围的低端的反应混合物或细胞制剂中的白细胞的0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8％至作为范围的高端的反应混合物或细胞制剂中的白细胞的2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.5、4、5、6、8和10％。在说明性实施例中，嗜酸性粒细胞占反应混合物或细胞制剂中的白细胞的0.05至10.0％、0.1至9％、0.2至8％、0.2至6％、0.5至4％、0.8至4％或1至4％。[0276]关于嗜碱性粒细胞，在一些实施例中，嗜碱性粒细胞存在于反应混合物或细胞制剂中，在一些实施例中，以相对于t细胞的量大于典型pbmc分离后的量存在，并且在一些实施例中，嗜碱性粒细胞可以占作为范围的低端的反应混合物中的白细胞的0.05、0.1、0.2、0.4、0.45和0.5％至作为范围的高端的反应混合物中的白细胞的0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5和2.0％。在说明性实施例中，嗜碱性粒细胞占反应混合物中的白细胞的0.05至1.4％、0.1至1.4％、0.2至1.4％、0.3至1.4％、0.4至1.4％、0.5至1.4％、0.5至1.2％、0.5至1.1％或0.5至1.0％。[0277]关于血浆，在一些实施例中，血浆组分存在于反应混合物或细胞制剂中，并且在一些实施例中，血浆可以占作为范围的低端的反应混合物的体积的0.1、0.5、1、5、10、25、35或45％至作为范围的高端的反应混合物的体积的25、50、60、70和80％。在说明性实施例中，血浆占反应混合物的0.1至80％、1至80％、5至80％、10至80％、30至80％、40至80％、45至70％、50至60％、52至58％、54至56％、约55％或55％。[0278]关于血小板，在一些实施例中，血小板存在于反应混合物或细胞制剂中，在一些实施例中，以相对于t细胞的量大于典型pbmc分离后的量存在，并且在一些实施例中，血小板可以包含作为范围的低端的1×105、1×106、1×107或1×108个血小板/ml反应混合物至作为范围的高端的1×109、1×1010、1×1011、1×1012、2×1013或2×1014个血小板/ml反应混合物。在说明性实施例中，血小板包含1×105至1×1012个血小板、1×106至1×1011个血小板、1×107至1×1010个血小板、1×108至1×109个血小板/ml、或1×108至5×108个血小板/ml反应混合物，在一些实施例中，以相对于t细胞的量大于典型pbmc分离后的量存在，并且在一些实施例中，占反应混合物或细胞制剂中白细胞的0.1％至9％、0.1％至1％、或1％至9％。[0279]用于修饰和/或基因修饰淋巴细胞的方法的步骤和反应混合物[0280]在某些方面中，本文提供了转导、转染、基因修饰和/或修饰淋巴细胞的方法，所述淋巴细胞为例如(通常是一群)外周血单核细胞(pbmc)，通常是t细胞和/或nk细胞，并且在某些说明性实施例中是静息t细胞和/或静息nk细胞，所述方法包括使所述淋巴细胞与(通常是一群)重组核酸载体接触，所述重组核酸载体在说明性实施例中是复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其中所述接触(和在接触条件下的培育)促进膜缔合、膜融合或内吞，和任选地通过重组核酸载体转导或转染静息t细胞和/或nk细胞，从而产生被修饰的和在说明性实施例中被基因修饰的t细胞和/或nk细胞。值得注意的是，尽管本文提供的许多方面和实施例是根据重组反转录病毒颗粒来讨论的，但本领域技术人员将认识到，许多不同的重组核酸载体(包括但不限于本文提供的那些)可以用于和/或被包括在这类方法和组合物中。在其中重组核酸载体是复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒通常在其表面上包含促融合元件和结合元件，所述结合元件可以是假型化元件的一部分。在说明性实施例中，不需要t细胞和/或nk细胞的预活化，并且在进行接触的反应混合物中存在活化元件，其可以是本文提供的任何活化元件。在另外的说明性实施例中，活化元件存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。在说明性实施例中，活化元件是抗cd3，例如抗cd3 scfv，或抗cd3 scfvfc。[0281]本文提供的许多方法方面包括以下步骤：1)从受试者采集血液的任选步骤；2)在反应混合物中使细胞(例如nk细胞和/或在说明性实施例中t细胞，其可以来自所采集的血液)与编码car和/或淋巴增生性元件的重组载体(通常是其多个拷贝)，在说明性实施例中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的步骤，其中所述接触可以包括任选的培育；3)典型地，将未结合的重组载体从反应混合物中的细胞上洗去的步骤；4)典型地，收集溶液中的修饰的细胞，例如修饰的nk细胞和/或在说明性实施例中修饰的t细胞的步骤，所述溶液在说明性实施例中可以是递送溶液，以形成细胞悬浮液，所述细胞悬浮液在说明性实施例中是细胞制剂；和5)将所述细胞制剂递送至受试者的任选步骤，在说明性实施例中，所述受试者是从其采集血液的受试者，例如通过输注，或在某些说明性实施例中，皮内、肌内或瘤内，或在另外的说明性实施例中，皮下。值得注意的是，在某些说明性实施例中，反应混合物包括未分级的全血或包括一种或多种不是pbmc的细胞类型，并且可以包括在全血中发现的所有或许多细胞类型，包括总有核细胞(tnc)。值得注意的是，在某些实施例中，重组载体包含自驱动car，其编码car和淋巴增生性元件。[0282]作为非限制性实例，在一些实施例中，收集10至120ml的血液(或通过对0.5至2.0总血体积进行白细胞去除术，在10至120ml中分离白细胞)；使收集的、未分级的血液/分离的细胞通过白细胞减少过滤器，以在过滤器的顶部分离tnc；将复制缺陷型重组反转录病毒颗粒加入到白细胞减少过滤器的顶部上的tnc中，使总反应混合物体积为500μl至10ml，以形成反应混合物并开始接触；任选地将反应混合物培育本文提供的任何接触时间，作为非限制性实例，例如1-4小时；通过用10至120ml的洗涤溶液过滤反应混合物，从反应混合物中的细胞中洗去非缔合的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒；并且保留在tnc过滤器上的细胞(包括修饰的t细胞和nk细胞)用2ml至10ml的递送溶液从过滤器洗脱，由此形成适于引入或再引入到受试者中的细胞制剂。[0283]在本文中所提供的任何方面中使用的任何方法(其通常是用于修饰并且在说明性实施例中用于基因修饰淋巴细胞、pbmc且在说明性实施例中，nk细胞和/或在其它说明性实施例中，t细胞的方法)的一些实施例可以包括从受试者收集血液的步骤。血液包括可以用于本文中所提供的方法和组合物中的血液组分，包括血细胞，如淋巴细胞(例如t细胞和nk细胞)。在某些说明性实施例中，受试者是罹患癌症的人类受试者(即，人类癌症受试者)。值得注意的是，某些实施例不包括这类步骤。然而，在包括从受试者收集血液的实施例中，可以通过所属领域中已知的如本文中更详细论述的任何合适的方法从受试者收集或获得血液，因此所收集的血液或血液衍生组分可以被称为“血液衍生产物”，并且通常是“外周血衍生产物”，因为其通常从外周血分离。举例来说，可以通过静脉穿刺或本领域已知的任何其它血液采集方法来采集血液衍生产物，通过所述方法将未分级的全血的样品收集在器皿(例如血液袋)中，或通过所述方法将白细胞和淋巴细胞从血液中分离，例如通过单采血液成分术(例如白细胞单采血液成分术或淋巴浆细胞单采血液成分术)。在一些实施例中，所收集的血液(例如未分级的全血)的体积为1至5ml、5至10ml、10至15ml、15至20ml、20至25ml、5至25ml、25至250ml、25至125ml、50至100ml、或50至250ml、75至125ml、90至120ml或95至110ml。在一些实施例中，所采集的血液的体积可以是作为范围的低端的1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、600、700、800或900ml至作为范围的高端的25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、600、700、800、或900ml或1l。在一些实施例中，所收集的血液的体积小于250ml、100ml、75ml、20ml、15ml、10ml或5ml。在一些实施例中，可以通过单采血液成分术来获得淋巴细胞(例如，t细胞和/或nk细胞)。在一些实施例中，在单采血液成分术期间(例如，白细胞单采血液成分术或淋巴浆细胞单采血液成分术)获取和处理的血液的体积可以是作为范围的低端的受试者的总血液体积的0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.25或1.5倍至作为范围的高端的受试者的总血液体积的0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25或2.5倍，例如总血液体积的0.5至2.5、0.5至2、0.5至1.5或1至2倍。人类的总血液体积通常在4.5至6l的范围内，因此与采集未分级的全血相比，在单采血液成分术期间通常要获取和处理更多的血液。无论目标血细胞(例如t细胞)是通过单采血液成分术获得的，还是未分级的全血被收集到例如血液袋中，预期其中的目标血细胞(例如t细胞)将根据本文提供的方法进行处理，这在某些说明性实施例中导致目标血细胞变得被修饰、基因修饰和/或转导。当使用单采血液成分术(例如白细胞单采血液成分术或淋巴浆细胞单采血液成分术)来收集包含t细胞和/或nk细胞的细胞级分(例如，以提供白细胞或淋巴浆细胞)时，将这类细胞直接或在一次或多次洗涤后再悬浮于溶液中，向其中加入编码car的重组载体以形成本文提供的反应混合物。这类反应混合物可以用于本文的任何方法中。在其中受试者或来自受试者的血液样品具有低cd3+血细胞计数的一些说明性方法中，使用单采血液成分术(例如白细胞单采血液成分术或淋巴浆细胞单采血液成分术)来收集血细胞(例如，白细胞或淋巴细胞)，以包含在本文提供的方法中。[0284]与是从受试者采集血液还是通过单采血液成分术获得血细胞无关，在本文提供的用于修饰淋巴细胞(例如，t细胞和/或nk细胞)的任何方法方面中，淋巴细胞的群体(例如，t细胞和/或nk细胞)通常在反应混合物中与多个拷贝的重组载体接触，所述重组载体在一些实施例中是非病毒载体的拷贝，并且在说明性实施例中是相同的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。本文中所提供的任何实施例中的接触可以在例如适用于处理血细胞的封闭系统的腔室中，例如在血液袋内进行，如本文中更详细论述。在一些实施例中，血液袋在接触期间可以具有5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400或500ml或更少的血液。在一些实施例中，血液袋在接触期间可以具有至少5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400或500ml的血液。在一些实施例中，血液袋在接触期间可以具有作为该范围的低端的1、2、3、4、5、10、15、20、25和50ml至作为该范围的高端的10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400和500ml的血液。例如，血液袋在接触期间可以具有1至10ml、5至25ml、10至50ml、25至100ml、50至200ml或100至500ml的血液。在一些实施例中，血液袋内部的混合物可以包括抗凝剂，例如肝素。在其它实施例中，血液袋内部的混合物不包括抗凝剂，或者不包括肝素。转导反应混合物可以包括一种或多种缓冲液、离子和培养基。[0285]关于本文中所提供的某些例示性反应混合物中的反转录病毒颗粒且在说明性实施例中，慢病毒颗粒，存在0.1至50、0.5至50、0.5至20、0.5至10、1至25、1至15、1至10、1至5、2至15、2至10、2至7、2至3、3至10、3至15或5至15感染倍率(moi)；或至少1且小于6、11或51moi；或在一些实施例中，5至10moi单位的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在一些实施例中，moi可以是至少0.1、0.5、1、2、2.5、3、5、10或15。关于用于转导血液中的淋巴细胞的组合物和方法，在某些实施例中，可以使用比其中分离pbmc且用于反应混合物中的方法中更高的moi。举例来说，用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法的说明性实施例，假设1×106个pbmc/ml血液，可以致moi是1至50、2至25、2.5至20、2.5至10、4至6或约5且在一些实施例中，5至20、5至15、10至20或10至15的情况下使用反转录病毒颗粒。[0286]如本文实例812所述，当这类细胞与展示结合tcr复合物的结合多肽(例如t细胞活化元件)的基因载体(例如复制缺陷型重组(rir)反转录病毒颗粒)接触时，包括tcrα、tcrβ和cd3的tcr复合物在cd4阳性(cd4+)细胞和cd8阳性(cd8+)细胞上的表面表达被降低或“变暗(dimmed)”。这种变暗主要是tcr复合物在活化后内化的结果。此外，这种变暗的程度随着在反应混合物中给定基因载体的浓度增加而增加，并且与基因载体活化和进入细胞的能力相关。类似地，在与基因载体的表面上的多肽结合之后，其它表面多肽的内化导致与基因载体接触的细胞上的表面多肽的变暗，并且在使用其它结合多肽的转导期间可能是常见的。因此，在一些实施例中，与未与包含结合多肽的基因载体接触的细胞上的表面多肽表达相比，在与包含结合多肽的基因载体接触的细胞上的表面多肽表达的减少百分比用于定量基因载体的效力并且确定用于修饰细胞的群体的基因载体的适当剂量。在说明性实施例中，与未与基因载体接触的细胞上的表面tcr复合物表达相比，与基因载体接触的细胞上的表面tcr复合物表达的减少百分比用于定量基因载体的效力并且确定用于修饰细胞的群体的基因载体的适当剂量。如本文所用，“变暗单元”(du)是在37℃和5％co2下与基因载体接触4小时后，与在类似条件下但未与基因载体接触的细胞混合物中表面多肽的表面表达相比，将1ml的细胞混合物中表面多肽的表面表达降低50％的基因载体(例如rir反转录病毒颗粒)的量。表面多肽通常是存在于基因载体的表面上的结合多肽的结合配偶体。在一些实施例中，表面多肽是tcr复合物多肽。在一些实施例中，tcr复合物多肽是cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、tcrα或tcrβ。在说明性实施例中，结合配偶体是cd3，并且结合多肽是抗cd3。[0287]因为结合多肽在基因载体的表面上的表达的水平将在不同的结合多肽之间和基因载体制剂之间有所不同，所以基因载体降低表面多肽的表面表达的能力应该针对基因载体的每种制剂来确定。在一些实施例中，基于靶细胞数目来确定基因载体减少表面多肽的表面表达的能力。在一些实施例中，基因载体减少表面多肽的表面表达的能力基于细胞的体积。在本文的任何方面和实施例中，表面多肽的表面表达的减少可以称为使表面多肽变暗。例如，如果细胞上的cd3的表面表达减少，则cd3在该细胞上变暗，并且该细胞可以被称为cd3-，即使该细胞仍可以包含在其表面上未表达的cd3。不受理论的限制，暂时内化cd3并使cd3变暗的t细胞是t细胞，并且最终将在其细胞表面上重新表达cd3，使得它们再次成为cd3+。[0288]因此，在一个方面中，本文提供了一种通过变暗体积中细胞上的变暗百分比来确定使表面多肽的表面表达变暗的基因载体制剂的量的方法，其包括：[0289]a)形成包括多个体积的基因载体制剂和多个体积的细胞混合物的多种反应混合物，其中所述多种反应混合物中的至少两种反应混合物包括不同体积的基因载体制剂和/或细胞混合物，其中所述细胞混合物包括在其表面上包含所述表面多肽的多个细胞，并且其中所述基因载体制剂包括在其表面上包含能够结合所述表面多肽的结合多肽的多个基因载体；[0290]b)培育所述反应混合物；[0291]c)测量所述表面多肽在所述反应混合物中和在所述细胞混合物的未接触体积中的表面表达，其中所述细胞混合物的所述未接触体积不与所述基因载体制剂接触；和[0292]d)使用所测量的反应混合物中的表面多肽的表面表达、所测量的细胞混合物的非接触体积中的表面多肽的表面表达、以及所述反应混合物中的基因载体制剂和细胞混合物的量，确定所述基因载体制剂的量，以将所述变暗体积中的细胞的变暗百分比变暗。[0293]在一些实施例中，反应混合物中的细胞混合物的量基于体积。在一些实施例中，反应混合物中的细胞混合物的量基于靶细胞的数量。在一些实施例中，基因载体制剂是病毒制剂。在说明性实施例中，病毒制剂是复制缺陷型重组反转录病毒颗粒制剂。在一些实施例中，变暗百分比(变暗的细胞百分比)为50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％或97％。在说明性实施例中，变暗百分比为至少或约80％、85％、90％或95％。在一些实施例中，变暗体积为0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、10ml、15ml、20ml或25ml。在一些实施例中，表面多肽可以是cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、tcrα、tcrβ、cd16a、nkp46、2b4、cd2、dnam、或nkg2c、nkg2d、nkg2e、nkg2f和/或nkg2h。在一些实施例中，表面多肽是tcr复合物多肽。在一些实施例中，tcr复合物多肽是cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、tcrα或tcrβ。在说明性实施例中，表面多肽是cd3e。在一些实施例中，结合多肽可以是在本文的活化元件部分中公开的任何活化元件。在此类实施例中，表面多肽可以是活化元件的结合配偶体。[0294]在说明性实施例中，细胞混合物是全血。在另外的说明性实施例中，细胞混合物已经经历红细胞耗尽程序。在一些实施例中，从健康受试者，例如不具有或不知道或怀疑具有与抗原的升高的表达相关的疾病、障碍或病症的受试者收集全血。在一些实施例中，从患有与抗原的升高的表达相关的疾病、障碍或病症的受试者收集全血，其中所述基因载体将施用于患有疾病、障碍或病症的受试者或其它受试者。在一些实施例中，从每个受试者收集全血，并且单独地针对每个受试者计算变暗单元。[0295]在一些实施例中，反应混合物可以被培育持续少于或约24、12、10、8、6、4或2小时或60、45、30、15、10或5分钟，或者仅持续初始接触。在一些实施例中，反应混合物可以被培育持续10分钟至24小时，或10分钟至8小时，或1小时至8小时，或1小时至6小时，或在说明性实施例中，持续3.5至4.5小时或持续4小时。在一些实施例中，反应混合物可以在约10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃或42℃下培育。在一些实施例中，在没有co2的情况下培育反应混合物。在说明性实施例中，反应混合物与5％co2一起培育。[0296]在一些实施例中，通过荧光活化细胞分选(facs)方法来测量表面多肽的表面表达。在一些实施例中，在facs方法中使用的抗体是gmp。在一些实施例中，cd3抗体用于确定表面多肽的表面表达。在一些实施例中，cd3抗体是ucht1、okt-3、hit3a、trx4、x35-3、vit3、bma030(bw264/56)、clb-t3/3、cris7、yth12.5、f111409、clb-t3.4.2、tr-66、tr66.opt、hum291、wt31、wt32、spv-t3b、11d8、xiii-141、xiii46、xiii-87、12f6、t3/rw2-8c8、t3/rw24b6、okt3d、m-t301、smc2、f101.01和sk7。在说明性实施例中，cd3抗体是percp小鼠抗人cd3–克隆sk7(bd,347344)。在一些实施例中，在测量表面多肽的表面表达之前，将细胞混合物中存在的细胞与培育的反应混合物中的未结合的基因载体分离。[0297]在上述方法的说明性实施例中，基因载体制剂是复制缺陷型重组反转录病毒颗粒制剂，变暗百分比是50％，变暗体积是1ml，表面多肽是cd3，细胞混合物是从健康受试者收集的全血，并且反应混合物在37℃和5％co2下培育4小时，并且所述方法用于计算变暗单元。[0298]此类方法可以用于确定基因载体制剂中的反转录病毒颗粒的量，所述基因载体制剂将细胞上的表面多肽表达减少特定百分比。然后，可以使用该量来确定反转录病毒颗粒的制剂的量，以用于随后的全血、分离的pbmc或分离的tnc的转导。在本文提供的包括基因修饰和/或转导淋巴细胞的任何方面和实施例中，添加到淋巴细胞中的基因载体的制剂(例如复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)的量可以使用上述方法来确定。[0299]变暗单元(du)可以用于本文的任何方面或实施例，其包括接触步骤以确定要添加的基因载体的量。由于在1ml体积的细胞中，1du的基因载体使表面多肽的表面表达减少50％，因此在10ml的细胞混合物中，10du的基因载体使表面多肽的表面表达减少50％。在一些实施例中，在与基因载体接触后，与在类似条件下但不与基因载体接触的细胞混合物中表面多肽的表面表达相比，向一定体积的细胞中加入足够的du以使表面多肽例如cd3的表面表达降低大于50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％或97％。在说明性实施例中，在与基因载体接触后，与在类似条件下但不与基因载体接触的细胞混合物中表面多肽的表面表达相比，向一定体积的细胞中加入足够的du以将表面多肽的表面表达降低大于80％、85％、90％或95％。在一些实施例中，每ml的细胞混合物添加至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20du。在说明性实施例中，每ml的细胞混合物添加5至20du、5至15du、10至20du、或13至18du。在一些实施例中，每1,000,000个靶细胞添加至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20du。在一些实施例中，靶细胞是淋巴细胞，例如t细胞或nk细胞。在说明性实施例中，细胞处于全血、分离的pbmc或分离的tnc中。在另外的说明性实施例中，细胞是在裂解红细胞之后的全血的其余级分。在一些实施例中，添加足够的du以将细胞的群体变暗特定的百分比，例如，将t细胞的群体上的cd3变暗大于50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％或97％。在一些实施例中，存在基因载体的足够的变暗单元，并且在说明性实施例中存在rip，以将细胞的群体中表面变暗的表面多肽的百分比，并且在说明性实施例中变暗的表面cd3-，并且在说明性实施例中t细胞，增加到至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％或97％。在本文包含与基因载体接触的细胞的任何方面和实施例中，包括细胞的组合物可以包含每ml细胞至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20du，例如每ml血液、细胞制剂、细胞的群体至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20du。[0300]在说明性实施例中，这类接触和其中发生接触的反应混合物在封闭式细胞处理系统中进行，如本文更详细讨论的。包装细胞且在说明性实施例中，包装细胞系，且在具体说明性实施例中，在本文中的某些方面中提供的包装细胞可以用于产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。反应混合物中的细胞可以是pbmc或tnc，和/或在提供用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法的本文中的反应混合物方面中，可以存在抗凝血剂和/或其它血液组分，包括其它类型的非pbmc型血细胞，如本文中所论述。实际上，在用于转导全血中的淋巴细胞的这些组合物和方法方面的说明性实施例中，反应混合物可以基本上是全血且通常是抗凝血剂、反转录病毒颗粒和相对少量溶液，其中反转录病毒颗粒在所述溶液中递送至全血中。[0301]在关于本文中所提供的用于修饰全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面的反应混合物中，与涉及在形成反应混合物之前的pbmc富集程序的方法相比，淋巴细胞(包括nk细胞和t细胞)可以按较低的血细胞百分比和较低的白细胞百分比存在于反应混合物中。举例来说，在这些方面的一些实施例中，与nk细胞或甚至t细胞相比，反应混合物中存在更多的粒细胞或嗜中性粒细胞。在本文中的其它章节中详细提供关于用于修饰全血中的淋巴细胞的方面的反应混合物中存在的抗凝血剂和一种或多种其它血液组分的组合物的细节。在本文中所提供的一些反应混合物中，t细胞可以占例如作为范围的低端的反应混合物中的淋巴细胞的10、20、30或40％至作为范围的高端的反应混合物中的淋巴细胞的40、50、60、70、80或90％。在说明性实施例中，t细胞占淋巴细胞的10至90％、20至90％、30至90％、40至90％、40至80％、或45％至75％。在这类实施例中，例如，nk细胞可以占作为范围的低端的反应混合物中的淋巴细胞的1、2、3、4或5％至作为范围的高端的反应混合物中的淋巴细胞的5、6、7、8、9、10、11、12、13或14％。在说明性实施例中，t细胞占反应混合物中的淋巴细胞的1至14％、2至14％、3至14％、4至14％、5至14％、5至13％、5至12％、5至11％或5至10％。在一些实施例中，t细胞可以是至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的反应混合物。如本文所公开的，在血液样品中的淋巴细胞在本文针对这些方面公开的反应混合物中与重组核酸载体(例如反转录病毒颗粒)接触之前，用于在全血中转导淋巴细胞的组合物和方法方面通常不涉及任何血液分级分离，例如血液样品的pbmc富集步骤。因此，在一些实施例中，使未分级的全血中的淋巴细胞与重组反转录病毒颗粒接触。然而，在一些实施例中，特别是对于本文中自驱动car方法和组合物章节中的某些方面，在细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，将嗜中性粒细胞/粒细胞与其它血细胞分离。在一些实施例中，在周边血液单核细胞(pbmc)(包括末梢血液淋巴细胞(pbl)，如t细胞和/或nk细胞)与反转录病毒颗粒组合成反应混合物之前，使用例如pbmc富集程序将周边血液单核细胞与血液样品中的其它组分分离。本领域技术人员将理解，本领域已知的各种方法可以用于富集含有t细胞和/或nk细胞的不同血液级分。[0302]pbmc富集程序是其中将pbmc从其它血细胞类型富集至少25倍且通常至少50倍的程序。举例来说，相信pbmc占全血中的血细胞的小于1％。在pbmc富集程序之后，pbmc洗脱份中分离的至少30％且在一些实例中，多达70％的细胞是pbmc。甚至有可能使用一些pbmc富集程序实现更高的pbmc富集。所属领域中已知各种不同的pbmc富集程序。举例来说，pbmc富集程序是菲科尔密度梯度离心过程，其在整个密度梯度介质中分离主要细胞群体，如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和红血球。在这类方法中，水性介质包括菲科尔，一种形成高密度溶液的亲水性多糖。全血在密度介质上方或下方分层(在不混合两个层的情况下)，接着进行离心将使细胞根据其密度分散且pbmc洗脱份在血浆与密度梯度介质之间的界面处形成薄的白色层(参见例如panda和ravindran(2013),《人类pbmc的分离(isolation of human pbmcs)》,《生物协议(bioprotoc.)》,第3卷(3))。此外，使用sepax细胞处理系统的旋转力，在菲科尔中可以使用向心力从其它血液组分分离pbmc。[0303]在一些实施例中，单采血液成分术，例如白细胞单采血液成分术，可以用于分离细胞，如pbmc。例如，可以使用amicus rbcx(fresenius-kabi)和trima accel(terumo bct)单采血液成分术装置和试剂盒。通过单采血液成分术分离的细胞通常含有t细胞、b细胞、nk细胞、单核细胞、粒细胞、其它有核白细胞、红细胞和/或血小板。可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞，以去除血浆级分，并将细胞置于适当的缓冲液或介质中，例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)或缺乏钙且可能缺乏镁或可能缺乏多种(如果不是全部)二价阳离子的洗涤溶液，以用于后续处理步骤。在一些实施例中，通过单采血液成分术收集的细胞可以通过本文提供的任何方法进行基因修饰。在一些实施例中，通过单采血液成分术收集的细胞可以用于制备本文提供的任何细胞制剂。在一些实施例中，通过单采血液成分术收集的细胞可以被再悬浮在多种生物相容性缓冲液(例如如不含ca、不含mg的pbs)中。可替代地，可以去除含有通过单采血液成分术收集的细胞的样品中的不合需要的组分，并将细胞再悬浮在培养基中。在一些实施例中，白细胞去除术可以用于分离细胞，如淋巴细胞。在本文提供的包括pbmc的任何实施例中，可以使用白细胞单采术(leukopak)。在包括tnc的任何实施例中，可以使用血沉棕黄层。在另一种pbmc富集方法中，使用自动白细胞去除收集系统(如spectraapheresis system，来自terumo bct,inc.lakewood,co 80215,usa)，使用高速离心从目标pbmc洗脱份分离流入的全血，同时通常将流出物质(如血浆、红血球和粒细胞)返回供体，但这种返回在本文中所提供的方法中将是任选的。可能需要其它处理以去除残余红血球和粒细胞。两种方法都包括pbmc的时间密集纯化，而白细胞去除方法需要患者在pbmc富集步骤期间在场且参与。[0304]作为pbmc富集程序的其它非限制性实例，在本文中的转导、基因修饰和/或修饰方法的一些实施例中，使用sepax或sepax 2细胞处理系统(biosafe)分离pbmc。在一些实施例中，使用clinimacs prodigy细胞处理器(miltenyi biotec)分离pbmc。在一些实施例中，使用自动单采血液成分术分离器，其从受试者采集血液，使血液通过挑选出具体细胞类型(如pbmc)的装置，且使剩余部分返回至受试者中。密度梯度离心可以在单采血液成分术之后进行。在一些实施例中，使用白细胞减少过滤器总成分离pbmc。在一些实施例中，接着使用磁珠活化的细胞分选来根据细胞表型从pbmc纯化特异性细胞群体，如pbl或其子集(即，阳性选择)，接着将其用于本文中的反应混合物中。[0305]也可以使用其它纯化方法，例如底物粘附，其利用模拟t细胞在募集期间遇到的环境的底物，以在将t细胞添加至反应混合物中之前纯化t细胞，或可以使用阴性选择，其中在形成用于接触步骤的反应混合物之前，靶向不合需要的细胞以用靶向待去除的不合需要的细胞的抗体复合物去除。在一些实施例中，在形成反应混合物之前，可以使用红血球花结法来去除红血球。在其它实施例中，可以在接触步骤之前去除造血干细胞且因此在这些实施例中，在接触步骤期间不存在造血干细胞。在本文中的一些实施例中，尤其对于用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法，在进行或不进行任选的培育或方法的任何步骤的情况下，在接触之前、在接触期间或在接触之前和在接触期间不存在abc转运蛋白抑制剂和/或底物(即，不存在于用于进行接触的反应混合物中)。[0306]在本文中所提供的任何方面的某些说明性实施例中，修饰和在说明性实施例中基因修饰和/或转导淋巴细胞是在不进行预先活化或刺激的情况下和/或在不需要预先活化或刺激的情况下进行，无论体内、体外或离体；和/或此外，在一些实施例中，在初始接触(进行或不进行任选的培育)之后，在不进行离体或体外活化或刺激的情况下或在初始接触(进行或不进行任选的培育)之后，在不需要离体或体外活化或刺激的情况下进行。在某些说明性实施例中，细胞在接触过程中被活化，而在接触前超过15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时或8小时完全不被活化或不被活化。在某些说明性实施例中，对于修饰、基因修饰和/或转导细胞，不需要通过不存在于反转录病毒颗粒表面上的元件的活化。因此，在接触之前、期间或之后，除了在反转录病毒颗粒上之外，不需要这类活化或刺激元件。因此，如本文更详细讨论的，不需要预活化或刺激的这些说明性实施例提供了快速进行体外实验的能力，所述体外实验旨在更好地理解t细胞和其中的生物制剂机制。此外，这类方法提供了使用pbmc、淋巴细胞、t细胞或nk细胞生产的生物产品的更有效的商业生产，以及这类商业生产方法的开发。最后，这类方法提供了用于过继细胞疗法的淋巴细胞(例如nk细胞，尤其是t细胞)的更快速的离体处理，例如通过提供快速护理点(rpoc)方法，从根本上简化了这类疗法的递送。在说明性实施例中，当与反转录病毒颗粒组合以形成反应混合物时，一些、大部分、至少25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％或全部淋巴细胞是静息的，且通常在与反应混合物中的反转录病毒颗粒接触时是静息的。在用于修饰血液或其组分中的淋巴细胞(如t细胞和/或nk细胞)的方法中，淋巴细胞可以其在即将收集之前体内存在于所收集的血液时的通常静息状态被接触。在一些实施例中，t细胞和/或nk细胞由95％至100％的静息细胞(ki-67-)组成。在一些实施例中，与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的t细胞和/或nk细胞包括作为范围的低端的90、91、92、93、94和95％静息细胞至作为范围的高端的96、97、98、99或100％静息细胞。在一些实施例中，t细胞和/或nk细胞包括原生细胞。在一些说明性实施例中，用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面包括此段落中的子实施例。[0307]在包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的本文方面的说明性实施例中，t细胞和/或nk细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒之间的接触可以有助于由复制缺陷型重组反转录病毒颗粒进行的t细胞和/或nk细胞的转导。不受理论约束，在接触期间，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒识别且结合于t细胞和/或nk细胞，并且t细胞和nk细胞被“修饰”，如该术语在本文中所使用。此时反转录病毒和宿主细胞膜开始融合，并且任何反转录病毒假型化元件和/或t细胞活化元件，包括抗cd3抗体，都变得被整合到修饰的t细胞和/或nk细胞的表面中。接着，作为转导过程中的下一个步骤，来自复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的遗传物质进入t细胞和/或nk细胞，此时t细胞和/或nk细胞被“基因修饰”，如该术语在本文中所使用。值得注意的是，这类过程可以在接触开始之后进行数小时或甚至数天，并且甚至在冲洗掉未缔合的反转录病毒颗粒之后进行。接着，通常将遗传物质整合到t细胞和/或nk细胞的基因组dna中，此时t细胞和/或nk细胞现被“转导”，如该术语在本文中所使用。类似地，细胞可以被除了复制缺陷型重组反转录病毒颗粒之外的重组载体修饰、基因修饰和/或转导。细胞也可以在转染后将遗传材料内在化并整合到t细胞和/或nk细胞的基因组dna中，此时t细胞和/或nk细胞现在被“稳定转染”，如该术语在本文中所使用。因此，在说明性实施例中，本文中的任何用于修饰和/或基因修饰淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)的方法是用于转导淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)的方法。相信在开始接触之后的第6天(体内或离体)，绝大部分修饰的细胞和基因修饰的细胞已被转导。慢病毒转导方法是已知的。示例性方法描述于例如wang等人(2012)《免疫治疗杂志(j.immuneticther.)》35(9):689-701；cooper等人(2003)《血液(blood)》101:1637-1644；verhoeyen等人(2009)《分子生物学方法(methods mol biol.)》506:97-114；和cavalieri等人(2003)《血液》102(2):497-505。在整个本公开中，转导的或在一些实施例中稳定转染的t细胞和/或nk细胞包括离体转导的细胞的后代，其保留至少一些在离体转导期间并入细胞基因组中的核酸或聚核苷酸。在引用“再引入”被转导的细胞的本文中的方法中，应理解，这类细胞在其自受试者的血液收集时通常并不处于被转导的状态。[0308]尽管在说明性实施例中，在本文中的方法中，t细胞和/或nk细胞在与重组反转录病毒接触之前不被活化，但在说明性实施例中，在进行重组反转录病毒和淋巴细胞的初始接触的反应混合物中存在t细胞活化元件。举例来说，这类t细胞活化元件可以在反应混合物中的溶液中。举例来说，在接触和随后任选的培育期间，可溶性抗cd3抗体可以按25-200、50-150、75-125或100ng/ml存在于反应混合物中。在说明性实施例中，可溶性抗cd3抗体是多价的，诸如二价、四价或更高阶的价度。在说明性实施例中，t细胞活化元件与反转录病毒表面缔合。t细胞活化元件可以是本文中所提供的任何t细胞活化元件。在说明性实施例中，t细胞活化元件可以是抗cd3，如抗cd3 scfv或抗cd3 scfvfc。因此，在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可以进一步包括t细胞活化元件，其在其它说明性实例中与反转录病毒的表面的外侧缔合。[0309]本文中所提供的转导方法和/或用于修饰或基因修饰全血中的淋巴细胞的方法的接触步骤通常包括初始步骤，其中使反转录病毒颗粒(通常是反转录病毒颗粒群体)与血细胞(通常是血细胞群体，其包括在pbmc富集程序之后不存在的抗凝血剂和/或除pbmc以外的其它血液组分)在液体缓冲液和/或培养基中的悬浮液中接触，以形成转导反应混合物。如在本文中所提供的其它方面中，在此接触之后可以在此反应混合物中进行任选的培育期，所述反应混合物包括悬浮液中的反转录病毒颗粒和包含淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)的血细胞。在用于修饰血液或其组分中的t细胞和/或nk细胞的方法中，反应混合物可以包括至少一种、两种、三种、四种、五种或所有如本文中所公开的其它血液组分且在说明性实施例中，包括一种或多种抗凝血剂。[0310]在反转录病毒颗粒和淋巴细胞的初始接触之后，本文中所提供的任何方面中的转导反应混合物可以在23至39℃下且在一些说明性实施例中，在37℃下培育。在某些实施例中，转导反应可以在37-39℃下进行以实现更快的融合/转导。在一些实施例中，接触步骤是如本文其它处所讨论的冷接触步骤，具有任选的培育步骤。在一些实施例中，冷接触步骤在低于37℃的温度下进行，例如在1℃至25℃或2℃至6℃下进行。与在这些温度下的接触步骤相关的任选的培育可以进行本文(例如在例示性实施例章节中)所讨论的任何时间长度。在说明性实施例中，与这些温度相关的任选的培育进行8小时、6小时、4小时、2小时，以及在说明性实施例中1小时或更少。[0311]在一些实施例(包括其中在过滤器上进行接触的说明性实施例)中，接触在较低的温度下进行，例如在2℃至25℃下进行，本文中被称为冷接触，然后从反应混合物中去除在悬浮液中保持未缔合的反转录病毒颗粒，例如通过在过滤器(例如白细胞减少过滤器)上洗涤反应混合物，所述过滤器保留包括t细胞和nk细胞的白细胞，但不保留游离的未缔合的病毒颗粒。当在转导反应混合物中接触时，细胞和反转录病毒颗粒可以被立即处理以从细胞去除在悬浮液中保持游离且不与细胞缔合的反转录病毒颗粒。任选地，将无论在悬浮液中游离或在悬浮液中与细胞缔合的悬浮液中的细胞和反转录病毒颗粒培育不同时间长度，如本文中所提供以用于本文中所提供的方法中的接触步骤中。在其它步骤之前，可以进行洗涤，无论这类细胞将在体外、离体研究或引入受试者中。这类悬浮液可以包括允许细胞和反转录病毒颗粒沉降，或通过向容器或腔室的底部施加力，例如离心力，来引起这类沉降，如本文进一步详细讨论的。在说明性实施例中，这类g力低于在离心接种程序(spinoculation procedure)中成功使用的g力。关于接触和任选的培育的进一步接触时间和讨论将在本文中(例如在例示性实施例章节中)进一步讨论。[0312]目前的方法要求在配制和再引入到受试者中之前，对基因修饰的淋巴细胞进行长时间的离体扩增。长期以来一直需要有效的护理点过继细胞疗法，该疗法允许受试者在单次访视中实现抽血(收集)、修饰淋巴细胞及再引入。本文提供的方法允许快速离体处理淋巴细胞，并且在某些说明性实施例中处理pbmc，并且在其它说明性实施例中处理总有核细胞(tnc)，而不需要离体扩增步骤，例如通过提供这类护理点方法，并且在一些说明性实施例中，在较短的时间段(快速护理点(rpoc))中，从根本上简化了过继细胞疗法的递送。本文中公开用于修饰淋巴细胞，尤其nk细胞且在说明性实施例中，t细胞的说明性方法，其与先前方法相比明显更快且更简单。因此，在一些实施例中，本文中所提供的任何用于转导、基因修饰和/或修饰pbmc或淋巴细胞，通常t细胞和/或nk细胞的方法中的接触步骤可以进行(或可以发生)本说明书中提供的任何时间段，包括(但不限于)例示性实施例章节中提供的时间段。举例来说，所述接触可以进行小于24小时，例如小于12小时、小于8小时、小于4小时、小于2小时、小于1小时、小于30分钟或小于15分钟，但在每种情况下，至少存在初始接触步骤，其中使反转录病毒颗粒和细胞在转导反应混合物中的悬浮液中接触，接着将留存于悬浮液中的未与细胞缔合的反转录病毒颗粒与细胞分离且通常丢弃，如本文中进一步详细论述。应注意但不希望受理论约束，相信接触是在反转录病毒颗粒与淋巴细胞组合到一起时开始，通常通过将含有反转录病毒颗粒的溶液添加到含有淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)的溶液中。[0313]在初始接触(包括初始冷接触)之后，在一些实施例中，在悬浮液中培育含有细胞和重组核酸载体(其在说明性实施例中为反转录病毒颗粒)的反应混合物指定时间段而不去除在溶液中保持游离且未与细胞缔合的重组核酸载体(例如反转录病毒颗粒)。此培育在本文中有时被称为任选的培育。因此，在说明性实施例中，接触(包括初始接触和任选的培育)可以进行(或可以发生)15分钟至12小时、15分钟至10小时、或15分钟至8小时、或在例示性实施例章节中包括的任何时间。在包括冷接触步骤的某些实施例中，通过在任选的洗涤步骤后悬浮细胞进行二次培育，使得未与细胞缔合的重组核酸载体和在说明性实施例中反转录病毒颗粒被洗掉。在说明性实施例中，二次培育在32℃与42℃之间的温度下(例如在37℃下)进行。任选的二次培育可以进行本文所述的任何时间长度。在说明性实施例中，任选的二次培育进行6小时或更少。因此，在说明性实施例中，所述接触(包括初始接触和任选的培育)可以进行(或可以发生)(其中如本文中一般指示，所选择的范围的低端小于所选择的范围的高端)作为范围的低端的30秒或1、2、5、10、15、30或45分钟，或1、2、3、4、5、6、7或8小时至作为范围的高端的10分钟、15分钟、30分钟，或1、2、4、6、8、10、12、18、24、36、48和72小时。因此，在一些实施例中，在通过向淋巴细胞中添加反转录病毒颗粒以形成反应混合物之后，可以将反应混合物培育作为范围的低端的5分钟至作为范围的高端的10、15或30分钟，或1、2、3、4、5、6、8、10或12小时。在其它实施例中，可以将反应混合物培育15分钟至12小时、15分钟至10小时、15分钟至8小时、15分钟至6小时、15分钟至4小时、15分钟至2小时、15分钟至1小时、15分钟至45分钟或15分钟至30分钟。在其它实施例中，可以将反应混合物培育30分钟至12小时、30分钟至10小时、30分钟至8小时、30分钟至6小时、30分钟至4小时、30分钟至2小时、30分钟至1小时、或30分钟至45分钟。在其它实施例中，可以将反应混合物培育1小时至12小时、1小时至8小时、1小时至4小时或1小时至2小时。在另一个说明性实施例中，接触仅在初始接触步骤(在反应混合物，包括在悬浮液中游离的反转录病毒颗粒和在悬浮液中的细胞，中没有任何进一步的培育)和在反应混合物中没有任何进一步的培育之间进行，或者在反应混合物中进行5分钟、10分钟、15分钟、30分钟或1小时的培育。[0314]在用于初始接触和可以是接触步骤的一部分的任选的培育的所指示的时间段之后，将反应混合物中的血细胞或其含有t细胞和/或nk细胞的洗脱份与未与这类细胞缔合的反转录病毒颗粒分离。举例来说，这可以使用pbmc富集程序(例如sepax单元中的ficoll梯度)来进行，或在本文中所提供的某些说明性实施例中，通过用白细胞耗减过滤器集合总成过滤反应混合物且接着收集白细胞(其包括t细胞和nk细胞)来进行。在另一实施例中，这可以通过在小于500g，例如400g，或300至490g，或350至450g的相对离心力下离心反应混合物来进行。这类用于从细胞分离反转录病毒颗粒的离心可以进行例如5分钟至15分钟，或5分钟至10分钟。在使用离心力从未与细胞缔合的反转录病毒颗粒分离细胞的说明性实施例中，这类g力通常低于在离心接种程序中成功使用的g力。[0315]在一些说明性实施例中，本文中所提供的方法在任何方面中都不涉及进行离心接种。在这类实施例中，一个或多个细胞至少15分钟未经受至少400g、500g、600g、700g或800g的离心接种。在一些实施例中，一个或多个细胞至少10、15、20、25、30、35、40或45分钟未经受至少800g的离心接种。在一些实施例中，包括离心接种作为接触步骤的一部分。在说明性实施例中，当进行离心接种时，不存在其它培育作为接触的一部分，因为离心接种的时间提供上文所论述的任选的培育的培育时间。在其它实施例中，在离心接种之后进行持续15分钟至4小时、15分钟至2小时或15分钟至1小时的额外培育。离心接种可以进行例如30分钟至120分钟，通常至少60分钟，例如60分钟至180分钟，或60分钟至90分钟。离心接种通常在具有至少800g，更通常至少1200g，例如800g至2400g、800g至1800g、1200g至2400g、或1200g至1800g的相对离心力的离心机中进行。在离心接种之后，这类方法通常涉及将粒化细胞和反转录病毒颗粒再悬浮且接着根据未进行离心接种时上文所论述的步骤去除未与细胞缔合的反转录病毒颗粒的额外步骤。[0316]在包括离心接种的实施例中，包括任选的培育的接触步骤和离心接种可以在4℃至42℃，或20℃至37℃下进行。在某些说明性实施例中，不进行离心接种且接触和相关任选的培育是在20-25℃下进行4小时或更短、2小时或更短、1小时或更短、30分钟或更短、15分钟或更短，或15分钟至2小时、15分钟至1小时，或15分钟至30分钟。[0317]根据本文中的任何方法提供的基因修饰淋巴细胞的方法通常包括将包含编码任何转基因例如car或淋巴增生性元件或在说明性实施例中，编码根据本文中所提供的car及淋巴增生性元件实施例中的任一个的car及淋巴增生性元件两者的一个或多个转录单元的聚核苷酸插入细胞中。可以提供这类car和淋巴增生性元件以支持本文中所提供的更短和更简化的方法，其可以支持在接触和任选的培育之后，修饰、基因修饰和/或转导的t细胞和/或nk细胞的扩增。因此，在本文中所提供的任何方法的例示性实施例中，可以从被基因修饰和/或转导的t细胞和/或nk细胞的内部的反转录病毒颗粒的基因组递送淋巴增生性元件，使得这些细胞具有本文中的淋巴增生性元件章节中所公开的增加的增殖和/或存活率的特征。在本文中所提供的任何方法的例示性实施例中，被基因修饰的t细胞或nk细胞能够在小鼠中体内移植和/或在小鼠中体内富集至少7、14或28天。所属领域的技术人员将认识到，这类小鼠可以被处理或以其它方式被基因修饰，使得在被基因修饰的t细胞和/或nk细胞之间的任何免疫学差异不会引起小鼠针对通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导的淋巴细胞的任何组分所引发的免疫反应。[0318]接触步骤中(例如当细胞和反转录病毒颗粒最初接触时)或本文中所提供的任何方面中(在任选的随后与反应混合物一起培育期间，所述反应混合物包括培养基中的悬浮液中的反转录病毒颗粒和细胞)可以包括的培养基或可以在细胞培养期间和/或在本文中所提供的任何方面中的各种洗涤步骤期间使用的培养基可以包括碱培养基，如用于离体t细胞和/或nk细胞培养的可商购的培养基。此类培养基的非限制性实例包括x-vivotm 15化学上定义的无血清造血细胞培养基(lonza)(2018目录号be02-060f、be02-00q、be-02-061q、04-744q或04-418q)、immunoculttm-xf t细胞扩增培养基(stemcell technologies)(2018目录号10981)、t细胞扩增xsfm(irvine scientific)(2018目录号91141)、aim 培养基ctstm(治疗性等级)(thermo fisher scientific(本文中被称为“thermo fisher”)，或ctstm optimizertm培养基(thermo fisher)(2018目录号a10221-01(基础培养基(瓶))和a10484-02(补充)，a10221-03(基础培养基(袋))、a1048501(基础培养基和补充试剂盒(瓶))和a1048503(基础培养基和补充试剂盒(袋))。此类培养基可以是按照cgmp制造的化学上定义的无血清制剂，如本文针对试剂盒组分所述。培养基可以是无外源的和完全的。在一些实施例中，基础培养基已被监管机构批准以用于离体细胞加工，如fda 510(k)批准的装置。在一些实施例中，培养基是具有或不具有2018目录号a1048501(ctstm optmizertm t细胞扩增sfm，瓶格式)或a1048503(ctstm optmizertm t细胞扩增sfm，袋格式)(两者均可从thermo fisher(马萨诸塞州沃尔瑟姆(waltham,ma))获得)的供应的t细胞扩增补充物的基础培养基。可以将如人类血清白蛋白、人类ab+血清和/或来源于受试者的血清等添加剂添加到转导反应混合物中。可以将支持性细胞因子(如il2、il7或il15，或在人类血清中发现的细胞因子)添加到转导反应混合物中。在某些实施例中，可以将dgtp添加到转导反应物中。[0319]在本文中的任何包括修饰淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)的步骤的方法的一些实施例中，可以在不进行预先活化的情况下使细胞与反转录病毒颗粒接触。在本文中的任何包括基因修饰t细胞和/或nk细胞的步骤的方法的一些实施例中，在一个实施例中，在转导之前，t细胞和/或nk细胞未在粘附到单核细胞的底物上培育超过4小时，或在另一实施例中，超过6小时或在另一实施例中，超过8小时。在一个说明性实施例中，在转导之前，在粘附性底物上培育t细胞和/或nk细胞过夜以去除单核细胞。在另一实施例中，所述方法可以包括在转导之前，在结合单核细胞的粘附性底物上培育t细胞和/或nk细胞不超过30分钟、1小时或2小时。在另一实施例中，在所述转导步骤之前，t细胞和/或nk细胞不暴露于通过在粘附性底物上培育来去除单核细胞的步骤。在另一实施例中，在接触步骤和/或修饰和/或基因修饰和/或转导步骤之前或期间，t细胞和/或nk细胞未与牛血清(如细胞培养牛血清，例如胎牛血清)一起培育或未暴露于牛血清。[0320]本文中所提供的用于修饰的方法中的一些或全部步骤或这类方法的用途是在封闭系统中进行。因此，这类方法中形成的反应混合物以及通过这类方法制备的被修饰的、被基因修饰和/或转导的淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)可以包含在这类封闭系统内。封闭系统是一种细胞处理系统，其通常对系统的用于处理和/或运输细胞的管和腔室外部的环境(如房间内的环境或甚至防护罩内的环境)封闭或完全封闭。对于细胞处理程序中的安全性和调控的一个最大风险是由于频繁暴露于环境而引起的污染风险，如在传统的开放式细胞培养系统中所发现。为了缓和此风险，尤其在不存在抗生素的情况下，已研发出致力于使用一次性(单次使用式)设备的一些商业方法。然而，即使在无菌条件下使用，打开烧瓶以取样或添加其它生长培养基始终存在污染风险。为了解决此问题，通常在封闭系统内进行本文中所提供的方法，其通常是离体方法。设计且可以操作这类方法使得产物不暴露于外部环境。通过无菌连接件(如无菌管和无菌焊接连接件)进行材料转移。用于气体交换的空气可以通过气体可渗透膜，通过0.2μm过滤器出现，以防止环境暴露。在一些说明性实施例中，对t细胞进行所述方法，例如以提供被修饰的且在说明性实施例中被基因修饰的t细胞。[0321]此类封闭系统方法可以使用可商购的器件来进行。可以在方法中的不同步骤中使用不同的封闭系统器件且可以使用管和连接件(如焊接、鲁尔(luer)、长钉或克拉维(clave)端口)在这些器件之间转移细胞以防止细胞或培养基暴露于环境。举例来说，可以将血液收集到iv袋或注射器中，任选地包括抗凝血剂，且在一些方面中转移到sepax 2器件(biosafe)中以用于pbmc富集和分离。在其它实施例中，可以使用白细胞减少过滤器总成来过滤全血以收集白细胞。可以将被分离的pbmc或被分离的白细胞转移到g-rex器件的腔室中以进行任选的活化、转导和任选的扩增。或者，可以在血液袋，例如用于收集血液的袋中转导所收集的血液。最终，可以使用sepax 2器件将细胞采集和收集到另一个袋子中。所述方法可以在任何适用于封闭系统t细胞和/或nk细胞产生的器件或器件组合中进行。这类器件的非限制性实例包括g-rex器件(wilson wolf)、gatherex(wilson wolf)、sepax 2(biosafe)、wave生物反应器(general electric)、cultilife细胞培养袋(takara)、permalife袋(origen)、clinimacs prodigy(miltenyi biotec)和vuelife袋(saint-gobain)。在说明性实施例中，任选的活化、转导和任选的扩增可以在封闭系统中的同一个腔室或容器中进行。举例来说，在说明性实施例中，腔室可以是g-rex器件的腔室且pbmc或白细胞可以在富集和分离之后转移到g-rex器件的腔室中，且可以保留在g-rex器件的同一个腔室中直到采集。[0322]本文中所提供的方法可以包括在血液和其中的细胞和/或其洗脱份以及淋巴细胞与反转录病毒颗粒接触之前或之后，在封闭系统内的容器之间转移血液和其中的细胞和/或其洗脱份以及淋巴细胞，因此其未发生环境暴露。封闭系统中使用的容器可以是例如管、袋子、注射器或其它容器。在一些实施例中，容器是用于研究设施的容器。在一些实施例中，容器是用于商业生产的容器。在其它实施例中，容器可以是用于血液收集过程的收集容器。本文中用于修饰的方法通常涉及其中淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的接触步骤。在一些实施例中，接触可以在容器中(例如，在血液袋内)进行。可以在封闭系统内将血液和其各种含有淋巴细胞的洗脱份从一个容器转移到另一个容器(例如从第一容器转移到第二容器)以进行接触。第二容器可以是封闭器件(如g-rex器件)的细胞处理室。在一些实施例中，在接触之后，可以将被修饰的且在说明性实施例中被基因修饰(例如，转导)的细胞转移到封闭系统内的不同容器中(即，不暴露于环境)。在此转移之前或之后，通常在封闭系统内洗涤细胞以去除基本上所有或所有反转录病毒颗粒。在一些实施例中，本文中所公开的方法(从收集血液到接触(例如转导)、任选的培育和培育后分离和任选的洗涤)进行作为范围的低端的15分钟、30分钟或1、2、3或4小时至作为范围的高端的4、8、10或12小时。[0323]本文详细地公开了该方法的各种实施例以及其它方面，例如通过这类方法制备的nk细胞和t细胞的用途。此外，用于转导、基因修饰和/或修饰pbmc、淋巴细胞、t细胞和/或nk细胞的这类方法方面的各种元件或步骤在本文中提供，例如在本章节和例示性实施例章节中提供，并且这类方法包括贯穿本说明书提供的实施例，如本文进一步讨论的。例如，用于转导、基因修饰和/或修饰pbmc或淋巴细胞(例如nk细胞或者在说明性实施例中t细胞)的任何方面的实施例，其例如在本章节和例示性实施例章节中提供，可以包括本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的任何实施例，包括那些包括本文公开的一种或多种淋巴增生性元件、car、假型化元件、对照元件、活化元件、膜结合细胞因子、mirna、kozak型序列、wpre元件、三重终止密码子和/或其它元件的实施例，并且可以与本文使用包装细胞生产反转录病毒颗粒的方法组合。在某些说明性实施例中，反转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。这类用于修饰、基因修饰和/或转导pbmc或淋巴细胞如t细胞和/或nk细胞的方法可以在体外或离体进行。本领域技术人员将认识到，本文提供的用于转导、基因修饰和/或修饰pbmc或淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)的细节可以适用于包括这类步骤的任何方面。[0324]在本文提供的方法中，将修饰的淋巴细胞和在说明性实施例中基因修饰的淋巴细胞，或在一些实施例中复制缺陷型反转录病毒颗粒(“rip”)引入或再引入(本文也被称为施用和再施用)到受试者中可以通过本领域已知的任何途径。基因修饰的淋巴细胞的这类引入或再引入通常包括将i)修饰的和/或ii)基因修饰的和/或iiia)转导的或iiib)转染的细胞悬浮在递送溶液中以形成可以被引入或再引入到受试者中的细胞制剂，如本文进一步详细讨论的。例如，rip的此类引入可以涉及将rip悬浮在递送溶液中以形成可以引入到受试者中的转导制剂。例如，引入或rips、淋巴细胞或修饰的淋巴细胞，或针对淋巴细胞或修饰的淋巴细胞的再引入，可以通过输注递送到受试者的血管中。在一些实施例中，对于淋巴细胞或修饰的淋巴细胞，rips或修饰的淋巴细胞(例如，t细胞和/或nk细胞)通过腹膜内施用、瘤内施用、肌内施用或在说明性实施例中通过皮下施用而施用或以其它方式引入或再引入回到受试者中。[0325]一些施用的细胞用编码淋巴增生性元件的核酸修饰。不受理论约束，在非限制性说明性方法中，将编码淋巴增生性元件的聚核苷酸(其可以整合至t细胞和/或nk细胞的基因组中)离体递送至静息t细胞和/或nk细胞提供了具有用于体内扩增的驱动子的细胞而无需使宿主经历淋巴细胞耗减。因此，在说明性实施例中，受试者在进行接触的1、2、3、4、5、6、7、10、14、21或28天内或1个月、2个月、3个月或6个月内、在接触期间和/或在将被修饰的t细胞和/或nk细胞再引回至受试者后的1、2、3、4、5、6、7、10、14、21或28天内或1个月、2个月、3个月或6个月内不暴露于淋巴细胞耗减剂。此外，在非限制性说明性实施例中，可以进行本文中所提供的方法而不在其中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒与受试者的静息t细胞和/或静息nk细胞接触的步骤期间和/或在整个离体方法期间使受试者暴露于淋巴细胞耗减剂。因此，体内扩增受试者中的被修饰的且在说明性实施例中被基因修饰的t细胞和/或nk细胞的方法是本公开的一些实施例的特征。在说明性实施例中，这类方法是离体无传播的或基本上无传播的。[0326]本文中所提供的任何方面的非限制性说明性实施例中的此整个方法/过程(从受试者抽血到在离体转导t细胞和/或nk细胞之后将修饰的和在说明性实施例中基因修饰的淋巴细胞再引回到受试者中)可以进行小于48小时、小于36小时、小于24小时、小于12小时、小于11小时、小于10小时、小于9小时、小于8小时、小于7小时、小于6小时、小于5小时、小于4小时、小于3小时、2小时或小于2小时的时间段。在本文公开的任何实施例中，修饰的淋巴细胞的引入或再引入可以通过静脉内注射、腹膜内施用、皮下施用、肿瘤内施用或肌内施用进行。在其它实施例中，本文中的非限制性说明性实施例中的整个方法/过程(从受试者抽血/收集血液到在离体转导t细胞和/或nk细胞之后将修饰的淋巴细胞再引回到受试者中)进行1小时至12小时，2小时至8小时，1小时至3小时，2小时至4小时，2小时至6小时，4小时至12小时，4小时至24小时，8小时至24小时，8小时至36小时，8小时至48小时，12小时至24小时，12小时至36小时，或12小时至48小时的时间段，或进行作为范围的低端的15、30、60、90、120、180和240分钟至作为范围的高端的120、180和240、300、360、420和480分钟的时间段。在其它实施例中，整个方法/过程(从受试者抽血/收集血液到在离体转导t细胞和/或nk细胞之后将修饰的和在说明性实施例中基因修饰的淋巴细胞再引回到受试者中)进行作为范围的低端的1、2、3、4、6、8、10和12小时至作为范围的高端的8、9、10、11、12、14、18、24、36或48小时的时间段。在一些实施例中，被修饰的和被基因修饰的t细胞和/或nk细胞是在进行接触的时间段后从未缔合的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒分离。[0327]因为本文中所提供的用于修饰淋巴细胞的方法和用于进行过继性细胞疗法的相关方法与先前方法相比可以在显著更短的时间内进行，因此有可能从根本上改善患者护理和安全性以及产品可制造性。因此，在负责批准在体内进行用于治疗性目的时的这类方法的管理机构看来，这类方法预期是有利的。举例来说，在将被修饰的t细胞和/或nk细胞再引入至患者中之前，在本文中所提供的任何包括受试者的方面的非限制性实例中的受试者可以在整个样品处理期间保持在与处理其血液或样品的仪器相同的建筑(例如输注诊所)或房间中。在非限制性说明性实施例中，在从受试者进行血液抽取/收集到在离体转导t细胞和/或nk细胞之后将血液再引入至受试者的整个方法/过程中，受试者保持在位置线内和/或距其正被处理的血液或细胞的100、50、25或12英尺或臂的距离内。在其它非限制性说明性实施例中，在从受试者进行血液抽取/收集到在离体转导t细胞和/或nk细胞之后将血液再引入至受试者的整个方法/过程中和/或连续地，受试者保持清醒和/或至少一个人可以持续监测受试者的正被处理的血液或细胞。因为本文中所提供的改善，用于过继性细胞疗法和/或转导静息t细胞和/或nk细胞的从受试者进行血液抽取/收集到在离体转导t细胞和/或nk细胞之后将血液再引入至受试者的整个方法/过程可以与人类的连续监测一起进行。在其它非限制性说明性实施例中，在从受试者进行血液抽取/收集到在离体转导t细胞和/或nk细胞之后将血液再引入至受试者的整个方法/过程的任何点处，都不会在无人存在的房间中培育血细胞。在其它非限制性说明性实施例中，从受试者进行血液抽取/收集到在离体转导t细胞和/或nk细胞之后将血液再引入至受试者的整个方法/过程是紧挨着受试者和/或与受试者在相同的房间中和/或紧挨着受试者的床或椅子上进行。因此，可以避免样品一致性混乱，以及避免超过数天或数周的长且昂贵的培育。本文中所提供的方法容易地适用于封闭和自动化血液处理系统的事实进一步证实此优点，其中将再引入至受试者中的血液样品和其组分仅与一次性、单次使用式组分进行接触。[0328]本文中所提供的用于修饰、基因修饰和/或转导淋巴细胞(如t细胞和/或nk细胞)的方法可以是用于进行过继性细胞疗法的方法的一部分。通常，用于进行过继性细胞疗法的方法包括从受试者收集血液和将被修饰的、被基因修饰和/或转导的淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)返回受试者的步骤。本公开提供使用car的各种治疗方法。当存在于t淋巴细胞或nk细胞中时，本公开的car可以介导针对靶细胞的细胞毒性。本公开的car结合于存在于靶细胞上的抗原，由此通过被基因修饰以产生car的t淋巴细胞或nk细胞介导靶细胞的杀伤。car的astr结合于存在于靶细胞的表面上的抗原。本公开提供用于杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长的方法，所述方法涉及接触被基因修饰以产生主题car的细胞毒性免疫效应细胞(例如细胞毒性t细胞或nk细胞)，使得t淋巴细胞或nk细胞识别存在于靶细胞的表面上的抗原且介导靶细胞的杀伤。举例来说，靶细胞可以是癌细胞且在一些说明性实施例中，本文中的自体细胞疗法方法可以是用于治疗癌症的方法。在这些实施例中，受试者可以是怀疑患有癌症的动物或人类，或更典型地，已知患有癌症的受试者。在用于治疗pdl-1阳性癌症的一些实施例中，以及在pdl-1阳性弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)的说明性实施例中，基因修饰的细胞可以与抗pdl-1抗体或抗体模拟物组合施用。[0329]在一些说明性实施例中，通过输注到静脉或动脉中将细胞引入或再引入到受试者，特别是当嗜中性粒细胞不存在于已经与反转录病毒颗粒接触并准备再引入的淋巴细胞的制备物中时，或通过皮下、肿瘤内或肌内施用，对于其中待施用的细胞制剂中的至少1％、2％、3％、4％、5％、7.5％、10％、15％、20％或25％的细胞，或1％至90％、1％至75％、1％至50％、1％至25％、1％至20％、1％至10％、5％至90％、5％至75％、5％至50％、5％至25％、5％至20％、5％至10％、10％至90％、10％至75％、10％至50％、10％至25％、或10％至20％的细胞是嗜中性粒细胞的实施例。这类实施例可以包括与透明质酸酶联合施用或顺序施用，如本文进一步详细讨论的。在本文公开的任何实施例中，存在于本文提供的细胞制剂中并任选地再输注或在说明性实施例中皮下递送到受试者中的淋巴细胞的数目，且在说明性实施例中修饰的t细胞和/或nk细胞的数目可以在作为范围的低端的1×103、2.5×103、5×103、1×104、2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106和1×107个细胞/kg至作为范围的高端的5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106、2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107、1×108、1×109和1×1010个细胞/kg之间。在某些实施例中，存在于本文的细胞制剂中并任选地再输注或以其它方式递送到受试者中的淋巴细胞的数目，且在说明性实施例中修饰的t细胞和/或nk细胞的数目可以在作为范围的低端的1×104、2.5×104、5×104和1×105个细胞/kg至作为范围的高端的2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106、1×107、2.5×107、5×107和1×108个细胞/kg之间，或者在作为范围的低端的1×104个细胞/kg至作为范围的高端的2.5×104、5×104、1×105、2.5×105、5×105、1×106、1×107、2.5×107、5×107和1×108个细胞/kg之间。在一些实施例中，存在于本文的细胞制剂中并任选地再输注或肿瘤内、肌内、皮下或以其它方式递送到受试者中的淋巴细胞的数目，且在说明性实施例中t细胞和/或nk细胞的数目可以在作为范围的低端的5×105、1×106、2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107和1×108个细胞至作为范围的高端的2.5×106、5×106、1×107、2.5×107、5×107、1×108、2.5×108、5×108和1×109个细胞之间。在一些实施例中，存在于本文的细胞制剂中并可用于输注、再输注或其它递送手段(例如皮下递送)到70kg受试者或患者中的淋巴细胞的数目，且在说明性实施例中t细胞和/或nk细胞的数目为7×105至2.5×108个细胞。在其它实施例中，存在于本文的细胞制剂中且可用于转导的淋巴细胞的数目，且在说明性实施例中t细胞和/或nk细胞的数目为约7×106加或减10％。[0330]在本文提供的包括t细胞、nk细胞、b细胞或干细胞的任何实施例和方面中，细胞可以是自体细胞或同种异体细胞。在一些实施例中，同种异体细胞可以是基因工程改造的同种异体细胞。同种异体细胞，例如同种异体t细胞，和用于基因工程化同种异体细胞的方法是本领域中已知的。在其中同种异体细胞是t细胞的一些实施例中，t细胞已经被基因工程改造，使得tcr复合物的至少一种组分在功能上受损和/或至少部分缺失。在一些实施例中，t细胞已经被基因工程改造，使得tcr复合物的至少一种组分的表达已经被降低或消除。在一些实施例中，可以修饰同种异体细胞，使得其缺失全部或部分b2微球蛋白基因。在一些实施例中，同种异体细胞可以包括本文公开的任何淋巴增生性元件和/或cle。使用淋巴增生性元件和cle可以减少期望的细胞数量，并且可以便于t细胞、nk细胞、b细胞或干细胞的细胞制造。在一些实施例中，同种异体细胞可以是永生化细胞。在本文的包括同种异体细胞的任何方面或实施例中，可以消除包括采集血液或使细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触的步骤。例如，为了用同种异体car-t细胞治疗受试者，t细胞可能先前已经被基因修饰，并且将基因修饰的同种异体car-t细胞施用于受试者而不从受试者采集血液。在一些实施例中，同种异体细胞被皮下施用。在一些实施例中，同种异体细胞被静脉内施用。在一些实施例中，同种异体细胞被腹膜内施用。[0331]在本文中所提供的任何用于修饰淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)的方法和涉及使用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(rip)制造用于修饰受试者的t细胞和/或nk细胞的试剂盒的方面的一些实施例中，将被修饰的、被基因修饰和/或转导的淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)或其群体或本文提供的不含细胞的组合物(例如gmp rip组合物)中的rip引入或再引入受试者中。可以通过所属领域中已知的任何途径将被修饰的且在说明性实施例中被基因修饰的淋巴细胞引入或再引入受试者中。例如，引入或再引入可以是通过输注递送到受试者的血管中。肿瘤内、腹膜内、肌内，以及在某些说明性实施例中，皮下。在一些实施例中，被修饰的、被基因修饰和/或转导的淋巴细胞(例如，t细胞和/或nk细胞)或其群体在被引入或再引入受试者中之前离体经历4次或更少的细胞分裂。在一些实施例中，这类方法中使用的淋巴细胞是静息t细胞和/或静息nk细胞，其与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触1小时至12小时。在一些实施例中，从受试者收集血液的时间与将被修饰的和/或被基因修饰的t细胞和/或nk细胞配制成用于递送和/或再引入受试者中的时间之间相距不超过12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、2小时或1小时。在一些实施例中，在收集血液之后及再引入血液之前的所有步骤都是在封闭系统中进行，其中在整个处理期间人工监测封闭系统。[0332]在本文中所公开的方法和组合物的一些实施例中，将被修饰的且在说明性实施例中被基因修饰的t细胞和/或nk细胞引回、再引入或再输注或以其它方式递送至受试者中而不进行其它离体操作，如刺激和/或活化t细胞和/或nk。在先前技术方法中，离体操作用于刺激/活化t细胞和/或nk细胞，且用于在将被基因修饰的t细胞和/或nk细胞引入受试者中之前扩增被基因修饰的t细胞和/或nk细胞。在先前技术方法中，此通常花费数天或数周，且需要受试者在初始抽血之后返回诊所以进行数天或数周的血液输注。在本文中所公开的方法和组合物的一些实施例中，在t细胞和/或nk细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，t细胞和/或nk细胞并不通过暴露于单独的抗cd3或抗cd3与通过例如抗cd28的共刺激组合，在溶液中或附着于固体载体(如，例如涂有抗cd3/抗cd28的珠粒)而被离体刺激。因此，本文中提供一种离体无传播方法。在其它实施例中，被修饰的且在说明性实施例中被基因修饰的t细胞和/或nk细胞并不离体扩增，或仅扩增较小数目的细胞分裂(例如1、2、3、4或5轮细胞分裂)，而相反是体内(即在受试者内)扩增或主要在体内扩增。在一些实施例中，不添加额外的培养基以允许细胞的进一步扩增。在一些实施例中，在原代血液淋巴细胞(pbl)与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触时，不发生pbl的细胞制造。在说明性实施例中，当pbl离体时不发生pbl的细胞制造。在传统的过继性细胞疗法的方法中，受试者在再输注被基因修饰的t细胞和/或nk细胞之前经历淋巴细胞耗减。在一些实施例中，患者或受试者在输注或再输注被修饰的和或被基因修饰的t细胞和/或nk细胞之前未经历淋巴细胞耗减。然而，本文中所公开的方法和组合物的实施例也可以用于被预活化或被预刺激的t细胞和/或nk细胞。在一些实施例中，在使t细胞和/或nk细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前可以通过在有或没有抗cd28固体载体的情况下暴露于抗cd3来离体刺激t细胞和/或nk细胞。在一些实施例中，在t细胞和/或nk细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，可以使t细胞和/或nk细胞暴露于抗cd3/抗cd28固体载体小于1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、或24小时，包括不暴露。在说明性实施例中，在t细胞和/或nk细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触之前，可以使t细胞和/或nk细胞暴露于抗cd3/抗cd28固体载体小于1、2、3、4、6或8小时。[0333]通过阳性选择富集t细胞和/或nk细胞[0334]在一些实施例中，细胞混合物、细胞制剂或反应混合物中可用于过继细胞疗法的任何细胞，本文中被称作期望的细胞，例如t细胞和/或nk细胞的一种或多种细胞群体，可以在配制用于递送之前被富集。在一些实施例中，期望的细胞可以在与重组核酸载体如复制缺陷型反转录病毒颗粒接触之前通过阳性选择被富集。在其它实施例中，期望的细胞可以在细胞混合物、细胞制剂或反应混合物与重组核酸载体如复制缺陷型反转录病毒颗粒接触后通过阳性选择被富集。在一些实施例中，富集一个或多个细胞群体可以与本文公开的任何基因修饰的方法同时进行，并且在说明性实施例中，用复制缺陷型反转录病毒颗粒进行基因修饰。[0335]单核细胞(如pbmc)或tnc可以分别通过密度梯度离心或白细胞减少过滤器总成的反向灌注从更复杂的细胞混合物如全血中分离，如本文更详细所述。在一些实施例中，期望的细胞可以具有特定的细胞谱系，例如nk细胞、t细胞和/或t细胞子集，包括初始的效应、记忆性、抑制性t细胞和/或调节性t细胞，并且可以通过选择表达一种或多种表面分子的细胞来富集。在说明性实施例中，一种或多种表面分子可以包括cd4、cd8、cd16、cd25、cd27、cd28、cd44、cd45ra、cd45ro、cd56、cd62l、ccr7、kir、foxp3和/或tcr组分如cd3。使用与针对一种或多种表面分子的抗体缀合的珠粒的方法可以用于使用基于磁性、密度和大小的分离来富集期望的细胞。[0336]在这类基于抗体的阳性选择方法的过程中，一种或多种细胞表面分子的结合可以导致信号转导和结合细胞的生物学的改变。例如，使用附着有cd3抗体的珠粒选择t细胞可能会导致cd3信号转导和t细胞活化。在其它实例中，结合和信号转导可能导致细胞的进一癌细胞的杀伤。car-癌细胞可以导致癌症的复发，且对car-t具有免疫力，即使在最初使用car-t成功治疗后(参见，例如，ruella等人，《自然医学(nat med.)》2018年10月；24(10):1499-1503)。本文提供的用于消耗不合需要的癌细胞的方法和组合物克服了对从癌症患者分离的细胞(例如血细胞或pbmc)进行基因修饰所带来的这种风险。[0342]通过将细胞混合物与固定的单核细胞结合底物(如标准塑料组织培养板、尼龙或玻璃棉或葡聚糖凝胶树脂)培育，可以耗尽单核细胞。不受理论的限制，与细胞混合物中以较低的频率或强度粘附或根本不粘附的其它细胞相比，单核细胞优先粘附于固定的单核细胞结合底物。在一些实施例中，培育可以在37℃下进行至少1小时，或通过使细胞混合物通过树脂进行。在培育后，收集悬浮液中所需的非粘附细胞用于进一步处理。在本文提供的淋巴细胞的快速离体处理的说明性实施例中，全血、tnc或pbmc不与固定的单核细胞结合底物一起培育至少8、7、6、5、4、3、2或1小时，并且单核细胞不会被这类培育耗尽。[0343]在说明性实施例中，本文的方法包括通过使用本领域已知的用于去除这类细胞的方法对表达一种或多种表面分子的细胞进行阴性选择来耗尽不合需要的细胞。在说明性实施例中，表面分子是肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原，或以其它方式在癌细胞如循环肿瘤细胞上表达。在一些实施例中，表面分子可以包括axl、ror1、ror2、her2(erbb2)、前列腺干细胞抗原(psca)、psma(前列腺特异性膜抗原)、b细胞成熟抗原(bcma)、甲胎蛋白(afp))、癌胚抗原(cea)、癌抗原125(ca-125)、ca19-9、钙调蛋白、嗜铬粒蛋白、蛋白melan-a(t淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；mart-1)、myo-d1、肌肉特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(nse)、muc-1、上皮膜蛋白(ema)、上皮肿瘤抗原(eta)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(mage)、mage-al、高分子量-黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶m2型的二聚体形式(肿瘤m2-pk)、cd19、cd20、cd22、cd23、cd24、cd27、cd30、cd33、cd34、cd37、cd38、cd40、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd45、cd70、cd99、cd117、cd123、cd138、cd171、gd2(神经节苷脂g2)、epha2、cspg4、fap(成纤维细胞活化蛋白)、κ、λ、5t4、αvβ6整合素、整合素αvβ3(cd61)、半乳素、k-ras(v-ki-ras2 kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因)、ral-b、b7-h3、b7-h6、caix、egfr、egp2、egp40、epcam、胎儿achr、frα、gd3、hla-a1+mage1、hla-a1+ny-eso-1、hla-dr、il-11rα、il-13rα2、lewis-y、muc16、ncam、nkg2d配体、prame、生存素、tag72、tems、vegfr2、egfrviii(表皮生长因子变体iii)、精子蛋白17(sp17)、间皮素、pap(前列腺酸性磷酸酶)、prostein、tarp(t细胞受体γ交替阅读框蛋白)、trp-p8、steap1(前列腺六跨膜上皮抗原1)、异常ras蛋白或异常p53蛋白、纽约食管鳞状细胞癌抗原(nyeso1)或pdl-1。在另外的说明性实施例中，表面分子是血癌抗原，例如cd19、cd20、cd22、cd25、cd32、cd34、cd38、cd123、bcma、taci或tim3。[0344]在一些实施例中，可以通过基于珠粒或柱的分离从细胞混合物(例如全血、pbmc或tnc)中去除不合需要的细胞。在这些实施例中，针对细胞表面分子的配体或抗体附着在珠粒或柱上。在一些实施例中，在去除不合需要的细胞的方法中，附着于珠粒的抗体可以结合与所使用的car(例如由t细胞和/或nk细胞表达的car)相同的抗原。在一些实施例中，附着于珠粒的抗体可以结合与car相同抗原的不同表位，所述car稍后将在患者体内表达。在说明性实施例中，附着于珠粒的抗体可以结合与car相同抗原的相同表位。在一些实施例中，珠粒可以具有多于一种的附着的抗体，该抗体结合至不合需要的细胞的表面上的抗原。在一些实施例中，可以组合使用附着有不同抗体的珠粒。在一些实施例中，珠粒可以是磁珠。在一些实施例中，在将细胞混合物与带有附着的抗体的磁珠培育后，可以通过磁分离来耗尽不合需要的细胞。在一些实施例中，珠粒不是磁性的。[0345]在一些实施例中，通过抗体包被的珠粒从细胞混合物(例如全血、pbmc或tnc)中耗尽表达一种或多种表面分子的不合需要的细胞，并按大小分离。在一些实施例中，珠粒是聚苯乙烯。在说明性实施例中，珠粒的直径为至少约30μm、约35μm、约40μm、约50μm、约60μm、约70μm或约80μm。在一些实施例中，在重组核酸载体(其在说明性实施例中为复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)与细胞混合物一起培育期间，将抗体包被的珠粒加入到细胞混合物中。在这些实施例中，形成包括以下的反应混合物：(a)细胞混合物，例如来自全血、富集的tnc或富集的pbmc的细胞混合物；(b)重组核酸载体，如复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其编码感兴趣的转基因，如car；和(c)结合至一种或多种表面分子或抗原的抗体包被的珠粒，所述表面分子或抗原在不合需要的细胞的表面上表达。在一些实施例中，反应混合物可以培育少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或45分钟或少于1、2、3、4、5、6、7或8小时。在一些实施例中，在培育后，可以进行基于密度梯度离心的细胞富集程序，以富集耗尽了与将要沉淀的抗体包被的珠粒复合的不合需要的细胞的总单核细胞。在其它实施例中，反应混合物可以通过较大直径网孔的预过滤器，以耗尽与抗体包被的珠粒复合的不合需要的细胞。在一些实施例中，过滤器可以具有比珠粒的直径小或者小约5μm、10μm或15μm的孔径。在其它实施例中，珠粒可以是磁珠，并且预过滤器可以是磁体。这类过滤器可以捕获结合到珠粒上的不合需要的细胞，并允许期望的细胞向下游流动到具有较小孔径的白细胞减少过滤器总成。[0346]在一些实施例中，通过红细胞抗体玫瑰花结疗法(ea-玫瑰花结疗法)从含有淋巴细胞和红细胞的细胞混合物如全血中耗尽或除去不合需要的细胞。在ea-玫瑰花结疗法中，与不合需要的细胞的细胞表面上的抗原结合的抗体与细胞混合物一起培育，以将不合需要的细胞交联成红细胞，然后通过密度梯度离心将红细胞与期望的细胞分离，如在rosetteseptm试剂盒(干细胞技术(stemcell technologies))中所提供的。在一些实施例中，在重组核酸载体(其在说明性实施例中是复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)与细胞混合物一起培育的时间期间，将介导ea-玫瑰花结疗法的抗体加入到细胞混合物中。在说明性实施例中，形成包含以下的反应混合物：(a)淋巴细胞和红细胞的细胞混合物，例如来自全血；(b)编码感兴趣的转基因的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，和在另外的说明性实施例中car；(c)针对不合需要的细胞的表面上的抗原的第一抗体，例如肿瘤抗原，例如血癌抗原cd19、cd20、cd22、cd25、cd32、cd34、cd38、cd123、bcma、taci或tim3；(d)针对红细胞的表面上的抗原的第二抗体，如血型糖蛋白a；和(e)使第一抗体和第二抗体交联的第三抗体。在另外的说明性实施例中，反应混合物可以包括针对不合需要的细胞的表面上的多于一种抗原的抗体。在一些实施例中，抗体可以结合至与car相同的抗原。在一些实施例中，将该反应混合物培育少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或45分钟或少于1、2、3、4、5、6、7或8小时。在说明性实施例中，在培育后，进行基于密度梯度离心的pbmc富集程序，以分离总pbmc减去将与红细胞一起沉淀的通过ea-玫瑰花结疗法耗尽或去除的群体。[0347]如上所述，在配制和/或递送至受试者之前，通过在本文提供的方法中包括通过从细胞混合物中进行阴性选择来阳性选择或耗尽癌细胞的步骤，在细胞处理期间通过富集t和/或nk细胞，可以使用编码工程改造的t细胞受体或car的重组核酸载体对癌细胞的基因修饰最小化。在本文中公开了几种降低用工程改造的t细胞受体构建体或car构建体基因修饰的癌细胞的潜在效应的额外方法。例如，t细胞特异性启动子(本文其它地方公开)可以用于表达car，并且可以有助于防止含有编码car的外源核酸的非t细胞实际表达car。因此，抗原不会被以顺式表达的car掩蔽，并且car-t细胞可以结合至含有编码car的外源核酸的靶细胞并且杀死含有编码car的外源核酸的靶细胞。此外，使用用于表达经工程改造的t细胞受体或car的t细胞特异性启动子有助于减少、最小化或在说明性实施例中基本上消除或甚至消除经工程改造的t细胞受体或car在包封核酸载体例如rir反转录病毒颗粒或病毒样颗粒中的表达，因为用于制造包封核酸载体的细胞系中经工程改造的t细胞受体或car的表达减少、很低、可忽略、基本上没有或没有。在说明性实施例中，此类表达在包封核酸载体(例如，rir颗粒或病毒样颗粒)的表面上减少、基本消除或消除。[0348]另一种降低car-癌细胞的潜在效应的方法是使用两种或更多种单独的car，并且在说明性实施例中在两种细胞群体中表达的两种car，来杀死可能掩蔽表位之一的靶细胞。细胞群体，如血细胞或pbmc，分别进行基因修饰，因此每个群体表达第一car或第二car。在说明性实施例中，表达第一或第二car的靶细胞不掩蔽第二和第一car分别结合的表位。因此，表达第一或第二car的靶细胞可以分别被表达第二或第一car的效应t细胞或nk细胞杀死。在一些实施例中，第一和第二car可以结合至在靶细胞上表达的相同抗原的不同表位。在其它实施例中，第一和第二car可以结合至在相同靶细胞上表达的不同抗原，包括本文其它地方公开的任何抗原。在一些实施例中，第一和第二car可以结合至选自cd19、cd20、cd22、cd25、cd32、cd34、cd38、cd123、bcma、taci或tim3的不同抗原的不同表位或不同抗原。在另外的说明性实施例中，第一car可以结合至cd19，并且第二car可以结合至cd22，两者都在b细胞上表达。在其它实施例中，car可以是癌症抗原的胞外配体。在说明性实施例中，分别配制修饰的细胞群体。在一些实施例中，将单独的细胞制剂在体内的不同位点处引入或再引回到受试者中。在一些实施例中，将单独的细胞制剂在相同位点单独引入或再引入回到受试者中。在其它实施例中，将修饰的细胞群体组合成一种制剂，其任选地在相同位点处被引入或再引回到受试者中。在其中细胞群体被组合的说明性实施例中，细胞群体直到洗涤步骤之后才被组合，在洗涤步骤中，细胞被从重组核酸载体上洗掉。通过使用两种或更多种不同car的这种方法，表达第一或第二car的car-癌细胞将被分别表达第二或第一car的car-t细胞杀死，所述第一或第二car以顺式方式结合并掩蔽其同源表位。[0349]在一些实施例中，不需要的细胞可以被耗尽，使得不需要的细胞包含细胞混合物、细胞制剂或反应混合物中最多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞。在一些实施例中，不需要的细胞可以被耗尽，使得不需要的细胞包含作为范围低端的细胞混合物、细胞制剂或反应混合物中1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％或40％的细胞至作为范围高端的细胞混合物、细胞制剂或反应混合物中10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞。在一些实施例中，不需要的细胞可以被耗尽，使得不需要的细胞包含细胞混合物、细胞制剂或反应混合物中10％至90％、20％至90％、30％至90％、40％至90％、40％至80％、45％至75％、1％至14％、2％至14％、3％至14％、4％至14％、5％至14％、5至13％、5％至12％、5％至11％或5％至10％的细胞。[0350]经工程改造的信号传导多肽[0351]在一些实施例中，用于接触t细胞和/或nk细胞的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒具有聚核苷酸或核酸，其具有一个或多个编码一种或多种经工程改造的信号传导多肽的转录单元。在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽包括胞外结构域(例如，抗原特异性靶向区或astr)、柄和跨膜结构域的任何组合，与一个或多个胞内活化结构域、任选的一个或多个调节结构域(如共刺激结构域)和任选的一个或多个t细胞存活模体组合。在说明性实施例中，经工程改造的信号传导多肽中的至少一个、两个或全部是嵌合抗原受体(car)或淋巴增生性元件(le)，如嵌合淋巴增生性元件(cle)。在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽中的至少一个、两个或全部是经工程改造的t细胞受体(tcr)。在一些实施例中，当利用两个信号传导多肽时，一个编码淋巴增生性元件且另一个编码包括抗原特异性靶向区(astr)、跨膜结构域和胞内活化结构域的嵌合抗原受体(car)。关于本文中所公开的经工程改造的信号传导多肽的任何结构域，例示性序列可见于wo 2019/055946中，其以全文引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员应认识到，这类经工程改造的多肽也可以称为重组多肽。本文中所提供的经工程改造的信号传导多肽(如car、经工程改造的tcr、le和cle)通常相对于使用本文中所提供的方法和组合物工程改造的淋巴细胞，尤其t细胞和nk细胞且最尤其t细胞和/或nk细胞来说是转基因，以表达这类信号传导多肽。[0352]胞外结构域[0353]在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽包括胞外结构域，其为特异性结合对的成员。举例来说，在一些实施例中，胞外结构域可以是细胞因子受体或其突变体或激素受体或其突变体的胞外结构域。这类突变型胞外结构域在一些实施例中经报导在至少一些细胞类型中表达时为组成性活性的。在说明性实施例中，这类胞外结构域及跨膜结构域不包括配体结合区。相信，这类结构域在存在于经工程改造的信号传导多肽中且表达于b细胞、t细胞和/或nk细胞中时不结合配体。这类受体突变体中的突变可发生于胞外近膜区中。不受理论约束，本文提供的经工程改造的信号传导多肽的至少一些胞外结构域(及一些胞外-跨膜结构域)中的突变通过使通常不在一起的活化链集合在一起而在不存在配体的情况下负责经工程改造的信号传导多肽的信号传导。关于包含胞外结构域中的突变的胞外结构域的另外的实施例可发现于例如本文中的淋巴增生性元件章节中。[0354]在某些说明性实施例中，胞外结构域包含二聚模体。在说明性实施例中，二聚模体包含亮氨酸拉链。在一些实施例中，亮氨酸拉链是来自jun多肽，例如c-jun。关于包含二聚模体的胞外结构域的其它实施例可发现于例如本文中的淋巴增生性元件章节中。[0355]在某些实施例中，胞外结构域为抗原特异性靶向区(astr)，有时在本文中称为抗原结合结构域。特异性结合对包括(但不限于)抗原-抗体结合对；配体-受体结合对；等。因此，适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽的特异性结合对的成员包括astr，所述astr是抗体、抗原、配体、配体的受体结合结构域、受体、受体的配体结合结构域和替代的非抗体支架，在本文中也被称为抗体模拟物。在本文提供的包括astr的任何方面或实施例中，astr可以是合适的抗体模拟物。在一些实施例中，抗体模拟物可以是亲和体、亲和素、亲和聚体、亲和丁、阿尔法体、alphamab、抗运载蛋白、armadillo重复蛋白、三聚体、亲和多聚体(也被称为亲合力多聚体)、c型凝集素结构域、半胱氨酸结小蛋白、环肽、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白-4、darpin(设计的锚蛋白重复蛋白)、纤维蛋白原结构域、纤连蛋白结合结构域(fn3结构域)(例如，附着蛋白或单克隆抗体)、fynomer、扭结菌素、kunitz结构域肽、富含亮氨酸的重复结构域、脂质运载蛋白结构域、mab 2或fcabtm、纳米抗体、纳米钳、obody、pronectin、单链tcr、三角形四肽重复结构域或v样结构域。在本文提供的包括作为抗体的astr(例如scfv)的任何方面或实施例中，可以使用合适的抗体模拟物来代替抗体。[0356]适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的astr可为任何抗原结合多肽。在某些实施例中，astr为抗体，如全长抗体、单链抗体、fab片段、fab'片段、(fab')2片段、fv片段，以及二价单链抗体或双功能抗体。[0357]在一些实施例中，astr为单链fv(scfv)。在一些实施例中，重链位于经工程改造的信号传导多肽中的轻链的n端。在其它实施例中，轻链位于经工程改造的信号传导多肽中的重链的n端。在任何所公开的实施例中，重链及轻链可由连接子隔开，如本文中更详细论述。在任何所公开的实施例中，重链或轻链可在经工程改造的信号传导多肽的n端且通常为另一结构域(如信号序列或信号肽)的c端。[0358]其它基于抗体的识别结构域(cab vhh(骆驼抗体可变结构域)及人类化版本，ignar vh(鲨鱼抗体可变结构域)及人类化版本，sdab vh(单一结构域抗体可变结构域)及“骆驼化”抗体可变结构域)适宜与经工程改造的信号传导多肽一起使用且适用于使用本公开的经工程改造的信号传导多肽的方法中。在一些情况下，基于t细胞受体(tcr)识别结构域。[0359]天然存在的t细胞受体包括α亚基和β亚基，其分别由t细胞的基因组中的独特重组事件产生。可以筛选tcr的文库对靶抗原(例如本文公开的任何抗原)的选择性。筛选天然和/或工程改造的tcr可以鉴定对靶抗原具有高亲和力和/或反应性的tcr。可以选择、克隆这类tcr，并且编码这类tcr的聚核苷酸可以被包含在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中，以基因修饰淋巴细胞，或在说明性实施例中，t细胞或nk细胞，使得淋巴细胞表达工程改造的tcr。在一些实施例中，tcr可以是单链tcr(sctv，包含vαvβ的单链双域tcr)。[0360]本文中的任何包括car的方面或实施例的某些实施例包括具有经工程改造以共同选择内源性tcr信号传导复合物和cd3z信号传导路径的胞外结构域的car。在一个实施例中，嵌合抗原受体astr与一个内源性tcr复合物链(例如tcrα、cd3e等)融合以促进并入tcr复合物中和通过内源性cd3z链进行信号传导。在其它实施例中，car含有结合于tcr复合物的第一scfv或蛋白质和结合于目标抗原(例如肿瘤抗原)的第二scfv或蛋白质。在另一实施例中，tcr可以是单链tcr(sctv，含有vαvβ的单链双域tcr)。最终，还可以产生scfv以识别特异性mhc/肽复合物，由此充当替代性tcr。这类肽/mhc scfv结合物可以按与car类似的许多构型使用。[0361]在一些实施例中，astr可为多特异性的，例如双特异性抗体。多特异性抗体具有针对至少两个不同位点的结合特异性。在某些实施例中，结合特异性中的一种是针对一种目标抗原且另一种是针对另一种目标抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可结合至目标抗原的两个不同的抗原决定基。双特异性抗体也可以用于将细胞毒剂定位至表达目标抗原的细胞中。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段。[0362]适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽或工程改造的tcr中的astr可具有多种抗原结合特异性。在一些情况下，抗原结合结构域对于由靶细胞表达(由其合成)的抗原中存在的抗原决定基具有特异性。在一个实例中，靶细胞为癌细胞相关的抗原。癌细胞相关的抗原可以为与以下相关的抗原：例如乳腺癌细胞、b细胞淋巴瘤细胞，如弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤、肺癌细胞(例如，小细胞肺癌细胞)、淋巴瘤细胞、非霍奇金b细胞淋巴瘤(b-nhl)细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤细胞、肺癌细胞(例如小细胞肺癌细胞)、黑色素瘤细胞、白血病细胞、慢性髓性白血病(cml)细胞、慢性淋巴细胞性白血病(cll)细胞、急性髓性白血病(aml)细胞、急性淋巴细胞性白血病(all)细胞、神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、结肠直肠癌细胞等。癌细胞相关的抗原也可以由非癌细胞表达。在一些实施例中，癌细胞是pdl-1阳性癌细胞。在说明性实施例中，癌细胞是pdl-1阳性dlbcl细胞。在一些实施例中，癌细胞是pdl-1阴性细胞。在说明性实施例中，癌细胞是pdl-1阴性dlbcl细胞。[0363]经工程改造的信号传导多肽的astr可以结合至其或经工程改造的t细胞受体可以结合至其的抗原的非限制性实例包括肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原。在一些实施例中，肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原是axl、ror1、ror2、her2(erbb2)、前列腺干细胞抗原(psca)、psma(前列腺特异性膜抗原)、b细胞成熟抗原(bcma)、α-胎蛋白(afp)、癌胚性抗原(cea)、癌症抗原-125(ca-125)、ca19-9、钙网膜素、嗜铬粒蛋白、蛋白黑色素-a(由t淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；mart-1)、myo-d1、肌特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(nse)、muc-1、上皮膜蛋白(ema)、上皮肿瘤抗原(eta)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(mage)、mage-al、高分子量-黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)、胎盘碱性磷酸酶，突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同功酶型的二聚体形式m2(肿瘤m2-pk)、cd19、cd20、cd22、cd23、cd24、cd27、cd30、cd33、cd34、cd37、cd38、cd40、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd45、cd70、cd99、cd117、cd123、cd138、cd171、gd2(神经节苷脂g2)、epha2、cspg4、fap(成纤维细胞活化蛋白)、κ、λ、5t4、αvβ6整合素、整合素ανβ3(cd61)、半乳糖凝集素、k-ras(v-ki-ras2 kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因)、ral-b、b7-h3、b7-h6、caix、egfr、egp2、egp40、epcam、胎儿achr、frα、gd3、hla-a1+mage1、hla-a1+ny-eso-1、hla-dr、il-11rα、il-13rα2、lewis-y、muc16、ncam、nkg2d配体、prame、存活素、tag72、tems、vegfr2、egfrviii(表皮生长因子变体iii)、精子蛋白17(sp17)、间皮素、pap(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺素、tarp(t细胞受体γ交替阅读框蛋白)、trp-p8、steap1(前列腺1的六跨膜上皮抗原)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、纽约州食管鳞状细胞癌抗原(nyeso1)、pdl-1等。[0364]在一些实施例中，适用于经工程改造的信号传导多肽中的特异性结合对的成员为受体的配体的astr。配体包括(但不限于)：激素(例如，红细胞生成素、生长激素、瘦素等)；细胞因子(例如，干扰素、介白素、某些激素等)；生长因子(例如，调节蛋白；血管内皮生长因子(vegf)等)；整合素结合肽(例如，包含序列arg-gly-asp(seq id no:1)的肽)等。[0365]当经工程改造的信号传导多肽中的特异性结合对的成员为配体时，可在特异性结合对的第二成员的存在下使经工程改造的信号传导多肽活化，其中特异性结合对的第二成员为该配体的受体。举例来说，当配体为vegf时，特异性结合对的第二成员可为包括可溶性vegf受体的vegf受体。[0366]如上所述，在一些情况下，包括于经工程改造的信号传导多肽中的特异性结合对的成员是astr，其为受体，例如配体的受体、共受体等。受体可以是受体的配体结合片段。合适的受体包括(但不限于)：生长因子受体(例如，vegf受体)；杀伤细胞凝集素样受体子家族k；成员1(nkg2d)多肽(mica、micb及ulb6的受体)；细胞因子受体(例如，il-13受体；il-2受体等)；cd27；自然细胞毒性受体(ncr)(例如，nkp30(ncr3/cd337)多肽(hla-b相关的转录物3(bat3)及b7-h6)的受体等)等。[0367]在包括astr的本文中所提供的任何方面的某些实施例中，可将astr定位于连接astr与表达与靶细胞上的目标分子的中间蛋白质。中间蛋白质可经内源性地表达或外源性地引入，且可为天然地、经工程改造或化学修饰的。在某些实施例中，astr可为抗标记astr，使得至少一个经标记中间物(通常抗标记结合物)包括于由astr识别的标记与目标分子(通常为表达于靶细胞上的蛋白质目标)之间。因此，在这类实施例中，astr结合标记且标记结合于针对靶细胞(如癌细胞)上的抗原的抗体。标记的非限制性实例包括异硫氰酸荧光素(fitc)、抗生蛋白链菌素、生物素、组氨酸、二硝基苯酚、多甲藻素叶绿素蛋白复合物、绿色荧光蛋白、藻红蛋白(pe)、辣根过氧化酶、棕榈酰化、亚硝基化、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶以及麦芽糖结合蛋白。因此，astr包含结合标记的分子。[0368]柄[0369]在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽包括位于经工程改造的信号传导多肽的部分中的柄，该部分位于细胞外部且插入在astr与跨膜结构域之间。在一些实施例中，柄与野生型cd8柄区(tttpaprpptpaptia sqplslrpeacrpaaggavhtrgldfa(seq id no:2))具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性，与野生型cd28柄区(fckievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskp(seq id no:3))具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性，或与野生型免疫球蛋白重链柄区具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在经工程改造的信号传导多肽中，所用柄允许抗原特异性靶向区及通常整个经工程改造的信号传导多肽保持与目标抗原的结合增加。[0370]柄区长度可为约4个氨基酸至约50个氨基酸，例如约4aa至约10aa、约10aa至约15aa、约15aa至约20aa、约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、约30aa至约40aa，或约40aa至约50aa。[0371]在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽的柄包括至少一个半胱氨酸。举例来说，在一些实施例中，柄可以包括序列cys-pro-pro-cys(seq id no:4)。如果存在，第一经工程改造的信号传导多肽的柄中的半胱氨酸可以能够与第二经工程改造的信号传导多肽中的柄形成二硫键。[0372]柄可以包括本领域已知的免疫球蛋白铰链区氨基酸序列；参见例如tan等人(1990)《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》87:162；和huck等人(1986)《核酸研究(nucl.acidsres.)》14:1779。作为非限制性实例，免疫球蛋白铰链区可以包括与任何以下氨基酸序列的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列一致性的结构域：dktht(seq id no:5)；cppc(seq id no:4)；cpepkscdtpppcpr(seq id no:6)(参见例如glaser等人(2005),《生物化学杂志(j.biol.chem.)》280:41494)；elktplgdttht(seq id no:7)；kscdkthtcp(seq id no:8)；kccvdcp(seq id no:9)；kygppcp(seq id no:10)；epkscdkthtcppcp(seq id no:11)(人类igg1铰链)；erkccvecppcp(seq id no:12)(人类igg2铰链)；elktplgdtthtcprcp(seq id no:13)(人类igg3铰链)；spnmvphahhaq(seq id no:14)(人类igg4铰链)等。柄可以包括具有人类igg1、igg2、igg3或igg4铰链区的氨基酸序列的铰链区。柄与野生型(天然存在的)铰链区相比可包括一个或多个氨基酸取代和/或插入和/或缺失。例如，人类igg1铰链的his229可被tyr取代，使得柄包括序列epkscdktytcppcp(seq id no:15)(参见例如yan等人(2012)《生物化学杂志(j.biol.chem.)》287:5891)。柄可包括来源于人类cd8的氨基酸序列；例如，柄可包括氨基酸序列：tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd(seq id no:16)，或其变体。[0373]跨膜结构域[0374]本公开的经工程改造的信号传导多肽可包括用于插入至真核细胞膜中的跨膜结构域。跨膜结构域可插入在astr与共刺激结构域之间。跨膜结构域可插入在柄与共刺激结构域之间，使得嵌合抗原受体自氨基端(n端)至羧基端(c端)依次包括：astr、柄、跨膜结构域以及活化结构域。[0375]提供将多肽插入至真核(例如，哺乳动物)细胞的细胞膜中的任何跨膜(tm)结构域适用于本文中所公开的方面及实施例。在一些实施例中，本文提供的包括car的任何方面的tm结构域可包括来自以下的跨膜结构域：baffr、c3z、ceacam1、cd2、cd3a、cd3b、cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、cd4、cd5、cd7、cd8a、cd8b、cd9、cd11a、cd11b、cd11c、cd11d、cd27、cd16、cd18、cd19、cd22、cd28、cd29、cd33、cd37、cd40、cd45、cd49a、cd49d、cd49f、cd64、cd79a、cd79b、cd80、cd84、cd86、cd96(tactile)、cd100(sema4d)、cd103、c134、cd137、cd154、cd160(by55)、cd162(selplg)、cd226(dnam1)、cd229(ly9)、cd247、crlf2、crtam、csf2ra、csf2rb、csf3r、epor、fcer1g、fcgr2c、fcgra2、ghr、hvem(lightr)、ia4、icos、ifnar1、ifnar2、ifngr1、ifngr2、ifnlr1、il1r1、il1rap、il1rl1、il1rl2、il2ra、il2rb、il2rg、il3ra、il4r、il5ra、il6r、il6st、il7ra、il7ra ins ppcl、il9r、il10ra、il10rb、il11ra、il12rb1、il12rb2、il13ra1、il13ra2、il15ra、il17ra、il17rb、il17rc、il17rd、il17re、il18r1、il18rap、il20ra、il20rb、il21r、il22ra1、il23r、il27ra、il31ra、itga1、itga4、itga6、itgad、itgae、itgal、itgam、itgax、itgb1、itgb2、itgb7、kirds2、lepr、lfa-1(cd11a、cd18)、lifr、ltbr、mpl、nkp80(klrf1)、osmr、pag/cbp、prlr、psgl1、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、slamf4(cd244、2b4)、slamf6(ntb-a、ly108)、slamf7、slamf8(blame)、tnfr2、tnfrsf4、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfrsf14、tnfrsf18、vla1或vla-6，或其功能突变体和/或片段。[0376]适用于本文中所提供的任何方面或实施例的tm结构域的非限制性实例包括与以下tm结构域或经组合柄及tm结构域中的任一个的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的结构域：a)cd8αtm(seq id no:17)；b)cd8βtm(seq id no:18)；c)cd4柄(seq id no:19)；d)cd3z tm(seq id no:20)；e)cd28 tm(seq id no:21)；f)cd134(ox40)tm(seq id no:22)；g)cd7 tm(seq id no:23)；h)cd8柄及tm(seq id no:24)；及i)cd28柄及tm(seq id no:25)。[0377]作为非限制性实例，本发明的方面的跨膜结构域可与seq id no:17跨膜结构域具有至少80％、90％或95％或可具有100％的序列一致性，或可分别与来自以下基因的跨膜结构域中的任一个具有100％的序列一致性：cd8β跨膜结构域、cd4跨膜结构域、cd3ζ跨膜结构域、cd28跨膜结构域、cd134跨膜结构域或cd7跨膜结构域。[0378]胞内活化结构域[0379]适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的胞内活化结构域在活化时通常诱导产生一种或多种细胞因子；增加细胞死亡；和/或增加cd8+t细胞、cd4+t细胞、nkt细胞、γδt细胞和/或嗜中性粒细胞的增殖。活化结构域也可以在本文中称为活化作用结构域。活化结构域可用于本文提供的car中或淋巴增生性元件中。[0380]在一些实施例中，胞内活化结构域包括至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个等)如下所述的itam模体。在一些实施例中，本发明一个方面的细胞内活化结构域可以与如下所述的cd3z、cd3d、cd3e、cd3g、cd79a、cd79b、dap12、fcerlg、fcgr2a、fcgr2c、dap10/cd28、zap70、nkp30(b7-h6)、nkg2d、nkp44、nkp46、fcrγ(fcer1g)、fcrβ(fcer1b)、fcγri、fcγriia、fcγriic、fcγriiia和fcrl5结构域具有至少80％、90％或95％或100％的序列一致性。[0381]适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的胞内活化结构域包括含有基于免疫受体酪氨酸的活化模体(itam)的胞内信号传导多肽。itam模体为yx1x2l/i，其中x1及x2独立地为任何氨基酸。在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽的胞内活化结构域包括1个、2个、3个、4个或5个itam模体。在一些实施例中，itam模体在胞内活化结构域中重复两次，其中itam模体的第一个例与第二个例彼此由6个至8个氨基酸(例如，(yx1x2l/i)(x3)n(yx1x2l/i)，其中n为整数6至8，且6个至8个x3中的每一个可为任何氨基酸)分隔开。在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽的胞内活化结构域包括3个itam模体。[0382]合适的胞内活化结构域可为含有itam模体的部分，所述部分来源于含有itam模体的多肽。举例来说，合适的胞内活化结构域可为来自任何含有itam模体的蛋白质的含有itam模体的结构域。因此，合适的胞内活化结构域不需要含有其源自的整个蛋白质的整个序列。合适的含有itam模体的多肽的实例包括(但不限于)：cd3z(cd3ζ)；cd3d(cd3δ)；cd3e(cd3ε)；cd3g(cd3γ)；cd79a(抗原受体复合物相关蛋白质α链)；cd79b(抗原受体复合物相关蛋白质β链)dap12；以及fcerlg(fcε受体iγ链)。[0383]在一些实施例中，胞内活化结构域可以包括与下列含itam模体的多肽中的至少10、15、20个或全部氨基酸的一段或与任何下列含itam模体的多肽的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110个aa至约115个aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的邻接延伸具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的结构域：cd3ζ链(也被称为cd3z、t细胞受体t3ζ链、cd247、cd3-ζ、cd3h、cd3q、t3z、tcrz等)，其具有示例性的序列mkwkalftaailqaqlpiteaqsfglldpklcylldgilfiygviltalflrvkfsrsadapayqqgqnql[ynelnlgrreeydvl]dkrrgrdpemggkprrknpqegl[ynelqkdkmaeaysei]gmkgerrrgkghdgl[yqglstatkdtydal]hmqalppr(seq id no:26)，mkwkalftaailqaqlpiteaqsfglldpklcylldgilfiygviltalflrvkfsrsadapayqqgqnql[ynelnlgrreeydvl]dkrrgrdpemggkpqrrknpqegl[ynelqkdkmaeaysei]gmkgerrrgkghdgl[yqglstatkdtydal]hmqalppr(seq id no:27)；rvkfsrsadapayqqgqnql[ynelnlgrreeydvl]dkrrgrdpemggkprrknpqegl[ynelqkdkmaeaysei]gmkgerrrgkghdgl[yqglstatkdtydal]hmqalppr(seq id no:28)，rvkfsrsadapayqqgqnql[ynelnlgrreeydvl]dkrrgrdpemggkpqrrknpqegl[ynelqkdkmaeaysei]gmkgerrrgkghdgl[yqglstatkdtydal]hmqalppr(seq id no:29)，nql[ynelnlgrreeydvl]dkr(seq id no:30)；egl[ynelqkdkmaeaysei]gmk(seq id no:31)和dgl[yqglstatkdtydal]hmq(seq id no:32)；t细胞表面糖蛋白cd3δ链(还被称为cd3d；cd3-delta；t3d；cd3抗原，δ亚基；cd3δ；cd3d抗原，δ多肽(tit3复合物)；okt3，δ链；t细胞受体t3δ链；t细胞表面糖蛋白cd3δ链；等等)，其具有示例性的序列：mehstflsglvlatllsqvspfkipieeledrvfvncntsitwvegtvgtllsditrldlgkrildprgiyrcngtdiykdkestvqvhyrmcqscveldpatvagiivtdviatlllalgvfcfaghetgrlsgaadtqallrndqv[yqplrdrddaqyshl]ggnwarnk(seq id no:33)，mehstflsglvlatllsqvspfkipieeledrvfvncntsitwvegtvgtllsditrldlgkrildprgiyrcngtdiykdkestvqvhyrtadtqallrndqv[yqplrdrddaqyshl]ggnwarnk(seq id no:34)和dqv[yqplrdrddaqyshl]ggn(seq id no:35)；t细胞表面糖蛋白cd3ε链(还被称为cd3e、t细胞表面抗原t3/leu-4ε链、t细胞表面糖蛋白cd3ε链、ai504783、cd3、cd3ε、t3e等)，其具有示例性的序列：mqsgthwrvlglcllsvgvwgqdgneemggitqtpykvsisgttviltcpqypgseilwqhndkniggdeddknigsdedhlslkefseleqsgyyvcyprgskpedanfylylrarvcencmemdmsvativivdicitggllllvyywsknrkakakpvtrgagaggrqrgqnkerpppvpnpd[yepirkgqrdlysgl]nqrri(seq id no:36)和npd[yepirkgqrdlysgl]nqr(seq id no:37)；t细胞表面糖蛋白cd3γ链(还被称为cd3g、t细胞受体t3γ链、cd3-γ、t3g、γ多肽(tit3复合物)等)，其具有示例性的序列：meqgkglavlilaiillqgtlaqsikgnhlvkvydyqedgsvlltcdaeaknitwfkdgkmigfltedkkkwnlgsnakdprgmyqckgsqnkskplqvyyrmcqncielnaatisgflfaeivsifvlavgvyfiagqdgvrqsrasdkqtllpndql[yqplkdreddqyshl]qgnqlrrn(seq id no:38)和dql[yqplkdreddqyshl]qgn(seq id no:39)；cd79a(还被称为b细胞抗原受体复合物相关蛋白α链；cd79a抗原(免疫球蛋白相关α)；mb-1膜糖蛋白；ig-α；膜结合免疫球蛋白相关蛋白；表面igm相关蛋白；等等)，其具有示例性的序列：mpggpgvlqalpatifllfllsavylgpgcqalwmhkvpaslmvslgedahfqcphnssnnanvtwwrvlhgnytwppeflgpgedpngtliiqnvnkshggiyvcrvqegnesyqqscgtylrvrqppprpfldmgegtknriitaegiillfcavvpgtlllfrkrwqneklgldagdeyedenl[yeglnlddcsmyedi]srglqgtyqdvgslnigdvqlekp(seq id no:40)，mpggpgvlqalpatifllfllsavylgpgcqalwmhkvpaslmvslgedahfqcphnssnnanvtwwrvlhgnytwppeflgpgedpneppprpfldmgegtknriitaegiillfcavvpgtlllfrkrwqneklgldagdeyedenl[yeglnlddcsmyedi]srglqgtyqdvgslnigdvqlekp(seq id no:41)和enl[yeglnlddcsmyedi]srg(seq id no:42)；cd79b，其具有示例性的序列：ldkddskagmeedht[yegldidqtatyedi]vtlrtgevkwsvgehpgqe(seq id no:211)；dap12(还被称为tyrobp；tyro蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；karap；plosl；dnax-活化蛋白12；kar相关蛋白；tyro蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；杀伤激活受体相关蛋白；等等)，其具有示例性的序列：mgglepcsrllllplllavsglrpvqaqaqsdcscstvspgvlagivmgdlvltvlialavyflgrlvprgrgaaeaatrkqritetesp[yqelqgqrsdvysdl]ntqrpyyk(seq id no:43)，mgglepcsrllllplllavsglrpvqaqaqsdcscstvspgvlagivmgdlvltvlialavyflgrlvprgrgaaeatrkqritetesp[yqelqgqrsdvysdl]ntq(seq id no:44)，mgglepcsrllllplllavsdcscstvspgvlagivmgdlvltvlialavyflgrlvprgrgaaeaatrkqritetesp[yqelqgqrsdvysdl]ntqrpyyk(seq id no:45)，mgglepcsrllllplllavsdcscstvspgvlagivmgdlvltvlialavyflgrlvprgrgaaeatrkqritetesp[yqelqgqrsdvysdl]ntqrpyyk(seq id no:46)和esp[yqelqgqrsdvysdl]ntq(seq id no:47)；和fcerlg(还被称为fcrg；fcε受体iγ链；fc受体γ链；fc-εri-γ；fcrγ；fceriγ；高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ；免疫球蛋白e受体，高亲和力，γ链；等等)，其具有示例性的序列：mipavvllllllveqaaalgepqlcyildailflygivltllycrlkiqvrkaaitsyeksdgv[ytglstrnqetyetl]khekppq(seq id no:48)和dgv[ytglstrnqetyetl]khe(seq id no:49)，其中在括号中阐述itam模体。[0384]适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的胞内活化结构域包括dap10/cd28型信号传导链。dap10信号传导链的实例为氨基酸seq id no:50。在一些实施例中，合适的胞内活化结构域可包括与seq id no:50中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的结构域。[0385]cd28信号传导链的实例为氨基酸序列seq id no:51。在一些实施例中，合适的胞内活化结构域可包括与seq id no:51中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的结构域。[0386]适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的胞内活化结构域包括zap70多肽，例如，合适的胞内活化结构域可包括与seq id no:52中的至少10个、15个、20个或全部氨基酸的一段或与以下氨基酸序列的约300个氨基酸至约400个氨基酸、约400个氨基酸至约500个氨基酸或约500个氨基酸至约619个氨基酸的一连续段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的结构域。[0387]调节结构域[0388]调节结构域可改变经工程改造的信号传导多肽中的胞内活化结构域的作用，包括增强或抑制活化结构域的下游作用或改变反应的性质。适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的调节结构域包括共刺激结构域。适合于包含在经工程改造的信号传导多肽中的调节结构域的长度可为约30个氨基酸至约70个氨基酸(aa)，例如，调节结构域的长度可为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。在其它情况下，调节结构域的长度可为约70aa至约100aa、约100aa至约200aa，或大于200aa。[0389]共刺激结构域通常增强和/或改变活化结构域的反应的性质。适用于本公开的经工程改造的信号传导多肽中的共刺激结构域通常为衍生自受体的多肽。在一些实施例中，共刺激结构域同源二聚。主题共刺激结构域可为跨膜蛋白质的胞内部分(即，共刺激结构域可衍生自跨膜蛋白质)。在一些实施例中，本文提供的car中的任一个可以包括共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域可以包括与至少10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的一段或以下的胞内结构域具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的结构域：4-1bb(cd137)、b7-h3、b7-hcdr3、baffr、btla、c100(sema4d)、cd2、cd4、cd7、cd8a、cd8b、cd11a、cd11b、cd11c、cd11d、cd18、cd19、cd27、cd28、针对lck结合缺失的cd28(icδ)、cd29、cd30、cd40、cd49a、cd49d、cd49f、cd69、cd84、cd96(触觉的)、cd103、cd160(by55)、cd162(selplg)、cd226(dnam1)、cd229(ly9)、与cd83特异性结合的配体、cds、ceacam1、crlf2、crtam、csf2ra、csf2rb、csf3r、epor、fc受体γ链、fc受体ε链、fcgra2、gads、ghr、gitr、hvem、ia4、icam-1、icos、ifnar1、ifnar2、ifngr1、ifngr2、ifnlr1、il1r1、il1rap、il1rl1、il1rl2、il2ra、il2rb、il2rg、il3ra、il4r、il5ra、il6r、il6st、il7ra、il9r、il10ra、il10rb、il11ra、il12rb1、il12rb2、il13ra1、il13ra2、il15ra、il17ra、il17rb、il17rc、il17rd、il17re、il18r1、il18rap、il20ra、il20rb、il21r、il22ra1、il23r、il27ra、il31ra、itga4、itga6、itgad、itgae、itgal、itgam、itgax、itgb1、itgb2、itgb7、lat、lepr、lfa-1(cd11a/cd18)、light、lifr、lmp1、ltbr、mpl、myd88、nkg2c、nkp80(klrf1)、osmr、ox40、pd-1、prlr、psgl1、pag/cbp、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、slamf4(c244、2b4)、slamf6(ntb-a、ly108)、slamf7、slamf8(blame)、slp-76、tilr2、tilr4、tilr7、tilr9、tnfr2、tnfrsf4、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfrsf14、tnfrsf18、trance/rankl、vla1、或vla-6，或其功能突变体和/或片段。[0390]适合于包含在经工程改造的信号传导多肽中的共刺激结构域的长度可为约30个氨基酸至约70个氨基酸(aa)，例如，共刺激结构域的长度可为约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa或约65aa至约70aa。在其它情况下，共刺激结构域的长度可为约70aa至约100aa、约100aa至约200aa，或大于200aa。[0391]在一些实施例中，共刺激结构域可以包括与以下的胞内部分的至少10、15、20或所有氨基酸或约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、或约65aa至约70aa、约70aa至约75aa、约75aa至约80aa、约80aa至约85aa、约85aa至约90aa、约90aa至约95aa、约95aa至约100aa、约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa、约150aa至约160aa、或约160aa至约185aa的一段(取决于蛋白质的胞内部分有多长)具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的结构域:cd137(也被称为tnfrsf9；cd137；4-1bb；cdwl37；ila；等等)，例如seq id no:53，cd28(也被称为tp44)例如seq id no:54，针对lck结合缺失的cd28(icδ)例如seq id no:55，icos(也被称为ailim、cd278和cvidl)例如seq id no:56，ox40(也被称为tnfrsf4、rp5-902p8.3、act35、cd134、ox-40、txgpll)，例如seq id no:57，cd27(也被称为s 152、t 14、tnfrsf7和tp55)，例如seq id no:58，btla(也被称为btlal和cd272)，例如seq id no:59,cd30(也被称为tnfrsf8、dls166e和ki-1)，例如seq id no:60,gitr(也被称为tnfrsf18、rp5-902p8.2、aitr、cd357和gitr-d)，例如seq id no:61或hvem(也被称为tnfrsf14、rp3-395m20.6、atar、cd270、hvea、hvem、lightr和tr2)，例如seq id no:62。ox40在(表1的)seq id no:296中的每一个的残基34-57处含有p85 pi3k结合模体，且在残基76-102处含有traf结合模体。在一些实施例中，共刺激结构域可包括ox40的p85 pi3k结合模体。在一些实施例中，共刺激结构域可包括ox40的traf结合模体。对应于seq id no:296的氨基酸17及41的赖氨酸为充当泛素靶向模体的部分的潜在负性调节位点。在一些实施例中，ox40的共刺激结构域中的这些赖氨酸中的一个或两个为突变精氨酸或另一种氨基酸。[0392]连接子[0393]在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽包括在任何两个相邻结构域之间的连接子。举例而言，连接子可在跨膜结构域与第一刺激结构域之间。作为另一实例，astr可为抗体，且连接子可在重链与轻链之间。作为另一实例，连接子可在astr与跨膜结构域及共刺激结构域之间。作为另一实例，连接子可在第二多肽的共刺激结构域与胞内活化结构域之间。作为另一实例，连接子可在astr与胞内信号传导结构域之间。[0394]连接肽可具有多种氨基酸序列中的任一个。蛋白质可通过通常具有柔性的间隔肽连接，但不排除其它化学键。连接子可为长度在约1个与约100个氨基酸之间，或长度在约1个与约25个氨基酸之间的肽。这些连接子可通过使用合成的编码连接子的寡核苷酸偶合所述蛋白质来产生。可使用具有一定程度柔性的肽连接子。连接肽可实际上具有任何氨基酸序列，考虑到合适的连接子将具有产生通常柔性肽的序列。使用如甘氨酸和丙氨酸等小型氨基酸在产生柔性肽方面是有用的。这类序列的创建对于所属领域的技术人员来说是常规的。[0395]合适的连接子可易于选择且可为合适的不同长度中的任一个，如1个氨基酸(例如gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，且可为1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个氨基酸。[0396]例示性柔性连接子包括甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(gs)n、(gsggs)n、(ggs)n、(gggs)n和(ggggs)n，其中n为至少一的整数)，甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物，及所属领域中已知的其它柔性连接子。甘氨酸及甘氨酸-丝氨酸聚合物是令人感兴趣的，这是由于这些氨基酸的两者皆为相对非结构化的，且因此可作为组分之间的中性链。甘氨酸聚合物尤其令人感兴趣，这是由于甘氨酸比甚至丙氨酸具有显著更多的phi-psi空间，且比具有较长侧链的残基受到更少限制(参见scheraga,《计算化学综述(rev.computationalchem.)》11173-142(1992))。例示性柔性连接子包括(但不限于)ggggsggggsggggs(seq id no:63)、ggggsggggsggggsggggsggggsggggs(seq id no:64)、ggggsgggsggggs(seq id no:65)、ggsg(seq id no:66)、ggsgg(seq id no:67)、gsgsg(seq id no:68)、gsggg(seq id no:69)、gggsg(seq id no:70)、gsssg(seq id no:71)、ggggsggggsggggsggggs(seq id no:372)等。所属领域的技术人员认识到，与上述任何元件结合的肽的设计可以包括具有全部或部分柔性的连接子，使得连接子可以包括柔性连接子以及赋予结构较弱柔性的一个或多个部分。[0397]组合[0398]在一些实施例中，通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒提供的聚核苷酸具有编码一种或多种经工程改造的信号传导多肽的某些组合的一个或多个转录单元。在本文所提供的一些方法及组合物中，在通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转录t细胞之后，被修饰的且在说明性实施例中被基因修饰的t细胞包括一种或多种经工程改造的信号传导多肽的组合。将理解，第一多肽、第二多肽、第三多肽等的参考是出于方便性，且“第一多肽”上的元件及“第二多肽”上的那些意谓，所述元件在不同多肽上，所述多肽称为第一或第二以通常在特异性多肽的其它元件或步骤中仅供参考及方便性。[0399]在一些实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽包括能够结合抗原的胞外抗原结合结构域，及胞内信号传导结构域。在其它实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽还包括t细胞存活模体和/或跨膜结构域。在一些实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽不包括共刺激结构域，而在其它实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽的确包括共刺激结构域。[0400]在一些实施例中，第二经工程改造的信号传导多肽包括淋巴增生性基因产物及任选的胞外抗原结合结构域。在一些实施例中，第二经工程改造的信号传导多肽还包括以下中的一种或多种：t细胞存活模体、胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在其它实施例中，当使用两种经工程改造的信号传导多肽时，至少一种为car。[0401]在一个实施例中，一种或多种经工程改造的信号传导多肽在相同转录物下在t细胞特异性启动子或一般启动子下表达，其中在所述转录物中，编码经工程改造的信号传导多肽的核酸由编码一种或多种内部核糖体进入位点(ire)或一种或多种蛋白酶裂解肽的核酸分隔开。[0402]在某些实施例中，聚核苷酸编码两种经工程改造的信号传导多肽，其中第一经工程改造的信号传导多肽包括能够结合第一抗原的第一胞外抗原结合结构域，及第一胞内信号传导结构域而非共刺激结构域，且第二经工程改造的信号传导多肽包括能够结合vegf的第二胞外抗原结合结构域，及第二胞内信号传导结构域，如共刺激分子的信号传导结构域。在某一实施例中，第一抗原为psca、psma或bcma。在某一实施例中，第一胞外抗原结合结构域包含抗体或其片段(例如scfv)，例如对psca、psma或bcma具有特异性的抗体或其片段。在某一实施例中，结合vegf的第二胞外抗原结合结构域为vegf的受体，即vegfr。在某些实施例中，vegfr为vegfr1、vegfr2或vegfr3。在某一实施例中，vegfr为vegfr2。[0403]在某些实施例中，聚核苷酸编码两种经工程改造的信号传导多肽，其中第一经工程改造的信号传导多肽包括胞外肿瘤抗原结合结构域及cd3ζ信号传导结构域，且第二经工程改造的信号传导多肽包括抗原结合结构域(其中所述抗原为血管生成或血管原性因子)，及一个或多个共刺激分子信号传导结构域。血管生成因子可为例如vegf。一个或多个共刺激分子信号传导模体可包含例如来自cd27、cd28、ox40、icos及4-1bb中的每一个的共刺激信号传导结构域。[0404]在某些实施例中，聚核苷酸编码两种经工程改造的信号传导多肽，其中第一经工程改造的信号传导多肽包括胞外肿瘤抗原结合结构域及cd3ζ信号传导结构域，第二多肽包含能够结合vegf的抗原结合结构域的抗原结合结构域，及来自cd27、cd28、ox40、icos及4-1bb中的每一个的共刺激信号传导结构域。在另一实施例中，第一信号传导多肽或第二信号传导多肽还具有t细胞存活模体。在一些实施例中，t细胞存活模体为il-7受体(il-7r)的胞内信号传导结构域、il-12受体的胞内信号传导结构域、il-15受体的胞内信号传导结构域、il-21受体的胞内信号传导结构域，或转型生长因子β(tgfβ)受体或tgfβ诱饵受体(tgf-β-显性-阴性受体ii(dnrii))的胞内信号传导结构域或由以上各者衍生。[0405]在某些实施例中，聚核苷酸编码两种经工程改造的信号传导多肽，其中第一经工程改造的信号传导多肽包括胞外肿瘤抗原结合结构域及cd3ζ信号传导结构域，且第二经工程改造的信号传导多肽包含能够结合vegf的抗原结合结构域、il-7受体胞内t细胞存活模体、及来自cd27、cd28、ox40、icos及4-1bb中的每一个的共刺激信号传导结构域。[0406]在一些实施例中，由聚核苷酸编码超过两种信号传导多肽。在某些实施例中，仅经工程改造的信号传导多肽中的一个包括结合至肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原的抗原结合结构域；所述经工程改造的信号传导多肽中的剩余者的每一个包含结合至非肿瘤相关的抗原或非肿瘤特异性抗原的抗原结合结构域。在其它实施例中，经工程改造的信号传导多肽中的两个或更多个包括结合至一种或多种肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原的抗原结合结构域，其中这些经工程改造的信号传导多肽中的至少一个包含未结合至肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原的抗原结合结构域。[0407]在本文的包括astr的任何方面或实施例中，抗原可以是肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原。在一些实施例中，肿瘤相关的抗原或肿瘤特异性抗原是axl、ror1、ror2、her2(erbb2)、前列腺干细胞抗原(psca)、psma(前列腺特异性膜抗原)、b细胞成熟抗原(bcma)、α-胎蛋白(afp)、癌胚性抗原(cea)、癌症抗原-125(ca-125)、ca19-9、钙网膜素、嗜铬粒蛋白、蛋白黑色素-a(由t淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；mart-1)、myo-d1、肌特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(nse)、muc-1、上皮膜蛋白(ema)、上皮肿瘤抗原(eta)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(mage)、mage-al、高分子量-黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同功酶型的二聚体形式m2(肿瘤m2-pk)、cd19、cd20、cd22、cd23、cd24、cd27、cd30、cd33、cd34、cd37、cd38、cd40、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd45、cd70、cd99、cd117、cd123、cd138、cd171、gd2(神经节苷脂g2)、epha2、cspg4、fap(成纤维细胞活化蛋白)、κ、λ、5t4、αvβ6整合素、整合素ανβ3(cd61)、半乳糖凝集素、k-ras(v-ki-ras2 kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因)、ral-b、b7-h3、b7-h6、caix、egfr、egp2、egp40、epcam、胎儿achr、frα、gd3、hla-a1+mage1、hla-a1+ny-eso-1、hla-dr、il-11rα、il-13rα2、lewis-y、muc16、ncam、nkg2d配体、prame、存活素、tag72、tems、vegfr2、egfrviii(表皮生长因子变体iii)、精子蛋白17(sp17)、间皮素、pap(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺素、tarp(t细胞受体γ交替阅读框蛋白)、trp-p8、steap1(前列腺1的六跨膜上皮抗原)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、纽约州食管鳞状细胞癌抗原(nyeso1)或pdl-1。[0408]在一些实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽包括结合第一抗原的第一胞外抗原结合结构域，及第一胞内信号传导结构域；且第二经工程改造的信号传导多肽包括结合第二抗原或结合第二抗原的受体的第二胞外抗原结合结构域，及第二胞内信号传导结构域，其中所述第二经工程改造的信号传导多肽不包含共刺激结构域。在某一实施例中，第一抗原结合结构域及第二抗原结合结构域独立地为受体的抗原结合部分或抗体的抗原结合部分。在某一实施例中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域中的一个或两个为scfv抗体片段。在某些实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽和/或第二经工程改造的信号传导多肽额外包含跨膜结构域。在某一实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽或第二经工程改造的信号传导多肽包含t细胞存活模体，例如本文所描述的t细胞存活模体中的任一个。[0409]在另一实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽包括结合her2的第一胞外抗原结合结构域，且第二经工程改造的信号传导多肽包括结合muc-1的第二胞外抗原结合结构域。[0410]在另一实施例中，第二经工程改造的信号传导多肽的第二胞外抗原结合结构域结合介白素。[0411]在另一实施例中，第二经工程改造的信号传导多肽的第二胞外抗原结合结构域结合损伤相关的分子模式分子(damp；也被称为警报素(alarmin))。在其它实施例中，damp为热休克蛋白质、染色质相关的蛋白质高迁移率组盒1(hmgb1)、s100a8(也被称为mrp8或钙粒蛋白a)、s100a9(也被称为mrp14或钙粒蛋白b)、血清淀粉样蛋白a(saa)、脱氧核糖核酸、三磷酸腺苷、尿酸或硫酸肝素。[0412]在某些实施例中，所述第二抗原为抗体上的抗原，所述抗体结合由肿瘤细胞呈现的抗原。[0413]在一些实施例中，经由第二经工程改造的信号传导多肽的信号转导活化为非抗原性的，但与低氧有关。在某些实施例中，低氧是通过低氧诱导因子-1α(hif-1α)、hif-1β、hif-2α、hif-2β、hif-3α或hif-3β的活化诱导的。[0414]在一些实施例中，例如用于修饰、基因修饰和/或转导待通过皮下注射引入或再引入的淋巴细胞，一种或多种经工程改造的信号传导多肽的表达是由在本文中更详细地公开的控制组件调节的。[0415]其它序列[0416]经工程改造的信号传导多肽(如car)可进一步包括一种或多种额外的多肽结构域，其中这类结构域包括(但不限于)信号序列、抗原决定基标记、亲和结构域，及可例如通过抗体分析法或由于其为产生可检测信号的多肽而检测(可检测标记)其存在或活性的多肽。对于本文所提供的任何方面或实施例中的额外结构域的非限制性实例包括与如下文所描述的以下序列中的任一个具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的结构域：信号序列、抗原决定基标记、亲和结构域或产生可检测信号的多肽。[0417]适用于主题car，例如主题car的第一多肽的信号序列包括任何真核信号序列，包括天然存在的信号序列、合成(例如人造)信号序列等。在一些实施例中，举例来说，信号序列可以是cd8信号序列malpvtalllplalllhaarp(seq id no:72)。[0418]合适的抗原决定基标记包括(但不限于)红血球凝集素(ha；例如ypydvpdya；seq id no:73)、flag(例如dykddddk；seq id no:74)、c-myc(例如eqkliseedl；seq id no:75)等。[0419]亲和结构域包括可与结合配偶体(例如在固体载体上固定的结合配偶体)相互作用的适用于识别或纯化的肽序列。编码多个连续的单一氨基酸(例如组氨酸)的dna序列当与所表达蛋白质融合时，可用于通过高亲和力结合至树脂柱(如琼脂糖凝胶)的重组蛋白质的一步纯化。例示性亲和结构域包括his5(hhhhh；seq id no:76)、hisx6(hhhhhh；seq id no:77)、c-myc(eqkliseedl；seq id no:75)、flag(dykddddk；seq id no:74)、链球菌标记(wshpqfek；seq id no:78)、红血球凝集素，例如ha标记(ypydvpdya；seq id no:73)、gst、硫氧还蛋白、纤维素结合结构域、ryirs(seq id no:79)、phe-his-his-thr(seq id no:80)、甲壳素结合结构域、s-肽、t7肽、sh2结构域、c端rna标记、weaaareaccreccara(seq id no:81)、金属结合结构域，例如锌结合结构域或钙结合结构域(如来自钙结合蛋白(例如钙调蛋白、肌钙蛋白c、钙调神经磷酸酶b、肌球蛋白轻链、恢复蛋白、s-调节蛋白、视锥蛋白、vilip、神经钙蛋白、河马钙蛋白、频青霉菌素、钙蛋白、钙蛋白酶大型子单元、s100蛋白、小白蛋白、钙结合蛋白d9k、钙结合蛋白d28k和钙网蛋白、内含蛋白、生物素、抗生蛋白链菌素、myod、id、亮氨酸拉链序列和麦芽糖结合蛋白)的结合结构域)。[0420]合适的可检测信号产生蛋白质包括例如荧光蛋白质、催化产生可检测信号作为产物的反应的酶等。[0421]合适的荧光蛋白质包括(但不限于)绿色荧光蛋白(gfp)或其变体、gfp的蓝色荧光变体(bfp)、gfp的青色荧光变体(cfp)、gfp的黄色荧光变体(yfp)、增强型gfp(egfp)、增强型cfp(ecfp)、增强型yfp(eyfp)、gfps65t、翡翠、黄宝石(tyfp)、金星、黄水晶、mcitrine、gfpuv、去稳定的egfp(degfp)、去稳定的ecfp(decfp)、去稳定的eyfp(deyfp)、mcfpm、天蓝、t-蓝宝石、cypet、ypet、mko、hcred、t-hcred、dsred、dsred2、dsred-单体、j-red、dimer2、t-dimer2(12)、mrfpl、杯型珊瑚色、renilla gfp、monster gfp、pagfp、kaede蛋白质和点燃蛋白、藻胆蛋白和藻胆蛋白结合物，包括b-藻红蛋白、r-藻红蛋白和别藻蓝蛋白。荧光蛋白质的其它实例包括mhoneydew、mbanana、morange、dtomato、tdtomato、mtangerine、mstrawberry、mcherry、mgrapel、mraspberry、mgrape2、mplum(shaner等人(2005)《自然方法(nat.methods)》2:905-909)等。适宜使用来自珊瑚虫物种的多种荧光及有色蛋白质中的任一种，如例如matz等人(1999)《自然生物技术(naturebiotechnol.)》17:969-973中所描述的。[0422]合适的酶包括(但不限于)辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(ap)、β-半乳糖苷酶(gal)、葡萄糖-6-磷酸去氢酶、β-n-乙酰胺基葡糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶、葡萄糖氧化酶(go)等。[0423]安全开关(识别结构域和/或消除结构域)[0424]已经开发出用于细胞疗法的安全开关，以在不良事件的情况下减少或消除输注的细胞。本文所提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中的任一个可包括编码安全开关的核酸，所述安全开关作为编码本文所提供的经工程改造的信号传导多肽中的任一个的核酸的部分或与其隔开。因此，本文所提供的经工程改造的信号传导多肽(例如待通过皮下注射引入或再引入的修饰的、基因修饰的和/或转导的淋巴细胞中的经工程改造的信号传导多肽)中的任一个可以包括安全开关。举例来说，本文中所公开的经工程改造的t细胞中的任一个可以包括安全开关。[0425]安全开关技术根据其作用机制可以被大致分为三类；代谢(基因导向的酶前药疗法，gdept)、二聚化诱导的凋亡信号和抗体介导的细胞毒性。[0426]在一个方面中，安全开关是gdept。在一些实施例中，gdept可以是编码病毒胸苷激酶的聚核苷酸，例如衍生自单纯疱疹病毒(hsv-tk)的聚核苷酸。hsv-tk是一种具有seq id no:368的序列的376个氨基酸的蛋白质。在一些实施例中，gdept是hsk-tv的片段，其能够将无毒药物更昔洛韦(ganciclovir)(gcv)转化为gcv-三磷酸，并通过停止dna复制导致细胞死亡。在其它实施例中，gdept可以是编码胞嘧啶脱氨酶的聚核苷酸。胞嘧啶脱氨酶将5-氟胞嘧啶(5-fc)转化为细胞毒性5-氟尿嘧啶(5-fu)。[0427]在一个方面中，安全开关基于二聚化诱导的凋亡信号。在一些实施例中，安全开关是嵌合蛋白，其由与凋亡途径的组分在框架中连接的诱导型二聚化结构域组成，使得由二聚化的细胞可渗透化学诱导剂(cid)的结合介导的条件性二聚化导致细胞的凋亡。在一些实施例中，安全开关是诱导型fas(ifas)，其由一个或多个与fas受体的胞质尾部融合并通过肉豆蔻酰基基团定位于膜的诱导型二聚化结构域组成。在一些实施例中，安全开关是由一个或多个与半胱天冬酶如半胱天冬酶-1或半胱天冬酶-9融合的诱导型二聚化结构域组成的诱导型半胱天冬酶。在一些实施例中，诱导型二聚化结构域是亲环素，并且cid是环孢菌素或环孢菌素衍生物。在一些实施例中，诱导型二聚化结构域是fkbp，并且cid是fk-506二聚体或其衍生物，如ap1903。[0428]在一个方面中，安全开关基于在抗体与在细胞表面上表达的重组多肽(本文被称为细胞标签)结合时抗体介导的细胞毒性。在一些实施例中，抗体结合至细胞标签并诱导补体依赖性细胞毒性(cdc)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。在一些实施例中，细胞标签是myc或flag标签。在优选的实施例中，细胞标签多肽是非免疫原性的。[0429]在一些实施例中，细胞标签包含内源细胞表面分子或被修饰的内源细胞表面分子。内源细胞表面分子可以是任何细胞表面受体、配体、糖蛋白、细胞粘附分子、抗原、整合素或分化簇。对内源细胞表面分子的修饰包括降低细胞表面分子结合其同源配体或受体的能力的对胞外结构域的修饰，和/或降低内源细胞表面分子的天然信号传导活性的对胞内结构域的修饰。对内源细胞表面分子的修饰还包括去除某些结构域和/或包含来自异源蛋白质或合成结构域的结构域。[0430]在一些实施例中，被修饰的内源细胞表面分子为经截短的酪氨酸激酶受体。在一个方面中，经截短的酪氨酸激酶受体为表皮生长因子受体(egfr)家族中的成员(例如erbb1(her1)、erbb2、erbb3和erbb4)，例如如在美国专利8,802,374或wo2018226897中公开的。在一些实施例中，细胞标签可为由抗体识别的多肽，所述抗体识别egfr成员的胞外结构域。在一些实施例中，细胞标签可为egfr家族成员的至少20个连续氨基酸，或在例如egfr家族成员的20个与50个连续氨基酸之间。在一些实施例中，通过去除编码包括膜远端egf结合结构域和细胞质信号传导尾部的多肽核酸序列但保留由抗egfr抗体识别的胞外膜近端表位来构建编码包括人表皮生长因子受体(egfr)的egfr多肽的基因。举例而言，seq id no:82为由识别egfr成员的胞外结构域的抗体结合且在适当条件下识别的例示性多肽。这类截短的egfr多肽有时在本文中被称为etag。在说明性实施例中，etag由市售的单克隆抗体(如马妥珠单抗(matuzumab)、尼西珠单抗(necitumumab)、帕尼单抗(panitumumab)并且在说明性实施中西妥昔单抗(cetuximab)识别。例如，通过介导的抗体依赖性细胞毒性(adcc)途径，etag被证明具有自杀基因潜能。本公开的发明人已经使用慢病毒载体在pbmc中成功表达了etag，并且已经发现通过暴露于西妥昔单抗的pbmc在体外表达etag，提供了一种pbmc的有效的消除机制。[0431]在一些实施例中，修饰的内源性细胞表面分子是tnf受体超家族成员的截短版本。例如，低亲和力神经生长因子受体(lngfr或tnfrsf16)的截短版本。人lngfr是一种单途径i型跨膜糖蛋白，其氨基酸序列为(seq id no:369)，包含28aa残基信号肽、包含4个富含半胱氨酸结构域的222aa胞外结构域、22aa跨膜结构域和155aa胞内结构域。在一些实施例中，所述细胞表面分子包含与lngfr的整个胞外结构域的氨基酸序列或与胞外结构域的截短片段(例如seq id no:369的残基29-250、65-250或108-250)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％一致性的表位。[0432]在一些实施例中，修饰的内源性细胞表面分子是cd20的版本。人cd20多肽是由氨基酸序列为seq id no:370的跨膜4结构域亚家族a成员(ms4a1)基因编码的多途径跨膜蛋白。在一些实施例中，cd20包含4个跨膜结构域途径，其包括氨基酸57-78、85-105、121-141和189-209。在一些实施例中，cd20包含2个包含氨基酸79-84和142-188的胞外结构域。在一些实施例中，cd20包含3个包含氨基酸1-56、106-120和210-297的细胞质结构域。在一些实施例中，cd20多肽可以相对于野生型多肽缺失多个结构域或结构域的多个部分。在实施例中，cd20多肽包含内源性cd20的m1-e263、m117-n214、m1-n214、v82-n214或v82-i186。在实施例中，cd20多肽与选自seq id no:370的k142-s185、p160-s185或c167-c183的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的一致性。在说明性实施例中，截短的cd20版本包含至少一个拷贝的由单克隆抗体识别的表位，所述单克隆抗体为例如奥瑞组单抗(ocrelizumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫单抗(tositumomab)、乌妥昔单抗(ublituximab)，并且在另外的说明性实施例中为利妥昔单抗(rituximab)。[0433]在一些实施例中，修饰的内源性细胞表面分子是cd52的版本。cd52在人类中作为其c端与gpi锚连接的12个氨基酸的肽内源性存在。在一些实施例中，gpi可以用于将多肽锚定于细胞表面。在其它实施例中，cd52可以使用异源跨膜结构域附着于细胞表面。在一些实施例中，截短的cd52多肽可以掺入一种或多种由抗体识别的表位，所述抗体为例如hi186(biorad)、yth34.5(biorad)、yth66.9(biorad)，或在说明性实施例中为阿仑单抗(alemtuzumab)。在一些实施例中，cd52表位与seq id no:371的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的一致性。[0434]在一些实施例中，细胞标签本身是结合预定结合配偶体抗体的抗体。在说明性实施例中，细胞标签抗体是抗独特型抗体。在一些实施例中，抗独特型抗体(ab2)识别与ab1上的抗原结合位点不同的预定结合配偶体抗体(ab1)上的表位。在说明性实施例中，ab2结合ab1的可变区。在其它说明性实施例中，ab2结合ab1的抗原结合位点。在某些实施例中，ab2可以来自任何动物，包括人和鼠，或人源化或嵌合抗体或抗体衍生物，包括抗体片段(fab、fab'、f(ab')2、scfv、双抗体、双特异性抗体，和抗体融合蛋白。在某些实施例中，ab2通过其内源性跨膜结构域与细胞表面缔合。在其它实施例中，ab2通过异源跨膜结构域或膜附着序列如gpi与细胞表面缔合。在一些实施例中，ab1是市售的单克隆抗体。在说明性实施例中，ab1是市售的单克隆抗体治疗剂。在另外的说明性实施例中，ab1能够介导如下所述的adcc和/或cdc。在wo2013188864中提供了结合对的实例，所述结合对包括在细胞系上显示的抗独特型抗体(及其制备方法)和介导adcc和cdc的同源单克隆ab2抗体。[0435]在一些实施例中，安全开关还起标记或标注聚核苷酸、多肽或如经工程改造的细胞的标记(flag)的作用。可以使用标准实验室技术(包括pcr、southern印迹、rt-pcr、northern印迹、蛋白质印迹、组织学和流式细胞术)来检测这类安全开关。例如，通过流式细胞术检测etag在本文中被用作用于在小鼠中t细胞植入的体内追踪标记物。在其它实施例中，使用任选地结合至固体底物如柱或珠粒的抗体或配体，使用细胞标签来富集工程改造的细胞。例如，其它已经表明，生物素化的西妥昔单抗与抗生物素微珠结合应用于免疫磁选择成功地富集了t细胞，所述t细胞已用含有etag的构建体自低至2％的群体慢病毒转导至大于90％纯度，而对细胞制剂无可观测毒性。[0436]在一些实施例中，安全开关被表达为还包括car的单个聚核苷酸的一部分，或被表达为包括淋巴增生性元件的单个聚核苷酸的一部分，或被表达为编码car和淋巴增生性元件的单个聚核苷酸。在一些实施例中，编码安全开关的聚核苷酸通过内部核糖体进入位点(ires)或核糖体跳跃序列和/或裂解信号与编码car的聚核苷酸和/或编码淋巴增生性元件的聚核苷酸分离。核糖体跳跃和/或裂解信号可以是本领域中已知的任何核糖体跳跃序列和/或裂解信号。核糖体跳跃序列可以是，例如，具有氨基酸序列gsgegrgslltcgdveenpgp(seq id no:83)的t2a。裂解信号和核糖体跳跃序列的其它实例包括fmdv 2a(f2a)；马a型鼻炎病毒2a(简称e2a)；猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1 2a(p2a)；扁刺蛾属(thoseaasigna)病毒2a(t2a)。[0437]在一些实施例中，安全开关和在说明性实施例中细胞标签被表达为与car融合的融合多肽的一部分。在其它实施例中，表达安全开关，并且如本文经验性举例说明的，细胞标签，其与淋巴增生性元件融合。这类构建体与单独的多肽相比提供，尤其结合本文中提供的其它“空间节省”元件，在rna基因组上占用更少的基因组空间的优势。在一个说明性实施例中，etag被表达为融合多肽，其与c-jun结构域(seq id no:104)、来自csf2ra的跨膜结构域(seq id no:129)、来自mpl的第一胞内结构域(seq id no:283)和来自cd40的第二胞内结构域(seq id no:208)的5'末端融合。当被表达为未与car或淋巴增生性元件融合的多肽时，细胞标签可以通过其天然膜附着序列或通过异源膜附着序列如gpi-锚或跨膜序列与细胞膜相缔合。在说明性实施例中，细胞标签在t细胞和/或nk细胞上表达，但不在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒上表达。在一些实施例中，聚核苷酸、多肽和细胞包含2个或更多个安全开关。[0438]嵌合抗原受体[0439]在本发明的一些方面中，经工程改造的信号传导多肽是嵌合抗原受体(car)或编码car的聚核苷酸，为简单起见，其在本文中称为“car”。本公开的car包括：a)至少一个抗原特异性靶向区(astr)；b)跨膜结构域；和c)胞内活化结构域。在说明性实施例中，car的抗原特异性靶向区为抗体针对目标抗原的scfv部分。在说明性实施例中，胞内活化结构域来自cd3z、cd3d、cd3e、cd3g、cd79a、cd79b、dap12、fcerlg、fcgr2a、fcgr2c、dap10/cd28或zap70，且在一些其它说明性实施例中，来自cd3z。在说明性实施例中，car进一步包含共刺激结构域，例如上文在调节结构域章节中所提供的共刺激结构域中的任一个，且在其它说明性实施例中，共刺激结构域为4-1bb(cd137)、cd28、icos、ox-40、btla、cd27、cd30、gitr及hvem的胞内共刺激结构域。在一些实施例中，car包括上文列于跨膜结构域章节中的跨膜结构域中的任一个。[0440]本公开的car可存在于真核细胞(例如，哺乳动物细胞)的质膜中，其中合适的哺乳动物细胞包括(但不限于)细胞毒性细胞、t淋巴细胞、干细胞、干细胞的后代、祖细胞、祖细胞的后代及nk细胞、nk-t细胞及巨噬细胞。当存在于真核细胞的质膜中时，本公开的car在存在一个或多个目标抗原(在某些条件下，结合astr)下经活化。目标抗原为特异性结合对的第二成员。特异性结合对的目标抗原可为可溶性(例如，未结合至细胞)因子；存在于如靶细胞的细胞的表面上的因子；存在于实体表面上的因子；存在于脂质双层上的因子等。当astr为抗体，且特异性结合对的第二成员为抗原时，抗原可为可溶性(例如，未结合至细胞)抗原；存在于如靶细胞的细胞的表面上的抗原；存在于实体表面上的抗原；存在于脂质双层上的抗原等。[0441]在一些实施例中，car的astr被表达为与胞内信号传导结构域分离的多肽。在这类实施例中，一种或两种多肽可以包括本文公开的任何跨膜结构域。在一些实施例中，一种或两种多肽可以包括异源信号序列和/或异源膜附着序列。在一些实施例中，异源膜连接序列为gpi锚定连接序列。[0442]在一些情况下，本公开的car在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，使细胞中的至少一个核酸的表达增加。举例来说，在一些情况下，本公开的car在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，与在不存在一种或多种目标抗原下的核酸的转录水平相比，使细胞中的至少一个核酸的表达增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍，或大于10倍。[0443]作为实例，本公开的car可包括含有基于免疫受体酪氨酸的活化模体(itam)的胞内信号传导多肽。[0444]在一些情况下，本公开的car在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，可使得细胞产生一种或多种细胞因子增加。举例来说，本公开的car在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，与在不存在一种或多种目标抗原下细胞所产生的细胞因子量相比，可使得细胞产生细胞因子增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍，或大于10倍。其产量可增加的细胞因子包括(但不限于)干扰素γ(ifn-γ)、肿瘤坏死因子-α(tnf-a)、il-2、il-15、il-12、il-4、il-5、il-10；趋化因子；生长因子等。[0445]在一些实施例中，当存在于真核细胞的质膜中时且当由一种或多种目标抗原活化时，本公开的car可引起细胞中核酸的转录增加和由细胞产生的细胞因子增加。[0446]在一些情况下，本公开的car在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，产生细胞朝向靶细胞的细胞毒性活性，所述靶细胞在其细胞表面上表达抗原，所述抗原与car的第一多肽的抗原结合结构域结合。举例来说，当真核细胞为细胞毒性细胞(例如，nk细胞或细胞毒性t淋巴细胞)时，本公开的car在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，使细胞朝向靶细胞的细胞毒性活性增加，所述靶细胞在其细胞表面上表达一种或多种目标抗原。举例来说，当真核细胞为nk细胞或t淋巴细胞时，本公开的car在存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，与在不存在一种或多种目标抗原下的细胞的细胞毒性活性相比，使得细胞的细胞毒性活性增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍，或大于10倍。[0447]在一些实施例中，当存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，本公开的car可引起其它car活化相关事件，如增殖和扩增(归因于细胞分裂增加或抗细胞凋亡反应)。[0448]在一些实施例中，当存在于真核细胞的质膜中时且由一种或多种目标抗原活化时，本公开的car可引起其它car活化相关事件，如胞内信号传导调节、细胞分化或细胞死亡。[0449]在一些实施例中，本公开的car受微环境限制。此特性通常为car的astr结构域的受微环境限制性质的结果。因此，本公开的car可具有较低结合亲和力或在说明性实施例中，在微环境的条件下比在正常生理环境的条件下可具有针对一种或多种目标抗原的更高结合亲和力。[0450]在某些说明性实施例中，除胞内活化结构域以外，本文中所提供的car包含共刺激结构域，其中共刺激结构域是本文中所提供的用于淋巴增生性元件(le)的胞内信号传导结构域中的任一个，例如cle的胞内结构域。在某些说明性实施例中，本文中的car的共刺激结构域是本文中关于cle鉴别的第一胞内结构域(p3结构域)或p4结构域，其作为在不存在p3结构域的情况下本文中的cle的有效胞内信号传导结构域展示。此外，在某些说明性实施例中，car的共刺激结构域可以包含本文中关于cle鉴别的p3和p4胞内信号传导结构域。某些说明性子实施例尤其包括如本文中关于cle鉴别的有效p3和p4配偶体胞内信号传导结构域。在说明性实施例中，共刺激结构域不是car的含有itam的胞内结构域，其作为共刺激结构域的一部分或在其它说明性实施例中，作为唯一的共刺激结构域。[0451]在这些包括car的实施例中，所述car具有本文中鉴别的共刺激结构域作为le的有效胞内结构域，car的共刺激结构域可以是本文中所提供的表1中的任何胞内信号传导结构域。表1中的任何胞内结构域的活性片段可以是car的共刺激结构域。在说明性实施例中，car的astr包含scfv。在说明性实施例中，除cle的c-刺激性胞内结构域以外，这些car包含胞内活化结构域，其在说明性实施例中是cd3z、cd3d、cd3e、cd3g、cd79a、cd79b、dap12、fcerlg、fcgr2a、fcgr2c。dap10/cd28，或zap70胞内活化结构域，或在其它说明性实施例中是cd3z胞内活化结构域。[0452]在这些说明性实施例中，car的共刺激结构域可以包含胞内结构域或其功能性信号传导片段，所述胞内结构域或其功能性信号传导片段包括来自以下的信号传导结构域：csf2rb、crlf2、csf2ra、csf3r、epor、ghr、ifnar1、ifnar2、ifngr1、ifngr2、ifnlr1、il1r1、il1rap、il1rl1、il1rl2、il2ra、il2rb、il2rg、il3ra、il5ra、il6r、il6st、il7ra、il9r、il10ra、il10rb、il11ra、il12rb1、il12rb2、il13ra1、il13ra2、il15ra、il17rb、il17rc、il17rd、il18r1、il18rap、il20ra、il20rb、il21r、il22ra1、il23r、il27ra、il31ra、lepr、lifr、lmp1、mpl、myd88、osmr或prlr。在一些实施例中，car的共刺激结构域可以包括胞内结构域或其功能性信号传导片段，所述胞内结构域或其功能性信号传导片段包括来自以下的信号传导结构域：csf2rb、crlf2、csf2ra、csf3r、epor、ghr、ifnar1、ifnar2、ifngr1、ifngr2、ifnlr1、il1r1、il1rap、il1rl1、il1rl2、il2ra、il2rb、il2rg、il3ra、il5ra、il6r、il6st、il9r、il10ra、il10rb、il11ra、il13ra1、il13ra2、il17rb、il17rc、il17rd、il18r1、il18rap、il20ra、il20rb、il22ra1、il31ra、lepr、lifr、lmp1、mpl、myd88、osmr或prlr。在一些实施例中，car的共刺激结构域可以包括胞内结构域或其功能性片段，所述胞内结构域或其功能性片段包括来自以下的信号传导结构域：csf2rb、csf2ra、csf3r、epor、ifngr1、ifngr2、il1r1、il1rap、il1rl1、il2ra、il2rg、il5ra、il6r、il9r、il10rb、il11ra、il12rb1、il12rb2、il13ra2、il15ra、il17rd、il21r、il23r、il27ra、il31ra、lepr、mpl、myd88或osmr。在一些实施例中，car的共刺激结构域可以包括胞内结构域或其片段，所述胞内结构域或其片段包括来自以下的信号传导结构域：csf2rb、csf2ra、csf3r、epor、ifngr1、ifngr2、il1r1、il1rap、il1rl1、il2ra、il2rg、il5ra、il6r、il9r、il10rb、il11ra、il13ra2、il17rd、il31ra、lepr、mpl、myd88或osmr。在一些实施例中，car的共刺激结构域可以包括胞内结构域或其功能性信号传导片段，所述胞内结构域或其功能性信号传导片段包括来自以下的信号传导结构域：csf2rb、csf3r、ifnar1、ifngr1、il2rb、il2rg、il6st、il10ra、il12rb2、il17rc、il17re、il18r1、il27ra、il31ra、mpl、myd88、osmr或prlr。在一些实施例中，car的共刺激结构域可以包括胞内结构域或其功能性信号传导片段，所述胞内结构域或其功能性信号传导片段包括来自以下的信号传导结构域：csf2rb、csf3r、ifngr1、il2rb、il2rg、il6st、il10ra、il17re、il31ra、mpl或myd88。[0453]在一些实施例中，car的共刺激结构域可以包括胞内结构域或其片段，所述胞内结构域或其片段包括来自以下的信号传导结构域：csf3r、il6st、il27ra、mpl和myd88。在某些说明性子实施例中，car的胞内活化结构域是来源于cd3z。[0454]重组t细胞受体(tcr)[0455]t细胞受体(tcr)识别来源于胞内和胞外蛋白的特异性蛋白质片段。当蛋白质分解成肽片段时，其与另一种称为主要组织相容复合物或mhc的蛋白质一起呈现于细胞表面上，所述蛋白质在人类中被称为hla(人类白细胞抗原)复合物。脊椎动物中的三种不同的t细胞抗原受体组合是αβtcr、γδtcr和pre-tcr。这类组合是由二聚亚型的成员(如tcr子单元和βtcr子单元、γtcr子单元和δtcr子单元以及对于pre-tcr，ptα子单元和βtcr子单元)之间的二聚作用形成。tcr子单元的集合二聚合且识别在mhc情形下呈现的目标肽片段。pre-tcr仅在未成熟αβt细胞的表面表达，而αβtcr在成熟αβt细胞和nk t细胞的表面表达，并且γδtcr在γδt细胞的表面表达。t细胞表面的αβtcr识别mhci或mhcii呈递的肽，并且nk t细胞表面的αβtcr识别cd1呈递的脂质抗原。γδtcr可以识别mhc和mhc样分子，也可以识别非mhc分子，例如病毒糖蛋白。在配体识别后，αβtcr和γδtcr通过cd3ζ链传输活化信号，其刺激t细胞增殖和细胞因子分泌。[0456]tcr分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于v区中，其中cdr3与cdr1和cdr2相比具有更高的可变性，直接决定tcr的抗原结合特异性。当mhc-抗原肽复合物由tcr识别时，cdrl和cdr2识别且结合mhc分子抗原结合通道的侧壁，且cdr3直接结合于抗原肽。因此，重组tcr可被工程改造，其识别呈现于mhc上的肿瘤特异性蛋白质片段。[0457]因此，可产生具有针对肿瘤特异性蛋白质的特异性的重组tcr，如来源于识别具有通用hla的特异性肽人类tcrα和tcrβ对的tcr(schmitt,tm等人,2009)。重组tcr的目标可以是来源于本文中所提供的car astr的任何抗原目标的肽，但更通常是来源于胞内肿瘤特异性蛋白质，如癌胚抗原，或正常胞内蛋白质的突变型变体或其它癌症特异性新抗原决定基。可以针对tcr子单元对目标抗原的选择性来筛选tcr子单元的库。天然和/或重组tcr子单元的筛选可以识别对目标抗原具有高亲和力和/或反应性的tcr子单元的集合。可以选择和克隆tcr子单元的这类集合的成员以产生一种或多种编码tcr子单元的聚核苷酸。[0458]在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒中可以包括编码tcr子单元的这类集合的聚核苷酸以基因修饰淋巴细胞或在说明性实施例中，t细胞或nk细胞，使得淋巴细胞表达重组tcr。因此，在本文提供的包括编码car的聚核苷酸或作为car的经工程改造的信号多肽的任何方面或实施例中，car可以被γδtcr链或在说明性实施例中，αβtcr链的集合替换。形成集合的tcr链可以使用多种不同技术来共表达，以共表达如本文中公开的两个tcr链以用于表达两种或更多种其它经工程改造的信号传导多肽，如car和淋巴增生性元件。举例来说，可以使用蛋白酶裂解抗原决定基(如2a蛋白酶)、内部核糖体进入位点(ires)和单独的启动子。[0459]已使用若干策略以降低混合tcr二聚体形成的可能性。通常，这涉及tcrα和tcrβ链的恒定(c)结构域的修饰以促进所引入的tcr链的彼此的优先配对，同时使其不大可能与内源性tcr链成功配对。一种展示一些前景的体外方法涉及用小鼠对应物置换人类tcrα和tcrβ链的c结构域。另一种方法涉及人类tcrα公共结构域和tcrβ链公共区的突变以促进自身配对，或病毒性基因构建体内的内源性tcrα和tcrβmirna的表达。因此，在本文中所提供的包括tcr链的一个或多个集合作为经工程改造的信号传导多肽的一些实施例中，tcr链，在说明性实施例中，αβtcr链的集合中的每个成员包含被修饰的恒定结构域，其促进彼此的优先配对。在一些子实施例中，tcr链，在说明性实施例中，αβtcr链的集合中的每个成员包含来自相同tcr链类型的小鼠恒定结构域，或来自相同的tcr链亚型的具有足够的来源于小鼠恒定结构域的序列的恒定结构域，所述小鼠恒定结构域是来自相同的tcr链亚型，使得tcr链的集合的彼此的二聚作用优先于与人类tcr链的二聚作用或以排除与人类tcr链的二聚作用的方式进行。在其它子实施例中，tcr链，在说明性实施例中，αβtcr链的集合中的每个成员包含其恒定结构域中的相应突变，使得tcr链的集合的彼此的二聚作用优先于与具有人类恒定结构域的tcr链的二聚作用或以排除与具有人类恒定结构域的tcr链的二聚作用的方式进行。在说明性实施例中，这类优选或排他性二聚作用是在生理条件下进行的。[0460]在本文提供的包括作为经工程改造的信号传导多肽的tcr链的一个或多个集合的一些实施例中，tcr链的一个或多个集合中的每个集合的成员的恒定区被交换。因此，集合的αtcr亚基具有βtcr恒定区，并且集合的βtcr亚基具有αtcr恒定区。不受理论的限制，认为这类交换可以防止与内源性对应物的错配。[0461]淋巴增生性元件[0462]本文中所提供的许多实施例包括淋巴增生性元件，或编码其的核酸，通常作为经工程改造的信号传导多肽的一部分。因此，在本发明的一些方面中，例如对于待通过皮下注射引入或再引入的修饰的和/或基因修饰的淋巴细胞，经工程改造的信号传导多肽为淋巴增生性元件(le)，如嵌合淋巴增生性元件(cle)。通常，le包含胞外结构域、跨膜结构域及驱动增殖的至少一个胞内信号传导结构域，且在说明性实施例中，包含第二胞内信号传导结构域。[0463]le的胞外结构域、跨膜结构域及胞内结构域可改变其各别氨基酸长度。举例来说，对于包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的实施例，存在对可包装至反转录病毒颗粒中以使具有较短氨基酸序列的le可在某些说明性实施例中有利的聚核苷酸的长度的限制。在一些实施例中，le的总长度可在3个与4000个氨基酸之间，例如在10个与3000个氨基酸、10个与2000个氨基酸、50个与2000个氨基酸、250个与2000个氨基酸之间，且在说明性实施例中，在50个与1000个氨基酸、100个与1000个氨基酸或250个与1000个氨基酸之间。当存在以形成胞外结构域及跨膜结构域时，胞外结构域可在1个与1000个氨基酸之间，且通常在4个与400个氨基酸之间，在4个与200个氨基酸之间，在4个与100个氨基酸之间，在4个与50个氨基酸之间，在4个与25个氨基酸之间或在4个与20个氨基酸之间。在一个实施例中，胞外区为针对本发明的此方面的胞外结构域及跨膜结构域的gggs。跨膜结构域或胞外结构域及跨膜结构域的跨膜区可在10个与250个氨基酸之间，且更通常长度为至少15个氨基酸，且长度可例如在15个与100个氨基酸、15个与75个氨基酸、15个与50个氨基酸、15个与40个氨基酸、15个与30个氨基酸之间。胞内信号传导结构域可例如在10个与1000个氨基酸、10个与750个氨基酸、10个与500个氨基酸、10个与250个氨基酸或10个与100个氨基酸之间。在说明性实施例中，胞内信号传导结构域可为至少30个氨基酸，或在30个与500个氨基酸、30个与250个氨基酸、30个与150个氨基酸、30个与100个氨基酸、50个与500个氨基酸、50个与250个氨基酸、50个与150个氨基酸或50个与100个氨基酸之间。在一些实施例中，具体基因的胞内信号传导结构域与来自所述胞内信号传导结构域的序列(如本文中所提供的所述胞内结构域的序列)的至少10、25、30、40或50个或所有氨基酸(最多整个胞内结构域序列的尺寸)至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致，且可以包括例如最多额外1、2、3、4、5、10、20或25个氨基酸，限制条件是这类序列仍能够提供本文中所公开的le的任何特性。[0464]在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括第一和/或第二胞内信号传导结构域。在一些实施例中，第一和/或第二胞内信号传导结构域可以包括cd2、cd3d、cd3e、cd3g、cd4、cd8a、cd8b、cd27、突变的δlck cd28、cd28、cd40、cd79a、cd79b、crlf2、csf2rb、csf2ra、csf3r、epor、fcer1g、fcgr2c、fcgra2、ghr、icos、ifnar1、ifnar2、ifngr1、ifngr2、ifnlr1、il1r1、il1rap、il1rl1、il1rl2、il2ra、il2rb、il2rg、il3ra、il4r、il5ra、il6r、il6st、il7ra、il9r、il10ra、il10rb、il11ra、il12rb1、il12rb2、il13ra1、il13ra2、il15ra、il17ra、il17rb、il17rc、il17rd、il17re、il18r1、il18rap、il20ra、il20rb、il21r、il22ra1、il23r、il27ra、il31ra、lepr、lifr、lmp1、mpl、myd88、osmr、prlr、tnfrsf4、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfrsf14或tnfrsf18，或其功能性突变体和/或片段。在说明性实施例中，第一胞内信号传导结构域可以包括myd88或其功能性突变体和/或片段。在其它说明性实施例中，第一胞内信号传导结构域可以包括myd88或其功能性突变体和/或片段，且第二胞内信号传导结构域可以包括icos、tnfrsf4或tnsfr18或其功能性突变体和/或片段。在一些实施例中，第一胞内结构域是myd88且第二胞内结构域是含有itam的胞内结构域，例如来自cd3z、cd3d、cd3e、cd3g、cd79a、cd79b、dap12、fcerlg、fcgr2a、fcgr2c、dap10/cd28或zap70的胞内结构域。在一些实施例中，第二胞内信号传导结构域可以包括tnfrsf18或其功能性突变体和/或片段。[0465]在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括胞外结构域与跨膜结构域的融合物。在一些实施例中，胞外结构域与跨膜结构域的融合物可以包括etag il7ra ins ppcl(介白素7受体)、myc lmp1、lmp1、etag crlf2、etag csf2rb、etag csf3r、etag epor、etag ghr、在fn f523c il27ra之后截短的etag或在fn s505n mpl之后截短的etag，或其功能性突变体和/或片段。在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括胞外结构域。在一些实施例中，胞外结构域可以包括在羧基端具有0、1、2、3或4个额外丙氨酸的细胞标签。在一些实施例中，胞外结构域可以包括在羧基端具有0、1、2、3或4个额外丙氨酸的myc或etag或其功能性突变体和/或片段。对于本文公开的包括细胞标签的淋巴增生性元件的任何实施例，存在相同但缺少细胞标签并且任选地缺少将细胞标签连接到淋巴增生性元件的任何连接子序列的相应实施例。[0466]在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域可以包括来自以下的跨膜结构域：baffr、c3z、ceacam1、cd2、cd3a、cd3b、cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、cd4、cd5、cd7、cd8a、cd8b、cd9、cd11a、cd11b、cd11c、cd11d、cd27、cd16、cd18、cd19、cd22、cd28、cd29、cd33、cd37、cd40、cd45、cd49a、cd49d、cd49f、cd64、cd79a、cd79b、cd80、cd84、cd86、cd96(tactile)、cd100(sema4d)、cd103、c134、cd137、cd154、cd160(by55)、cd162(selplg)、cd226(dnam1)、cd229(ly9)、cd247、crlf2、crtam、csf2ra、csf2rb、csf3r、epor、fcer1g、fcgr2c、fcgra2、ghr、hvem(lightr)、ia4、icos、ifnar1、ifnar2、ifngr1、ifngr2、ifnlr1、il1r1、il1rap、il1rl1、il1rl2、il2ra、il2rb、il2rg、il3ra、il4r、il5ra、il6r、il6st、il7ra、il7ra ins ppcl、il9r、il10ra、il10rb、il11ra、il12rb1、il12rb2、il13ra1、il13ra2、il15ra、il17ra、il17rb、il17rc、il17rd、il17re、il18r1、il18rap、il20ra、il20rb、il21r、il22ra1、il23r、il27ra、il31ra、itga1、itga4、itga6、itgad、itgae、itgal、itgam、itgax、itgb1、itgb2、itgb7、kirds2、lepr、lfa-1(cd11a、cd18)、lifr、ltbr、mpl、nkp80(klrf1)、osmr、pag/cbp、prlr、psgl1、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、slamf4(cd244、2b4)、slamf6(ntb-a、ly108)、slamf7、slamf8(blame)、tnfr2、tnfrsf4、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfrsf14、tnfrsf18、vla1或vla-6，或其功能突变体和/或片段[0467]用于本文中的任何方面或实施例的cle可以包括wo2019/055946(其以全文引用的方式并入本文中)中公开的任何cle，其绝大部分被设计成且被认为具有组成性活性，通常是因为它们组成性地活化信号传导路径。在一些实施例中，组成型活性信号传导途径包括jak/stat途径的活化，所述途径包括jak1、jak2、jak3和tyk2以及stat，例如stat1、stat2、stat3、stat4、stat5、stat6，并且在说明性实施例中，stat3和/或stat5。在一些实施例中，cle包括一个或多个stat活化结构域。在一些实施例中，cle包括两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个或更多个stat活化结构域。在一些实施例中，一个或多个stat活化结构域中的至少一个是或衍生自如本领域已知的blnk、il2rg、egfr、epor、ghr、ifnar1、ifnar2、ifnar1/2、ifnlr1、il10r1、il12rb1、il12rb2、il21r、il2rb、il2small、il7r、il7ra、il9r、il15r和il21r。在一些实施例中，两个或更多个stat活化结构域是或衍生自两个或更多个不同的受体。在一些实施例中，组成型活性信号传导途径包括通过活化tnf受体相关因子如traf3、traf4、traf7并且在说明性实施例中traf1、traf2、traf5和/或traf6来活化traf途径。因此，在某些实施例中，用于本文的任何试剂盒、方法、用途或组合物中的淋巴增生性元件是组成型活性的，并且包含活化jak/stat路径和/或traf路径的胞内信号传导结构域。在一些实施例中，组成型活性信号传导路径包括pi3k路径的活化。在一些实施例中，组成型活性信号传导路径包括plc路径的活化。因此，在某些实施例中，用于本文的任何试剂盒、方法、用途或组合物中的淋巴增生性元件是组成型活性的，并且包括活化jak/stat路径、traf路径、pi3k路径和/或plc路径的胞内信号传导结构域。如其中所示，在其中存在cle的第一和第二胞内信号传导结构域的情况下，第一胞内信号传导结构域位于膜缔合模体(例如跨膜结构域)和第二胞内结构域之间。[0468]在一些实施例中，本文提供的淋巴增生性元件包括一个或多个或所有的结合结构域(包括本文公开的那些)，其负责在自然界中在相应的淋巴增生性元件中发现的信号传导。在一些实施例中，本文提供的淋巴增生性元件包括一个或多个jak结合结构域。在一些实施例中，jak结合结构域是或衍生自epor、gp130、prlr、ghr、gcsfr或tpor/mplr。来自这些蛋白质的jak结合结构域是本领域中已知的，并且技术人员将理解如何使用它们。例如，已知epor的残基273-338和tpor的残基478-582是jak结合结构域。已知在负责此信号传导的细胞因子受体的胞内结构域中发现的保守性模体并且存在于本文提供的某些例示性淋巴增生性元件中(参见例如morris等人,《通过jak/stat路径进行的细胞因子信号传导的分子细节(the molecular details of cytokine signaling via the jak/stat pathway)》,《蛋白质科学(protein science)》(2018)27:1984-2009)。box1和box2模体涉及与jak的结合和信号转导，但增殖信号并非始终需要存在box2模体(murakami等人,《美国国家科学院院刊》,1991年12月15日；88(24):11349-53；fukunaga等人《欧洲分子生物学杂志(embo j.)》,1991年10月；10(10):2855-65；以及o'neal和lee.,《淋巴因子细胞因子研究(lymphokine cytokine res.)》1993年10月；12(5):309-12)。因此，在一些实施例中，本文中的淋巴增生性元件是含有转基因box1的细胞因子受体，其包括细胞因子受体的胞内结构域，所述胞内结构域包含box1 janus激酶(jak)结合模体、任选的box2 jak结合模体和包含酪氨酸残基的信号转导子和转录活化子(stat)结合模体。在一些实施例中，淋巴增生性元件包括两个或更多个jak结合模体，例如三个或更多个或四个或更多个jak结合模体，其在说明性实施例中是在相应的淋巴增生性元件的天然形式中发现的结合模体。[0469]来自ifnar1、ifngr1、ifnlr1、il2rb、il4r、il5rb、il6r、il6st、il7ra、il9r、il10ra、il21r、il27r、il31ra、lifr和osmr的胞内结构域在本领域中已知用于活化jak1信号传导，并且因此包括jak1结合模体。来自crlf2、csf2ra、csf2rb、csf3r、epor、ghr、ifngr2、il3ra、il5ra、il6st、il20ra、il20rb、il23r、il27r、lepr、mpl和prlr的胞内结构域在本领域中已知用于活化jak2，并且因此包括jak2结合模体。来自il2rg的胞内结构域在本领域中已知用于活化jak3，并且因此包括jak3结合模体。来自ghr、ifnar1、ifnar2、ifngr1、ifngr2、il2rb、il2rg、il4r、il5ra、il5rb、il7ra、il9r、il21r、il22ra1、il31ra、lifr、mpl及osmr的胞内结构域在所属领域中已知用于活化stat1。来自ifnar1及ifnar2的胞内结构域在所属领域中已知用于活化stat2。来自ghr、il2rb、il2rg、il6r、il7ra、il9r、il10ra、il10rb、il21r、il22ra1、il23r、il27r、il31ra、lepr、lifr、mpl及osmr的胞内结构域在所属领域中已知用于活化stat3。来自il12rb1的胞内结构域在所属领域中已知用于活化stat4。来自csf2ra、csf2rb、csf3r、epor、ghr、il2rb、il2rg、il3ra、il4r、il5ra、il5rb、il7ra、il9r、il15ra、il20ra、il20rb、il21r、il22ra1、il31ra、lifr、mpl、osmr及prlr的胞内结构域在所属领域中已知用于活化stat5。来自il4r及osmr的胞内结构域在所属领域中已知用于活化stat6。发现于第一胞内结构域中的基因及其胞内结构域与任选的第二胞内结构域相同，除如果第一胞内结构域及第二胞内结构域相同，那么至少一个且通常跨膜结构域及胞外结构域皆不来自相同基因以外。[0470]在一些实施例中，本文的淋巴增生性元件可以包括包含一个或多个box1模体的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实施例中，包含一个或多个box1模体的一个或多个胞内信号传导结构域可以是il7ra(在seq id nos:248和249的残基9-17处的box1模体)、il12rb(在seq id nos:254和255的残基10-12处的box1模体；以及seq id no:256的残基107-110和139-142)、il31ra(在seq id nos:275和276的残基12-15处的box1模体)、csf2rb(在seq id no:213的残基14-22处的box1模体)、il2rb(在seq id no:240的残基13-21处的box1模体)、il6st(在seq id no:247的残基10-18处的box1模体)、il2rg(在seq id no:241的残基3-11处的box1模体)、il27ra(在seq id no:273的残基17-25处的box1模体)、mpl(在seq id no:283的残基17-20处的box1模体)、osmr(在seq id no:294的残基16-30处的box1模体)、ifnar2(在seq id no:227的残基23-31处的box1模体)、csf3r或epor(在全长epor的残基257-264处的box1模体)。[0471]在一些实施例中，本文的淋巴增生性元件可以包括包含一个或多个box2模体的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实施例中，包含一个或多个box2模体的一个或多个胞内信号传导结构域可以是mpl(在seq id no:283中的残基46-64处的box2模体)、ifnar2(在seq id no:227的残基37-46处的box1模体)、csf3r或epor(在全长epor的残基303-313处的box2模体)。epor还包含对结合酪氨酸激酶受体kit重要的扩展的box2模体(全长epor的残基329–372)，在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括该box2模体。csf3r还包含box3模体，在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括该box3模体。[0472]一些胞内信号传导结构域在相对于box1模体的位置-1、-2和-6处具有疏水性残基，其形成细胞因子诱导的jak2活化但不是jak2结合所需的“开关模体”(constantinescu等人,《分子细胞》,2001年2月；7(2):377-85；和huang等人,《分子细胞》,2001年12月；8(6):1327-38)。因此，在某些实施例中，含有box1模体的淋巴增生性元件具有开关模体，其在说明性实施例中在相对于box1模体的位置-1、-2和-6处具有一个或多个并且优选地全部疏水性残基。在某些实施例中，box1模体，淋巴增生性元件的icd相对于box2模体位于跨膜(tm)结构域的近侧(例如tm结构域下游的5至15个或约10个残基)，所述box2模体相对于stat结合模体位于跨膜结构域的近侧(例如tm结构域下游的10至50个残基)。stat结合模体通常包含酪氨酸残基，其磷酸化影响stat与淋巴增生性元件的stat结合模体的结合。在一些实施例中，icd包含多个stat结合模体，其中多个stat结合模体存在于天然icd中(例如，epo受体和il-6受体信号传导链(gp130))。在一些实施例中，含有胞内信号传导结构域的开关模体可以是mpl(在seq id no:283的残基11、15和16处的开关模体)。[0473]在一些实施例中，本文的淋巴增生性元件可以包括一个或多个胞内信号传导结构域，所述一个或多个胞内信号传导结构域包括一个或多个可磷酸化残基，例如，可磷酸化的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸。在一些实施例中，包括一个或多个可磷酸化残基的一个或多个胞内信号传导结构域可以是il31ra(在seq id no:275的残基y96、y237和y165处的可磷酸化的酪氨酸；不存在于seq id no:276中)、cd27(在seq id no:205的残基s6处的可磷酸化的丝氨酸)、csf2rb(在seq id no:213的残基y306处的可磷酸化的酪氨酸)、il6st(在seq id no:247的残基s20、s26、s141、s148、s188和s198处的可磷酸化的丝氨酸)、mpl(在seq id no:283的残基y8、y29、y78、y113和y118处的可磷酸化的酪氨酸)、cd79b(在seq id no:211的残基y16和y27处的可磷酸化的酪氨酸)、osmr(在seq id no:294的残基s65和s128处的可磷酸化的丝氨酸)或cd3g(在全长cd3g的残基s123和s126处的可磷酸化的丝氨酸)。在一些实施例中，包括csf3r胞内结构域的淋巴增生性元件可以包括对应于全长csf3r的y704、y729、y744和y764的酪氨酸残基中的一个、两个、三个或全部，其各种组合已显示出对结合stat3、socs3、grb2和p21ras很重要。在一些实施例中，本文的淋巴增生性元件可以包括一个或多个胞内信号传导结构域，所述一个或多个胞内信号传导结构域具有突变为磷模拟残基例如天冬氨酸或谷氨酸的一个或多个其可磷酸化的残基。在一些实施例中，本文的淋巴增生性元件可以包括一个或多个胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域具有突变为不可磷酸化的残基例如丙氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸的一个或多个其可磷酸化的酪氨酸。在一些实施例中，包含csf3r胞内结构域的淋巴增生性元件可以包含一个或多个对应于全长csf3r的t615a和t618i的突变，这些突变已经显示出增加受体二聚化和活性。[0474]在一些实施例中，本文的淋巴增生性元件可以包括包含一个或多个泛素化靶向模体残基的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实施例中，包含一个或多个泛素化靶向模体残基的一个或多个胞内信号传导结构域可以是mpl(在seq id no:283的k40和k60处的残基)或ox40(在seq id no:296的k17和k41处的残基)。在本文的一些实施例中，包含泛素化靶向模体残基的胞内结构域可以具有突变为精氨酸或另一种氨基酸的一种或多种赖氨酸。[0475]在一些实施例中，本文的淋巴增生性元件可以包括包含一个或多个traf结合位点的一个或多个胞内信号传导结构域。不受理论的限制，traf1、traf2和traf3结合位点包括氨基酸序列pxqxt(seq id no:303)，其中每个x可以是任何氨基酸，不同的traf2结合位点包括共有序列sxxe(seq id no:304)，其中每个x可以是任何氨基酸，并且traf6结合位点包括共有序列qxpxex(seq id no:305)。在一些实施例中，包含一个或多个traf结合位点的一个或多个胞内信号传导结构域可以是cd40(在seq id no:208的残基35-39处的traf1、traf2和traf3的结合位点；在seq id no:208的残基57-60处的traf2结合位点；在seq id no:208的残基16-21处的traf6结合位点)或ox40(在seq id no:296的残基20-27处的traf1、traf2、traf3和traf5结合模体)。[0476]在一些实施例中，本文的淋巴增生性元件可以包括包含tir结构域的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实施例中，包含tir结构域的一个或多个胞内信号传导结构域可以是il17re(在seq id no:265的残基13-136处的tir结构域)、il18r1(在seq id no:266的残基28-170处的tir结构域)或myd88(在seq id no:284的残基160-304处的tir结构域)。[0477]在一些实施例中，本文的淋巴增生性元件可以包括包含pi3k结合模体结构域的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实施例中，包含pi3k结合模体的一个或多个胞内信号传导结构域可以是cd28(在seq id nos:206和207的残基12-15处的pi3k结合模体，其也结合grb2)、icos(在seq id no:225的残基19-22处的pi3k结合模体，其可以突变f21q以增加il-2产生和/或以结合grb2)，ox40(在全长ox40的残基34-57处的p85 pi3k结合模体)。[0478]在一些实施例中，本文的淋巴增生性元件可以包括包含二亮氨酸模体的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实施例中，包含二亮氨酸模体的一个或多个胞内信号传导结构域可以是ifngr2(在seq id no:230的残基8-9处的二亮氨酸模体)或cd3g(在全长cd3g的残基131-132处的二亮氨酸模体)。在一些实施例中，二亮氨酸模体中的一个或两个残基可以突变。[0479]在一些实施例中，本文的淋巴增生性元件可以包括包含一个或多个n末端死亡结构域的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实施例中，包含一个或多个n末端死亡结构域的一个或多个胞内信号传导结构域可以是myd88(在seq id no:284的残基29-106处的n末端死亡结构域)或tnfr。tnf受体(tnfr)的细胞质结构域，其在说明性实施例中可以是tnfrsf4、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfrsf14或tnfrsf18，可以募集信号传导分子，包括traf(tnf受体相关因子)和/或“死亡结构域”(dd)分子。诱导t细胞和/或nk细胞的增殖和/或存活的tnfr的结构域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别tnfr多肽中相应的结构域、模体和点突变。所属领域的技术人员将能够使用例如与已知的结合模体的序列比对来识别不同tnfr家族中的traf和/或dd结合模体。在一些实施例中，包括tnfr胞内结构域的淋巴增生性元件可以包括一个或多个traf结合模体。在一些实施例中，包括tnfr胞内结构域的淋巴增生性元件不包括dd结合模体，或具有在胞内结构域内缺失或突变的一个或多个dd结合模体。在一些实施例中，包括tnfr胞内结构域的淋巴增生性元件可以募集tradd和/或traf2。tnfr还包括富含半胱氨酸的结构域(crd)，其对于配体结合来说是重要的(locksley rm等人,《细胞》,2001年2月23日；104(4):487-501)。在一些实施例中，包括tnfr胞内结构域的淋巴增生性元件不包括tnfr crd。[0480]在一些实施例中，本文的淋巴增生性元件可以包括一个或多个胞内信号传导结构域，所述一个或多个胞内信号传导结构域包含与il-1r相关激酶相互作用的一个或多个中间结构域。在一些实施例中，包含一个或多个中间结构域的一个或多个胞内信号传导结构域可以是myd88(在seq id no:284的残基107-156处的中间结构域)。[0481]在一些实施例中，包含来自il7ra的胞内结构域的淋巴增生性元件可以包括s区或t区中的一个或多个(在残基359-394处的s区和在全长il7ra的残基y401、y449和y456处的t区)。在包括来源于il7ra的第一胞内结构域的淋巴增生性元件的说明性实施例中，第二胞内结构域可以来源于tnfrsf8。[0482]在包括来源于cd40的第一胞内结构域的淋巴增生性元件的说明性实施例中，第二胞内结构域可以不是来源于以下的胞内结构域：myd88、cd28家族成员(例如，cd28、icos)、模式识别受体、c反应性蛋白受体(即，nodi、nod2、ptx3-r)、tnf受体、cd40、rank/trance-r、ox40、4-1bb、hsp受体(lox-1及cd91)或cd28。模式识别受体包括(但不限于)内吞模式识别受体(即，甘露糖受体、清除剂受体(即，mac-1、lrp、肽聚醣、肌酸、毒素、cd11c/cr4))；外部信号模式识别受体(toll样受体(tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10)、肽聚醣识别蛋白质(pgrp结合细菌肽聚醣，和cd14)；内部信号模式识别受体(即，nod-受体1和2)和rig1。[0483]在一些实施例中，包括来自myd88的胞内结构域的淋巴增生性元件可以包括全长myd88中的突变l93p、r193c和l265p(seq id no:284中的突变l93p、r196c和l260p)中的一个或多个。在包括来源于myd88的第一胞内结构域的淋巴增生性元件的说明性实施例中，第二胞内结构域可以来源于tnfrsf4或tnfrsf8。在包括来源于myd88的第一胞内结构域的淋巴增生性元件的其它说明性实施例中，第二胞内结构域可以不是来源于以下的胞内结构域：cd28家族成员(例如，cd28、icos)、模式识别受体、c反应性蛋白受体、tnf受体或hsp受体。[0484]在一些实施例中，表达包含mpl的胞内和跨膜结构域的淋巴增生性元件的细胞可以与艾曲波帕接触或暴露于艾曲波帕，或可用艾曲波帕治疗已输注这类细胞的患者或受试者。不受理论的限制，艾曲波帕结合于mpl的跨膜结构域且诱导mpl的胞内结构域的活化。[0485]诱导t细胞和/或nk细胞的增殖和/或存活的mpl的结构域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别mpl多肽中相应的结构域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。缺失涵盖seq id no:283中的氨基酸70至95的区域被证明可以支持v-mpl的情形中的病毒转化(benit等人,《病毒学杂志(j virol.)》1994年8月；68(8):5270-4)，因此指示此区域于此情形中并非mpl的功能所必需。morello等人《血液(blood)》,1995年7月；86(8):557-71使用相同缺失以展示此区域并非刺激红细胞生成素受体反应性cat报导基因构建体的转录所需的且进一步发现此缺失引起关于去除此区域中的非必需和阴性元件所预期的略微增强的转录，如由drachman和kaushansky提出。因此，在一些实施例中，mpl胞内信号传导结构域不含包含seq id no:283中的氨基酸70至95的区域。使用计算机模拟，lee等人发现，mpl的跨膜结构域的临床相关突变应按以下次序的活化效果活化mpl：w515k(对应于seq id no:283的氨基酸取代w2k)》s505a(对应于seq id no:187的氨基酸取代s14a)》w515i(对应于seq id no:283的氨基酸取代w2i)》s505n(对应于seq id no:187的氨基酸取代s14n，其经测试为t075(seq id no:188))(lee等人，《科学公共图书馆综合卷(plos one.)》,2011；6(8):e23396)。预测这些突变的模拟可能造成jak2(mpl的激酶配偶体)的组成性活化。在一些实施例中，mpl的胞内部分可以包括seq id no:283中存在的本文中所描述的结构域和模体中的一个或多个或全部。在一些实施例中，mpl的跨膜部分可以包括seq id no:187中存在的本文中所描述的结构域和模体中的一个或多个或全部。在包括来源于mpl的第一胞内结构域的淋巴增生性元件的说明性实施例中，第二胞内结构域可以来源于cd79b。[0486]在包括来源于cd79b的第二胞内结构域的淋巴增生性元件的说明性实施例中，第一胞内结构域可以来源于csf3r。[0487]在一些实施例中，包含prlr胞内结构域的淋巴增生性元件可以包括prlr的生长激素受体结合结构域和任何已知的突变(在seq id no:295的残基28-104处的生长激素受体结合结构域)。[0488]在一些实施例中，包含icos胞内结构域的淋巴增生性元件可以包括钙信号传导模体(在seq id no:225的残基5-8处的钙信号传导模体)。在一些实施例中，包含icos胞内结构域的淋巴增生性元件可以包括第一保守模体和第二保守模体(分别位于seq id no:225的残基9-18和24-30处的第一保守模体和第二保守模体)中的至少一个。在一些实施例中，包含icos胞内结构域的淋巴增生性元件不包括第一保守模体或第二保守模体中的至少一个。[0489]epor还含有对于epor内化来说重要的短区段(全长epor的残基267-276)。在一些实施例中，包括epor胞内结构域的淋巴增生性元件不包括内化区段。[0490]诱导t细胞和/或nk细胞的增殖和/或存活的胞内信号传导结构域的结构域、模体和点突变在本领域中是已知的，并且技术人员可以鉴定多肽中的相应结构域、模体和点突变，其中一些是上述的，并且技术人员可以鉴定其它多肽中的相应结构域、模体和点突变。技术人员将能够使用例如与已知的结合模体的序列比对来鉴定相似多肽中的这些结构域、模体和点突变。在一些实施例中，本文中的淋巴增生性元件可以包括本文中所公开的或以其它方式已知诱导t细胞和/或nk细胞的增殖和/或存活的胞内信号传导结构域的任何一个，例如一个或多个直至所有的结构域、模体和突变。[0491]在另一实施例中，le提供、能够提供和/或具有以下特性(或用le修饰、基因修饰和/或转导的细胞能够提供、适用于、拥有以下特性和/或被修饰以用于)体内驱动t细胞扩增。[0492]在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括表1中列出的任何序列(seq id no:84-302)。表1展示在cle中测试的结构域的部分、名称(包括基因名称)和氨基酸序列。在某些说明性实施例中，cle可以包括胞外结构域(表示为p1)、跨膜结构域(表示为p2)、第一胞内结构域(表示为p3)和第二胞内结构域(表示为p4)。通常，淋巴增生性元件包括第一胞内结构域。在说明性实施例中，第一胞内结构域可以包括表1中列举为s036至s0216的部分中的任一个或其功能性突变体和/或片段。在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括第二胞内结构域。在说明性实施例中，第二胞内结构域可以包括表1中列举为s036至s0216的部分中的任一个或其功能性突变体和/或片段。在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括胞外结构域。在说明性实施例中，胞外结构域可以包括表1中列举为m001至m049或e006至e015的部分的序列中的任一个或其功能性突变体和/或片段。在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括跨膜结构域。在说明性实施例中，跨膜结构域可以包括表1中列举为m001至m049或t001至t082的部分中的任一个或其功能性突变体和/或片段。在一些实施例中，淋巴增生性元件可以是胞外/跨膜结构域(表1中的m001至m049)、第一胞内结构域(表1中的s036至s0216)和第二胞内结构域(表1中的s036至s216)的融合物。在一些实施例中，淋巴增生性元件可以是胞外结构域(表1中的e006至e016)、跨膜结构域(表1中的t001至t082)、第一胞内结构域(表1中的s036至s0216)和第二胞内结构域(表1中的s036至s0216)的融合物。举例来说，淋巴增生性元件可以是e006、t001、s036和s216的融合物，也写成e006-t001-s036-s216。在说明性实施例中，淋巴增生性元件可以是融合物e010-t072-s192-s212、e007-t054-s197-s212、e006-t006-s194-s211、e009-t073-s062-s053、e008-t001-s121-s212、e006-t044-s186-s053或e006-t016-s186-s050。[0493]在说明性实施例中，le的胞内结构域或具有两个或更多个胞内结构域的le中的第一胞内结构域不是来自含有itam的胞内结构域的功能性胞内活化结构域，例如来自cd3z、cd3d、cd3e、cd3g、cd79a、cd79b、dap12、fcerlg、fcgr2a、fcgr2c、dap10/cd28或zap70且在其它说明性实施例中，cd3z的胞内结构域。在说明性实施例中，le胞外结构域不包含单链可变片段(scfv)。在其它说明性实施例中，在与结合配偶体结合时活化le的le胞外结构域不包含单链可变片段(scfv)。cle不包含astr及来自以下的活化结构域：cd3z、cd3d、cd3e、cd3g、cd79a、cd79b、dap12、fcerlg、fcgr2a、fcgr2c、dap10/cd28或zap70。如果le确实包括astr(而不是先前列表中的活化结构域)，则在说明性实施例中le的astr不包括scfv。在一些实施例中，淋巴增生性元件不包括胞外结构域。[0494]在一些实施例中，淋巴增生性元件且在说明性实施例中cle未与细胞因子共价连接。在一些方面中，淋巴增生性元件且在说明性实施例中cle包含与其同源受体共价连接的细胞因子多肽。在这些实施例的任一个中，cle可以是组成型活性的，并且通常组成型活化与相应活化的野生型细胞因子受体相同的jak/stat和/或traf途径。在一些实施例中，嵌合细胞因子受体是白细胞介素。在一些实施例中，cle是与il7ra共价连接的il-7或与il15ra共价连接的il-15。在其它实施例中，cle不是共价连接到il15ra的il-15。在其它方面中，cle包含仅与其同源受体的一部分共价连接的细胞因子多肽，该同源受体包括能够结合细胞因子多肽的胞外结构域的功能部分，跨膜结构域和/或胞内结构域来自异源多肽，并且cle是组成型活性的。在一个实施例中，cle是与il7ra的胞外和跨膜结构域以及来自il2rb的胞内结构域共价连接的il-7。在另一实施例中，cle是共价连接至其同源受体的一部分的细胞因子多肽，所述部分包括能够结合细胞因子多肽的胞外结构域、异源跨膜结构域和本文提供的淋巴增生性元件胞内结构域的功能部分。在一些实施例中，淋巴增生性元件是不与细胞因子结合的细胞因子受体。[0495]在一些方面中，淋巴增生性元件能够与可溶性细胞因子或生长因子结合，并且这类结合是活性所必需的。在某些说明性实施例中，淋巴增生性元件是组成型活性的，因此不需要结合至可溶性生长因子或细胞因子来获得活性。通常，组成型活性淋巴增生性元件不结合可溶性细胞因子或生长因子。在一些实施例中，淋巴增生性元件是嵌合体，其包含来自一种受体的胞外结合结构域和来自不同受体的胞内信号传导结构域。在一些实施例中，cle是反向受体，其在结合配体时被活化，所述配体在与其天然受体结合时会抑制增殖和/或存活，但在活化cle时反而导致增殖和/或存活。在一些实施例中，反向受体包括嵌合体，其包含来自il4ra的胞外配体结合结构域和来自il7ra或il21的胞内结构域。反向细胞因子受体的其它实施例包括嵌合体，其包含来自受体(如用于il-4、il-10、il-13或tgfb的受体)的胞外配体结合结构域以及本文公开的任何淋巴增生性元件胞内结构域，所述受体当结合到其天然配体时将抑制增殖和/或存活。在说明性方面中，淋巴增生性元件不结合细胞因子。在另外的说明性方面中，淋巴增生性元件不结合任何配体。在说明性实施例中，不结合任何配体的淋巴增生性元件是组成型二聚化的或以其它方式多聚化的，并且是组成型活性的。在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内结构域可来源于tnf受体家族的跨膜蛋白质cd40的胞内部分。诱导t细胞和/或nk细胞的增殖和/或存活的cd40的结构域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别cd40多肽中相应的结构域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。cd40蛋白含有traf蛋白的若干结合位点。不受理论约束，traf1、traf2及traf3的结合位点位于cd40的胞内部分的膜远端结构域且包括氨基酸序列pxqxt(seq id no:303)，其中每个x可以是任何氨基酸(对应于seq id no:208的氨基酸35-39)(elgueta等人,《免疫学综述(immunol rev.)》2009年5月；229(1):152-72)。还证实traf2结合于共同序列sxxe(seq id no:304)，其中每个x可以是任何氨基酸(对应于seq id no:208的氨基酸57-60)(elgueta等人,《免疫学综述》2009年5月；229(1):152-72)。traf6的不同结合位点位于cd40的胞内部分的膜近端结构域且包括共同序列qxpxex(seq id no:305)，其中每个x可以是任何氨基酸(对应于seq id no:208的氨基酸16-21)(lu等人,《生物化学杂志(j biol chem.)》2003年11月14日；278(46):45414-8)。在说明性实施例中，跨膜蛋白cd40的胞内部分可包括traf蛋白的所有结合位点。traf结合位点是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员将能够在类似cd40多肽中识别相应traf结合位点。在一些实施例中，合适的胞内结构域可包括与seq id no:208或seq id no:209中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的结构域。在一些实施例中，来源于cd40的胞内结构域具有约30个氨基酸(aa)至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa或约60aa至约65aa的长度。在说明性实施例中，来源于cd40的胞内结构域具有约30aa至约66aa，例如30aa至65aa或50aa至66aa的长度。在包括来源于cd40的第一胞内结构域的淋巴增生性元件的说明性实施例中，第二胞内结构域可以不是来源于以下的胞内结构域：myd88、cd28家族成员(例如，cd28、icos)、模式识别受体、c反应性蛋白受体(即，nodi、nod2、ptx3-r)、tnf受体、cd40、rank/trance-r、ox40、4-1bb、hsp受体(lox-1及cd91)或cd28。模式识别受体包括(但不限于)内吞模式识别受体(即，甘露糖受体、清除剂受体(即，mac-1、lrp、肽聚醣、肌酸、毒素、cd11c/cr4))；外部信号模式识别受体(toll样受体(tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10)、肽聚醣识别蛋白质(pgrp结合细菌肽聚醣，和cd14)；内部信号模式识别受体(即，nod-受体1和2)和rig1。[0496]在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方法和组合物的说明性实施例中，胞内结构域可来源于跨膜蛋白质mpl的一部分。因此，在一些实施例中，淋巴增生性元件包括mpl或是mpl，或其变体和/或片段，包括包含mpl的至少75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％的胞内结构域(具有或不具有mpl的跨膜和/或胞外结构域)的变体和/或片段，其中所述变体和/或片段保留促进pbmc且在一些实施例中t细胞的细胞增殖的能力。在一些实施例中，表达包含mpl的胞内和跨膜结构域的淋巴增生性元件的细胞可以与艾曲波帕(eltrombopag)接触、暴露于艾曲波帕或用艾曲波帕处理。不受理论的限制，艾曲波帕结合于mpl的跨膜结构域且诱导mpl的胞内结构域的活化。诱导t细胞和/或nk细胞的增殖和/或存活的mpl的结构域、模体和点突变是所属领域中已知的，且所属领域的技术人员可以识别mpl多肽中相应的结构域、模体和点突变，其中一些论述于此段落中。跨膜mpl蛋白含有box1模体pxxp(seq id no:306)及box2模体，其为具有增加的丝氨酸及谷氨酸含量(对应于seq id no:283中的氨基酸46-64)的区域，在pxxp中，每个x可为任何氨基酸(对应于seq id no:283中的氨基酸17-20)(drachman及kaushansky.,《美国国家科学院院刊》,1997年3月18日；94(6):2350-5)。box1和box2模体涉及与jak的结合和信号转导，但增殖信号并非始终需要存在box2模体(murakami等人,《美国国家科学院院刊》,1991年12月15日；88(24):11349-53；fukunaga等人《欧洲分子生物学杂志(embo j.)》,1991年10月；10(10):2855-65；以及o'neal和lee.,《淋巴因子细胞因子研究(lymphokine cytokine res.)》1993年10月；12(5):309-12)。许多细胞因子受体相对于box1模体在位置-1、-2和-6处具有疏水性残基(分别对应于seq id no:283的氨基酸16、15和11)，其形成细胞因子诱导的jak2活化但非jak2结合所需的“开关模体”(constantinescu等人,《分子细胞(mol cell.)》,2001年2月；7(2):377-85；和huang等人,《分子细胞》,2001年12月；8(6):1327-38)。缺失涵盖seq id no:283中的氨基酸70至95的区域经展示以支持v-mpl的情形中的病毒转化(benit等人,《病毒学杂志(j virol.)》1994年8月；68(8):5270-4)，因此指示此区域于此情形中并非mpl的功能所必需。morello等人《血液(blood)》,1995年7月；86(8):557-71使用相同缺失以展示此区域并非刺激红细胞生成素受体反应性cat报导基因构建体的转录所需的且进一步发现此缺失引起关于去除此区域中的非必需和阴性元件所预期的略微增强的转录，如由drachman和kaushansky提出。因此，在一些实施例中，mpl胞内信号传导结构域不含包含seq id no:283中的氨基酸70至95的区域。在全长mpl中，赖氨酸k553(对应于seq id no:283的k40)及k573(对应于seq id no:283的k60)经展示为充当泛素化靶向模体的部分的阴性调节位点(saur等人,《血液》2010年2月11日；115(6):1254-63)。因此，在本文中的一些实施例中，mpl胞内信号传导结构域不包含这些泛素化靶向模体残基。在全长mpl中，已证实酪氨酸y521(对应于seq id no:283的y8)、y542(对应于seq id no:283的y29)、y591(对应于seq id no:283的y78)、y626(对应于seq id no:283的y113)和y631(对应于seq id no:283的y118)被磷酸化(varghese等人,《前沿内分泌学(front endocrinol)》(lausanne).2017年3月31日；8:59)。全长mpl的y521和y591是负调控位点，其作为溶酶体靶向模体(y521)的一部分，或者通过与衔接蛋白ap2(y591)的相互作用发挥作用(drachman和kaushansky.《美国国家科学院院刊》1997年3月18日；94(6):2350-5；和hitchcock等人《血液》，2008年9月15日；112(6):2222-31)。全长mpl的y626和y631是正调控位点(drachman和kaushansky《美国国家科学院院刊》,1997年3月18日；94(6):2350-5)且y626的鼠类同系物为shc的细胞分化及磷酸化所需的(alexander等人,《欧洲分子生物学杂志》,1996年12月2日；15(23):6531-40)且y626也是在mpl中用下文所描述的w515a突变进行组成性信号传导所需的(pecquet等人,《血液》,2010年2月4日；115(5):1037-48)。mpl含有shc磷酸化酪氨酸结合结合模体nxxy(seq id no:307)，其中每个x可以是任何氨基酸(对应于seq id no:283的氨基酸110-113)，且此酪氨酸被磷酸化且对shc、ship和stat3的tpo依赖性磷酸化是重要的(laminet等人,《生物化学杂志》,1996年1月5日；271(1):264-9；和van der geer等人,《美国国家科学院院刊》,1996年2月6日；93(3):963-8)。mpl还含有stat3共有结合序列yxxq(seq id no:308)，其中每个x可为任何氨基酸(对应于seq id no:283的氨基酸118至121)(stahl等人,《科学(science)》,1995年3月3日；267(5202):1349-53)。此序列的酪氨酸可以被磷酸化且mpl能够进行部分stat3募集(drachman和kaushansky.《美国国家科学院院刊》,1997年3月18日；94(6):2350-5)。mpl还含有序列ylpl(seq id no:309)(对应于seq id no:283的氨基酸113-116)，其与stat5募集pylxl(seq id no:310)的共有结合位点类似，其中py是磷酸酪氨酸且x可以是任何氨基酸(may等人,《欧洲生物化学学会联合会快报(febs lett.)》,1996年9月30日；394(2):221-6)。使用计算机模拟，lee等人发现，mpl的跨膜结构域的临床相关突变应按以下次序的活化效果活化mpl：w515k(对应于seq id no:283的氨基酸取代w2k)》s505a(对应于seq id no:187的氨基酸取代s14a)》w515i(对应于seq id no:283的氨基酸取代w2i)》s505n(对应于seq id no:187的氨基酸取代s14n，其经测试为t075(seq id no:188))(lee等人，《科学公共图书馆综合卷(plos one.)》,2011；6(8):e23396)。预测这些突变的模拟可能造成jak2(mpl的激酶配偶体)的组成性活化。在一些实施例中，mpl的胞内部分可以包括seq id no:283中存在的本文中所描述的结构域和模体中的一个或多个或全部。在一些实施例中，mpl的跨膜部分可以包括seq id no:187中存在的本文中所描述的结构域和模体中的一个或多个或全部。本文中所提供的mpl的结构域、模体及点突变为所属领域中已知的，且所属领域的技术人员将认识到，本文中的mpl胞内信号传导结构域在说明性实施例中将包括经展示促进增殖活性的对应结构域、模体及点突变，且将不包括经展示抑制mpl增殖活性的那些。mpl的任何或全部这些结构域、模体和点突变可以存在于胞内信号传导结构域中，并且可以包括在本文公开的任何方面和实施例中。在一些实施例中，合适的胞内结构域可包括与seq id no:283中的氨基酸中的至少10个、15个、20个或全部的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的结构域。在一些实施例中，来源于mpl的胞内结构域具有约30aa至约35aa、约35aa至约40aa、约40aa至约45aa、约45aa至约50aa、约50aa至约55aa、约55aa至约60aa、约60aa至约65aa、约65aa至约70aa、约70aa至约100aa、约100aa至约125aa、约125aa至150aa、约150aa至约175aa、约175aa至约200aa、约200aa至约250aa、约250aa至300aa、约300aa至350aa、约350aa至约400aa、约400aa至约450aa、约450aa至约500aa、约500aa至约550aa、约550aa至约600aa或约600aa至约635aa的长度。在说明性实施例中，来源于mpl的胞内结构域具有约30aa至约200aa的长度，例如30aa至150aa、30aa至119aa、30aa至121aa、30aa至122aa或50aa至125aa的长度。在包括来源于mpl的第一胞内结构域的淋巴增生性元件的说明性实施例中，第二胞内结构域可以来源于cd79b。[0497]可以包括在本文中所公开的任何方面中的淋巴增生性元件和cle可以是wo2019/055946中所公开的任何le或cle。其中公开cle，所述cle促进用编码cle慢病毒颗粒转导的pbmc在转导之后第7天至第21、28、35和/或42天的细胞培养物中的增殖。此外，其中鉴别cle，其在存在或不存在由car识别的抗原的情况下促进小鼠中的体内增殖，其中将表达cle和car中的一个的t细胞引入小鼠中。如其中例示，实例提供测试和/或标准可用于识别任何测试多肽，包括le或le的测试结构域，如第一胞内结构域或第二胞内结构域或第一及第二胞内结构域两者是否确实为le或le的有效胞内结构域，或特别有效的le或le的胞内结构域。因此，在某些实施例中，本文中所提供的包括le或编码le的聚核苷酸或核酸的任何方面或其它实施例可以证明le符合关于用于识别本文中所提供的le的所识别的测试或准则中的任一个或多个，或提供所述测试或准则的特性，或能够提供和/或具有所述测试或准则的特性，或用重组核酸载体基因修饰、转导和/或稳定转染的细胞(例如用编码le的慢病毒颗粒转导的细胞)能够提供、适用于、具有和/或被修饰以实现所述测试中的一个或多个的结果。在一个实施例中，与对照性反转录病毒颗粒(例如在相同条件下的慢病毒颗粒)相比，le提供、能够提供和/或具有以下的特性(或用编码le的反转录病毒颗粒基因修饰和/或转导的细胞能够提供、适用于、具有以下的特性和/或被修饰以用于)：在不存在外源添加的细胞因子的情况下，在体外转导后培养的第7天至第21、28、35和/或42天，改善的针对用包含编码le的核酸的慢病毒和包含cd3ζ胞内活化结构域(但不包含共刺激结构域)的抗cd19 car转导的预先活化的pbmc的扩增。在一些实施例中，针对用反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)转导的细胞的改善或增强的存活率、扩增和/或增殖的淋巴增生性元件测试可以基于与对照细胞比较来进行，所述反转录病毒颗粒具有编码测试构建体的基因组，所述测试构建体编码假设的le(测试细胞)，所述对照细胞可以是例如未被转导的细胞或用对照性反转录病毒(例如慢病毒)颗粒转导的细胞，所述对照性反转录病毒颗粒与包含编码淋巴增生性元件的核酸的慢病毒颗粒相同，但不具有淋巴增生性元件，或不具有测试多肽构建体的一个或多个胞内结构域，但包含相同的胞外结构域(如果存在)，以及相应测试多肽构建体的相同跨膜区或膜靶向区。在一些实施例中，用具有编码本文中如例示淋巴增生性元件所识别的淋巴增生性元件或其胞内结构域的基因组的反转录病毒颗粒(例如，慢病毒颗粒)转导对照细胞。在这类实施例中，测试标准可包括：当使用具有相对于编码对照淋巴增生性元件编码测试构建体的基因组的反转录病毒颗粒(例如，慢病毒颗粒)，通常通过分析经其转导的细胞进行测试时，存在至少足够多的富集、存活和/或扩增，或不存在富集、存活和/或扩增的统计差异。在一些实施例中，本文中的淋巴增生性元件的例示性或说明性实施例为针对这类测试的对照淋巴增生性元件的说明性实施例。[0498]在一些实施例中，通过进行复制和/或进行统计测试来进行针对推定或测试淋巴增生性元件的经改善特性的此测试。所属领域的技术人员将认识到，许多统计测试可用于这类淋巴增生性元件测试。涵盖这些实施例中的这类测试将为所属领域中已知的任何这类测试。在一些实施例中，统计测试可为t测试或曼-惠特尼-威尔科克森测试(mann-whitney-wilcoxon test)。在一些实施例中，测试构建体的标准化富集水平在小于0.1或小于0.05或小于0.01的p值下为显著的。[0499]在另一实施例中，当与包含cd3ζ胞内活化结构域但不包含共刺激结构域的抗cd19 car一起转导时，在不存在外源添加的细胞因子的情况下的体外培养的第7天至第21、28、35和/或42天，le提供以下、能够提供以下和/或具有以下特性(或用le基因修饰和/或转导的细胞能够提供、适用于、具有以下的特性和/或被修饰以用于)：用编码le的核酸转导的预先活化的pbmc的至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍扩增，或1.5倍至25倍扩增，或2倍至20倍扩增，或2倍至15倍扩增，或5倍至25倍扩增，或5倍至20倍扩增，或5倍至15倍扩增。在一些实施例中，于pbmc的存在下，例如以经转导细胞与pbmc(其可例如来自经匹配供体)的1:1比率进行测试，且在一些实施例中，所述测试不存在pbmc的情况下进行。在一些实施例中，如wo2019/055946中所说明进行这些测试中的任一个的扩增的分析。在一些实施例中，测试可包括其它统计测试及截止值，如低于0.1、0.05或0.01的p值，其中测试多肽或编码所述测试多肽的核酸需要满足一个或两个临限值(即扩增倍数及统计截止值)。[0500]对于本文中所提供的淋巴增生性元件测试中的任一个，在转导后的第7天与第14天、第21天、第28天、第35天、第42天或第60天之间，将测试细胞的数目与对照细胞的数目进行比较。在一些实施例中，可通过对dna进行测序及对存在于各构建体中的标识符进行计数来测定测试及对照细胞的数目。在一些实施例中，可例如用血细胞计数器或细胞计数器直接地计数测试及对照细胞的数目。在一些实施例中，所有测试细胞及对照细胞可生长于相同容器、孔或烧瓶内。在一些实施例中，可将测试细胞接种于一个或多个孔、烧瓶或容器中，且可将对照细胞接种于一个或多个烧瓶或容器中。在一些实施例中，可将测试及对照细胞可单独接种至孔或烧瓶中，例如每孔一个细胞。在一些实施例中，可使用富集水平将测试细胞与对照细胞的数目进行比较。在一些实施例中，可通过各构建体将稍后时间点处(第14天、第21天、28天、35天或第45天)的细胞数除以第7天的细胞数来计算测试或对照构建体的富集水平。在一些实施例中，可通过针对未经转导的细胞将一个时间点处(第14天、第21天、28天、35天或第45天)的细胞数除以在所述时间点处的细胞数来计算测试或对照构建体的富集水平。在一些实施例中，可将各测试构建体的富集水平标准化为各别对照构建体的富集水平以产生经标准化的富集水平。在一些实施例中，在测试构建体中编码的le提供(或用具有编码le的基因组的反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)基因修饰和/或转导的细胞能够提供、适用于、具有以下的特性和/或被修饰以用于)至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍标准化富集水平，或1.5倍至25倍标准化富集水平，或3倍至20倍标准化富集水平，或5倍至25倍标准化富集水平，或5倍至20倍标准化富集水平，或5倍至15倍标准化富集水平。可例如通过直接细胞计数来测量富集。截止值可以基于单次测试，或两次、三次、四次或五次重复，或基于许多次重复。当淋巴增生性元件符合一个或多个重复测试时，或符合或超过全部重复的截止值时，可以符合截止值。在一些实施例中，富集经测量为log2((测试日的标准化计数数据+1)/(第7天的标准化计数数据+1))。[0501]关于用于识别le的测试的额外细节说明于wo2019/055946中，包括实验条件。[0502]如wo2019/055946中所说明，将测试构建体识别为cle，这是因为cle在这些馈入或未馈入培养物中诱导增殖/扩增，而无需在第7天与第21天、第28天、35天和/或42天之间添加细胞因子，如il-2。举例来说，如wo2019/055946中所说明，相较于不包括任何胞内结构域的对照构建体，在转导后第7天与第21天、第28天、第35天和/或第42天之间，通过识别提供这些体外培养物的经增加扩增的测试cle来识别有效cle，而不论是否馈入或未馈入未被转导的pbmc。wo2019/055946公开至少一种且通常超过一种测试cle，其包括来自测试基因的胞内结构域，所述胞内结构域与存在于转导后第7天的不包括胞内结构域的每种对照构建体相比提供更多的扩增。wo2019/055946还提供提供统计方法，所述统计方法用于识别关于第一胞内结构域以及来自这些基因的一个或多个例示性胞内结构域的特别有效的基因。所述方法使用曼-惠特尼-威尔科克森测试及小于0.1或小于0.05的假发现截止率。wo2019/055946识别第一胞内结构域或第二胞内结构域的尤其有效的基因，例如通过分析以所有具有所述基因的构建体的组合分数形式计算的基因的分数。这类分析可以使用大于1的截止值，或大于无任何胞内结构域的阴性对照构建体，或大于2，如wo2019/055946中所公开的一些测试所展示。[0503]在另一实施例中，le提供、能够提供和/或具有以下特性(或用le基因修饰和/或转导的细胞能够提供、适用于、拥有以下特性和/或被修饰以用于)：体内驱动t细胞扩增。举例来说，体内测试可以利用小鼠模型且在t细胞与引入小鼠中的编码le的慢病毒载体接触之后，在第15至25天体内，或在第19至21天体内，或在约第21天体内测量t细胞扩增，如wo2019/055946中所公开。[0504]在包括le(其通常包括car)的例示性方面和实施例中，如在本文中所提供的用于修饰、基因修饰和/或转导细胞的方法和其用途中，被基因修饰的细胞被修饰以便具有在基因修饰和/或转导之前细胞不预先具有的新特性。这类特性可由使用编码car或le(且在说明性实施例中，car及le两者)的核酸的基因修饰来提供。举例来说，在某些实施例中，被基因修饰和/或转导的细胞能够、适用于、具有以下的特性和/或被修饰以用于：在不存在所添加的il-2的情况下或在不存在所添加的如il-2、il-15或il-7等细胞因子情况下且在某些说明性实施例中，在存在由car识别的抗原情况下，在转导后至少7、14、21、28、35、42或60天或第7天至第14、21、28、35、42或60天的离体培养物中的存活和/或增殖，其中所述方法包含使用在表面上具有假型化元件和任选的单独或稠合的活化结构域的反转录病毒颗粒进行修饰且通常无需预先活化。[0505]在某些实施例中，能够增强存活和/或增殖是指被基因修饰和/或转导的细胞呈现、能够、适用于、具有以下的特性和/或被修饰以用于：与对照细胞(其与基因修饰和/或转导之前的被基因修饰和/或转导的细胞相同)或用与测试中的反转录病毒颗粒相同的反转录病毒颗粒(其包含le或假设的le，但不包含le或le的胞内结构域)转导的对照细胞相比，在不存在一种或多种所添加的细胞因子(如il-2、il-15或il-7)或所添加的淋巴细胞促有丝分裂剂的情况下，培养基中离体或体外培养中改善的存活或扩增，其中所述对照细胞的所述存活或增殖是由向培养基中添加所述一种或多种细胞因子(如il-2、il-15或il-7)或所述淋巴细胞促有丝分裂剂而促进。通过所添加细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂，意谓将细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂自外源添加至培养基，使得相较于初始培养基，在培养细胞期间，所述细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂的浓度在培养基中增加，且在一些实施例中，在所述添加之前可不存在初始培养基。“添加”或“外源添加”是指将这类细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂添加到用于在修饰后培养被修饰的、被基因修饰和/或转导的细胞的淋巴细胞培养基中，其中培养基可以具有或可以不具有细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂。在无外源性添加的细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂的情况下，包括多种培养基组分的混合物的所有或部分培养基通常经储存，且在说明性实施例中，运送至培养发生的位点。在一些实施例中，淋巴细胞培养基是从供应商处购买的，并且未由供应商雇用并且不在供应商设施内的用户(如技术人员)将外源添加的细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂添加到淋巴细胞培养基中，且接着在存在或不存在这类外源添加的细胞因子或淋巴细胞促有丝分裂剂的情况下培养被基因修饰和/或转导的细胞。[0506]在一些实施例中，改善的或增强的存活、扩增和/或增殖可以展示为通过对来自用具有编码cle的基因组的反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)转导的细胞的dna进行测序并且对每个cle的唯一标识符中存在的序列的发生进行计数来确定的细胞数目的增加。在一些实施例中，可通过于每一时间点处用血细胞计数器或细胞计数器直接对细胞计数来测定经提高的存活和/或经提高的扩增。在一些实施例中，可通过针对各构建体将稍后时间点处(第21天、第28天、第35天和/或第45天)的细胞数除以第7天的细胞数来计算经改善的存活和/或经改善的扩增和/或富集。在一些实施例中，可通过血细胞计数器或细胞计数器来对细胞进行计数。在一些实施例中，可使用各特定测试构建体的核酸计数或细胞计数所测定的富集水平标准化为各别对照构建体(即，具有相同胞外结构域及跨膜结构域但缺少存在于测试构建体中的胞内结构域的构建体)的富集水平。在这些实施例中，在测试构建体中编码的le提供(或用具有编码le的基因组的反转录病毒颗粒(例如慢病毒颗粒)基因修饰和/或转导的细胞能够提供、适用于、具有以下的特性和/或被修饰以用于)至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍标准化富集水平，或1.5倍至25倍标准化富集水平，或3倍至20倍标准化富集水平，或5倍至25倍标准化富集水平，或5倍至20倍标准化富集水平，或5倍至15倍标准化富集水平。[0507]在一些实施例中，淋巴增生性元件可包括细胞因子受体或片段，所述细胞因子受体或片段包括其信号传导结构域。在一些实施例中，细胞因子受体可为cd27、cd40、crlf2、csf2ra、csf2rb、csf3r、epor、ghr、ifnar1、ifnar2、ifngr1、ifngr2、ifnlr1、il1r1、il1rap、il1rl1、il1rl2、il2r、il2ra、il2rb、il2rg、il3ra、il4r、il5ra、il6r、il6st、il7r、il7ra、il9r、il10ra、il10rb、il11ra、il12rb1、il13r、il13ra1、il13ra2、il15r、il15ra、il17ra、il17rb、il17rc、il17re、il18r1、il18rap、il20ra、il20rb、il21r、il22ra1、il23r、il27r、il27ra、il31ra、lepr、lifr、mpl、osmr、prlr、tgfβr、tgfβ诱饵受体、tnfrsf4、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfrsf14或tnfrsf18。[0508]在一些实施例中，包括cle的淋巴增生性元件包含如上文所公开的胞内活化结构域。在一些说明性实施例中，淋巴增生性元件是包含胞内活化结构域的cle，所述胞内活化结构域包含含有itam的结构域，因此，cle可以包含与本文中所提供的cd3z、cd3d、cd3e、cd3g、cd79a、cd79b、dap12、fcerlg、fcgr2a、fcgr2c、dap10/cd28或zap70结构域具有至少80％、90％、95％、98％或100％序列一致性的胞内活化结构域，其中cle不包含astr。[0509]在一些实施例中，淋巴增生性元件的一个或多个结构域与car的调节结构域(如共刺激结构域)和/或胞内活化结构域融合。在用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法方面的一些实施例中，淋巴增生性元件的一个或多个胞内结构域可以是与car相同的多肽的一部分或可以与car的一些组件稠合和任选地功能性连接。在其它实施例中，经工程改造的信号传导多肽可包括astr、胞内活化结构域(如cd3ζ信号传导结构域)、共刺激结构域及淋巴增生结构域。关于共刺激结构域、胞内活化结构域、astr及其它car结构域的其它细节公开于本文中的其它地方中。[0510]本文中所提供的淋巴增生性元件通常包括跨膜结构域。举例来说，跨膜结构域可以与来自wo2019/055946中所公开的以下基因和代表性序列的跨膜结构域中的任一个具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列一致性：cd8β、cd4、cd3ζ、cd28、cd134、cd7、cd2、cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、cd4、cd8a cd8b、cd27、cd28、cd40、cd79a、cd79b、crlf2、crlf2、csf2ra、csf2rb、csf2rb、csf3r、epor、fcer1g、fcgr2c、fcgra2、ghr、icos、ifnar、ifnar1、ifnar2、ifngr1、ifngr2、ifnlr1、il1r1、il1rap、il1rl1、il1rl2、il2ra、il2rb、il2rg、il3ra、il4r、il5ra、il6r、il6st、il7ra、il9r、il10ra、il10rb、il11ra、il12rb1、il12rb2、il13ra1、il13ra2、il15ra、il17ra、il17rb、il17rc、il17rd、il17re、il18r1、il18rap、il20ra、il20rb、il21r、il22ra1、il23r、il27ra、il27ra、il31ra、lepr、lifr、mpl、osmr、prlr、tnfrsf4、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfrsf14和tnfrsf18或其突变体，已知它们在这些突变体中的某些细胞类型中促进信号传导活性。适用于任何经工程改造的信号传导多肽中的tm结构域包括(但不限于)组成性活性细胞因子受体、来自lmp1的tm结构域及来自包含二聚化模体的1型tm蛋白的tm结构域，如本文中更详细地论述。在本文中所公开的任何含有来自i型跨膜蛋白质的跨膜结构域的方面中，跨膜结构域可为i型生长因子受体、激素受体、t细胞受体或tnf家族受体。[0511]在一些实施例中，cle包括来自相同蛋白质(在说明性实施例中，相同受体)的胞外部分及跨膜部分，其中的任一个在说明性实施例中为突变体，因此形成胞外结构域及跨膜结构域。这些结构域可来自细胞因子受体或其突变体，或激素受体或其突变体，在一些实施例中，当在至少一些细胞类型中表达时，其经报导为组成性活性的。在说明性实施例中，这类胞外结构域及跨膜结构域不包括配体结合区。相信，这类结构域在存在于cle中且表达于b细胞、t细胞和/或nk细胞中时不结合配体。这些受体突变体中的突变可发生于跨膜区中或胞外近膜区中。不受理论约束，本文提供的cle的至少一些胞外-跨膜结构域中的突变通过使通常不在一起的活化链集合在一起或通过改变经连接跨膜结构域和/或胞内结构域的确认而在不存在配体的情况下负责cle的信号传导。[0512]包括这些结构域(在说明性实施例中，胞外结构域)的实施例的cle的例示性胞外结构域及跨膜结构域通常少于来自经报导为组成性的突变体受体的膜近端胞外结构域连同跨膜结构域的30个氨基酸，其不需要用于活化相关胞内结构域的配体结合。在说明性实施例中，这些胞外结构域及跨膜结构域包括il7ra ins ppcl、crlf2 f232c、csf2rb v449e、csf3r t640n、epor l251c i252c、ghr e260c i270c、il27ra f523c以及mpl s505n。在一些实施例中，胞外结构域及跨膜结构域不包含在序列中与il7ra或其突变体的胞外结构域和/或跨膜结构域的部分相同的多于10、20、25、30或50个组成性氨基酸。在一些实施例中，胞外结构域及跨膜结构域不为il7ra ins ppcl。在一些实施例中，胞外结构域及跨膜结构域不包含在序列中与il15r的胞外域和/或跨膜结构域的部分相同的多于10、20、25、30或50个组成性氨基酸。[0513]在其中跨膜结构域为类型i跨膜蛋白的这些方面中的任一个的实施例中，跨膜结构域可为类型i生长因子受体、激素受体、t细胞受体或tnf家族受体。在其中嵌合多肽包含胞外结构域且其中胞外结构域包含二聚模体的方面及实施例中的任一个的实施例中，跨膜结构域可为i型细胞因子受体、激素受体、t细胞受体或tnf家族受体。[0514]在一些实施例中，胞外域及跨膜结构域为病毒蛋白lmp1或其突变体和/或片段。lmp1为已知在靶向脂质筏时或在融合至cd40时独立于配体活化细胞信号传导的多跨跨膜蛋白(kaykas等人,《欧洲分子生物学杂志》,20:2641(2001))。lmp1的片段通常足够长以跨越质膜且活化所连接的胞内结构域。举例而言，lmp1可在15个氨基酸与386个氨基酸之间、15个氨基酸与200个氨基酸之间、15个氨基酸与150个氨基酸之间、15个氨基酸与100个氨基酸之间、18个氨基酸与50个氨基酸之间、18个氨基酸与30个氨基酸之间、20个氨基酸与200个氨基酸之间、20个氨基酸与150个氨基酸之间、20个氨基酸与50个氨基酸之间、20个氨基酸与30个氨基酸之间、20个氨基酸与100个氨基酸之间、20个氨基酸与40个氨基酸之间或20个氨基酸与25个氨基酸之间。lmp1的突变体和/或片段在包括于本文提供的cle中时保留其活化胞内结构域的能力。此外，如果存在，胞外结构域包括至少1个，但通常至少4个氨基酸且其通常连接至另一个功能性多肽，如间隙结构域，例如etag。在一些实施例中，淋巴增生性元件包含lmp1跨膜结构域。在说明性实施例中，淋巴增生性元件包含lmp1跨膜结构域且一个或多个胞内结构域不包含来自以下的胞内结构域：tnfrsf蛋白质(即，cd40、4-ibb、rank、taci、ox40、cd27、gitr、ltr和baffr)、tlr1至tlr13、整合素、fcyriii、dectinl、dectin2、nod1、nod2、cd16、il-2r、i型ii干扰素受体、趋化介素受体(如ccr5和ccr7)、g蛋白偶合受体、trem1、cd79a、cd79b、ig-α、ips-1、myd88、rig-1、mda5、cd3z、myd88δtir、trif、tram、tirap、mal、btk、rtk、rac1、syk、nalp3(nlrp3)、nalp3δlrr、nalp1、card9、dai、ipag、sting、zap70或lat。[0515]在本文提供的cle的其它实施例中，胞外结构域包括二聚部分。本文中所公开的许多不同二聚部分可用于这些实施例中。在说明性实施例中，二聚部分能够同源二聚。不受理论约束，二聚部分可对经由跨膜结构域连接至其的胞内结构域提供活化功能。在一些实施例中，本文中所提供的淋巴增生性元件包含胞外结构域且在说明性实施例中，胞外结构域包含二聚化模体。在此方面的说明性实施例中，胞外结构域包含亮氨酸拉链。在一些实施例中，亮氨酸拉链是来自jun多肽，例如c-jun。在某些实施例中，c-jun多肽为ecd-11的c-jun多肽区。[0516]具有二聚部分的胞外结构域还可以充当将细胞标签多肽连接至表达cle的细胞的功能。在一些实施例中，二聚剂可位于胞内而非胞外。在一些实施例中，可使用多于一个或多个二聚结构域。在其中cle的胞外结构域包含二聚模体的任何方面或实施例中，二聚模体可选自由以下组成的组：含亮氨酸拉链模体的多肽、cd69、cd71、cd72、cd96、cd105、cd161、cd162、cd249、cd271及cd324，以及其保留二聚能力的突变体和/或活性片段。在本文中的cle的胞外结构域包含二聚模体的任何方面或实施例中，二聚模体可需要二聚剂，且二聚模体及相关二聚剂可选自由以下组成的组：fkbp及雷帕霉素(rapamycin)或其类似物、gyrb及库马霉素(coumermycin)或其类似物、dhfr及甲氨蝶呤或其类似物，或dmrb及ap20187或其类似物，以及保留二聚能力的所述二聚蛋白质的突变体和/或活性片段。在一些方面和说明性实施例中，淋巴增生性元件具有组成性活性且不是需要二聚剂以进行活化的淋巴增生性元件。[0517]一个实施例中的内部二聚和/或多聚淋巴增生性元件为使用脂质可渗透二聚免疫抑制剂药物fk506的类似物的系统的整体部分，其损失其正常生物活性，同时获得交联以基因方式融合至fk506结合蛋白fkbp12的分子的能力。通过将一个或多个fkbp及豆蔻酰化序列融合至目标受体的胞质信号传导结构域，可以二聚物药物依赖型但配体及胞外结构域独立型方式刺激信号传导。此为系统提供时间控制、使用单体药物类似物的可逆性，且增强特异性。第三代ap20187/ap1903二聚物药物对于其结合结构域fkbp12的高亲和力允许活体内特异性活化重组受体，且无需经由内源性fkbp12诱导非特异性副作用。还可使用与二聚物药物结合的具有氨基酸取代及缺失的fkbp12变体(如fkbp12v36)。此外，合成配体对蛋白酶分解具有抗性，使得其在活体内活化受体时比大多数所递送蛋白剂更有效。[0518]其中胞外结构域具有二聚模体的实施例的胞外结构域足够长以形成二聚物，如亮氨酸拉链二聚物。因此，包括二聚部分的胞外结构域可为15个氨基酸至100个氨基酸、20个氨基酸至50个氨基酸、30个氨基酸至45个氨基酸或35个氨基酸至40个氨基酸，在说明性实施例中为c-jun胞外结构域的c-jun部分。包括二聚部分的多肽的胞外结构域可不保留其它功能性。举例来说，对于亮氨酸拉链二聚物，这些亮氨酸拉链能够形成二聚物，这是由于其保留沿着α隔开7个残基的亮氨酸的模体。然而，本文提供的cle的某些实施例的亮氨酸拉链部分可或可不保留其的dna结合功能。[0519]1个丙氨酸残基与4个丙氨酸残基之间的间隔子可包括于具有二聚部分的胞外结构域与跨膜结构域之间的cle中。不受理论约束，相信丙氨酸间隔子通过改变胞内结构域的定向来影响经由跨膜结构域连接至亮氨酸拉链胞外区的胞内结构域的信号传导。[0520]在说明性实施例中，cle包括细胞标签结构域。关于细胞标签的细节提供于本文中的其它章节中。本文提供的细胞标签中的任一个可为cle的部分。通常，细胞标签连接至胞外结构域的n端。不受理论约束，在一些实施例中，胞外结构域包括提供连接子(在说明性实施例中，柔性连接子)的功能，从而将细胞标签结构域连接至表达cle的细胞。[0521]此外，包括编码本文提供的cle的核酸序列的聚核苷酸通常还包含信号序列以直接表达质膜。例示性信号序列通常提供在本文中提供于其它章节中。在某些实施例中，可在转录物上提供组件，使得car及cle两者自相同转录物表达。[0522]结合和促融合元件[0523]本文提供的许多方法、组合物和试剂盒包括在其表面上具有包膜蛋白的反转录病毒颗粒，例如多个拷贝的t细胞和/或nk细胞结合多肽和多个拷贝的促融合多肽(也被称为融合原(fusogen))。“结合多肽”包括一种或多种识别和结合靶宿主细胞的多肽，通常是糖蛋白。“促融合多肽”介导反转录病毒和靶宿主细胞膜的融合，从而允许反转录病毒基因组进入靶宿主细胞。在某些实施例中，结合多肽和促融合多肽位于相同的包膜蛋白例如异源糖蛋白上。在其它实施例中，结合多肽和促融合多肽位于两种或更多种不同的异源糖蛋白上。[0524]这些结合和促融合多肽功能中的一种或两种可以由假型化元件提供。在一些实施例中，结合多肽功能可以由活化元件执行，如本文其它地方所公开的。具有异源包膜糖蛋白的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的假型化通常改变病毒的向性且有助于宿主细胞的转导。在本文所提供的一些实施例中，假型化元件提供为多肽/蛋白质，或提供为编码多肽/蛋白质的核酸序列。[0525]在一些实施例中，假型化元件包括来自不同病毒的包膜蛋白。在一些实施例中，假型化元件是猫内源性病毒(rd114)包膜蛋白、肿瘤反转录病毒双嗜性包膜蛋白、肿瘤反转录病毒单嗜性包膜蛋白、水泡性口炎病毒包膜蛋白(vsv-g)(seq id no:336)、狒狒反转录病毒包膜糖蛋白(baev)(seq id no:337)、鼠类白血病包膜蛋白(mulv)(seq id no:338)、流感糖蛋白ha表面糖蛋白(ha)、流感糖蛋白神经氨酸酶(na)、副粘病毒麻疹包膜蛋白h、副粘病毒麻疹包膜蛋白f、树鼩副粘病毒(tpmv)包膜蛋白h、tpmv包膜蛋白f、来自亨尼帕病毒属的糖蛋白g和f、尼帕病毒(niv)包膜蛋白f、niv包膜蛋白g、辛德毕斯病毒(sinv)蛋白e1、sinv蛋白e2、和/或这些包膜蛋白中的任一种的功能变体或片段(参见，例如frank和bucholz《分子疗法-方法与临床发展(mol ther methods clin dev.)》2018年10月17日；12:19-31)。[0526]在一些实施例中，假型化元件可为野生型baev。不受理论约束，baev含有被证实抑制转导的r肽。在一些实施例中，baev可含有r肽的缺失。在一些实施例中，在核苷酸编码氨基酸序列ha(本文中称为baevδr(ha))(seq id no:339)之后，baev可含有抑制性r肽的缺失。在一些实施例中，在核苷酸编码氨基酸序列ham(本文中称为baevδr(ham))(seq id no:340)之后，baev可含有抑制性r肽的缺失。[0527]在一些实施例中，假型化元件可为野生型mulv。在一些实施例中，mulv可含有一个或多个突变以去除位于包膜糖蛋白的跨膜(tm)与表面(su)子单元之间的弗林蛋白酶介导的裂解位点。在一些实施例中，mulv含有sux突变(mulvsux)(seq id no:372)，其抑制包装细胞中的mulv包膜蛋白的弗林蛋白酶介导的裂解。在某些实施例中，mulv或mulvsux蛋白质的细胞质尾区的c端被截短4至31个氨基酸。在某些实施例中，mulv或mulvsux蛋白质的细胞质尾区的c端被截短4、8、12、16、20、24、28或31个氨基酸。[0528]在一些实施例中，假型化元件包括结合多肽及来源于不同蛋白质的促融合多肽。在一个方面中，假型化元件可以包括流感蛋白血凝素ha和/或神经氨酸酶(na)。在某些实施例中，ha来自a型流感病毒亚型h1n1。在说明性实施例中，ha来自h1n1 pr8 1934，其中一元胰蛋白酶依赖性切割位点已经被突变为更混杂的多元序列(seq id no:311)。在某些实施例中，na来自a型流感病毒h10n7亚型。在说明性实施例中，na来自h10n7-hkwf446c-07(seq id no:312)。在一些实施例中，结合多肽可以是保持与靶细胞结合的能力的vsv-g、baev、baevδr(ha)、baevδr(ham)、mulv、mulvsux、流感ha、流感na或麻疹包膜蛋白h的功能性变体或片段，并且促融合多肽可以是保持介导反转录病毒和靶宿主细胞膜的融合的能力的vsv-g、baev、baevδr(ha)、baevδr(ham)、mulv、mulvsux、流感ha、流感na或麻疹包膜蛋白f的功能性变体或片段。[0529]在另一个方面中，本文中所公开的方法及组合物中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒可通过麻疹病毒(mv)的融合(f)多肽和/或凝血素(h)多肽来假型化，作为非限制性实例，mv的临床野生型菌株，及包括埃德蒙斯顿菌株(edmonston strain；mv-edm)(genbank；af266288.2)或其片段的疫苗菌株。不受理论约束，认为凝血素(h)及融合(f)多肽两者都可在进入宿主细胞中发挥作用，其中所述h蛋白质在靶细胞上将mv与受体cd46、slam及nectin-4结合，且f介导反转录病毒及宿主细胞膜的融合。在说明性实施例中，尤其在靶细胞是t细胞和/或nk细胞时，结合多肽为麻疹病毒h多肽，且融合多肽为麻疹病毒f多肽。[0530]在一些研究中，用截短的f和h多肽假型化的慢病毒颗粒在滴度和转导效率方面具有显著的增加(funke等人，2008.《分子疗法》.16(8):1427-1436),(frecha等人，2008.《血液》.112(13):4843-4852)。在f胞质尾区截短30个残基(也被称为mv(ed)-fδ30(seq id no:313))时获得最高效价。对于h变体，在缺失18个或19个残基(mv(ed)-hδ18(seq id no:314)或(mv(ed)-hδ19))时出现最佳截短，但具有24个残基的截短的变体在缺失残基经丙氨酸置换下及未置换下(mv(ed)-hδ24(seq id no:315)及mv(ed)-hδ24+a)也产生最佳效价。在一些实施例中，包括针对转导t细胞和/或nk细胞的那些，本文中所公开的方法及组合物中的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒经麻疹病毒融合(f)多肽及凝血素(h)多肽的突变或变异版本(在说明性实例中，麻疹病毒f及h多肽的胞质结构域缺失变体)假型化。在一些实施例中，经突变f及h多肽为“经截短h”或“经截短f”多肽，其的胞质部分已经截短，即，氨基酸残基(或编码蛋白质的对应核酸分子的编码核酸)已经缺失。“hδy”及“fδx”分别表示这类经截短h及f多肽，其中“y”是指已自氨基端缺失的1个至34个残基，且“x”是指已自胞质结构域的羧基端缺失的1个至35个残基。在另一实施例中，“经截短f多肽”为fδ24或fδ30和/或“经截短h蛋白质”选自由以下组成的组：hδ14、hδ15、hδ16、hδ17、hδ18、hδ19、hδ20、hδ21+a、hδ24及hδ24+4a，更优选是hδ18或hδ24。在说明性实施例中，经截短f多肽为mv(ed)-fδ30，且经截短h多肽为mv(ed)-hδ18。[0531]在一些实施例中，假型化元件可以是来自亨尼帕病毒属的包膜蛋白(例如，尼帕病毒、亨德拉病毒、松湾病毒、墨江病毒或库马西病毒)，并且包括包膜糖蛋白g(亨尼帕病毒-g蛋白)和它们的融合配偶体包膜糖蛋白f(亨尼帕病毒-f蛋白)。在一些实施例中，亨尼帕病毒-f蛋白包含seq id no:374的序列，并且亨尼帕病毒-g蛋白包含seq id no:375的序列。在一些实施例中，亨尼帕病毒-f蛋白包含与seq id no:374的至少10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施例中，亨尼帕病毒-g蛋白包含与seq id no:375的至少10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的一段具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的序列。[0532]在一些实施例中，亨尼帕病毒-g蛋白可以含有一个或多个突变以修饰(例如，截短)细胞质尾部，并且因此改善假型化和颗粒并入效率(palomares等人.2013.《病毒学杂志》.87(8):4794-4794；witting等人.2013.《基因疗法》.20(10):997-1005；bender等人.2016.plos pathog.12(6):e1005641)。在某些实施例中，任何亨尼帕病毒-g蛋白的细胞质尾部的n末端可以被截短1个氨基酸至其所有氨基酸。在一些实施例中，涉及受体结合的亨尼帕病毒-g蛋白的残基被突变以改变，并且在说明性实施例中去除其与其天然受体的天然相互作用。在某些实施例中，亨尼帕病毒-g蛋白例如但不限于在seq id no:375的y389、e501、w504、e505、v507、q530、e533或i588中的一个或多个处被突变(给出氨基酸用于nipah-g,也被称为niv-g，并且技术人员将能够鉴定其它亨尼帕病毒-g蛋白的相应的谷氨酰胺)(guillaume等人.2006.《病毒学杂志》.80(15):7546-7554；negrete等人.2007.《病毒学杂志》.81(19):10804-10814；xu等人.2008.《美国国家科学院院刊》.105(29):9953-9958；xu等人.2012.《科学公共图书馆综合卷》.7(11):e48742；bender等人.2016.plos pathog.12(6):e1005641)。在一些实施例中，亨尼帕病毒-g蛋白是具有突变e533a和/或q530a的seq id no:375。在一些实施例中，使一个或多个n-糖基化位点或o-糖基化位点突变以改善假型化和融合(biering等人.2012.《病毒学杂志》.86(22):11991-12002；stone等人，2016.plos pathog.12(2):e1005445)。在一些实施例中，一个或多个n-糖基化位点例如但不限于在seq id no:375的n72、n159、n306、n378、n417、n481或n529中的一个或多个处，或在其它亨尼帕病毒-g蛋白的相应谷氨酰胺处被突变为另一种氨基酸例如谷氨酰胺。在一些实施例中，一个或多个o-糖基化位点从丝氨酸或苏氨酸被突变为另一种氨基酸例如丙氨酸。在一些实施例中，在来自seq id no:375的氨基酸103至137的高度o-糖基化柄结构域中的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基被突变为例如丙氨酸。在其它实施例中，亨尼帕病毒-g蛋白的c末端可以被修饰并且融合至结合多肽并且在说明性实施例中活化元件，例如抗体或抗体模拟物，其在说明性实施例中可以是抗cd3抗体或抗体模拟物(bender等人.2016.plos pathog.12(6):e1005641；jamali等人.2019.《分子治疗-方法与临床发展(mol ther-meth clin d.)》13:371-379；frank等人.2020.《血液进展(blood adv.)》4(22):5702-5715)。[0533]在一些实施例中，f蛋白可以含有一个或多个突变以修饰(例如，截短)细胞质尾部，并且因此改善假型化、颗粒并入效率和/或f蛋白从非活性f0到裂解活性f1形式的裂解(khetawat等人.2010.《病毒学杂志》.7:312；palomares等人.2013.《病毒学杂志》.87(8):4794-4794；witting等人.2013.《基因疗法》.20(10):997-1005；bender等人.2016.plos pathog.12(6):e1005641；johnston等人.2017.《病毒学杂志》91(10):e02150-16)。在一些实施例中，一个或多个n-糖基化位点例如但不限于在n64、n67、n99、n414或n464中的一个或多个处被突变为另一个氨基酸如谷氨酰胺。在某些实施例中，来自亨尼帕病毒属(亨尼帕病毒-f蛋白)的包膜糖蛋白f的细胞质尾部的c末端被截短1至所有其氨基酸。在一些实施例中，f蛋白可以含有一个或多个突变，以使其更具有融合性(aguilar等人.2007.《病毒学杂志》81(9):4520-4532；weis等人.2015.《欧洲细胞生物学杂志(eur j cell biol.)》94(7-9):316-322)。[0534]在一些实施例中，假型化元件可以包括来自亨尼帕病毒属的同种病毒的亨尼帕病毒-f蛋白和亨尼帕病毒-g蛋白(即，同源蛋白)。在一些实施例中，假型化元件可以包括来自亨尼帕病毒属的不同病毒的亨尼帕病毒-f蛋白和亨尼帕病毒-g蛋白(即异源蛋白)。在一些实施例中，假型化元件可以包括亨尼帕病毒-f蛋白，并且亨尼帕病毒-g蛋白可以是由异源蛋白的结构域组成的嵌合体(bradel-tretheway等人.2019.《病毒学杂志》.93(13):e00577-19)。[0535]在一些实施例中，任何假型化元件可以包含一个或多个突变以修饰(例如，截短)细胞质尾部，并且因此改善假型化和颗粒并入效率。在某些实施例中，细胞质尾部的n末端被截短1至所有其氨基酸。在一些实施例中，涉及受体结合的残基被突变以改变，并且在说明性实施例中去除其与其天然受体的天然相互作用。类似于nipah-g蛋白的突变，在一些实施例中，vsv-g蛋白例如但不限于在残基k47或r354，例如k47a或k47q和/或r354a或r354q中被突变。在一些实施例中，这些假型化元件与异源结合多肽融合，所述异源结合多肽起到将假型化元件引导或重定向到相同或不同细胞靶上的新靶蛋白的作用。[0536]在一些实施例中，分离的结合和/或促融合多肽包含一种或多种非病毒衍生的蛋白质。在一些实施例中，结合多肽包括抗体、配体或与靶细胞上的多肽结合的受体。在一些实施例中，结合多肽包含替代的非抗体支架(在本文中也被称为抗体模拟物)。在本文提供的包含结合多肽的任何方面或实施例中，结合多肽可以是抗体模拟物。在本文提供的包含作为抗体的结合多肽的任何方面或实施例中，可以使用合适的抗体模拟物来代替抗体。在一些实施例中，抗体模拟物可以是亲和体、亲和素、亲和聚体、亲和丁、阿尔法体、alphamab、抗运载蛋白、armadillo重复蛋白、三聚体、亲和多聚体(也被称为亲合力多聚体)、c型凝集素结构域、半胱氨酸结小蛋白、环肽、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白-4、darpin(设计的锚蛋白重复蛋白)、纤维蛋白原结构域、纤连蛋白结合结构域(fn3结构域)(例如，附着蛋白或单克隆抗体)、fynomer、扭结菌素、kunitz结构域肽、富含亮氨酸的重复结构域、脂质运载蛋白结构域、mab 2或fcabtm、纳米抗体、纳米钳、obody、pronectin、单链tcr、三角形四肽重复结构域或v样结构域。在一些实施例中，结合多肽识别nk细胞如cd16、cd56和cd57的表面上的蛋白质。在一些实施例中，结合多肽识别t细胞如cd3、cd4、cd8、cd25、cd28、cd62l、ccr7、tcra和tcrb的表面上的蛋白质。在一些实施例中，结合多肽也是活化元件。在一些实施例中，结合多肽是结合cd3的膜多肽。在一些实施例中，融合原来源于被修饰以去除其结合活性的辛德毕斯病毒糖蛋白sv1，并且结合多肽是膜结合的抗cd3抗体(yang等人，2009.《药学研究(pharm res)》26(6):1432-1445)。[0537]在一些实施例中，病毒性颗粒由具有来自2种或更多种异源病毒的包膜糖蛋白共假型化。在一些实施例中，病毒性颗粒由vsv-g或其功能性变体或片段以及来自rd114、baev、mulv、流感病毒、麻疹病毒和/或其功能性变体或片段的包膜蛋白共假型化。在一些实施例中，病毒性颗粒由vsv-g和mv(ed)-h糖蛋白或mv(ed)-h糖蛋白和被截短的细胞质结构域共假型化。在说明性实施例中，病毒性颗粒由vsv-g和mv(ed)-hδ24共假型化。在某些实施例中，vsv-g由mulv或具有截短的细胞质结构域的mulv共假型化。在其它实施例中，vsv-g由mulvsux或具有截短的细胞质结构域的mulvsux共假型化。在其它说明性实施例中，vsv-g由抗cd3scfv与mulv的融合物共假型化。[0538]在一些实施例中，促融合多肽来源于i类融合原。在一些实施例中，促融合多肽来源于ii类融合原。在一些实施例中，结合多肽和分离的促融合多肽都是病毒衍生的。在一些实施例中，融合多肽包括表达为一种多肽的多种元件。在一些实施例中，结合多肽及融合多肽自相同的转录物但自单独的核糖体结合位点翻译；在其它实施例中，结合多肽及融合多肽由裂解肽位点(其不受理论约束，在翻译之后裂解，如文献中常见)或核糖体跳跃序列隔开。在一些实施例中，结合多肽及融合多肽自分离的核糖体结合位点的翻译产生比结合多肽更高量的融合多肽。在一些实施例中，融合多肽与结合多肽的比率为至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1，或至少8:1。在一些实施例中，融合多肽与结合多肽的比率是作为范围的低端的1.5:1、2:1或3:1至作为范围的高端的3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。[0539]在本文公开的包括短接触时间的实施例中，在将修饰的淋巴细胞再引入到受试者期间，通过与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒缔合或者通过反转录病毒包膜与修饰的淋巴细胞的质膜融合，细胞制剂中的许多修饰的淋巴细胞在它们的表面上具有假型化元件。在一些实施例中，细胞制剂中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的修饰的淋巴细胞可以在其表面上包括假型化元件。在一些实施例中，假型化元件可以被结合到修饰的淋巴细胞的表面和/或假型化元件可以存在于修饰的淋巴细胞的质膜中。[0540]活化元件[0541]本公开的包含复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的许多方法和组合物方面进一步包括活化元件(在本文中也被称为t细胞活化元件)，或编码活化元件的核酸。活化元件是复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的包膜蛋白。免疫系统的细胞(如t淋巴细胞)通过受体或受体复合物识别特异性抗原并与其相互作用，在识别或与这类抗原相互作用时，使得细胞活化并在体内扩增。这类受体的实例是在t淋巴细胞的表面上表达的抗原特异性t淋巴细胞受体复合物(tcr/cd3)。tcr识别抗原肽，这些抗原肽由抗原呈递细胞和其它t淋巴细胞靶的表面上的主要组织相容性复合物(mhc)的蛋白质呈递。tcr/cd3复合物的刺激导致t淋巴细胞的活化及随后的抗原特异性免疫反应。因此，本文提供的活化组件通过与t细胞受体相关复合物的一种或多种组分结合，例如通过与cd3结合来活化t细胞。在一些实施例中，活化元件可单独活化。在其它情况下，活化需要经由tcr受体复合物活化，以便进一步活化细胞。t淋巴细胞还需要第二、共刺激信号以于体内变得完全活性。在无此信号的情况下，t淋巴细胞对结合至tcr的抗原无反应，或变得无变应性。然而，第二共刺激信号对于t细胞的转导和扩增不是必需的，并且可以通过例如转导后来自car或le的稍后共刺激信号来提供，如本文其它地方所提供的。在一些实施例中，共刺激信号可以在转导期间由例如cd28(一种t淋巴细胞蛋白)提供，cd28是与抗原产生细胞上的cd80和cd86相互作用。[0542]t细胞受体(tcr)cd3复合物的活化及经cd28的共刺激可通过离体暴露于用抗cd3及抗cd28涂布的固体表面(例如，珠粒)上来发生。在本文中所公开的方法及组合物中的一些实施例中，静息t细胞通过暴露于用抗cd3及抗cd28离体涂布的固体表面上来活化。在其它实施例中，静息t细胞或nk细胞(说明性实施例中，t细胞)通过暴露于可溶性抗cd3抗体(例如，在50ng/ml至150ng/ml，或75ng/ml至125ng/ml，或100ng/ml下)来活化。在这类实施例中，其可以是用于修饰、基因修饰或转导的方法的一部分，在不进行预先活化的说明性实施例中，这类活化和/或接触可以通过在转导反应混合物中包括抗cd3且进行本文中所提供的接触和任选的培育任何时间来进行。此外，这类由可溶性抗cd3进行的活化可以通过在与反转录病毒颗粒在含有抗cd3的培养基中接触之后培育淋巴细胞，如pbmc且在说明性实施例中，nk细胞且在说明性更高的实施例中，t细胞来进行。这类培育可以例如持续作为范围的低端的5、10、15、30、45、60或120分钟至作为范围的高端的15、30、45、60、120、180或240分钟，例如15分钟至1小时或2小时。[0543]在本文中所提供的方法、试剂盒和组合物的某些说明性实施例中，例如用于修饰、基因修饰和/或转导淋巴细胞(特别是t细胞和/或nk细胞)的方法、试剂盒和组合物中，能够结合于活化t细胞表面蛋白的多肽是作为复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的“活化元件”呈现。因此，在一些实施例中，活化元件可以执行结合多肽功能。在一些实施例中，活化元件是包膜蛋白。反转录病毒颗粒的表面上的这类t细胞和/或nk细胞活化元件存在于本文的实施例中，用于修饰、基因修饰和/或转导淋巴细胞，例如其中反转录病毒颗粒具有编码car、自驱动car或le的基因组。在一些实施例中，其表面具有活化元件的此类反转录病毒颗粒用于包括通过皮下施用的施用的方法和用途中，以及用于皮下施用的试剂盒组分中。本文在本章节中讨论的活化元件功能，以及本文其它地方公开的结合多肽和促融合多肽，在某些说明性实施例中，都被发现与反转录病毒颗粒的表面缔合，作为一种、两种或三种蛋白质的一部分，在说明性实施例中糖蛋白，并且在另外的说明性实施例中异源糖蛋白。例如，一些活化元件多肽，例如能够结合至cd3的那些，也可以提供t细胞结合多肽功能。[0544]在一些实施例中，活化元件是能够结合淋巴细胞并且在说明性实施例中t细胞和/或nk细胞的表面上的多肽的多肽。在说明性实施例中，活化元件能够结合于tcr复合多肽。在一些实施例中，tcr复合物多肽是cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、tcrα或tcrβ。在一些实施例中，能够与tcr复合物多肽结合的活化元件是能够与cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、tcrα或tcrβ中的一种或多种结合的多肽。在说明性实施例中，活化元件活化zap-70。在一些实施例中，活化元件包括能够结合至cd16a、nkg2c、nkg2d、nkg2e、nkg2f或nkg2h的多肽。在一些实施例中，能够与nkg2d结合的多肽是mic-a、mic-b或ulbp，例如ulbp1或ulbp2。在另外的实施例中，能够与cd16a结合的多肽包括能够与nkp46、2b4、cd2、dnam、nkg2c、nkg2d、nkg2e、nkg2f或nkg2h中的一种或多种结合。在一些实施例中，活化元件是能够与以下组合中的一种或多种结合的多肽：nkp46和2b4、nkp46和cd2、nkp46和dnam、nkp46和nkg2d、2b4和dnam、或2b4和nkg2d。在一些实施例中，活化元件可以是能够与淋巴细胞的表面上的多肽结合的两种或更多种多肽。在一些实施例中，活化元件可以是能够与以下组合中的至少一种结合的一种或多种多肽：nkp46和2b4、nkp46和cd2、nkp46和dnam、nkp46和nkg2d、2b4和dnam、或2b4和nkg2d。在说明性实施例中，活化元件是能够结合于cd3e的多肽。在一些实施例中，能够与cd3结合的多肽为抗cd3抗体或其保留与cd3结合的能力的片段。在说明性实施例中，抗cd3抗体或其片段为单链抗cd3抗体，如(但不限于)抗cd3 scfv。在另一说明性实施例中，能够结合于cd3的多肽为抗cd3scfvfc。在一些实施例中，活化元件是抗体。在一些实施例中，活化元件包含替代的非抗体支架，在本文中也被称为抗体模拟物。在本文提供的包含能够结合至淋巴细胞(并且在说明性实施例中t细胞)的表面上的多肽的活化元件的任何方面或实施例中，结合多肽可以是抗体模拟物。在一些实施例中，抗体模拟物可以是亲和体、亲和素、亲和聚体、亲和丁、阿尔法体、alphamab、抗运载蛋白、armadillo重复蛋白、三聚体、亲和多聚体(也被称为亲合力多聚体)、c型凝集素结构域、半胱氨酸结小蛋白、环肽、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白-4、darpin(设计的锚蛋白重复蛋白)、纤维蛋白原结构域、纤连蛋白结合结构域(fn3结构域)(例如，附着蛋白或单克隆抗体)、fynomer、扭结菌素、kunitz结构域肽、富含亮氨酸的重复结构域、脂质运载蛋白结构域、mab 2或fcabtm、纳米抗体、纳米钳、obody、pronectin、单链tcr、三角形四肽重复结构域或v样结构域。在本文提供的包含作为抗体的活化元件的任何方面或实施例中，可以使用合适的抗体模拟物来代替抗体。在一些实施例中，能够结合淋巴细胞的表面上的多肽的活化元件(例如tcrβ)是超抗原多肽。[0545]大量抗人类cd3单克隆抗体及其抗体片段为可用的，且可用于本发明，包括(但不限于)ucht1、okt-3、hit3a、trx4、x35-3、vit3、bma030(bw264/56)、clb-t3/3、cris7、yth12.5、f111409、clb-t3.4.2、tr-66、tr66.opt、hum291、wt31、wt32、spv-t3b、11d8、xiii-141、xiii46、xiii-87、12f6、t3/rw2-8c8、t3/rw24b6、okt3d、m-t301、smc2及f101.01。[0546]在其它实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上的活化元件可以包括一种或多种能够结合cd2、cd28、ox40、4-1bb、icos、cd9、cd53、cd63、cd81和/或cd82的多肽以及任选的一种或多种能够结合cd3的多肽。在说明性实施例中，活化元件是能够结合促有丝分裂四跨膜蛋白(mitogenic tetraspanin)的多肽，例如，能够结合至cd81、cd9、cd53、cd63或cd82的多肽。在一些实施例中，活化元件是四跨膜蛋白。四跨膜蛋白是本领域已知的。在一些实施例中，四跨膜蛋白可以是tspan1(tsp-1)、tspan2(tsp-2)、tspan3(tsp-3)、tspan4(tsp-4、nag-2)、tspan5(tsp-5)、tspan6(tsp-6)、tspan7(cd231/talla-1/a15)、tspan8(co-029)、tspan9(net-5)、tspan10(四旋蛋白(oculospanin))、tspan11(cd151样)、tspan12(net-2)、tspan13(net-6)、tspan14、tspan15(net-7)、tspan16(tm4-b)、tspan17、tspan18、tspan19、tspan20(up1b、upk1b)、tspan21(up1a、upk1a)、tspan22(rds、prph2)、tspan23(rom1)、tspan24(cd151)、tspan25(cd53)、tspan26(cd37)、tspan27(cd82)、tspan28(cd81)、tspan29(cd9)、tspan30(cd63)、tspan31(sas)、tspan32(tssc6)或tspan33。在一些实施例中，四跨膜蛋白可以是tspan1(tsp-1)、tspan2(tsp-2)、tspan3(tsp-3)、tspan4(tsp-4、nag-2)、tspan5(tsp-5)、tspan6(tsp-6)、tspan7(cd231/talla-1/a15)、tspan8(co-029)、tspan9(net-5)、tspan10(四旋蛋白)、tspan11(cd151样)、tspan12(net-2)、tspan13(net-6)、tspan14、tspan15(net-7)、tspan16(tm4-b)、tspan17、tspan18、tspan19、tspan20(up1b、upk1b)、tspan21(up1a、upk1a)、tspan22(rds、prph2)、tspan23(rom1)、tspan24(cd151)、tspan26(cd37)、tspan31(sas)、tspan32(tssc6)或tspan33。在说明性实施例中，四跨膜蛋白是tspan7(cd231/talla-1/a15)、tspan9(net-5)、tspan24(cd151)、tspan27(cd82)、tspan28(cd81)、tspan29(cd9)或tspan30(cd63)。在一些实施例中，活化元件是四跨膜蛋白，并且四跨膜蛋白是tspan25(cd53)、tspan27(cd82)、tspan28(cd81)、tspan29(cd9)或tspan30(cd63)。在一些实施例中，四跨膜蛋白是唯一的包膜蛋白。在一些实施例中，四跨膜蛋白是包含结合多肽和促融合元件的假型化元件。在一些实施例中，四跨膜蛋白是活化元件和假型化元件。在说明性实施例中，作为活化元件和假型化元件的四跨膜蛋白是tspan29(cd9)。[0547]在一些实施例中，这些活化元件中的一个或通常多个拷贝可在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上表达为与假型化元件隔开且不同的多肽。在一些实施例中，活化元件可在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒上表达为融合多肽。在说明性实施例中，融合多肽包括一个或多个活化元件及一个或多个假型化元件或一个或多个结合和/或促融合元件。在其它说明性实施例中，融合多肽包括抗cd3，例如抗cd3scfv，或抗cd3scfvfc，和病毒包膜蛋白质。在一个实例中，融合多肽是与病毒包膜蛋白质(如mulv包膜蛋白)的氨基端融合的okt-3scfv，如maurice等人(2002)中所示。在一些实施例中，融合多肽是与病毒包膜蛋白质融合的ucht1scfv，所述病毒包膜蛋白质是例如mulv包膜蛋白(seq id no:341)、mulvsux包膜蛋白(seq id no:366)、vsv-g(seq id no:367)或其功能变体或片段，包括本文中所提供的任何膜蛋白截短物。在说明性实施例中，特别是对于本文用于转导全血中的淋巴细胞的组合物和方法，融合多肽在融合蛋白的位于反转录病毒颗粒外部的部分中不包括任何血液蛋白(例如，血液因子(例如，因子x))裂解位点。在一些实施例中，融合构建体不包括任何弗林蛋白酶裂解位点。弗林蛋白酶是在所检验的全部哺乳动物细胞中表达的膜结合蛋白酶，其中一些在血浆中分泌且具有活性(参见例如c.fernandez等人《国际药学杂志(j.internal.medicine)》(2018)284；377-387)。可以使用已知的方法使融合构建体进行突变以去除这类蛋白酶裂解位点。[0548]因为其活化静息t细胞的能力，所以结合cd3、cd28、ox40、4-1bb或icos的多肽被称为活化元件。在某些实施例中，编码这类活化元件的核酸发现于在其表面上含有活化元件的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的基因组中。在说明性实施例中，编码活化元件的核酸未发现于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒基因组中。在一些实施例中，编码活化元件的核酸发现于病毒包装细胞的基因组中。[0549]在一些实施例中，活化元件是能够结合于cd28的多肽，例如抗cd28抗体或抗cd28 scfv抗体，或其保留结合于cd28的能力的片段。在其它实施例中，能够结合于cd28的多肽为cd80、cd86，或其能够结合cd28且诱导cd28介导的akt的活化的片段，如cd80的外部片段。在本文中的一些方面中，cd80的外部片段意谓通常存在于保留结合于cd28的能力的cd80的标准细胞位置中的细胞外部的片段。[0550]抗cd28抗体是本领域已知的，并且可以包括作为非限制性实例的单克隆抗体9.3(igg2a抗体)、kolt-2(igg1抗体)、15e8(igg1抗体)、248.23.2(igm抗体)和ex5.3d10(igg2a抗体)。[0551]在说明性实施例中，活化元件包括两种多肽，能够结合于cd3的多肽及能够结合于cd28的多肽。[0552]在某些实施例中，能够结合于cd3或cd28的多肽为抗体(单链单株抗体)或抗体片段(例如单链抗体片段)。因此，抗体片段可为例如单链片段可变区(scfv)、抗体的抗体结合(fab)片段、单链抗原结合片段(scfab)、无半胱氨酸的单链抗原结合片段(scfabδc)、片段可变区(fv)、对抗原的相邻抗原决定基具有特异性的结构(crab)或单域抗体(vh或vl)。[0553]在一些实施例中，细胞制剂中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的修饰的淋巴细胞可以在其表面上包括t细胞活化元件。在一些实施例中，t细胞活化元件可以通过例如t细胞受体被结合到修饰的淋巴细胞的表面，和/或假型化元件可以存在于修饰的淋巴细胞的质膜中。[0554]本文中所公开的实施例中的任一个中，活化元件或编码其的核酸可包括二聚或更高级多聚模体。二聚或多聚模体在所属领域中是众所周知的且所属领域的技术人员将理解如何将其并入多肽中以供有效二聚或多聚。在说明性实施例中，能够与cd3结合的多肽为抗cd3scfvfc，其在一些实施例中被视为具有二聚模体但不具有任何额外二聚模体的抗cd3，这是由于已知抗cd3scfvfc构建体能够在不需要单独二聚模体的情况下二聚。[0555]在一些实施例中，当存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上时，包括二聚模体的活化元件可在不存在二聚剂的情况下为活性的。在一些实施例中，二聚或多聚模体或编码其的核酸序列可为来自作为同源二聚物或多聚物天然地存在的跨膜多肽的氨基酸序列。在一些实施例中，二聚或多聚模体或编码其的核酸序列可为来自天然蛋白质或经工程改造的蛋白质的片段的氨基酸序列。在一个实施例中，同源二聚多肽为含亮氨酸拉链模体的多肽(亮氨酸拉链多肽)。举例来说，亮氨酸拉链来源于c-jun，其非限制性实例经公开与本文中的嵌合淋巴增生性元件(cle)有关。在一些实施例中，这些跨膜同二聚体多肽可以包括cd69、cd71、cd72、cd96、cd105、cd161、cd162、cd249、cd271、cd324或其活性片段。[0556]在一些实施例中，当存在于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上时，包括二聚模体的活化元件可在二聚剂的存在下为活性的。在一些实施例中，二聚模体及编码其的核酸可包括来自在配体(在本文中也被称为二聚物或二聚剂)结合后二聚的跨膜蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中，二聚模体及二聚物可包括(其中二聚物在二聚物结合对后的圆括号里)：fkbp及fkbp(雷帕霉素或其类似物)；gyrb及gyrb(香豆霉素或其类似物)；dhfr及dhfr(甲氨蝶呤)；或dmrb及dmrb(ap20187)。如上文所提及，雷帕霉素可用作二聚物。替代地，可使用雷帕霉素衍生物或类似物(参见例如wo96/41865、wo 99/36553、wo 01/14387；及ye等人(1999)《科学(science)》283:88-91)。可使用香豆霉素类似物(参见例如farrar等人(1996)《自然(nature)》383:178-181；及美国专利案第6,916,846号)。尽管淋巴增生性元件的一些实施例包括二聚剂，但在一些方面和说明性实施例中，淋巴增生性元件具有组成性活性且不是需要二聚剂以进行活化的淋巴增生性元件。[0557]在一些实施例中，活化元件与异源信号序列和/或异源膜连接序列或膜结合蛋白融合，其都帮助将活化元件引导至膜上。在一些实施例中，翻译后脂质修饰可经由豆蔻酰化、棕榈酰化或gpi锚定来发生。在一些实施例中，异源膜连接序列为gpi锚定连接序列。异源gpi锚定连接序列可以源自任何已知的gpi锚定蛋白。在一些实施例中，异源gpi锚定连接序列为来自cd14、cd16、cd48、cd55(daf)、cd59、cd80及cd87的gpi锚定连接序列。在一些实施例中，异源gpi锚定连接序列来源于cd16。在说明性实施例中，异源gpi锚定连接序列来源于fc受体fcγriiib(cd16b)或衰变加速因子(daf)，另外称为补体衰变加速因子或cd55。[0558]在一些实施例中，活化元件中的一个或多个包括帮助活化元件至细胞膜的直接表达的异源信号序列。可使用在包装细胞系中具有活性的任何信号序列。在一些实施例中，信号序列为daf信号序列。在说明性实施例中，活化元件与在其n端的daf信号序列及在其c端的gpi锚定连接序列融合。[0559]在说明性实施例中，活化元件包括与来源于cd14的gpi锚定连接序列融合的抗cd3 scfvfc，及与来源于cd16b的gpi锚定连接序列融合的cd80；且两者表达于本文所提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。在一些实施例中，抗cd3 scfvfc与其n端的daf信号序列及其c端的来源于cd14的gpi锚定连接序列融合，且cd80与其n端的daf信号序列及其c端的来源于cd16b的gpi锚定连接序列融合；且两者皆表达于本文所提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。在一些实施例中，daf信号序列包括daf蛋白质的氨基酸残基1-30。[0560]在一些实施例中，活化元件可以与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒分开。因此，在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上不包含活化元件。[0561]在一些实施例中，使用多于一个活化元件。在一些实施例中，活化元件可以是超抗原，例如脂多糖、sec3和葡萄球菌肠毒素b。在一些实施例中，活化元件可以是细胞因子。在一些实施例中，活化元件可以是佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(pma)、离子霉素或植物血凝(pha)。在一些实施例中，细胞制剂中或待与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒分开施用的pma的浓度可以为10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml或100ng/ml或10至100ng/ml或25至75ng/ml。在一些实施例中，细胞制剂中或待与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒分开施用的离子霉素的浓度可以为至少或约为100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml或750ng/ml或1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml或5μg/ml或100ng/ml至5μg/ml或500ng/ml至2μg/ml。在一些实施例中，细胞制剂中或待与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒分开施用的pha的浓度可以为至少或约为0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、7.5μg/ml或10μg/ml或0.1μg/ml至10μg/ml、1μg/ml至10μg/ml或2.5μg/ml至7.5μg/ml。在一些实施例中，活化元件在施用细胞制剂的5、10、15、20、30、45或60分钟或1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、18或24小时或1、2、3、4、5、6、7、14、21或28天内被施用。在一些实施例中，一个或多个活化元件被施用多次，例如在施用细胞制剂后的不同天。[0562]膜结合的细胞因子[0563]本文所提供的方法及组合物方面中的一些实施例包括膜结合的细胞因子，或编码膜结合的细胞因子的聚核苷酸。细胞因子通常但不总为分泌性蛋白质。天然分泌的细胞因子可经工程改造为膜结合的融合蛋白质。膜结合细胞因子融合多肽包括在本文所公开的方法及组合物中，且也是本发明的方面。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒具有在其表面上的能够结合t细胞和/或nk细胞且促进其增殖和/或存活的膜结合细胞因子融合多肽。通常地，将膜结合多肽并入复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的膜中，且在细胞通过复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导时，反转录病毒及宿主细胞膜的融合产生结合至经转导细胞的膜的多肽。[0564]在一些实施例中，细胞因子融合多肽包括il-2、il-7、il-15或其活性片段。膜结合细胞因子融合多肽通常为与异源信号序列和/或异源膜连接序列融合的细胞因子。在一些实施例中，异源膜连接序列为gpi锚定连接序列。异源gpi锚连接序列可来源于任何已知的gpi锚定蛋白质(评述于ferguson maj,kinoshita t,hart gw.《糖基磷脂酰肌醇锚》varki a,cummings rd,esko jd等人编,《糖生物学的要点(essentialsofglycobiology.)》,第2版.cold spring harbor(ny):cold spring harbor laboratory press；2009.第11章中)。在一些实施例中，异源gpi锚定连接序列为来自cd14、cd16、cd48、cd55(daf)、cd59、cd80及cd87的gpi锚定连接序列。在一些实施例中，异源gpi锚定连接序列来源于cd16。在一个说明性实施例中，异源gpi锚定连接序列来源于fc受体fcγriiib(cd16b)。在一些实施例中，gpi锚定为daf的gpi锚定。[0565]在说明性实施例中，膜结合细胞因子为与daf融合的细胞因子的融合多肽。已知daf积聚在并入至自包装细胞萌芽的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的膜中的脂质筏中。因此，不受理论约束，认为daf融合蛋白质优选靶向包装细胞的膜的部分，所述包装细胞将变成重组反转录病毒膜的部分。[0566]在非限制说明性实施例中，细胞因子融合多肽为il-7，或其与daf融合的活性片段。在特定非限制说明性实施例中，融合细胞因子多肽依次包括：daf信号序列(daf的残基1-31)、无其信号序列的il-7，及daf的残基36-525。[0567]制备重组反转录病毒颗粒的包装细胞系/方法[0568]本公开提供产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的哺乳动物包装细胞及包装细胞系。产生复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的所述细胞系在本文中也被称为包装细胞系。这类方法的非限制性实例说明于wo2019/055946中。本文中提供用于制备反转录病毒颗粒的其它例示性方法，例如在本文中的实例部分中。当包括编码其它膜结合蛋白的核酸(如不与病毒包膜融合的t细胞活化元件，如gpi连接的抗cd3)时，这类方法包括例如4质体系统或5质体系统(参见wo2019/05546)。在说明性实施例中，本文中提供4质体系统，其中t细胞活化元件，如gpi-连接的抗cd3在一个包装质体(如编码病毒包膜的质体或编码rev的质体)上编码且任选地，可在另一包装质体上编码第二病毒膜相关转基因，如膜结合细胞因子。在每种情况下，编码病毒蛋白质的核酸通过ires或核糖体跨越序列(如p2a或t2a)与转基因分离。这类4质体系统和相关聚核苷酸陈述于实例中，在短暂转染中与5载体系统相比提供增加的效价，且因此提供本文中的说明性实施例。本公开提供包装细胞及为包装细胞系的哺乳动物细胞系，其产生基因修饰目标哺乳动物细胞及目标哺乳动物细胞系本身的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在说明性实施例中，包装细胞包含核酸序列，其编码复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的可包装rna基因组、rev蛋白、gag多肽、pol多肽及假型化元件。[0569]包装细胞系的细胞可为粘着细胞或悬浮细胞。下文提供例示性细胞类型。在说明性实施例中，包装细胞系可为悬浮细胞系，即在生长期间不黏着至表面的细胞系。所述细胞可在化学上定义的培养基和/或无血清培养基中生长。在一些实施例中，包装细胞系可为来源于粘着细胞系的悬浮细胞系，例如hek293可在根据所属领域中已知的方法产生适应悬浮的hek293细胞系的条件下生长。包装细胞系通常在化学上定义的培养基中生长。在一些实施例中，包装细胞系培养基可包括血清。在一些实施例中，包装细胞系培养基可包括血清替代物，如所属领域中已知。在说明性实施例中，包装细胞系培养基可为无血清培养基。此培养基可为按照美国食品及药物管理局(us food and drug administration；fda)的现行药品优良制造实践(current good manufacturing practice；cgmp)条例制造的化学上定义的无血清调配物。包装细胞系培养基可为无异源的及完整的。在一些实施例中，包装细胞系培养基由管理机构清除以用于离体细胞处理，如fda 510(k)清除装置。[0570]因此，在一个方面中，本文中提供用于制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法，其包括：a.在无血清培养基中在悬浮液中培养包装细胞，其中包装细胞包含编码复制缺陷型反转录病毒颗粒的可包装rna基因组的核酸序列、rev蛋白质、gag多肽、pol多肽和假型化元件；和b.从无血清培养基收集复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在另一方面中，本文中提供用于用复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导淋巴细胞的方法，其包含：a.在无血清培养基中在悬浮液中培养包装细胞，其中包装细胞包含编码复制缺陷型反转录病毒颗粒的可包装rna基因组的核酸序列、rev蛋白质、gag多肽、pol多肽和假型化元件；b.从无血清培养基收集复制缺陷型重组反转录病毒颗粒；和c.使淋巴细胞与复制缺陷型重组反转录病毒颗粒接触，其中接触进行小于24小时、20小时、18小时、12小时、8小时、4小时、2小时、1小时、30分钟或15分钟(或在作为范围的低端的接触且不培育或培育15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时或4小时与作为范围的高端的培育1、2、3、4、6、8、12、18、20或24小时之间)，由此转导淋巴细胞。[0571]在一些说明性实施例中，可包装rna基因组经设计以表达一种或多种目标多肽，作为非限制性实例包括本文中所公开的经工程改造的信号传导多肽中的任一个和/或一种或多种(例如两种或更多种)与如gag及pol等反转录病毒组分相反定向(例如，在相反链上且在相反方向上编码)的抑制性rna分子。举例来说，从5'至3'，可包装rna基因组可以包括：5'长末端重复序列或其活性截短片段；编码反转录病毒顺式作用rna包装元件的核酸序列；编码第一和任选的第二目标多肽的核酸序列，所述目标多肽如(但不限于)相反方向的经工程改造的信号多肽，其可以相对于5'长末端重复序列和顺式作用rna包装元件以此相反方向被启动子驱除，其在一些实施例中仅出于方便起见被称为“第四”启动子(且有时在本文中称为在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子)，其在靶细胞(如t细胞和/或nk细胞)中具有活性，但在说明性实例中在包装细胞中不具有活性，或仅在包装细胞中具有诱导性或最低程度的活性；以及3'长末端重复序列或其活性截短片段。在一些实施例中，可包装rna基因组可包括中枢聚嘌呤区域(cppt)/中枢终止序列(cts)元件。在一些实施例中，反转录病毒顺式作用rna包装元件可为hiv psi。在一些实施例中，反转录病毒顺式作用rna包装元件可为rev反应元件。在例示性实施例中，由与5'长末端重复相反定向的启动子驱动的经工程改造的信号传导多肽为本文所公开的一种或多种经工程改造的信号传导多肽，且可任选地表达如本文及在wo2017/165245a2、wo2018/009923a1及wo2018/161064a1中更详细公开的一种或多种抑制性rna分子。在一些方面中，本文提供了被设计成表达自驱动car的可包装rna基因组。关于这类复制缺陷型重组反转录病毒颗粒以及包括自驱动car的组合物和方法方面的细节在本文中被更详细地公开，例如在自驱动car方法和组合物章节中和在例示性实施例章节中被更详细地公开。在说明性实施例中，编码淋巴增生性元件的第一一个或多个转录单元以反向方向编码，并且编码car的第二一个或多个转录单元以正向方向编码。[0572]应理解，如第一启动子、第二启动子、第三启动子、第四启动子等的启动子编号仅出于方便起见。除非明确地叙述其它启动子，否则称为“第四”启动子的启动子不应被视为暗示存在任何其它启动子，如第一启动子、第二启动子或第三启动子。应注意，所述启动子中的每一个能够驱动转录物以适当细胞类型表达，且这类转录物形成转录单元。[0573]在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽可包括第一淋巴增生性元件。适合的淋巴增生性元件公开于本文中的其它部分中。作为非限制性实例，淋巴增生性元件可表达为具有细胞标签的融合物，如etag，如本文所公开。在一些实施例中，可包装rna基因组可进一步包括编码第二经工程改造的多肽的核酸序列，包括编码本文所提供的任何car实施例的嵌合抗原受体。举例来说，第二经工程改造的多肽可包括第一抗原特异性靶向区、第一跨膜结构域，及第一胞内活化结构域。抗原特异性靶向区、跨膜结构域及胞内活化结构域的实例公开于本文其它处。在靶细胞为t细胞的一些实施例中，在靶细胞中具有活性的启动子在t细胞中具有活性，如本文其它处所公开。[0574]在一些实施例中，经工程改造的信号传导多肽可包括car，且核酸序列可编码本文所提供的任何car实施例。举例来说，经工程改造的多肽可包括第一抗原特异性靶向区、第一跨膜结构域及第一胞内活化结构域。抗原特异性靶向区、跨膜结构域及胞内活化结构域的实例公开于本文其它处。在一些实施例中，可包装rna基因组可进一步包括编码第二经工程改造的多肽的核酸序列。在一些实施例中，第二经工程改造的多肽可为淋巴增生性元件。在其中靶细胞为t细胞或nk细胞的一些实施例中，在靶细胞中具有活性的启动子在t细胞或nk细胞中具有活性，如本文其它处所公开。[0575]在一些实施例中，本文中所提供的任何方面中所包括的可包装rna基因组可以进一步包括核糖开关，如wo2017/165245a2、wo2018/009923a1和wo2018/161064a1中所论述。在一些实施例中，编码经工程改造的信号传导多肽的核酸序列可以相对于由5'ltr及3'ltr建立的5'至3'定向来反向定向。在其它实施例中，可包装rna基因组可进一步包括核糖开关，且任选地该核糖开关可呈反向定向。在本文所公开的实施例中的任一个中，包括所述元件中的任一个的聚核苷酸可包括引物结合位点。在说明性实施例中，隔离子和/或聚腺苷酸化序列可位于基因之前、之后、之间或附近以防止或减少不受调节的转录。在一些实施例中，隔离子可以是本领域已知的鸡hs4隔离子、kaiso隔离子、sar/mar元件、嵌合鸡隔离子-sar元件、ctcf隔离子、gypsy隔离子或β-珠蛋白隔离子或其片段。在一些实施例中，隔离子和/或聚腺苷酸化序列可以是hgh polya(seq id no:316)、spa1(seq id no:317)、spa2(seq id no:318)、b-血球蛋白polya间隔子b(seq id no:319)、b-血球蛋白polya间隔子a(seq id no:320)、250chs4隔离子v1(seq id no:321)、250chs4隔离子v2(seq id no:322)、650chs4隔离子(seq id no:323)、400chs4隔离子(seq id no:324)、650chs4隔离子和b-血球蛋白polya间隔子b(seq id no:325)或b-血球蛋白polya间隔子b和650chs4隔离子(seq id no:326)。[0576]在本文所公开的实施例中的任一个中，编码vpx的核酸序列可位于第二转录单元上或任选地存在的第三转录单元上，或位于可操作地连接到第一可诱导启动子的额外转录单元上。[0577]本公开的一些方面包括细胞或为细胞，在说明性实例中为用作包装细胞以制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的哺乳动物细胞，如用于转导t细胞和/或nk细胞的慢病毒颗粒。在一些方面中，本文提供了包装细胞以制备复制缺陷型重组反转录病毒颗粒，其包括编码自驱动car的聚核苷酸。关于这类复制缺陷型重组反转录病毒颗粒以及包括自驱动car的组合物和方法方面的细节在本文中被更详细地公开，例如在自驱动car方法和组合物章节中和在例示性实施例章节中被更详细地公开。[0578]任选择广泛多种细胞中的任一个来在体外产生病毒或病毒颗粒，如根据本发明的复位向重组反转录病毒颗粒。通常使用真核细胞，尤其哺乳动物细胞，包括人类细胞，猿类细胞，犬类细胞，猫类细胞，马类细胞及啮齿动物细胞。在说明性实例中，细胞为人类细胞。在其它说明性实施例中，细胞无限地增殖，且因此永生。可有利地用于本发明的细胞的实例包括nih 3t3细胞、cos细胞、madin-darby犬肾细胞、人类胚胎293t细胞及衍生自这类细胞的任何细胞，如gpnlslacz细胞，其衍生自293t细胞。可使用高度可转染细胞，如人胚胎肾293t细胞。“高度可转染”是指细胞的至少约50％、优选地至少约70％、最佳地至少约80％可表达引入的dna的基因。[0579]适合的哺乳动物细胞包括原代细胞及永生化细胞系。适合的哺乳动物细胞系包括人类细胞系、非人类灵长类细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括(但不限于)hela细胞(例如，美国菌种保藏中心(american type culture collection；atcc)编号ccl-2)、cho细胞(例如，atcc编号crl9618，ccl61，crl9096)、293细胞(例如，atcc编号crl-1573)、vero细胞、nih 3t3细胞(例如，atcc编号crl-1658)、huh-7细胞、bhk细胞(例如，atcc编号ccllo)、pc12细胞(atcc编号crl1721)、cos细胞、cos-7细胞(atcc编号crl1651)、ratl细胞、小鼠l细胞(atcc编号ccli.3)、人胚肾(hek)细胞(atcc编号crl1573)、hlhepg2细胞、hut-78、jurkat、hl-60等。[0580]被基因修饰的t细胞和nk细胞[0581]在本文的方法及组合物的实施例中，产生本身为本发明的单独方面的被基因修饰的淋巴细胞。这类被基因修饰的淋巴细胞可以是被基因修饰和/或转导的淋巴细胞。在一个方面中，本文中提供被基因修饰的t细胞或nk细胞，其是使用根据本文中所提供的任何用于基因修饰血液或其组分中的t细胞和/或nk细胞的方面的方法制备。举例来说，在一些实施例中，t细胞或nk细胞被基因修饰以表达第一经工程改造的信号传导多肽。在说明性实施例中，第一经工程改造的信号传导多肽可以是淋巴增生性元件或car，其包括抗原特异性靶向区(astr)、跨膜结构域和胞内活化结构域。在一些实施例中，t细胞或nk细胞可进一步包括可为car或淋巴增生性元件的第二经工程改造的信号传导多肽。在一些实施例中，淋巴增生性元件可为嵌合淋巴增生性元件。在一些实施例中，t细胞或nk细胞可进一步包括表面上的假型化元件。在一些实施例中，t细胞或nk细胞可以进一步包括表面上的活化元件。被基因修饰的t细胞或nk细胞的car、淋巴增生性元件、假型化元件及活化元件可包括本文公开的方面、实施例或子实施例中的任一个。在说明性实施例中，活化元件可以是抗cd3抗体，如抗cd3 scfvfc。[0582]在一些实施例中，被基因修饰的淋巴细胞为已被基因修饰以表达包含至少一种淋巴增生性元件的第一经工程改造的信号传导多肽和/或包含嵌合抗原受体的第二经工程改造的信号传导多肽的淋巴细胞，如t细胞或nk细胞，所述嵌合抗原受体包括抗原特异性靶向区(astr)、跨膜结构域及胞内活化结构域。在本文方面中的任一个的一些实施例中，nk细胞为nkt细胞。nkt细胞为表达cd3且通常共表达αβt细胞受体且还表达通常与nk细胞相关的多种分子标记物(nk1.1或cd56)的子组。[0583]本公开的被基因修饰的淋巴细胞具有已通过重组dna方法引入淋巴细胞中的异源核酸序列。举例来说，在用于转导本文所提供的淋巴细胞的方法期间将说明性实施例中的异源序列插入淋巴细胞中。异源核酸发现于淋巴细胞内，且在一些实施例中经整合或未整合至被基因修饰的淋巴细胞的基因组中。[0584]在说明性实施例中，将异源核酸整合至被基因修饰的淋巴细胞的基因组中。在说明性实施例中，使用利用重组反转录病毒颗粒的本文所提供的用于转导淋巴细胞的方法来产生这类淋巴细胞。这类重组反转录病毒颗粒可包括编码嵌合抗原受体的聚核苷酸，所述嵌合抗原受体通常包括至少一个抗原特异性靶向区(astr)、跨膜结构域及胞内活化结构域。在本公开的其它部分中，本文提供复制缺陷型重组反转录病毒颗粒及在复制缺陷型反转录病毒颗粒的基因组中编码的聚核苷酸的各种实施例，所述复制缺陷型反转录病毒颗粒可用以产生本身形成本公开的另一方面的被基因修饰的淋巴细胞。[0585]本公开的被基因修饰的淋巴细胞可在体外分离。举例来说，这类淋巴细胞可发现于如本文所提供的用于离体转导的培养基及其它溶液中。淋巴细胞可以未被基因修饰的形式存在于以本文所提供的方法自受试者收集的血液中，接着在转导方法期间被基因修饰。被基因修饰的淋巴细胞可在其被基因修饰之后在其经引入或再引入受试者之后发现于受试者内部。被基因修饰的淋巴细胞可为静息t细胞或静息nk细胞，或被基因修饰的t细胞或nk细胞可以主动分裂，尤其在其表达在如本文所公开的转导之后经插入t细胞或nk细胞中的核酸中所提供的功能元件中的一些之后。[0586]在一个方面中，本文中提供被转导和/或基因修饰的t细胞或nk细胞，其包含重组聚核苷酸，所述重组聚核苷酸在其基因组中包含一个或多个以可操作的方式连接至在t细胞和/或nk细胞中具有活性的启动子的转录单元。[0587]在一些方面中，本文提供了包括基因修饰和/或转导的t细胞或nk细胞的方面，所述t细胞或nk细胞包括编码自驱动car的聚核苷酸。关于包含这类聚核苷酸的这类被基因修饰和/或转导的t细胞或nk细胞以及包括自驱动car的组合物和方法方面的细节在本文中被更详细地公开，例如在自驱动car方法和组合物章节和例示性实施例章节中被更详细地公开。[0588]在一些实施例中，本文中提供被基因修饰的淋巴细胞，在说明性实施例中，t细胞和/或nk细胞，或本文提供的自驱动car方面，其涉及用于转导血液或其组分中的t细胞和/或nk细胞的方面，所述淋巴细胞包括编码一种、两种或更多种(例如1-10、2-10、4-10、1-6、2-6、3-6、4-6、1-4、2-4、3-4种)抑制性rna分子的转录单元。在一些实施例中，这类抑制性rna分子是淋巴增生性元件且因此可以包括于本文中所公开的作为淋巴增生性元件的任何方面或实施例中，只要其诱导t细胞和/或nk细胞的增殖或以其它方式满足本文中所提供的淋巴增生性元件的测试即可。在一些实施例中，针对本文的抑制性rna分子章节中所鉴定的任何靶标的抑制性rna分子。[0589]在紧接以上t细胞或nk细胞包含一种或多种(例如两种或更多种)抑制性rna分子及car或编码其的核酸的方面的一些实施例中，car的astr为mrb astr和/或car的astr结合至与肿瘤相关的抗原。此外，在以上方面的一些实施例中，第一核酸序列可操作地连接到核糖开关，所述核糖开关例如能够结合核苷类似物，且在说明性实施例中为抗病毒药物，例如阿昔洛韦(acyclovir)。[0590]在本文公开的方法及组合物中，经工程改造的信号传导多肽的表达由控制元件调节，且在一些实施例中，所述控制元件为包含核糖开关的聚核苷酸。在某些实施例中，核糖开关能够结合核苷类似物，且当核苷类似物存在时，表达经工程改造的信号传导多肽中的一个或两个。[0591]核酸[0592]本公开提供编码本公开的多肽的核酸，并且公开了用于本文各种方法的核酸。在一些实施例中，核酸将是dna，包括例如重组表达构建体，或作为例如t细胞或nk细胞的全部或部分基因组。在一些实施例中，核酸将是rna，例如反转录病毒基因组或包装细胞系、t细胞或nk内的表达的转录物。在一些实施例中，核酸将是rna，例如，体外合成的rna。在一些实施例中，核酸可以被分离。如本文所用，术语“分离的”是指材料从其原始环境(例如，当其为天然存在时，则是天然环境)移出。例如，存在于活体动物中的天然存在的聚核苷酸，或在其它实施例中多肽是未经分离的，但从天然系统中的共存材料中的一些或全部中分离的相同聚核苷酸或多肽是经分离的。这类聚核苷酸可以是载体的一部分，和/或这类聚核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是经分离的，这因为这类载体或组合物不是其自然环境的一部分。例如，分离的核酸可以是重组核酸载体例如表达载体的一部分，其在说明性实施例中可以是复制缺陷型重组反转录病毒颗粒。在一些实施例中，如本文对试剂盒组分所讨论的，按照cgmp生产核酸。[0593]在一些实施例中，提供用于产生本公开的多肽(例如在哺乳动物细胞中)的核酸。在其它情况下，主题核酸提供编码本公开的多肽的核酸的扩增。[0594]对于包装病毒颗粒，适合使用的启动子可以是组成型的或可诱导的。对于病毒颗粒rna的表达，可以使用ltr启动子或杂交ltr启动子。例如，单独的rsv/ltr、tre/ltr或ltr可以用于转录待包装的核酸。ltr的实例包括但不限于mscv、galv、hiv-1、hiv-2和mulv。例如，在含有大t抗原的包装系中，sv40复制起点的并入可以被包含在一个或多个包装载体中，以在转录和/或翻译期间扩增环状质粒dna。多个启动子的使用可以用于防止转录因子竞争。例如，cmv、sv40、rsv、hsvtk、tre和其它启动子可以用于表达lv颗粒的不同组分。在一些情况下，病毒颗粒组分可以从整合的表达载体表达。在其它情况下，核酸中的一个或多个可以经由瞬时表达引入。在一些实施例中，使用诱导型启动子用于在病毒颗粒包装之前将细胞毒性最小化。[0595]对于转基因(例如car)在基因修饰的细胞(例如淋巴细胞、巨噬细胞或树突状细胞)中的表达，合适的启动子包括本领域已知的任何组成型启动子。在一些实施例中，组成型启动子可以是ef1-a启动子、pgk启动子、cmv启动子、mscv-u3启动子(参见，例如，jones等人，《人类基因疗法》(2009)20:630-40)、sv40hcd43启动子、vav启动子、tcrβ启动子、ubc启动子、巨细胞病毒即时早期启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子、早期和晚期sv40启动子、存在于来自反转录病毒的长末端重复序列中的启动子、小鼠金属硫蛋白-i启动子以及各种本领域已知的组织特异性启动子。在一些实施例中，组成型启动子可以包括ef1-a启动子核苷酸序列(seq id no:350)、pgk启动子核苷酸序列(seq id no:351)或其功能部分或变体。在一些实施例中，组成型启动子可以包括除了ef1-a启动子以外的启动子。在一些实施例中，启动子包括轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件。[0596]在一些实施例中，启动子在包装系中没有活性或者在包装系中只有最低限度的活性。这类实施例在表达经工程改造的t细胞受体或car方面具有优势，即它们将减少、最小化或在说明性实施例中基本上消除或者甚至消除经工程改造的t细胞受体或car在包封的核酸载体如rir反转录病毒颗粒或病毒样颗粒中的表达，因为在用于制备包封的核酸载体的包装细胞系中经工程改造的t细胞受体或car的表达减少、低、可忽略、基本上没有或没有。在说明性实施例中，此类表达在包封核酸载体(例如，rir颗粒或病毒样颗粒)的表面上减少、基本消除或消除。在一些实施例中，启动子可以是t细胞特异性启动子、cd8细胞特异性启动子、cd4细胞特异性启动子、nkt细胞特异性启动子或nk细胞特异性启动子。在一些实施例中，t细胞特异性启动子可以是cd3ζ启动子或cd3δ启动子(参见，例如，ji等人，《生物化学杂志》.2002年12月6日；277(49):47898-906)。在说明性实施例中，t细胞特异性启动子可以是cd3ζ启动子。在一些实施例中，t细胞特异性启动子可以是cd8基因启动子。在一些实施例中，t细胞特异性启动子可以是cd4基因启动子(参见，例如，salmon等人.(1993)《美国国家科学院院刊》90:7739；和marodon等人.(2003)《血液》101:3416)。在一些实施例中，nk细胞特异性启动子可以是neri(p46)启动子(参见，例如，eckelhart等人(2011)《血液》117:1565)。在一些实施例中，由重组基因载体编码的特定蛋白质不在基因载体(例如rip)的表面中表达、展示和/或不并入到基因载体(例如rip)的表面中。在一些实施例中，这通过驱动基因载体中转基因表达的t细胞特异性启动子来实现。在一些实施例中，该启动子是来自cd3家族的启动子。在其它实施例中，它是杂交cd3启动子。在其它实施例中，包装细胞系编码能够基本上抑制包装细胞系中慢病毒转基因的表达的阻遏蛋白。在一些实施例中，抑制剂可以是tet阻遏蛋白。在其它实施例中，针对包装系中的蛋白质活化的转录因子已被抑制或灭活。在一些实施例中，灭活可以通过dna编辑核酸酶来实现。在其它实施例中，灭活通过shrna或mirna来实现。在其它实施例中，转录因子的抑制是通过转录因子的显性阴性蛋白或降解决定子实现的。在其它实施例中，病毒核酸经由包装细胞系中未活化的配体诱导型或阻抑型启动子来控制。[0597]在其它实施例中，启动子可以是可逆启动子。合适的可逆启动子，包括可逆诱导型启动子是所属领域中已知的。这类可逆启动子可以从许多生物体，例如真核生物和原核生物分离和衍生。对用于第二生物中的衍生自第一生物(例如第一原核生物及第二真核生物、第一真核生物及第二原核生物等)的可逆启动子的修饰为所属领域中已知的。这类可逆启动子和基于这类可逆启动子但还包含其它对照蛋白质的系统包括(但不限于)乙醇调节的启动子(例如醇脱氢酶i(alca)基因启动子、对乙醇反式活化因子蛋白质(alcr)起反应的启动子等)、四环素调节的启动子(例如包括tetactivators、teton、tetoff等的启动子)、类固醇调节的启动子(例如大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人类雌激素受体启动子系统、类视黄醇启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮(mifepristone)启动子系统等)、金属调节的启动子(例如金属硫蛋白启动子系统等)、相关发病机制调节的启动子(例如水杨酸调节的启动子、乙烯调节的启动子、苯并噻二唑调节的启动子等)、温度调节的启动子(例如热休克诱导型启动子(例如hsp-70、hsp-90、大豆热休克启动子等)、光调节的启动子、合成诱导型启动子等。本文提供了用于各种方法和作为单独方面的合适启动子的进一步讨论。[0598]在一些实施例中，启动子在待基因修饰的细胞(例如car-t细胞)中是可诱导的。在一些实施例中，诱导型启动子可以包括t细胞特异性应答元件或nfat应答元件。在其它实施例中，启动子可以由环境条件调节，例如缺氧、温度、葡萄糖、ph或光。在其它实施例中，启动子可以响应细胞外分子的浓度。在一些情况下，含有适合的启动子的基因座或构建体或转基因通过对可诱导系统的诱导来进行不可逆转换。用于诱导不可逆转换的合适的系统为所属领域中众所周知的，例如，不可逆转换的诱导可使用cre-lox介导的重组(参见例如fuhrmann-benzakein等人，《美国国家科学院院刊》(2000)28:e99，其公开内容以引用的方式并入本文中)。所属领域中已知的重组酶、内切核酸酶、连接酶、重组位点等的任何适合的组合可用于产生不可逆转换的启动子。本文其它地方所述的用于执行位点特异性重组的方法、机制和要求在产生不可逆交换的启动子中发现用途，并且是本领域熟知的，参见例如grindley等人，(2006)《生物化学年度综述(annualreviewofbiochemistry)》，567-605和tropp(2012)《分子生物学》(jones&bartlett出版,马萨诸塞州萨德伯里(sudbury,ma)),其公开通过引用并入本文。[0599]在一些方面中，本文提供了包括对自驱动car特别有用的启动子的聚核苷酸。关于这类启动子以及包括包含这类启动子的自驱动car的组合物和方法方面的细节在本文中被更详细地公开，例如在自驱动car方法和组合物章节和例示性实施例章节中被更详细地公开。在一些情况下，启动子是cd8细胞特异性启动子、cd4细胞特异性启动子、巨噬细胞特异性启动子或nk特异性启动子。例如，可以使用cd4基因启动子。[0600]在一些实施例中，例如，为了在酵母细胞中表达，合适的启动子是组成型启动子，例如adhl、pgkl、eno或pykl启动子等；或可调控的启动子，例如gali、gallo、adh2、ph05、cupl、gal7、met25、met3、cycl、his3、adhl、pgk、gapdh、adcl、trpl、ura3、leu2、eno、tpl，或者aoxl启动子(例如用于毕赤酵母)。对合适的载体及启动子的选择在本领域普通技术人员的水平内。[0601]用于原核宿主细胞中的合适的启动子包括(但不限于)细菌噬菌体t7rna聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂交启动子，例如lac/tac杂交启动子、tac/trc杂交启动子、trp/lac启动子、t7/lac启动子；trc启动子；tac启动子等；arabad启动子；体内r调节的启动子，如ssag启动子或相关启动子(参见，例如美国专利公开案第20040131637号)、pagc启动子(pulkkinen和miller,《细菌学杂志(j.bacterial.)》,1991:173(1):86-93；alpuche-aranda等人,《美国国家科学院院刊》,1992；89(21):10079-83)、nirb启动子(harborne等人(1992)《微观分子学(mal.micro.)》6:2805-2813)等(参见，例如dunstan等人(1999)《感染免疫学(infect.immun.)》67:5133-5141；mckelvie等人(2004)《疫苗(vaccine)》22:3243-3255；和chatfield等人(1992)《生物科技(biotechnol..)》10:888-892)；σ70启动子，例如共同σ70启动子(参见例如genome accession第ax798980号、第ax798961号及第ax798183号)；固定相启动子，例如dps启动子、spv启动子等；来源于致病岛spi-2的启动子(参见，例如wo96/17951)；acta启动子(参见，例如shetron-rama等人(2002)《感染免疫学》70:1087-1096)；rpsm启动子(参见，例如valdivia和falkow(1996).《微观分子学》22:367)；tet启动子(参见，例如hillen,w.和wissmann,a.(1989)in saenger,w.和heinemann,u.(编),《分子和结构生物学，蛋白质-核酸相互作用的主题(topicsinmolecularandstructuralbiology,protein-nucleicacidinteraction)》macmillan,英国伦敦,第10卷,第143-162页)；sp6启动子(参见，例如melton等人(1984)《核酸研究(nucl.acidsres.)》12:7035)等。用于如大肠杆菌等原核生物的合适的强启动子包括(但不限于)trc、tac、t5、t7及pλ。用于细菌性宿主细胞中的操纵子的非限制性实例包括乳糖启动子操纵子(laci抑制子蛋白质在与乳糖接触时改变构形，由此阻止laci抑制子蛋白质结合于操纵子)、色氨酸启动子操纵子(当与色氨酸复合时，trpr抑制子蛋白质具有结合操纵子的构形；在不存在色氨酸的情况下，trpr抑制子蛋白质具有不结合于操纵子的构形)和tac启动子操纵子(参见例如deboer等人(1983)《美国国家科学院院刊》80:21-25)。[0602]编码本公开的多肽的分离的核苷酸序列可存在于真核表达载体和/或克隆载体中。编码两个单独多肽的核苷酸序列可在相同或不同的载体中克隆。表达载体可包括选择性标记、复制起点及提供载体的复制和/或维持以及转基因表达的其它特征。例如，表达载体通常包括与转基因可操作连接的启动子。合适的表达载体在本领域中是已知的并且包括例如质体和病毒载体。在一些实施例中，表达载体是重组反转录病毒颗粒，如本文详细公开的。[0603]大量合适的载体及启动子为所属领域的技术人员已知；许多在商业上可用于产生主题重组构建体。借助于实例提供以下细菌载体：pbs、phagescript、psixl74、pbluescript sk、pbs ks、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(stratagene,la jolla,ca,usa)；ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pdr540，及prit5(pharmacia,uppsala,sweden)。借助于实例提供以下真核生物载体：pwlneo、psv2cat、pog44、pxrl、psg(stratagene)psvk3、pbpv、pmsg，及psvl(pharmacia)。[0604]表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便限制位点，以提供编码异源蛋白质的核酸序列的插入。可存在于表达宿主中操作的任选择标记。[0605]如上所述，在一些实施例中，编码本公开的多肽的核酸在一些实施例中将为rna，例如体外合成的rna。体外合成rna的方法为所属领域中已知的；可使用任何已知的方法来合成包括编码本公开的多肽的核苷酸序列的rna。用于将rna引入宿主细胞中的方法是所属领域中已知的。参见例如zhao等人(2010)《癌症研究》15:9053。将包括编码本公开的多肽的核苷酸序列的rna引入宿主细胞中可在体外或离体或体内进行。举例来说，可通过包含编码本公开的多肽的核苷酸序列的rna对宿主细胞(例如，nk细胞、细胞毒性t淋巴细胞等)进行体外或离体电穿孔。[0606]包括聚核苷酸、核酸序列和/或转录单元的各种方面和实施例和/或包括其的载体进一步包括以下中的一个或多个：kozak类序列(在本文中也被称为kozak相关序列)、土拔鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)和双重终止密码子或三重终止密码子，其中双重终止密码子或三重终止密码子中的一个或多个终止密码子定义由一个或多个转录单元中的至少一个的读取的终止。在某些实施例中，聚核苷酸、核酸序列和/或转录单元和/或包括其的载体进一步包括在一个或多个转录单元中的至少一个的起始密码子上游的10个核苷内具有5'核苷酸的kozak类型序列。kozak确定了699个脊椎动物mrna的kozak共有序列(gcc)gccrccatg(seq id no:327)，其中r为嘌呤(a或g)(kozak.《核酸研究》1987年10月26日；15(20):8125-48)。在一个实施例中，kozak型序列是或包括ccaccat/ug(g)(seq id no:328)、ccgccat/ug(g)(seq id no:329)、gccgccgccat/ug(g)(seq id no:330)或gccgccaccat/ug(g)(seq id no:331)(其中括号中的核苷酸代表任选的核苷酸，并且由斜线分隔的核苷酸表示该位置不同的可能核苷酸，例如取决于核酸是dna还是rna。在包含au/tg起始密码子的这些实施例中，a可以被认为是位置0。在某些说明性实施例中，在-3和+4处的核苷酸是相同的，例如-3和+4核苷酸可以是g。在另一个实施例中，kozak型序列包括在atg上游第3位置中的a或g，其中atg是起始密码子。在另一个实施例中，kozak型序列包括在aug上游第3位置中的a或g，其中aug是起始密码子。在说明性实施例中，kozak序列是(gcc)gccrccatg(seq id no:327)，其中r是嘌呤(a或g)。在说明性实施例中，kozak型序列是gccgccaccaug(seq id no:332)。在可以与包括kozak型序列的前述实施例和/或包括三重终止密码子的以下实施例组合的另一个实施例中，多核苷酸包括wpre元件。wpre已在本领域中被表征(参见，例如(higashimoto等人,《基因疗法》.2007；14:1298))和如在wo2019/055946中所述。在一些实施例中，wpre元件位于一个或多个转录单元的终止密码子的3'和多核苷酸的3'ltr的5'。在可以与前述实施例中的任一个或两个组合的另一个实施例中(即其中多核苷酸包括kozak序列的实施例和/或其中多核苷酸包括wpre序列的实施例)，所述一个或多个转录单元以双重终止密码子或三重终止密码子的一个或多个终止密码子终止，其中双重终止密码子包括第一阅读框中的第一终止密码子和第二阅读框中的第二终止密码子，或具有第二终止密码子的框中的第一终止密码子，并且其中所述三重终止密码子包括第一阅读框中的第一终止密码子、第二阅读框中的第二终止密码子和第三阅读框中的第三终止密码子，或具有第二终止密码子和第三终止密码子的框中的第一终止密码子。[0607]本文的三重终止密码子包括三个终止密码子，一个在各读取框中，在彼此的10个核苷酸内，且优选具有重叠序列，或在相同读取框中的三个终止密码子，优选在连续密码子处。二重终止密码子意谓两个终止密码子，各自在不同读取框中，在彼此的10个核苷酸内，且优选具有重叠序列，或在相同读取框中的两个终止密码子，优选在连续密码子处。[0608]在本文公开的方法及组合物中的一些中，使用利用重组核酸载体而不是复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法执行dna至pbmc、b细胞、t细胞和/或nk细胞中的引入及任选的dna至宿主细胞基因组中的并入。举例来说，可利用其它病毒载体，如来源于腺病毒、腺病毒相关病毒或1型单纯疱疹病毒的那些，作为非限制实例。[0609]在一些实施例中，本文提供的方法以及相关的用途、反应混合物、试剂盒和细胞制剂可包括用在病毒载体中未编码的聚核苷酸转染细胞。这类聚核苷酸可以被称为非病毒载体。在利用非病毒载体基因修饰或转染细胞的本文中所公开的任何实施例中，可使用包括电穿孔、核转染、脂质配制物、脂质、树状体、阳离子聚合物(如聚(乙烯亚胺)(pei)及聚(l-赖氨酸)(pll))、纳米颗粒、细胞穿透肽、微注射和/或未整合慢病毒载体的方法将非病毒载体(包括例如质体或裸dna)引入到细胞(如pbmc、b细胞、t细胞和/或nk细胞)中。在一些实施例中，脂质体制剂、脂质、树状体、pei、pll、纳米颗粒和细胞穿透肽可以被修饰以包括淋巴细胞靶向配体，例如抗cd3抗体。与抗cd3抗体偶联的pei显示可有效地用外源性核酸转染pbmc(o'neill等人，《基因疗法》2001年3月；8(5):362-8)。类似地，由与抗cd3e f(ab')2片段偶联的聚谷氨酸分子制成的纳米颗粒转染t淋巴细胞(smith等人，《自然纳米技术》2017年8月；12(8):813–820)。在一些实施例中，可将dna引入到具有脂质体及鱼精蛋白的复合物中的细胞(如pbmc、b细胞、t细胞和/或nk细胞)中。本文中所提供的方法的实施例中可以使用的其它用于离体转染t细胞和/或nk细胞的方法是所属领域中已知的(参见例如morgan和boyerinas,《生物医药(biomedicines.)》2016年4月20日；4(2).pii:e9，以全文引用的方式并入本文中)。[0610]在本文中所提供的方法的一些实施例中，可以使用基于转座子的载体系统，通过目标dna(作为含有相关基因的5'和3'端中的转座子itr片段的质体)和转座酶载体系统(作为dna或mrna或蛋白质或位点特异性丝氨酸重组酶，如整合人类基因组中的伪attp位点中的相关基因的phic31)的共转染、共核转染或共电穿孔来将dna整合到基因组中，在此实例中，dna载体含有34至40bp attb位点，其是重组酶的识别序列(bhaskar thyagarajan等人,《由噬菌体整合酶介导的哺乳动物细胞中的位点特异性基因组整合(site-specific genomic integration in mammalian cells mediated by phageintegrase)》,《分子细胞生物学(mol cell biol.)》,2001年6月；21(12):3926-3934)且与重组酶一起共转染。关于t细胞和/或nk细胞，本文中所提供的某些方法中可以使用的基于转座子的系统利用sleepingbeauty dna载体系统(参见例如美国专利案第6,489,458号和美国专利申请案第15/434,595号，其以全文引用的方式并入本文中)、piggybac dna载体系统(参见例如manuri等人,《人类基因疗法》,2010年4月；21(4):427-37，其以全文引用的方式并入本文中)或tolcdr2转座子系统(参见例如tsukahara等人,《基因疗法》,2015年2月；22(2):209-215，其以全文引用的方式并入本文中)，其呈dna、mrna或蛋白质形式。在一些实施例中，在引入t细胞和/或nk细胞中之前，基于转座子的载体系统的转座子和/或转座酶可以微型环dna载体形式产生(参见例如hudecek等人,《当前癌症研究结果(recent results cancer res.)》2016；209:37-50和monjezi等人,《白血病(leukemia.)》,2017年1月；31(1):186-194，其以全文引用的方式并入本文中)。然而，在一些情况下，基于转座酶的载体系统不是引入外源性核酸的优选方法。因此，在一些实施例中，本文公开的任何方面或实施例的聚核苷酸不包括转座子itr片段。在一些实施例中，本文公开的任何方面或实施例的修饰的、基因修饰的和/或转导的细胞不包括作为dna或mrna或蛋白质的转座酶载体系统。[0611]也可以通过添加与目标位点的整合5'及3'同源的50-1000bp同源臂，使用crispr或talen介导的整合将car或淋巴增生性元件整合至基因组中的所定义及特异性位点中(jae seong lee等人.《科学报告(scientific reports)》5,文章编号：8572(2015)，由crispr/cas9及同源定向的dna修复路径介导的cho细胞中的位点特异性整合)。crispr或talen提供特异性和基因组靶向裂解且构建体将通过同源性介导的末端接合来整合(yao x等人,《细胞研究(cell res.)》2017年6月；27(6):801-814.doi:10.1038/cr.2017.76.epub 2017年5月19日)。crispr或talen可与目标质体一起共转染为dna、mrna或蛋白质。[0612]对于用于修饰、基因修饰和/或转导t细胞和/或nk细胞(例如，在全血中或在全血级分如tnf或pbmc中)的任何方法，或包括这类方法的用途，或使用这类方法产生的修饰的细胞，和本文提供的任何其它方法或限定产物，本领域技术人员将理解外源性核酸可以使用不包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的方法，例如使用另一种类型的重组载体(例如，与脂质转染剂相关的质体)被引入到细胞中。[0613]抑制性rna分子[0614]本文中所提供的任何方面的实施例可以包括重组反转录病毒颗粒，其基因组被构造成在整合至宿主细胞(如淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞))中之后诱导一个或多个且在说明性实施例中，两个或更多个抑制性rna分子(如mirna或shrna)的表达。这类抑制性rna分子可以在内含子(包括例如ef1-a内含子)内编码。此利用本发明的方法教示以使可包括于可包装反转录病毒基因组中的功能元件最大化，以克服先前教示的缺点，且使这类重组反转录病毒颗粒在过继性t细胞疗法中的有效性最大化。[0615]在一些实施例中，抑制性rna分子包括与彼此部分或完全互补的5'链及3'链(在一些实例中，有义链及反义链)，使得所述两个链能够在细胞环境内形成18至25个核苷酸的rna双螺旋。5'链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，且3'链长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。5'链及3'链可为相同或不同的长度，且rna双螺旋可包括一个或多个错配。替代地，rna双螺旋不具有错配。在一些说明性实施例中，本文的载体或基因组包括本文提供的抑制性rna中的2种或更多种。[0616]包括于本文所提供的组合物及方法中的抑制性rna分子在某些说明性实施例中不存在于和/或不天然表达在其插入其基因组的t细胞中。在一些实施例中，抑制性rna分子为mirna或shrna。在一些实施例中，本公开的实施例中的抑制性分子可为mirna的前体(如pri-mirna或pre-mirna)，或shrna的前体。在一些实施例中，mirna或shrna为人工衍生的(即，人工mirna或sirna)。在其它实施例中，抑制性rna分子为经处理成sirna的dsrna(经转录或人工引入)或sirna本身。在一些实施例中，mirna或shrna具有在自然界中未发现的序列，或具有在自然界中未发现的至少一个功能区段，或具有在自然界中未发现的功能区段的组合。[0617]在一些实施例中，抑制性rna分子以一连串或多重排列方式置于第一核酸分子中，使得多个mirna序列同时自单个多顺反子mirna转录物表达。在一些实施例中，抑制性rna分子可利用非功能性连接子序列直接地或间接地与彼此邻接。在一些实施例中，连接子序列长度可在5个核苷酸与120个核苷酸之间，且在一些实施例中，长度可在10个核苷酸与40个核苷酸之间，作为非限制性实例。在一些实施例中，功能序列可以从与抑制性rna分子相同的转录物表达，例如本文提供的任何淋巴增生性元件。在一些实施例中，抑制性rna分子为天然存在的mirna，如(但不限于)mir-155、mir-30、mir-17-92、mir-122和mir-21。因此，在一些实施例中，抑制性rna分子自5'至3'定向包括：5'微型rna侧接序列、5'茎、环、与所述5'茎部分或完全互补的3'茎，及3'微型rna侧接序列。在一些实施例中，5'茎(在本文中也被称为5'臂)长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，3'茎(在本文中也被称为3'臂)长度可为18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施例中，环的长度为3至40、10至40、20至40或20至30个核苷酸，且在说明性实施例中，环的长度可为18、19、20、21或22个核苷酸。在一些实施例中，一个茎比另一茎长两个核苷酸。较长的茎可为5'茎或3'茎。抑制性rna分子可以是本文的抑制性rna分子章节中的任何抑制性rna分子。[0618]在一些实施例中，5'微型rna侧接序列、3'微型rna侧接序列或两者皆衍生自天然存在的mirna，如(但不限于)mir-155、mir-30、mir-17-92、mir-122及mir-21。在某些实施例中，5'微型rna侧接序列、3'微型rna侧接序列或两者皆衍生自mir-155，例如来自小家鼠或智人的mir-155。将合成mirna茎-环插入mir-155构架(即，5'微型rna侧接序列、3'微型rna侧接序列和mirna 5'和3'茎之间的环)是所属领域的一般技术人员已知的(chung,k..等人2006.《核酸研究(nucleicacidsresearch.)》34(7):e53；us 7,387,896)，例如sibr和esibr序列。在本公开的一些实施例中，mirna可置于sibr或esibr mir-155框架中。在本文的说明性实施例中，mirna置于mir-155框架中，所述框架包括由seq id no:333展示的mir-155的5'微型rna侧接序列或其功能变体、由seq id no:334展示的3'微型rna侧接序列(小家鼠bic非编码mrna的核苷酸221至265)或其功能变体；及被修饰的mir-155环(seq id no:335)或其功能变体。然而，作用以在插入其中的mirna的细胞内提供适当处理以形成能够抑制其结合的目标mrna的表达的成熟mirna的任何已知的微型rna框架涵盖于本公开中。[0619]在一些实施例中，当包括两个或更多个抑制性rna分子(在一些实例中，包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个抑制性rna分子)时，这些抑制性rna分子针对相同或不同的rna目标(如自相关基因转录的mrna)。[0620]在一些实施例中，一个或多个抑制性rna分子是一个或多个淋巴增生性元件，因此，在本文中所提供的任何包括淋巴增生性元件的方面或实施例中，除非与其不相容或其中已陈述。在说明性实施例中，在本文提供的方法中插入至t细胞基因组中的mirna针对靶标，使得t细胞的增殖被诱导和/或增强和/或凋亡被抑制。在一些实施例中，rna靶标是从是mir-155靶标的基因转录的mrna。[0621]在一些实施例中，抑制性rna，例如mirna，编码abcg1的靶mrna、cbl原癌基因(rnf55)(也被称为ccbl和rnf55)(hgnc:1541，entrez基因:867，omim:165360)、t细胞受体t3ζ链(cd3z)(hgnc:1677，entrez基因:919，omim:186780)，t细胞受体α基因座(tcra)(也被称为tcrα)(hgnc:12027，entrez基因:6955，omim:186880)、t细胞受体β基因座(tcrb)(也被称为tcrβ)(hgnc:12155，entrez基因:6957，omim:186930)、pd1、ctla4、ifnγ、t细胞免疫球蛋白粘蛋白3(tim3)(也被称为甲型肝炎病毒细胞受体2)(hgnc:18437entrez基因:84868，omim:606652)、淋巴细胞活化3(lag3)(hgnc:6476，entrez基因:3902，omim:153337)、smad2、tnf受体超家族成员10b(tnfrsf10b)(hgnc:11905，entrez基因:8795，omim:603612)、蛋白磷酸酶2催化亚基α(ppp2ca)(hgnc:9299，entrez基因:5515，omim:176915)、肿瘤坏死因子受体超家族成员6(tnfrsf6)(也被称为fas细胞表面死亡受体(fas))(hgnc:11920,entrez基因:355,omim:134637)、b和t淋巴细胞相关(btla)(hgnc:21087、entrez基因:151888、omim:607925)、具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)(hgnc:26838、entrez基因:201633、omim:612859)、腺苷a2a受体(adora2a或a2ar)(hgnc:263，entrez基因:135，omim:102776)、芳香烃受体(ahr)(hgnc:348，entrez基因:196，omim:600253)、脱中胚蛋白(eomes)(hgnc:3372，entrez基因:8320，omim:604615)、smad家族成员3(smad3)(hgnc:6769，entrez基因:4088，omim:603109)、smad家族成员4(smad4)(gnc:6770，entrez基因:4089，omim:600993)、tgfbr2、trail2、pp2a、蛋白磷酸酶2调节亚基bδ(ppp2r2d)(hgnc:23732，entrez基因:55844，omim:613992)、肿瘤坏死因子配体超家族成员6(tnfsf6)(也被称为fasl)(hgnc:11936,entrez基因:356,omim:134638)、半胱氨酸蛋白酶3(casp3)hgnc:1504,entrez基因:836,omim:600636)、socs1、细胞因子信号传导2的抑制因子(socs2)(hgnc:19382,entrez基因：8835,omim:605117),kruppel样因子10(klf10)(也被称为tgpb诱导型早期生长反应蛋白1(tieg1))(hgnc:11810,entrez基因：7071,omim:601878)、junb原癌基因、ap-1转录因子亚基(junb)(hgnc:6205,entrez基因：3726,omim:165161)、染色体盒1(cbx)(hgnc:1551,entrez基因：10951,omim:604511)、cbx3、tet甲基胞嘧啶双加氧酶2(tet2)(hgnc:25941,entrez基因：54790,omim:612839)、己糖激酶2(hk2)(hgnc:4923,entrez基因：3099,omim:601125)fv、含src同源性区域2结构域的磷酸酶-1(shp1)(hgnc:9658，entrez基因:5777，omim:176883)、含src同源性区域2结构域的磷酸酶-2(shp2)(hgnc:9644，entrez基因:5781，omim:176876)、集落刺激因子2(csf2；gmcsf)(entrez基因:1437)。在一些实施例中，抑制性rna(例如mirna)靶向car的astr结合的抗原。[0622]在一些方面中，本文提供了一种被设计成表达自驱动car的聚核苷酸。关于这类复制缺陷型重组反转录病毒颗粒以及包括自驱动car的组合物和方法方面的细节在本文中被更详细地公开，例如在自驱动car方法和组合物章节中和在例示性实施例章节中被更详细地公开。在一些实施例中，被设计成表达自驱动car的聚核苷酸可以包括本文公开的任何抑制性rna分子。这类聚核苷酸还可以具有靶向nfat途径的抑制剂的抑制性rna分子，有或没有本文公开的其它抑制性rna分子。在一些实施例中，抑制性rna分子可以靶向cabin、homer2、akap5、lrrk2和/或dscr1/mcip(敲除编码这些蛋白的rna分子可以减少对钙调神经磷酸酶或钙调蛋白的抑制)；和/或dyrk1a、ck1和/或gsk3(敲除编码这些蛋白质的rna分子可以防止nfat的磷酸化和核输出)。在一些其它说明性实施例中，本文中的载体或基因组包括本文中，例如在以上段落中鉴别的抑制性rna(例如mirna)中的2个或更多个、2-10个、2-8个、2-6个、3-5个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个。[0623]在本文提供的一些实施例中，两种或更多种抑制性rna分子可在单个内含子中递送，如(但不限于)ef1-a内含子a。可用于携带本公开的mirna的内含子序列包括在t细胞内处理的任何内含子。内含子的序列要求为所属领域中已知的。在一些实施例中，这类内含子处理可操作地连接到核糖开关，如本文所公开的任何核糖开关。因此，本文所提供的说明性实施例为针对内源性t细胞受体子单元的mirna的组合，其中mirna的表达由核糖开关调节，所述核糖开关可为本文所论述的核糖开关中的任一个。[0624]在一些实施例中，抑制性rna分子可提供于可包括于相同或不同转录单元上的多个核酸序列上。举例来说，第一核酸序列可编码一种或多种抑制性rna分子，且自第一启动子表达，且第二核酸序列可编码一种或多种抑制性rna分子且自第二启动子表达。在说明性实施例中，两种或更多种抑制性rna分子位于自单个启动子表达的第一核酸序列上。用于表达这类mirna的启动子通常为在用于表达反转录病毒颗粒的包装细胞中无活性的启动子，所述反转录病毒颗粒将其基因组中的mirna递送至目标t细胞，但这类启动子在t细胞内为组成性活性或呈可诱导的方式的活性。启动子可以为pol i、pol ii或pol iii启动子。在一些说明性实施例中，启动子为pol ii启动子。[0625]治疗方法[0626]本公开提供了使用经工程改造的t细胞受体或car的各种治疗方法。当存在于t淋巴细胞或nk细胞中时，本公开的经工程改造的t细胞受体或car可以介导针对靶细胞的细胞毒性。此类方法通常涉及如本文提供的将修饰的淋巴细胞、或基本上纯化的或纯化的rir反转录病毒颗粒施用于受试者。本公开的经工程改造的t细胞受体或car结合于存在于靶细胞上的抗原，由此通过被基因修饰以产生经工程改造的t细胞受体或car的t淋巴细胞或nk细胞介导靶细胞的杀伤。在一些实施例中，经工程改造的t细胞受体或car的astr结合至靶细胞的表面上存在的抗原。[0627]本公开提供了用于杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长的方法，所述方法涉及接触被基因修饰以产生受试者经工程改造的t细胞受体或car的细胞毒性免疫效应细胞(例如，细胞毒性t细胞或nk细胞)，使得t淋巴细胞或nk细胞识别存在于靶细胞的表面上的抗原并且介导靶细胞的杀伤。[0628]本公开提供了一种治疗患有疾病或障碍的个体的疾病或障碍的方法，所述方法包括：a.将包含编码car的多核苷酸序列的表达载体引入到从所述受试者获得的外周血细胞中以产生基因经工程改造的细胞毒性细胞；和b.向所述受试者施用所述基因经工程改造的细胞毒性细胞。[0629]本文提供的方法，例如过继细胞疗法、用于产生细胞的持久群体(persistent population)的方法、用于递送制剂的方法等作为非限制性实例，特别用于治疗癌症。此类癌症可以是任何类型的癌症。例如，此类方法可以用于治疗患有以下或患有与以下相关的肿瘤的受试者：卵巢癌、软组织肉瘤、外周t细胞癌、结直肠癌、肝内胆管癌、成胶质细胞瘤、食管癌、皮肤t细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、基底细胞癌、上皮样肉瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌、间皮瘤、转移性葡萄膜黑色素瘤、肾癌、血癌、表达her2的癌症、非黑色素瘤皮肤癌、脂肪肉瘤、肝细胞癌、小淋巴细胞性淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌、肛门癌、边缘区淋巴瘤、皮肤鳞状细胞癌、甲状腺癌、甲状腺髓癌、三阴性乳腺癌、神经内分泌前列腺癌、膀胱癌、副神经节瘤、髓母细胞瘤、浅表基底细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、血液恶性肿瘤、黑色素瘤、b细胞淋巴瘤、复发性/难治性急性髓性白血病、血管肉瘤、骨肉瘤、难治性宫颈癌、胆管癌、骨肉瘤、胆道癌、去势抵抗性前列腺癌、胃食管腺癌、横纹肌肉瘤、癌、非肌肉浸润性膀胱癌、葡萄膜黑色素瘤、小细胞肺癌、宫颈癌、原发性开角型青光眼、滤泡性淋巴瘤、滑膜肉瘤、肝癌、癌肉瘤、软脑膜脑肿瘤、t细胞淋巴瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、套细胞淋巴瘤、b细胞恶性肿瘤、子宫内膜癌、粘液样/圆形细胞脂肪肉瘤、转移性默克尔细胞癌、成神经细胞瘤、慢性淋巴细胞白血病、腱鞘巨细胞瘤、肉瘤、急性髓性白血病、皮肤癌、鼻咽癌、复发性/难治性尤文氏肉瘤、骨癌、神经胶质瘤、唾液腺癌、胃癌、良性肿瘤、低度恶性浆液性卵巢癌、转移性乳腺癌、多发性骨髓瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、复发性/难治性淋巴瘤、转移性结直肠癌、晚期恶性肿瘤、急性成淋巴细胞白血病、表达间皮素的实体瘤。[0630]在一些实施例中，本文的方法可以用于治疗表达本文提供的任何一种或多种肿瘤相关抗原和/或肿瘤特异性抗原的肿瘤，并且经工程改造的t细胞受体和car可以被设计成识别此类靶。作为非限制性实例，此类肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原包括本说明书中其它地方提供的血液肿瘤抗原，并且在一些非限制性实施例中，包括以下抗原，其大部分或全部被认为与实体瘤相关：axl、cd44v6、caix、cea、cd133、c-met、egfr、egfrviii、epcam、epha2、gd2、gpc3、gucy2c、her1、her2、icam-1、il13rα2、il11rα、kras、kras g12d、l1cam、mage、met、间皮素、muc1、muc16ecto、nkg2d、ny-eso-1、psca、ror-2、wt-1。[0631]在一些实施例中，本文提供的任何涉及施用步骤的方法可以与另一种癌症疗法的施用组合，在某些实施例中，所述癌症疗法可以是例如皮下递送的癌症疫苗。在其它实施例中，并且任选地与癌症疫苗施用进一步组合，本文提供的包括将经基因修饰的t细胞和/或nk细胞施用于受试者的此类方法，特别是在受试者患有、罹患或怀疑患有癌症的情况下，可以进一步包括向受试者递送有效剂量的免疫检查点抑制剂。这种检查点抑制剂递送可以在施用经基因修饰的t细胞和/或nk细胞之前、之后或同时发生。免疫检查点抑制剂是已知的，并且多种化合物被批准并且处于临床开发中。检查点分子(其中许多是检查点抑制剂化合物的靶标)包括但不限于抗-pd1抗体。[0632]在一些实施例中，所述施用用于治疗受试者的癌症，并且其中所述受试者的肿瘤在所述施用后60天、45天、30天或14天内消退。在一些实施例中，肿瘤是血液癌，例如dlbcl，其在说明性实例中表达本文提供的任何血液癌抗原。在其它实施例中，肿瘤是表达实体瘤抗原的实体瘤，其在某些说明性实施例中是her2阳性实体瘤，例如但不限于乳腺癌。在一些实施例中，所述施用用于治疗受试者的癌症，并且其中所述受试者在所述施用后90天、75天、60天、45天、30天或14天内，在说明性实施例中通过recist1.1标准经历稳定的疾病、至少部分应答或完全应答。在一些实施例中，肿瘤缩小至少10％、20％、25％、30％、50％或更多。在一些实施例中，当肿瘤病变的总和减少30％或更多并且在先前扫描后至少4周被确认而没有新的病变的出现和/或任何病理性淋巴结的短轴减少至小于10mm时，发生部分应答。在一些实施例中，当所有靶和非靶病变消失时，发生完全应答。在一些实施例中，所述施用用于治疗受试者的癌症，并且其中所述受试者在所述施用后60天、45天、30天或14天内经历至少部分应答或经历完全应答。在一些实施例中，受试者是罹患癌症的人。在一些实施例中，细胞制剂被施用2次、3次、4次、5次、6次或更多次，或者在说明性实施例中，在稳定的疾病之前仅向受试者施用一次，或者在说明性实施例中，实现部分应答或完全应答。在一些实施例中，在施用第一细胞制剂后的1天与1个月、2个月、3个月、6个月或12个月之间的第二、第三、第四等时间点将第二制剂施用于受试者，其中第二制剂可以与第一制剂相同，或者可以包含本文提供的任何制剂。[0633]在本文提供的包括肌内施用和在说明性实施例中皮下施用修饰的淋巴细胞(例如，修饰的t细胞和/或nk细胞)的任何方面中，在某些实施例中，通过本文提供的任何途径的施用在已经历淋巴耗尽过程的哺乳动物受试者上进行，如本领域已知的。然而，在说明性实施例中，修饰的t细胞和/或nk细胞或rer反转录病毒颗粒(rip)的施用以不需要受试者的淋巴耗尽以用于在受试者中成功植入和/或用于在受试者中成功减少肿瘤体积的方法进行，或者在这样的施用(例如皮下施用)之前的前几天、前几周或前几个月或者甚至之前未经历淋巴耗尽的哺乳动物(例如人类)受试者上进行。在某些实施例中，施用在不患有低白细胞计数、淋巴球减少症(lymphopenia)或淋巴细胞减少症(lymphocytopenia)的哺乳动物(例如人类)受试者上进行。在某些实施例中，在具有在正常范围内(即，在1微升(μl)的血液中的1,000个和4,800个淋巴细胞)的淋巴细胞计数的受试者上进行皮下施用。在某些实施例中，在具有1,000个淋巴细胞/μl血液至5,000个淋巴细胞/μl血液、超过300个淋巴细胞/μl血液、超过500个淋巴细胞/μl血液、超过1,000个淋巴细胞/μl血液、超过1,500个淋巴细胞/μl血液或超过2,000个淋巴细胞/μl血液的受试者上进行皮下施用。在某些实施例中，在淋巴丰富的哺乳动物(例如，人类)受试者上进行皮下施用。[0634]特征及商业生产方法[0635]本公开提供多种方法及组合物，可用作科学实验中的研究试剂及用于商业生产。此科学实验可包括使用用于修饰例如基因修饰和/或转导本文提供的淋巴细胞的方法表征淋巴细胞(如nk细胞，且在说明性实施例中，t细胞)的方法。这些方法例如可用于研究淋巴细胞的活化及通过其活化使得这些细胞可转导的详述分子机制。此外，本文提供了将用于例如作为研究工具以更好理解影响t细胞增生及存活的因素的被修饰的且在说明性实施例中被基因修饰的淋巴细胞。这些被修饰的淋巴细胞(如nk细胞，且在说明性实施例中，t细胞)可此外用于商业生产，例如用于产生可经采集或测试或用于产生商业产物的某些因子，如生长因子及免疫调节剂。[0636]淋巴细胞的科学实验和/或特征可包括用于分析或比较淋巴细胞的本文提供的方面、实施例或子实施例中的任一个。在一些实施例中，可用包括聚核苷酸的本文提供的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒转导t细胞和/或nk细胞。在一些实施例中，转导t细胞和/或nk细胞可包括聚核苷酸，所述聚核苷酸包括编码本公开的多肽的聚核苷酸，例如car、淋巴增生性元件和/或活化元件。在一些实施例中，聚核苷酸可包括如本文其它地方论述的抑制性rna分子。在一些实施例中，淋巴增生性元件可为嵌合淋巴增生性元件。[0637]例示性实施例[0638]此例示性实施例章节提供本文中提供的非限制性的例示性方面及实施例且贯穿此说明书进一步论述。出于简洁及方便起见，所有本文公开的方面及实施例及所公开的方面及实施例的所有可能的组合不列于此章节中。在本文的其它章节中提供了另外的实施例和方面。此外，应理解，所提供的实施例为针对许多方面的特定实施例，如此整个公开内容所论述。意图鉴于本文的完整公开内容，以下所述或此完整公开内容中的任何个别实施例可与以下所述或此完整公开内容中的任何方面组合，其中其为可添加至方面的额外元素或因为其为针对已呈现于方面中的元素的更窄元素。此组合在此详细描述的其它章节中具体地论述。因此，例如，本文提供的任何实施例可以用于本文提供的任何反应混合物、细胞制剂、试剂盒、用途、细胞加工组件、过滤器总成、细胞群体、修饰的、基因修饰的和转导的t细胞或nk细胞、混合物、细胞混合物或方法方面，除非不相容或另有说明。本文提供的许多方法方面包括以下在本文中称为“c/f步骤”的步骤。这类步骤包括以下步骤:a)在包含活化元件的反应混合物中离体接触细胞，例如血细胞，包括nk细胞和/或在说明性实施例中的t细胞，并且与重组或核酸载体(在说明性实施例中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(“rip”))接触，其中rip包含编码包含转基因(并且在说明性实施例中抗原、经工程改造的t细胞受体或嵌合抗原受体(“car”))的第一多肽的多核苷酸，其中所述car包含抗原特异性靶向区(“astr”)、跨膜结构域和胞内激活结构域，和/或淋巴增生性元件(“le”)，其中所述接触促进t细胞和/或nk细胞与核酸载体(在说明性实施例中rip)的缔合，并且其中核酸载体(在说明性实施方案中rip)修饰t细胞和/或nk细胞以形成修饰的t细胞和/或nk细胞的群体；和b)通过将修饰的t细胞和/或nk细胞的群体悬浮在递送溶液中来形成细胞制剂。这些步骤通常可以包括任选的培育和/或从反应混合物中的细胞洗去未结合的核酸载体的步骤。[0639]在本文被称为“c/f/a步骤”的一些说明性实施例中，在上述接触和形成步骤之后进行以下步骤：c)向受试者施用细胞制剂。在一些说明性实施例中，在接触步骤(本文被称为“收集步骤”或“抽取血液”步骤)之前，在接触步骤之前，从受试者(例如，哺乳动物，例如家养动物或在说明性实施例中人类)收集血液，所述血液包含淋巴细胞，例如t细胞和nk细胞，通常以及其它全血组分，例如嗜中性粒细胞和本文提供的其它组分。[0640]值得注意的是，在某些说明性实施例中，反应混合物包括未分级的全血或包括在全血中发现的所有或许多细胞类型，包括总有核细胞(tnc)。值得注意的是，在某些实施例中，重组载体包含自驱动car，其编码car和淋巴增生性元件。稍后在该例示性实施例章节中提供的是例示性范围和列表，其可以用于紧接在下面提供的任何方面或本文中的其它方面，除非与本领域技术人员将认识到的不兼容或以其它方式指出。[0641]在一个方面中，本文提供了一种用于向受试者施用修饰的t细胞和/或nk细胞的方法，其包括c/f/a步骤。在另一方面中，本文提供了一种用于将细胞制剂施用于受试者的方法，其包括c/f/a步骤。在另一个实施例中，本文提供了一种在受试者中产生基因修饰的细胞的持久群体的方法，其包括c/f/a步骤，其中基因修饰的淋巴细胞的持久群体在施用后在受试者中保持持续至少7、14、21或28天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或1、2、3、4或5年。在另一方面中，本文提供了一种用于将修饰的t细胞和/或nk细胞皮下或肌内递送至受试者的方法，其包括c/f/a步骤。在另一方面中，本文提供了一种执行细胞疗法的方法，其包括c/f/a步骤。在另一方面中，本文提供了一种扩增受试者中的经基因修饰的淋巴细胞的群体的方法，其包括c/f/a步骤，其中施用的修饰的淋巴细胞产生受试者中的后代经基因修饰的淋巴细胞的群体。[0642]在另一方面中，本文提供了一种对罹患癌症的受试者执行car-t疗法的方法，其包括c/f/a步骤。在另一方面中，本文提供了一种治疗患有与抗原的升高的表达相关的疾病、障碍或病症(在说明性实施例中癌症)的受试者的方法，其包括c/f/a步骤。在另一方面中，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括c/f/a步骤。在另一方面中，本文提供了一种在受试者中提供抗肿瘤免疫性的方法，其包括cfa，其中所述抗肿瘤免疫应答是对由肿瘤表达的抗原的主动或被动免疫应答，其包括c/f/a步骤。在另一方面中，本文提供了一种稳定或减少受试者的肿瘤负荷的方法，其包括c/f/a步骤。在另一方面中，本文提供了一种用于在受试者中提供抗肿瘤免疫性的方法，其包括c/f/a步骤，其中抗肿瘤免疫应答是对由肿瘤表达的抗原的主动或被动免疫应答。在另一方面中，本文提供了一种用于刺激对受试者的靶细胞群体或组织的t细胞介导的免疫应答的方法，其包括c/f/a步骤。[0643]在一个方面中，本文提供了一种向受试者施用、注射或递送修饰的淋巴细胞(例如，nk细胞和/或t细胞)的方法，其包括向受试者皮下施用包含所述修饰的淋巴细胞(例如，t细胞和/或nk细胞)的细胞制剂，其中所述修饰的t细胞和/或nk细胞是以下中的任何一种或两种：[i]用包含一个或多个转录单元的多核苷酸进行基因修饰，其中所述一个或多个转录单元中的每一个与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接；或[ii]与包含所述多核苷酸的rip缔合，其中所述一个或多个转录单元编码包含car的第一多肽，并且其中嗜中性粒细胞、b细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞中的至少一种与修饰的t细胞和/或nk细胞一起在所述细胞制剂中皮下施用。[0644]在一个方面中，本文提供了一种用于向受试者递送修饰的淋巴细胞(例如，t细胞和/或nk细胞)的方法，或包括在该方法中的细胞制剂，包括向所述受试者皮下施用包含所述修饰的淋巴细胞(例如，t细胞和/或nk细胞)的细胞制剂，其中所述修饰的淋巴细胞(例如，t细胞和/或nk细胞)是以下中的任一种或两者：与包含多核苷酸(所述多核苷酸包含与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个转录单元)的rip缔合(用包含多核苷酸的rip修饰)，或用所述多核苷酸进行基因修饰，其中所述一个或多个转录单元编码包含car的第一多肽，并且其中[0645]i)聚核苷酸在至少10％、25％、50％、75％、80％、90％或95％的修饰的淋巴细胞中是染色体外的；[0646]ii)细胞制剂中至少25％、50％、75％、80％、90％或95％的修饰的t细胞和/或nk细胞不表达一种或多种car或转座酶；[0647]iii)细胞制剂中至少25％、50％、75％、80％、90％或95％的修饰的t细胞和/或nk细胞包含重组病毒反转录酶或重组病毒整合酶；[0648]iv)细胞制剂中至少25％、50％、75％、80％、90％或95％的修饰的t细胞和/或nk细胞不具有稳定整合到其基因组中的聚核苷酸；[0649]v)细胞制剂中1％至20％，或任选地5％至15％的t细胞和/或nk细胞是基因修饰的；[0650]vi)细胞制剂中至少25％、50％、75％、80％、90％或95％的修饰的t细胞和/或修饰的nk细胞是活的；和/或[0651]vii)至少10％、20％、30％、40％、50％的修饰的淋巴细胞在其表面上包含病毒假型化元件和/或t细胞活化抗体。[0652]如所述，上述方法中提供的制剂本身代表了本文提供的另一个方面。此类制剂方面可以提供本文提供的细胞聚集体实施例、本文提供的小体积元件、本文提供的变暗的t细胞特征和变暗的nk细胞特征中的任何一种。在某些实施例中，在加入以形成制剂之前，将细胞离体持续少于24小时、12小时、8小时、6小时、4小时、2小时或1小时。[0653]在一些实施例中，通过皮内、瘤内、腹膜内、皮下或肌内施用、递送或注射引入到受试者中的修饰的淋巴细胞可以是同种异体淋巴细胞。在这类实施例中，淋巴细胞来自不同的人，并且来自受试者的淋巴细胞未被修饰。在一些实施例中，不从受试者采集血液以收获淋巴细胞。[0654]在上述方面中的任何一个中，淋巴细胞可以被认为是修饰的淋巴细胞，这是因为以下中的任何一种或两种：它们与重组核酸载体如rip缔合，所述重组核酸载体包含含有一个或多个转录单元的聚核苷酸，其中每个转录单元与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接；或者因为它们被聚核苷酸基因修饰，包括正在被聚核苷酸转导。[0655]在一个方面中，本文提供了一种用于向受试者递送、注射或施用修饰的t细胞和/或nk细胞的方法，其包括：[0656]a)任选地从所述受试者采集包含淋巴细胞的血液；[0657]b)使包含所述t细胞和/或nk细胞的血细胞与rip在包含t细胞和/或nk细胞活化元件的反应混合物中离体接触，其中所述rip包含[0658]i)反转录病毒颗粒的表面上的结合多肽和促融合多肽，其中所述结合肽能够结合至t细胞和/或nk细胞，并且其中所述促融合多肽能够介导反转录病毒颗粒膜与t细胞和/或nk细胞膜的融合；和[0659]ii)包含一个或多个转录单元的聚核苷酸，其中所述一个或多个转录单元中的每一个与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接，其中所述一个或多个转录单元编码包含car的第一多肽，[0660]其中所述接触促进t细胞和/或nk细胞与rip的缔合，并且其中所述重组反转录病毒颗粒修饰t细胞和/或nk细胞；以及；[0661]c)向所述受试者肌内或在说明性实施例中皮下施用包含修饰的t细胞和/或nk细胞的溶液，其中[0662]i)所述反应混合物包含按体积计至少25％的未分级的全血，[0663]ii)反应混合物包含嗜中性粒细胞，[0664]iii)将修饰的t细胞和/或nk细胞与b细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞中的一种或多种一起以细胞制剂的形式皮下施用，和/或[0665]iv)在从受试者采集血液的时间到将修饰的t细胞和/或nk细胞施用(或再施用/再引入)到受试者中的时间之间经过不超过14小时。在说明性实施例中，这类重组核酸载体是在其表面上包含假型化元件的复制缺陷型反转录病毒颗粒。[0666]在本文提供的包括施用步骤的任何方法的一些实施例中，所述施用步骤包括但不限于上述方法，所述方法进一步包括在修饰之后但在施用之前，将修饰的淋巴细胞配制在稀释溶液中以形成包含修饰的淋巴细胞的细胞制剂，并且其中施用于受试者的溶液是细胞制剂。[0667]在一个方面中，本文提供了一种用于将修饰的淋巴细胞施用于受试者的方法，其包括：[0668]a)从所述受试者采集包含淋巴细胞的血液；[0669]b)通过在包含血液或其级分的反应混合物中使淋巴细胞与重组核酸载体离体接触来修饰淋巴细胞，其中所述接触在没有任何培育的情况下进行，或者通过将反应混合物培育1分钟至12小时来修饰淋巴细胞，并且其中所述接触促进淋巴细胞与重组核酸载体的缔合，从而修饰淋巴细胞；和[0670]c)向所述受试者皮下或肌内施用包含所述修饰的淋巴细胞的溶液，其中所述修饰的淋巴细胞通过以下中的任何一种或两种而被修饰：与包含聚核苷酸的重组核酸载体缔合，所述聚核苷酸包含与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个转录单元；或通过用所述聚核苷酸进行基因修饰，其中所述一个或多个转录单元编码包含car的第一多肽。在说明性实施例中，这类重组核酸载体是复制缺陷型反转录病毒颗粒，在其表面上包含促融合多肽、结合多肽(例如假型化元件)和任选的活化元件[0671]在另一个方面中，本文提供了一种将修饰的t细胞和/或nk细胞递送至受试者的方法，其中所述方法包括将包含修饰的t细胞和/或nk细胞的细胞制剂皮下递送至受试者，其中所述修饰的t细胞和/或nk细胞用包含一个或多个转录单元的聚核苷酸进行基因修饰，其中所述一个或多个转录单元中的每一个与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接，并且其中所述一个或多个转录单元编码包含car的第一多肽和包含le的第二多肽，所述淋巴增生性元件包含来自细胞因子受体的胞内信号传导结构域。[0672]在一个方面中，本文提供了一种细胞制剂，以及重组核酸载体(在说明性实施例中复制缺陷型反转录病毒颗粒)用于制备或在制备细胞制剂中的用途，所述细胞制剂包含修饰的淋巴细胞(例如，t细胞和/或nk细胞)，并且在说明性实施例中为肿瘤浸润性淋巴细胞或基因修饰的淋巴细胞，用于将修饰的淋巴细胞皮下或肌内施用于受试者，其中所述重组核酸载体包含含有一个或多个转录单元的聚核苷酸，其中所述转录单元中的每一个与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接，其中所述一个或多个转录单元编码包含car的第一多肽，并且其中所述细胞制剂对于皮下或肌内施用是有效的、适合于皮下或肌内施用和/或能够皮下或肌内施用。细胞制剂可以进一步包含本文提供的细胞制剂组分中的任一种。[0673]在一个方面中，本文提供了一种细胞制剂，其包含在递送溶液中的修饰的淋巴细胞，其中所述修饰的淋巴细胞具有一种或多种基因载体，例如与其表面缔合的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(rip)，并且其中所述修饰的淋巴细胞包含t细胞和/或nk细胞，其中所述t细胞包含cd4+细胞和cd8+细胞，并且其中所述nk细胞包含cd56+细胞，[0674]其中所述基因载体或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括编码转基因(在说明性实施例中抗原、经工程改造的t细胞受体、嵌合抗原受体(car)的多核苷酸，[0675]其中所述基因载体或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒包括能够结合至表面多肽(在说明性实施例中t细胞受体复合物多肽，或在说明性实施例中cd3)的多肽，所述表面多肽与所述基因载体或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面缔合，[0676]其中所述细胞制剂中至少50％的t细胞和/或nk细胞对所述表面多肽呈表面阴性或对所述t细胞受体复合物多肽呈表面阴性，或是表面cd3-，并且[0677]其中至少5％的修饰的淋巴细胞在细胞聚集体中。在一些实施例中，至少10％的cd4+细胞和/或cd8+细胞和/或cd56+细胞在细胞聚集体中。在一些实施例中，细胞制剂中至少50％的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-。在一些实施例中，细胞制剂中至少90％的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-。在一些实施例中，在形成和/或施用时，细胞制剂中50％至99％的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-。在一些实施例中，细胞聚集体包含5个至500个修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，细胞聚集体能够通过孔径为至少40μm的粗过滤器来保持。在一些实施例中，细胞聚集体的直径大于40μm。在一些实施例中，细胞制剂包括3×104至3×109个修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，细胞制剂具有0.5ml至20ml的体积，并且被包含在注射器内。在一些实施例中，细胞制剂具有1ml至10ml的体积，并且被包含在注射器内。在一些实施例中，细胞制剂具有2ml至7ml的体积，并且被包含在注射器内。在一些实施例中，至少10％的修饰的淋巴细胞在细胞聚集体中，并且其中所述细胞制剂在注射器中并且具有2ml至7ml的体积。在一些实施例中，细胞制剂进一步包含嗜中性粒细胞。在一些实施例中，细胞制剂包括所有类型的有核血细胞，并且任选地，此类细胞以存在于血液中的比率。在一些实施例中，其中所述制剂包括所有类型的外周血单核细胞，并且任选地此类细胞以存在于外周血中的比率。[0678]在另一方面中，本文提供了一种细胞制剂，其包含在递送溶液中的修饰的细胞(并且在说明性实施例中修饰的t细胞和/或nk细胞)，其中所述修饰的细胞具有与其表面缔合的rip，[0679]其中所述rip包括编码转基因(并且在说明性实施例中抗原、经工程改造的t细胞受体或car)的多核苷酸，[0680]其中所述rip包括能够结合至与所述rip的表面缔合的tcr复合物多肽(并且在说明性实施例中cd3)的多肽，[0681]其中所述细胞中的至少一些细胞如本文所提供的那样变暗，例如具有来自变暗的t细胞特征和/或变暗的nk细胞特征的一种或多种特征；和[0682]其中所述细胞中的至少一些细胞在如本文提供的细胞聚集体中。[0683]在一些方面中，本文提供了一种细胞制剂，其包含在递送溶液中的修饰的细胞(并且在说明性实施例中修饰的t细胞和/或nk细胞)，其中所述修饰的细胞具有与其表面缔合的rip，[0684]其中所述rip包括编码转基因并且任选地编码淋巴增生性元件的多核苷酸，[0685]其中所述rip包括能够结合至与所述rip的表面缔合的tcr复合物多肽(并且在说明性实施例中cd3)的多肽，并且[0686]其中：[0687]i)细胞中的至少一些如本文所提供的那样变暗，例如具有来自变暗的t细胞特征和/或变暗的nk细胞特征的一种或多种特征；[0688]ii)细胞中的至少一些在如本文提供的细胞聚集体中；和/或[0689]iii)细胞制剂的体积或收集的血液的体积或反应混合物的体积是在小体积元件中。[0690]在另一方面中，本文提供了一种细胞群体，其包含皮下t细胞和/或nk细胞，其中至少10％、20％、30％、40％、50％、75％的t细胞和/或nk细胞是具有与其表面缔合的rip的修饰的细胞，[0691]其中所述rip包含编码转基因(并且在说明性实施例中抗原、经工程改造的t细胞受体或嵌合抗原受体(car))的多核苷酸，[0692]其中所述rip包括结合与所述反转录病毒颗粒的表面缔合的tcr复合物多肽(并且在说明性实施例中cd3)的多肽，并且[0693]其中细胞中的至少一些如本文所提供的那样变暗，例如具有来自变暗的t细胞特征和/或变暗的nk细胞特征的一种或多种特征；[0694]在一个方面中，本文提供了一种经基因修饰的淋巴细胞的群体，包括：至少10、100、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010或1×1011个表达转基因(在说明性实施例中抗原、经工程改造的t细胞受体或嵌合抗原受体(car))的经基因修饰的淋巴细胞，其中所述经基因修饰的淋巴细胞中的至少一些在受试者中皮下定位，并且其中所述经基因修饰的淋巴细胞包括t细胞和/或nk细胞。在一些实施例中，细胞群体进一步包括不表达car的其它白细胞。在一些实施例中，细胞群体包含各自至少10、20、30、40、50、100或1,000个细胞的一个或多个聚集体。[0695]在另一方面中，本文提供了一种皮下淋巴样结构(其可以被认为是三级淋巴样结构)，其包含经基因修饰的淋巴细胞的群体、紧邻上述的细胞群体方面或本文提供的任何细胞群体中的修饰的淋巴细胞中的至少一些。在一些实施例中，表达car的经基因修饰的淋巴细胞中的一些位于淋巴脉管系统中。在一些实施例中，其它白细胞包括b细胞、巨噬细胞、树突状细胞、t细胞和/或nk细胞。在一些实施例中，群体中的一些修饰的淋巴细胞处于淋巴脉管系统中，在某些实施例中，位于距皮下淋巴样结构的25、50、75、100、125、150、200、250、500或1,000μm内。在一些实施例中，皮下淋巴样结构或基因修饰的淋巴细胞的群体进一步包括受试者天然的且不表达car的主动分裂的淋巴细胞。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞表达淋巴增生性元件。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。在一些实施例中，皮下淋巴样结构是人工淋巴结。在一些实施例中，经基因修饰的淋巴细胞的群体在人工淋巴结中。[0696]在一些实施例中，本文的皮下细胞群体和/或淋巴样结构是本文提供的皮下修饰的淋巴细胞的可分辨的、瞬时的和/或动态的结构。因此，在一些实施例中，根据本文的任何方法，在皮下施用后1、2、4、5、7或14天，此类群体和结构出现和/或在其中的修饰的细胞的大小和/或数量增加，但是随后在稍后的时间点，例如在21天、28天或稍后的时间点，可以在受试者的皮下区域中减少其中的修饰的细胞的大小和/或数量。因此，本文提供了包含本文提供的任何修饰的淋巴细胞的细胞群体的可分辨的淋巴样结构。[0697]在一些实施例中，t细胞包括cd4+和cd8+细胞，并且其中作为cd4+和/或cd8+的至少50％的经基因修饰的淋巴细胞是cd3-；[0698]在本文的经基因修饰的淋巴细胞的群体的任何方面或实施例的一些实施例中，[0699]i)经基因修饰的淋巴细胞的群体包含表达转基因、经工程改造的t细胞受体或嵌合抗原受体(car)的经基因修饰的淋巴细胞的持久群体，其在施用后在受试者中保持持续至少7、14、21或28天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或1、2、3、4或5年。[0700]ii)经基因修饰的淋巴细胞产生后代淋巴细胞的群体，其中所述后代淋巴细胞的群体包含至少1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、或1×1011、或1×106至1×1010、或1×108至1×1012个细胞；[0701]iii)所述经基因修饰的淋巴细胞的群体包含至少100个位于皮下的经基因修饰的淋巴细胞并且皮下区域不包含人工基质组分；和/或[0702]iv)群体中的至少10个经基因修饰的淋巴细胞在皮下保持定位持续至少7、14、21或28天，并且在说明性实施中，皮下区域不包含人工基质组分。[0703]在一些实施例中，基因修饰的淋巴细胞中的至少1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、或1×1011、或1×106至1×1010、或1×108至1×1012个细胞位于皮下。在一些实施例中，至少1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、或1×1011、或1×106至1×1010、或1×108至1×1012个细胞不在皮下区域中，并且在说明性实施例中在受试者的血液中和/或在肿瘤的部位处循环。[0704]在一个方面中，本文提供了一种皮下淋巴样结构，其包括：[0705]细胞聚集体，其中所述细胞聚集体包括：[0706]a)至少10、100、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、或1×1011个表达转基因(在说明性实施例中抗原、经工程改造的t细胞受体或嵌合抗原受体(car))的经基因修饰的淋巴细胞，其中所述细胞聚集体被皮下定位于受试者中，并且其中所述经基因修饰的淋巴细胞包括t细胞和/或nk细胞；和[0707]b)不表达所述car的其它白细胞，其中所述细胞聚集体中至少10％的所述细胞是其它白细胞。[0708]在另一方面中，本文提供了一种用于制备细胞制剂的方法，其包括：[0709]a)在包含t细胞和/或nk细胞激活元件和复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的反应混合物中离体接触包含t细胞和/或nk细胞的血细胞，其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(rip)包括多核苷酸，所述多核苷酸编码包含转基因(并且在说明性实施例中抗原、经工程改造的t细胞受体或嵌合抗原受体(car))的第一多肽，并且任选地在说明性实施例中编码le的第二多核苷酸；[0710]其中所述接触促进所述t细胞和/或nk细胞与所述rip的缔合，并且其中所述rip修饰所述t细胞和/或nk细胞以形成修饰的t细胞和/或nk细胞的群体；并且[0711]b)通过将修饰的t细胞和/或nk细胞的群体悬浮在递送溶液中来形成细胞制剂，其中：[0712]i)使细胞制剂中的至少一些细胞如本文所提供的变暗，例如细胞制剂具有来自变暗的t细胞特征和/或变暗的nk细胞特征的一个或多个特征；[0713]ii)所述细胞制剂中的至少一些细胞在如本文提供的细胞聚集体中；[0714]iii)所述细胞制剂的体积、所述反应混合物的体积或收集的包含所述血细胞的血液的体积在所述小体积元件中；和/或[0715]iv)在施用于受试者时，在说明性实施例中皮下施用于受试者时，修饰的t细胞和/或nk细胞的群体能够在施用后在受试者体内保持持续至少1、2、3、4、5、6、7、14、17、21或28天或1、2或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或1、2、3、4或5年。[0716]在本文提供的任何方面的一些实施例中，包括但不限于本文上文在此示例性实施例中提供的那些，细胞制剂或群体中的至少一些细胞如本文所提供的变暗，例如细胞制剂或群体具有来自变暗的t细胞特征和/或变暗的nk细胞特征的一个或多个特征。[0717]在本文提供的任何方面的一些实施例中，包括但不限于本文上文在此示例性实施例中提供的那些，细胞或细胞的群体可以形成或能够形成细胞的持久群体，所述细胞的持久群体在施用后在受试者体内保持持续或者能够保持持续至少1、2、3、4、5、6、7、14、17、21或28天或1、2或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或1、2、3、4或5年。[0718]在本文提供的任何方面的一些实施例中，包括但不限于本文上文在此示例性实施例中提供的那些，细胞制剂或群体中的至少一些细胞在如本文提供的细胞聚集体中。[0719]在本文提供的任何方面的一些实施例中，包括但不限于本文上文在此示例性实施例中提供的那些，细胞制剂的体积、收集的血液的体积或反应混合物的体积在小体积元件中。[0720]在另一方面中，本文提供了一种细胞的持久群体，其包含修饰的t细胞和/或nk细胞，其中所述修饰的细胞表达[0721]i)经工程改造的t细胞受体或car，和[0722]ii)淋巴增生性元件，以及[0723]其中所述持久群体和/或其亲本细胞的修饰的细胞在所述哺乳动物中皮下保持持续至少28天。[0724]在另一方面中，本文提供了一种包含修饰的t细胞的细胞群体，其中所述持久群体的修饰的细胞表达经工程改造的t细胞受体或car和淋巴增生性元件。其中所述持久群体的修饰的细胞和/或其亲代细胞源自能够或适于形成能够在哺乳动物体内保持持续28天的持久皮下细胞群体的亲代细胞。[0725]在另一方面中，本文提供了一种包含修饰的t细胞的细胞的持久群体，其中所述持久群体是皮下细胞群体，并且所述细胞群体的修饰的细胞表达[0726]i)经工程改造的t细胞受体或car，和[0727]ii)le，其中所述细胞群体包含至少1×106、1×107、1×108、或1×109、或至少1×105至1×107、1×108或1×109个修饰的细胞。[0728]在另一方面中，本文提供了一种皮下细胞群体，其包括表达经工程改造的t细胞受体或car的经基因修饰的t细胞和/或nk细胞的细胞聚集体，其中所述皮下细胞群体由在施用位点处施用的细胞形成，并且其中所述皮下细胞群中的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞保持定位在施用位点的1、2、3、4或5cm内。[0729]在一组相关方面中，本文提供了一种用于向受试者施用细胞制剂的方法，或基因载体或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制备用于向受试者施用细胞制剂的试剂盒中的用途，其中所述方法或试剂盒的用途包括：[0730]a)在包含t细胞和/或nk细胞活化元件以及一个或多个基因载体或复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(rip)的反应混合物中离体接触包含淋巴细胞的血细胞，其中所述基因载体或rip包括编码第一多肽的多核苷酸，所述第一多肽包含转基因(并且在说明性实施例中抗原、经工程改造的t细胞受体、嵌合抗原受体(car))，[0731]其中所述淋巴细胞包括t细胞和/或nk细胞，其中所述t细胞包含cd4+细胞和cd8+细胞，并且其中所述nk细胞包含cd56淋巴细胞，并且[0732]其中所述接触促进所述淋巴细胞与所述rip的缔合，并且其中所述rip修饰所述t细胞和/或nk细胞以形成包含修饰的t细胞和/或nk细胞的修饰的淋巴细胞的群体；[0733]b)通过将所述修饰的淋巴细胞的群体悬浮在递送溶液中来形成细胞制剂；以及[0734]c)通过皮下、肌内、腹膜内、瘤内或静脉内施用向受试者施用所述细胞制剂，其中至少5％的修饰的淋巴细胞在细胞聚集体中，其中在形成和/或施用时，细胞制剂中至少50％的t细胞、cd4+细胞和/或cd8+细胞和/或cd56+细胞对于表面多肽是表面阴性的或对于t细胞受体复合物多肽是表面阴性的，或者是表面cd3-。在一些实施例中，至少10％的cd4+细胞和/或cd8+细胞和/或cd56+细胞在细胞聚集体中。在一些实施例中，细胞制剂中至少50％的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-。在一些实施例中，细胞制剂中至少90％的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-。在一些实施例中，在形成和/或施用时，细胞制剂中50％至99％的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-。在一些实施例中，细胞聚集体包含5个至500个修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，细胞聚集体能够通过孔径为至少40μm的粗过滤器来保持。在一些实施例中，细胞聚集体的直径大于40μm。在一些实施例中，细胞制剂包括3×104至3×109个修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，细胞制剂具有0.5ml至20ml的体积，并且被包含在注射器内。在一些实施例中，细胞制剂具有1ml至10ml的体积，并且被包含在注射器内。在一些实施例中，细胞制剂具有2ml至7ml的体积，并且被包含在注射器内。在一些实施例中，至少10％的修饰的淋巴细胞在细胞聚集体中，并且其中所述细胞制剂在注射器中并且具有2ml至7ml的体积。在一些实施例中，细胞制剂进一步包含嗜中性粒细胞。在一些实施例中，细胞制剂包括所有类型的有核血细胞，并且任选地，此类细胞以存在于血液中的比率。在一些实施例中，其中所述制剂包括所有类型的外周血单核细胞，并且任选地此类细胞以存在于外周血中的比率。在一些实施例中，所述用途进一步包含在接触之前从受试者收集包含在反应混合物中接触的淋巴细胞的血液，并且在一些实施例中，从受试者收集5ml至50ml或5ml至30ml的血液。在一些实施例中，反应混合物具有5ml至30ml的体积，或[0735]c)通过皮下、肌内、腹膜内、瘤内或静脉内施用向受试者施用所述细胞制剂，其中至少5％的修饰的淋巴细胞在细胞聚集体中，其中在形成和/或施用时，细胞制剂中至少50％的cd4+细胞和/或cd8+细胞和/或cd56+细胞对于表面多肽是表面阴性的或对于t细胞受体复合物多肽是表面阴性的，或者是表面cd3-。在一些实施例中，至少10％的cd4+细胞和/或cd8+细胞和/或cd56+细胞在细胞聚集体中。在一些实施例中，细胞制剂中至少50％的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-。在一些实施例中，细胞制剂中至少90％的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-。在一些实施例中，在形成和/或施用时，细胞制剂中50％至99％的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-。在一些实施例中，细胞聚集体包含5个至500个修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，细胞聚集体能够通过孔径为至少40μm的粗过滤器来保持。在一些实施例中，细胞聚集体的直径大于40μm。在一些实施例中，细胞制剂包括3×104至3×109个修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，细胞制剂具有0.5ml至20ml的体积，并且被包含在注射器内。在一些实施例中，细胞制剂具有1ml至10ml的体积，并且被包含在注射器内。在一些实施例中，细胞制剂具有2ml至7ml的体积，并且被包含在注射器内。在一些实施例中，至少10％的修饰的淋巴细胞在细胞聚集体中，并且其中所述细胞制剂在注射器中并且具有2ml至7ml的体积。在一些实施例中，细胞制剂进一步包含嗜中性粒细胞。在一些实施例中，细胞制剂包括所有类型的有核血细胞，并且任选地，此类细胞以存在于血液中的比率。在一些实施例中，其中所述制剂包括所有类型的外周血单核细胞，并且任选地此类细胞以存在于外周血中的比率。在一些实施例中，所述用途进一步包括在接触之前从受试者收集包含在反应混合物中接触的淋巴细胞的血液，并且在一些实施例中，从受试者收集5ml至50ml或5ml至30ml的血液，或[0736]c)通过皮下、肌内、腹膜内、瘤内或静脉内施用向受试者施用所述细胞制剂，[0737]其中在形成和/或施用时，至少5％的修饰的t细胞在细胞聚集体中，其中在形成和/或施用时，细胞制剂中至少50％的修饰的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-，其中细胞制剂中的修饰的t细胞能够产生经基因修饰的淋巴细胞的持久群体，所述经基因修饰的淋巴细胞的持久群体表达包含car的第一多肽，其中所述经基因修饰的淋巴细胞的持久群体能够在施用后在所述受试者中保持持续至少7天，和/或其中所述细胞制剂具有包含在注射器内的0.5ml至10ml的体积。在一些实施例中，至少10％的cd4+细胞和/或cd8+细胞和/或cd56+细胞在细胞聚集体中。在一些实施例中，细胞制剂中至少50％的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-。在一些实施例中，细胞制剂中至少90％的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-。在一些实施例中，在形成和/或施用时，细胞制剂中50％至99％的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-。在一些实施例中，细胞聚集体包含5个至500个修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，细胞聚集体能够通过孔径为至少40μm的粗过滤器来保持。在一些实施例中，细胞聚集体的直径大于40μm。在一些实施例中，细胞制剂包括3×104至3×109个修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，细胞制剂具有0.5ml至20ml的体积，并且被包含在注射器内。在一些实施例中，细胞制剂具有1ml至10ml的体积，并且被包含在注射器内。在一些实施例中，细胞制剂具有2ml至7ml的体积，并且被包含在注射器内。在一些实施例中，至少10％的修饰的淋巴细胞在细胞聚集体中，并且其中所述细胞制剂在注射器中并且具有2ml至7ml的体积。在一些实施例中，细胞制剂进一步包含嗜中性粒细胞。在一些实施例中，细胞制剂包括所有类型的有核血细胞，并且任选地，此类细胞以存在于血液中的比率。在一些实施例中，其中所述制剂包括所有类型的外周血单核细胞，并且任选地此类细胞以存在于外周血中的比率。在一些实施例中，所述用途进一步包含在接触之前从受试者收集包含在反应混合物中接触的淋巴细胞的血液，并且在一些实施例中，从受试者收集5ml至50ml或5ml至30ml的血液。在一些实施例中，反应混合物具有5ml至30ml的体积。在一些实施例中，在细胞制剂中施用的修饰的淋巴细胞产生表达第一多肽的经基因修饰的淋巴细胞的持久群体，所述第一多肽包括转基因(在说明性实施例中抗原、经工程改造的t细胞受体或car)，其中所述经基因修饰的淋巴细胞的持久群体在施用后在所述受试者中保持或者能够保持持续至少7、14、21或28天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或1、2、3、4或5年、并且其中所述经基因修饰的淋巴细胞的持久群体包含经基因修饰的t细胞和/或nk细胞，和在说明性实施例中其中经基因修饰的淋巴细胞的持久群体在施用后在所述受试者中持续至少28天，并且其中至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的表达包含转基因、抗原、经工程改造的t细胞受体或car的第一多肽的经基因修饰的淋巴细胞在血液中循环。在一些实施例中，在细胞制剂中施用的修饰的淋巴细胞产生后代细胞的群体，其中所述后代细胞的群体包含至少1×106、至少1×109、或1×106至1×1011个修饰的t细胞和/或nk细胞。在一些实施例中，在细胞制剂中至少100个施用的修饰的淋巴细胞或其后代中在皮下保持定位持续至少7、14、21或28天。[0738]在另一个方面中，本文提供了一种细胞制剂，其包含t细胞和/或nk细胞的聚集体，其中所述t细胞和/或nk细胞用包含一个或多个转录单元的聚核苷酸修饰，其中每个所述转录单元与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接，并且其中所述一个或多个转录单元编码包含car的第一多肽，[0739]并且另外其中所述聚集体包含至少4、5、6或8个t细胞和/或nk细胞，其中所述细胞聚集体的最小尺寸为至少15μm，和/或其中所述细胞聚集体由孔径为至少15μm的粗过滤器保留。[0740]在一个方面中，本文提供了一种用于在受试者中植入基因修饰的淋巴细胞的方法，其包括：[0741]a)向所述受试者皮下施用包含修饰的淋巴细胞的溶液，其中所述修饰的淋巴细胞被以下中的任何一种或两种修饰：与包含含有一个或多个转录单元的聚核苷酸的rip缔合，其中每个转录单元与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接；或通过用所述聚核苷酸进行基因修饰，其中所述一个或多个转录单元编码包含car的第一多肽和典型地包含le的第二多肽；和[0742]b)将修饰的淋巴细胞皮下培育至少0.5、1、2、3、4或8小时，使得至少一些修饰的淋巴细胞被聚核苷酸基因修饰，或直到至少10％、20％、25％、30％、40％或50％的修饰的淋巴细胞被聚核苷酸基因修饰。在说明性实施例中，在不存在针对car的抗原特异性靶向区域的靶标的情况下和在不存在外源性细胞因子的情况下，基因修饰的t细胞和/或nk细胞能够在离体培养中存活至少7天。[0743]在本文提供的包括肌内施用和在说明性实施例中皮下施用修饰的淋巴细胞(例如，修饰的t细胞和/或nk细胞)的任何方面中，在某些实施例中，在哺乳动物受试者上以不需要受试者的淋巴耗尽以用于在受试者中成功植入和/或用于在受试者中成功减少肿瘤体积的方法进行皮下施用，或者在先前1、2、3、4、5、6或7天、或先前1、2、3或4周、或先前1、2、3、6、9、12或24个月或者甚至在这种皮下施用之前未经历淋巴耗尽的哺乳动物(例如人类)受试者上进行。在某些实施例中，在不患有低白细胞计数、淋巴球减少症或淋巴细胞减少症的哺乳动物(例如人类)受试者上进行皮下施用。在某些实施例中，在具有在正常范围内(即，在1微升(μl)的血液中的1,000和4,800个淋巴细胞)的淋巴细胞计数的受试者上进行皮下施用。在某些实施例中，在具有1,000个淋巴细胞/μl血液至5,000个淋巴细胞/μl血液、超过300个淋巴细胞/μl血液、超过500个淋巴细胞/μl血液、超过1,000个淋巴细胞/μl血液、超过1,500个淋巴细胞/μl血液或超过2,000个淋巴细胞/μl血液的受试者上进行皮下施用。在某些实施例中，在淋巴丰富的哺乳动物(例如，人类)受试者上进行皮下施用。[0744]在本文提供的包括肌内施用并且在说明性实施例中皮下施用修饰的淋巴细胞(例如，修饰的t细胞和/或nk细胞)的任何方面中，在某些实施例中，此类方法可以包括其中将修饰的细胞皮下扩增(例如，皮下扩增修饰的细胞)，例如在皮下施用位点处或在皮下施用位点附近(例如，在10、5、4、3、2或1cm)，持续数天(例如，持续高达5、7、14、17、21或28天)或数月(例如，持续高达1、2、3、6、12或24个月)的步骤。在本文的包括腹膜内施用、肌内施用和在说明性实施例中皮下施用修饰的t细胞和/或nk细胞或rip以修饰体内t细胞和/或nk细胞的一些实施例中，修饰的t细胞和/或nk细胞(例如，经基因修饰的t细胞和/或nk细胞)从皮下施用位点迁移至身体的其它位点，例如肿瘤。因此，在一些修饰的实施例中和在说明性实施例中，这类方法可以包括这样的步骤，在该步骤中，在将修饰的t细胞腹膜内、肌内或在说明性实施例中皮下注射到受试者中之后数天(例如，1、2、3、4、5、6或7天)、数周(例如，1、2、3或4周)或数月(例如，1、2、3、6、12或24个月)，经基因修饰的t细胞和/或nk细胞出现在从皮下施用位点迁移的循环中。在某些实施例中，在这些时间点，这类方法可以包括这样的步骤，在该步骤中，从肌内施用的位点或在说明性实施例中皮下施用的位点形成修饰的t细胞和/或nk细胞和在说明性实施例中经基因修饰的t细胞和/或nk细胞的区域梯度或在说明性实施例中浓度梯度。[0745]在本文提供的包括腹膜内施用、肌内施用和在说明性实施例中皮下施用修饰的淋巴细胞(例如，修饰的t细胞和/或nk细胞)的任何方面中，某些实施例可以包括在相同或不同制剂中，在修饰的t细胞和/或nk细胞的递送位点处或附近皮下递送可以影响修饰的t细胞和/或nk细胞的另一种组分的步骤，所述另一种组分例如分子(离子)、大分子(例如，dna、rna、肽和多肽)和/或其它细胞，例如其它修饰的细胞(例如，经基因修饰的细胞))。在某些说明性实施例中，其它组分包括抗原、编码重组抗原的重组细胞、或编码抗原的rna、或驱动t细胞和/或nk细胞的增殖的细胞因子。本文更详细地公开的这些其它组分可以在与修饰的t细胞和/或nk细胞相同的制剂或不同的制剂中递送。此外，这些其它组分可以与修饰的t细胞和/或nk细胞一起递送，或者可以在递送修饰的t细胞和/或nk细胞之前或之后数天(例如，1、2、3、4、5、6或7天)、数周(例如，1、2、3或4周)或甚至数月(例如，1、2、3、6、12或24个月)递送。在一些实施例中，这些其它组分中的一种或多种在多于一个时间点递送，例如与修饰的t细胞和/或nk细胞在同一天，或与修饰的t细胞和/或nk细胞同时，并且上文在该段落中所述的一个或多个时间递送。因此，在一些实施例中，在施用细胞制剂后1天至1个月、2个月、3个月、6个月或12个月的第二时间点向受试者施用第二制剂。除了修饰的淋巴细胞或基本上纯化的或纯化的rip之外，施用于受试者的其它组分可以包括(例如，i)细胞因子，例如il-2，ii)能够结合cd2、cd3、cd28、ox40、4-1bb、icos、cd9、cd53、cd63、cd81和/或cd82的抗体或多肽，和/或iii)由car识别的同源抗原的来源)。在某些实施例中，修饰的t细胞和/或nk细胞的皮下施用在肿瘤(例如癌性)细胞的位点附近(例如，在1、2、3、4、5、10、20或30cm内)进行，所述肿瘤细胞例如肿瘤或包含肿瘤的器官，包括例如在血癌的情况下的脾，或者在对相同制剂或不同制剂进行多次施用的情况下，它们可以在先前施用的部位或其附近或远离这类部位进行。在一些实施例中，细胞制剂包含car的同源抗原的来源，其中所述同源抗原的来源是同源抗原、编码所述同源抗原的mrna或表达所述同源抗原的细胞。在一些实施例中，细胞制剂包含细胞因子，并且其中所述细胞因子是il-2、il-7、il-15或il-21，或者这些细胞因子中能够结合至细胞因子的天然受体和活化细胞因子的天然受体的修饰的形式。用于此实施例和本文的任何实施例(包括在该示例性实施例部分中)的同源抗原可以是本文提供的任何肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。[0746]在某些方面中，本文提供了一种基因修饰的t细胞和/或nk细胞的群体，其中所述群体在哺乳动物如人类的皮下环境中，其中至少50％、75％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的修饰的t细胞和/或nk细胞是基因修饰的，并且在说明性实施例中包括编码整合到它们的基因组dna中的car的多核苷酸。在一些实施例中，这类群体可以进一步包括源自肌内递送和在说明性实施例中皮下递送的位点的修饰的t细胞和/或nk细胞的梯度，在一些实施例中，所述梯度在将修饰的t细胞肌内注射到受试者中或在说明性实施例中皮下注射到受试者中之后数天(例如，1、2、3、4、5、6或7天)、数周(例如，1、2、3或4周)或数月(例如，1、2、3、6、12或24个月)形成。在一些实施例中，在皮下环境中存在另一种组分，例如分子(离子)、大分子(例如，dna、rna、肽和多肽)和/或其它细胞，例如可以影响如本文所公开的修饰的t细胞和/或nk细胞的其它修饰的(例如，基因修饰的)细胞。皮下环境的体积可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10cm3。在一些实施例中，此类皮下环境可以包括至少1×1010、1×1011、1×1012或1×1013个经基因修饰的t细胞和/或nk细胞，或1×109至1×1015个经基因修饰的t细胞和/或nk细胞，例如1×1010至1×1013、1×1010至1×1012、或1×1011至1×1013个经基因修饰的t细胞和/或nk细胞。在一些实施例中，此类皮下环境可以包括1×109至1×1013，例如在1×1010至1×1013、1×1010至1×1012或1×1011至1×1013个经基因修饰的t细胞和/或修饰的nk细胞，其中这类细胞包括编码整合到其基因组dna中的car的多核苷酸。在相关方面中，提供了一种哺乳动物受试者，例如人类受试者，其中受试者中表达car的经基因修饰的t细胞和/或nk细胞的至少50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％是皮下的，并且在说明性实施例中，是在本段落中公开的皮下环境中的经基因修饰的t细胞和/或nk细胞的群体。在一些实施例中，此类哺乳动物受试者位于医院外。在一些实施例中，此类哺乳动物受试者在先前的1、2、3、4、5、6或7天内，或在先前的1、2、3或4周内，或在先前的1、2、3、6、9、12或24个月内或者甚至之前未经历淋巴耗尽。[0747]在一个方面中，本文提供了一种细胞制剂，其包含修饰的t细胞和/或nk细胞，其中所述修饰的t细胞和/或nk细胞被悬浮在递送溶液中，并且是以下中的任何一种或两种，[0748]i)用包含一个或多个转录单元的聚核苷酸进行基因修饰，其中所述一个或多个转录单元中的每一个与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接，或[0749]ii)与包含所述聚核苷酸的rip缔合，[0750]其中所述一个或多个转录单元编码包含car的第一多肽，并且其中所述细胞制剂在说明性实施例中被包含在注射器内，并且具有0.5ml至20ml、或2ml至10ml的体积，或本文提供的另一皮下或肌内细胞制剂体积，并且进一步包含嗜中性粒细胞、b细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞中的至少一种、例如两种或更多种。在说明性实施例中，细胞制剂与肌内递送(且在另外的说明性实施例中皮下递送)相容、对肌内递送(且在另外的说明性实施例中皮下递送)有效和/或适于肌内递送(且在另外的说明性实施例中皮下递送)。[0751]在本文是或包括细胞制剂的任何方面的一些实施例和任何反应混合物实施例中，特别是包括皮下、肌内反应或腹膜内反应混合物的实施例中，细胞制剂或反应混合物进一步包含i)细胞因子，ii)能够结合cd3、cd28、ox40、4-1bb、icos、cd9、cd53、cd63、cd81和/或cd82的抗体、抗体模拟物或多肽，和/或iii)由car识别的同源抗原的来源。[0752]在本文提供的任何细胞混合物、细胞制剂或递送溶液方面或实施例中，细胞混合物、细胞制剂或递送溶液可以包括以下中的一种或多种：[0753]a.聚核苷酸在至少10％、25％、50％、75％、80％、90％或95％的修饰的淋巴细胞中是染色体外的；[0754]b.细胞制剂中至少25％、50％、75％、80％、90％或95％的修饰的t细胞和/或nk细胞不表达一种或多种car或转座酶；[0755]c.细胞制剂中至少25％、50％、75％、80％、90％或95％的修饰的t细胞和/或nk细胞包含重组病毒反转录酶或重组病毒整合酶；[0756]d.细胞制剂中至少25％、50％、75％、80％、90％或95％的修饰的t细胞和/或nk细胞不具有稳定整合到其基因组中的聚核苷酸；[0757]e.细胞制剂中1％至20％，或任选地5％至15％的t细胞和/或nk细胞是基因修饰的；[0758]f.细胞制剂中至少25％、50％、75％、80％、90％或95％的修饰的t细胞和/或修饰的nk细胞是活的；和/或[0759]g.至少10％、20％、30％、40％、50％的修饰的淋巴细胞在其表面上包含病毒假型化元件和/或t细胞活化抗体。[0760]在另一个方面中，本文提供了一种用于制备细胞制剂的方法，其包括：[0761]a)任选地从所述受试者采集包含淋巴细胞的血液；[0762]b)使包含所述t细胞和/或nk细胞的血细胞与rip在包含t细胞和/或nk细胞活化元件的反应混合物中离体接触，其中所述rip包含[0763]i)反转录病毒颗粒的表面上的结合多肽和促融合多肽，其中所述结合肽能够结合至t细胞和/或nk细胞，并且其中所述促融合多肽能够介导反转录病毒颗粒膜与t细胞和/或nk细胞膜的融合；和[0764]ii)包含一个或多个转录单元的聚核苷酸，其中所述一个或多个转录单元中的每一个与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接，其中所述一个或多个转录单元编码包含car的第一多肽，[0765]其中所述接触促进所述t细胞和/或nk细胞与所述rip的缔合，并且其中所述重组反转录病毒颗粒修饰所述t细胞和/或nk细胞；[0766]b)收集递送溶液中被修饰的t细胞和/或nk细胞，以形成包含被修饰的t细胞和/或nk细胞的悬浮液的细胞制剂；和[0767]c)将0.5ml至20ml、或2ml至10ml、或本文提供的另一皮下或肌内细胞制剂体积的细胞制剂转移到注射器中。[0768]在下文和本文的详细描述中，在该例示性实施例章节之外，提供了另外的细胞制剂方面和实施例。本文针对任何细胞制剂方面提供了各种体积的细胞制剂。在一些实施例中，细胞制剂的体积为3ml或更大，例如体积为3ml至600ml,或在50ml至500ml之间，或在100ml至500ml之间。在一些实施例中，细胞制剂包含透明质酸酶。在一些实施例中，细胞制剂为1ml至10ml、1ml至5ml、1ml至3ml或10ml、5ml、4ml、3ml或2ml或更少、或少于3ml,或本文提供的任何小体积元件。在说明性实施例中，细胞制剂不包含透明质酸酶。本文提供了其它体积和制剂。在本文的任何细胞制剂方面的一些实施例中，细胞制剂被包含在注射器内。在一些实施例中，对于本文提供的任何细胞制剂，细胞制剂在培育袋或血液处理袋中。在说明性实施例中，注射器使用良好生产规范(gmp)制造，并且为gmp等级和质量。[0769]在本文提供的任何细胞制剂方面的一些实施例中，所述细胞制剂在受试者中被定位于皮下或肌内，或所述细胞制剂的大部分被定位于皮下或肌内。在一些实施例中，细胞制剂进一步包含由car识别的抗原的来源。在一些实施例中，修饰的淋巴细胞是本文提供的用于修饰淋巴细胞的方法的产物。[0770]在本文的方面的任何一个中，反应混合物可以包含至少10％、20％、25％、50％、75％、80％、90％、95％或99％未分级的全血和任选的有效量的抗凝血剂，或者反应混合物可进一步包含至少一种不是pbmc的另外的血液或血液制剂组分，并且在另外的说明性实施例中，这类血液或血液制剂组分是本文提供的值得注意的非pbmc血液或血液制剂组分中的一种或多种。[0771]在另一个方面中，本文提供了一种反应混合物，其包含rip、t细胞活化元件和血细胞，其中所述重组反转录病毒颗粒在其表面上包含假型化元件，其中所述血细胞包含t细胞和/或nk细胞，其中所述rip包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个核酸序列，所述核酸序列通常是与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接的转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含car的第一多肽、包含le的第一多肽和/或一个或多个抑制性rna分子，并且其中所述反应混合物包含至少10％、20％、25％、50％、75％、80％、90％、95％或99％的未分级的全血。一个或多个抑制性rna分子可以针对在本文中提供的任何靶标，包括但不限于在本例示性实施例章节中或在本文的抑制性rna分子章节中提供的任何靶标。[0772]在一个方面中，本文提供了一种反应混合物，其包含rip和血细胞，其中所述重组反转录病毒颗粒在其表面上包含假型化元件，其中所述血细胞包含t细胞和/或nk细胞，并且其中所述反应混合物包含至少10％、20％、25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％的未分级的全血和任选的有效量的抗凝血剂，或者其中所述反应混合物进一步包含至少一种不是pbmc的另外的血液或血液制剂组分，并且在说明性实施例中，这类血液或血液制剂组分是本文提供的值得注意的非pbmc血液或血液制剂组分中的一种或多种。[0773]在另一个方面中，本文提供了一种反应混合物，其包含rip、t细胞活化元件和血细胞，其中所述重组反转录病毒颗粒在其表面上包含假型化元件，其中所述血细胞包含t细胞和/或nk细胞，其中所述rip包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个核酸序列，所述核酸序列通常是与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接的转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码包含car的第一多肽、包含le的第一多肽和/或一个或多个抑制性rna分子，并且其中所述反应混合物包含至少10％、20％、25％、50％、75％、80％、90％、95％或99％的未分级的全血和任选的有效量的抗凝血剂，或者其中所述反应混合物进一步包含至少一种不是pbmc的另外的血液或血液制剂组分，并且在说明性实施例中，这类血液或血液制剂组分是本文提供的值得注意的非pbmc血液或血液制剂组分中的一种或多种。一个或多个抑制性rna分子可以针对在本文中提供的任何靶标，包括但不限于在本例示性实施例章节中或在本文的抑制性rna分子章节中提供的任何靶标。[0774]在另一个方面中，本文提供了一种用于修饰和在说明性实施例中基因修饰血液或其组分中的t细胞和/或nk细胞的方法，其包括使反应混合物中包含t细胞和/或nk细胞的血细胞与rip离体接触，其中所述rip在其表面上包含假型化元件，其中所述接触促进t细胞和/或nk细胞与rip的缔合，其中所述重组反转录病毒颗粒基因修饰和/或转导t细胞和/或nk细胞，并且其中所述反应混合物包含至少10％、10％、20％、25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％的未分级的全血和任选的有效量的抗凝血剂，或者其中所述反应混合物进一步包含至少一种不是pbmc的另外的血液或血液制品组分，并且在说明性实施例中，所述血液或血液制品组分是本文提供的值得注意的非pbmc血液或血液制品组分中的一种或多种。[0775]在另一个方面中，本文提供了rip在制备用于修饰和在说明性实施例中基因修饰受试者的t细胞和/或nk细胞的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒的用途包括：使反应混合物中包含t细胞和/或nk细胞的血细胞与所述rip离体接触，其中所述rip在其表面上包含假型化元件，其中所述接触促进t细胞或nk细胞与rip的缔合，其中所述重组反转录病毒颗粒基因修饰和/或转导t细胞和/或nk细胞，并且其中所述血细胞包括t细胞、nk细胞，并且其中所述反应混合物包含至少10％、20％、25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％的未分级的全血和任选的有效量的抗凝血剂，或者其中所述反应混合物进一步包含至少一种不是pbmc的另外的血液或血液制剂组分，并且在说明性实施例中，所述血液或血液制剂组分是本文提供的值得注意的非pbmc血液或血液制剂组分中的一种或多种。[0776]一种或多种值得注意的非pbmc血液或血液制剂组分存在于本文提供的反应混合物、用途、修饰的和在说明性实施例中基因修饰的t细胞或nk细胞或用于修饰t细胞和/或nk细胞的方法中的任何一种的某些说明性实施例中，包括但不限于在本例示性实施例章节中提供的那些，因为在这些特定说明性实施例中，反应混合物包含至少10％的全血。在本文中包括反应混合物的任何方面的某些实施例中，反应混合物包含作为范围的低端的10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％和75％至作为范围的高端的80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、或99.99％的全血，或至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％的未分级的全血。[0777]在本文的另一方面中，本文提供了一种方法，其包括将本文提供的任何复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(rip)典型地连同活化元件(其在说明性实施例中与rip的膜缔合)，直接施用于受试者，例如通过静脉内、肌内、瘤内、腹膜内施用，并且在说明性实施例中通过皮下施用。此类rip通常连同活化元件一起可以在修饰组合物中施用。在此类方法中，本文提供的任何接触步骤可以在体内发生。因此，在这些实施例中，接触通常在体内发生，在一些实施例中，与存在于受试者内的未改变的天然存在的靶细胞(例如，t细胞和/或nk细胞)接触，例如被募集到施用位点的靶细胞。在此类实施例中，rip可以在本文提供的任何递送溶液和任何体积中配制以形成修饰组合物。这类递送可以进一步包括在受试者施用rip的部位或其附近，或在不同的部位，向受试者施用细胞悬浮液，其中细胞悬浮液包括t细胞和/或nk细胞。[0778]因此，在一些实施例中，本文提供了复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制备用于在受试者中皮下修饰和/或基因修饰t细胞和/或nk细胞的试剂盒中的方法或在相关方面中的用途，其中所述方法或所述试剂盒的用途包括：[0779]在说明性实施例中，向所述受试者皮下施用修饰组合物，所述修饰组合物包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(rip)和活化元件，其中所述rip包括编码包含转基因(并且在说明性实施例中抗原、经工程改造的t细胞受体或嵌合抗原受体(car))的第一多肽的多核苷酸，[0780]其中所述修饰组合物具有被包含在注射器内的0.5ml至10ml的体积，其中所述施用促进所述t细胞和/或nk细胞与所述rip的缔合，其中所述t细胞和/或nk细胞存在于所述受试者的所述皮下区域中，并且其中所述rip修饰所述t细胞和/或nk细胞以在所述修饰组合物中形成修饰的t细胞和/或nk细胞的群体。[0781]在一些实施例中，本文提供了复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在制备用于在受试者中皮下修饰和/或基因修饰t细胞和/或nk细胞的试剂盒中的方法或在相关方面中的用途，其中所述用途进一步包括向受试者皮下施用细胞悬浮液，其中施用所述细胞悬浮液具有被包含在注射器内的2ml至25ml的体积，其中所述细胞悬浮液包括t细胞和/或nk细胞，其中修饰组合物中的rip与t细胞和/或nk细胞接触，从而修饰和/或基因修饰细胞悬浮液中的t细胞和/或nk细胞。细胞悬浮液可以包含先前从受试者或同种异体t细胞和/或nk细胞收集的t细胞和/或nk细胞。[0782]在一些实施例中，修饰组合物和细胞悬浮液在受试者的皮肤的表面上彼此在0.5cm、1cm、2cm、3cm、4cm或5cm内施用。在一些实施例中，施用所述细胞悬浮液与施用修饰组合物同时或在1、2、3、4、5、10、15、30、45或60分钟或1、2、3、4、5、6、7或8小时内进行。在一些实施例中，细胞悬浮液包括从受试者收集的全血。在一些实施例中，细胞悬浮液包括来自受试者的嗜中性粒细胞。在一些实施例中，全血已经经受pbmc和tnc富集程序。[0783]在一些实施例中，修饰组合物和细胞悬浮液被包含在相同注射器内。在一些实施例中，活化元件是t细胞活化元件。在一些实施例中，t细胞活化元件是能够结合cd3或本文提供的任何t细胞活化元件的多肽。在一些实施例中，活化元件在复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面上。在一些实施例中，修饰的t细胞和/或nk细胞的群体包含经基因修饰的t细胞和/或nk细胞的持久群体，其中经基因修饰的t细胞和/或nk细胞的持久群体在施用所述修饰组合物后在受试者中保持持续至少7、14、21或28天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或1、2、3、4或5年。[0784]在一些实施例中，修饰的t细胞和/或nk细胞的群体中至少10％的修饰的t细胞和/或nk细胞(在这些方面的说明性实施例中是体内形成的)在根据本文提供的任何细胞聚集体实施例的细胞聚集体中。在一些实施例中，根据本文提供的任何变暗的t细胞特征或变暗的nk细胞特征，修饰的t细胞和/或nk细胞的群体中至少50％的cd4+和/或cd8+细胞是cd3–。[0785]在一个方面中，本文提供了一种用于确定基因载体(例如病毒样颗粒或病毒颗粒，例如复制缺陷型病毒颗粒制剂)的量的方法，以通过在变暗体积中靶细胞上的目标变暗百分比来变暗表面多肽的表面表达，所述方法包括：[0786]a)形成包含多种浓度的基因载体制剂和固定量的靶细胞悬浮液的多种反应混合物，其中所述多种反应混合物中的至少两种反应混合物包括不同浓度的基因载体制剂和/或靶细胞悬浮液，其中所述靶细胞悬浮液包括在其表面上包含所述表面多肽的多种细胞，并且其中所述基因载体制剂包括在其表面上包含能够结合所述表面多肽的结合多肽的多种基因载体；[0787]b)将反应混合物培育持续目标变暗时间，其中在培育期间，基因载体接触靶细胞；和[0788]c)测量所述表面多肽在所述反应混合物中和在表达所述表面多肽但不与所述基因载体制剂接触的对照样品中的表面表达，和/或测量所述表面多肽和已知在所述靶细胞悬浮液的所有靶细胞上表达的另一种表面多肽的表面表达；和[0789]d)使用所测量的反应混合物中表面多肽的表面表达、所测量的对照量中表面多肽的表面表达或所测量的另一种表面多肽的表面表达，以及反应混合物中基因载体制剂和靶细胞悬浮液的量(例如体积或稀释度)，来确定基因载体制剂的量，以将变暗体积中细胞的目标变暗百分比变暗。[0790]在一些实施例中，对照样品是靶细胞悬浮液的量，例如体积和/或稀释度。在一些实施例中，对照样品是正常血细胞悬浮液，在一些实施例中来自健康供体。[0791]在另一方面中，本文提供了一种用于确定添加到t细胞悬浮液中的病毒颗粒制剂如复制缺陷型病毒颗粒的量的方法，其包括：[0792]确定所述病毒颗粒制剂的变暗单元，其中所述病毒颗粒制剂的病毒颗粒在其表面上表达结合多肽，并且其中所述变暗单元是所述病毒颗粒制剂的量(例如体积和/或稀释度)，其在接触条件下，在对照细胞悬浮液或未与所述病毒颗粒制剂接触的待测细胞悬浮液的目标量(例如体积或稀释度)中，或者与待测或样品t细胞悬浮液上的另一种t细胞表面标记物如cd4或cd8相比，将由结合多肽识别的靶表面多肽的表达降低目标百分比，其中待添加的病毒颗粒制剂的量由所述病毒颗粒制剂的变暗单元和所述t细胞悬浮液上表面多肽的目标变暗百分比确定。[0793]在一些实施例中，待添加的病毒颗粒制剂的量由病毒颗粒制剂的变暗单元、t细胞悬浮液上表面多肽的目标变暗百分比以及t细胞悬浮液中表面多肽的近似的、估计的、计算的和/或经验确定的浓度确定。在一些实施例中，使用表达确定或已知量的表面多肽的对照细胞悬浮液，经验性地确定接触条件下t细胞悬浮液上表面多肽的浓度，并且其中待添加的病毒颗粒制剂的量由病毒颗粒制剂的变暗单元、t细胞悬浮液中表面多肽的浓度和t细胞悬浮液上表面多肽的目标变暗百分比确定。[0794]在另一方面中，本文提供了一种用于确定包封在膜中的基因载体(例如基因载体颗粒制剂)的量、结合能力或转导能力的方法，所述基因载体例如病毒样颗粒或病毒颗粒，例如添加到靶细胞悬浮液中的复制缺陷型病毒颗粒制剂，所述靶细胞悬浮液例如靶血细胞悬浮液，例如t细胞悬浮液或nk细胞悬浮液，所述方法包括:[0795]在包含反应混合物的变暗条件下确定所述基因载体、病毒样颗粒或病毒颗粒制剂的变暗单元，其中基因载体或基因载体或病毒颗粒制剂的病毒颗粒在其表面上表达结合多肽，并且其中变暗单元是所述基因载体、病毒样颗粒或病毒颗粒制剂的量或体积，在接触条件下，例如在靶接触/孵育时间后，例如12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、2小时、1小时、30分钟、15分钟、10分钟、5分钟、1分钟接触/孵育或仅接触和不孵育，在目标温度，例如20℃、22℃、25℃或37℃和百分比co2例如4％、5％或6％下，在表达表面多肽的对照细胞悬浮液例如在说明性实施例中正常血细胞悬浮液、来自健康供体的肝素化的外周血制剂或基因载体将接触的相同待测血液制剂的目标体积(例如，10ml、5ml、4ml、3ml、2ml、1ml、0.5ml、0.1ml)中，或者与表达表面多肽的靶细胞群体如待测或样品细胞悬浮液中的另一表面标记物相比，所述量和体积将靶表面多肽减少目标百分比，其中要添加的基因载体(例如病毒颗粒)制剂的量由基因载体(病毒颗粒)制剂的变暗单元和靶细胞(例如t细胞)悬浮液上表面多肽的目标变暗百分比确定。[0796]在一些实施例中，待添加的基因载体(例如病毒颗粒)制剂的量由基因载体(例如病毒颗粒)制剂的变暗单元、靶细胞(例如t细胞)悬浮液上表面多肽的目标变暗百分比以及t细胞悬浮液上表面多肽的近似的、估计的、计算的和/或经验确定的浓度来确定。[0797]在一些实施例中，在接触条件下表面多肽在基因载体(例如t细胞)悬浮液上的浓度是使用表达确定的或已知量的表面多肽的对照细胞悬浮液凭经验确定的，并且其中待添加的基因载体(例如病毒颗粒)制剂的量是由病毒颗粒制剂的变暗单元、靶细胞(例如t细胞)悬浮液中表面多肽的浓度和靶细胞(例如t细胞)悬浮液上表面多肽的目标变暗百分比确定的。[0798]在一些实施例中，基因载体制剂是复制缺陷型重组反转录病毒颗粒制剂。在一些实施例中，目标变暗百分比为50％。在一些实施例中，变暗体积为1ml。在一些实施例中，表面多肽是cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、tcrα、tcrβ、cd16a、nkp46、2b4、cd2、dnam或nkg2d。在一些实施例中，表面多肽是cd3d、cd3e、cd3g、tcrα或tcrβ。[0799]在一些实施例中，结合多肽是活化元件。在一些实施例中，活化元件是抗cd3抗体。[0800]在一些实施例中，在测量表面多肽的表面表达之前将反应混合物培育持续2至6小时。在一些实施例中，反应混合物在37℃和5％co2下培育。在一些实施例中，测量表面多肽的表面表达包括使用荧光活化的细胞分选方法。在一些实施例中，测量表面多肽的表面表达包括使用cd3抗体，并且在说明性实施例中包括使用cd4和/或cd8抗体来测量另一表面多肽。在一些实施例中，cd3抗体是抗人cd3-克隆sk7，例如抗cd3-percp(sk7)(bd,347344)，并且在说明性实施例中抗-cd8抗体是sk1，例如抗-cd8-fitc(sk1)(bd,347313)。[0801]在另一个方面中，本文提供了一种用于修饰、基因修饰和/或转导淋巴细胞(例如t细胞或nk细胞)或其群体的方法，其包括使包含淋巴细胞(例如t细胞或nk细胞)或其群体的血细胞与rip离体接触，所述rip在其基因组中包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含与在淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码car，car包含astr、跨膜结构域和胞内活化结构域，并且任选地所述一个或多个核酸序列中的另一个编码针对一个或多个rna靶的一个或多个(例如两个或更多个)抑制性rna分子，并且进一步任选地所述一个或多个核酸序列中的另一个编码多肽淋巴细胞增生性元件，其中所述接触促进淋巴细胞(例如t细胞或nk细胞)或至少一些淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)通过rip的基因修饰和/或转导，从而产生修饰的、基因修饰的和/或转导的淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)。在这类方法中，接触通常在反应混合物(有时在本文中被称为转导反应混合物)中进行，所述反应混合物包含淋巴细胞的群体(例如t细胞和/或nk细胞)，并与rip的群体接触。在本文中(包括但不限于在本例示性实施例章节中)提供了各种接触时间，其可以用于本方面以促进淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)与rip的膜缔合和最终膜融合。[0802]在一个方面中，本文提供了rip在制备用于修饰受试者的淋巴细胞(例如t细胞或nk细胞)的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒的用途包括：使反应混合物中包含淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)的血细胞与所述rip离体接触，其中所述rip在其表面上包含假型化元件，其中所述rip包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个核酸序列，通常是与在淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)中有活性的启动子可操作地连接的转录单元，其中所述一个或多个转录单元编码car的第一多肽、包含le的第一多肽、或包含le的第一多肽和包含car的第二多肽，从而产生被修饰的和在说明性实施例中被基因修饰的淋巴细胞(例如被修饰的t细胞和/或被修饰的nk细胞)。在本文中(包括但不限于在本例示性实施例章节中)提供了各种接触时间，其可以用于本方面以促进淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)与rip的膜缔合和最终膜融合。在说明性实施例中，接触进行少于15分钟。[0803]在另一个方面中，本文提供了一种用于修饰淋巴细胞例如t细胞和/或nk细胞的方法中的rip，其中所述方法包括使反应混合物中包含受试者的淋巴细胞例如t细胞和/或nk细胞的血细胞与rip离体接触，所述rip在其基因组中包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码car，car包含astr、跨膜结构域和胞内活化结构域，并且任选地，所述一个或多个核酸序列中的另一个编码针对一个或多个rna靶的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性rna分子，并且进一步任选地，所述一个或多个核酸序列中的另一个编码多肽淋巴增生性元件，其中所述接触促进通过rip对至少一些静息t细胞和/或nk细胞的转导，从而产生被修饰的和在说明性实施例中被基因修饰的t细胞和/或nk细胞。在本文中(包括但不限于在本例示性实施例章节中)提供了各种接触时间，其可以用于本方面以促进淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)与rip的膜缔合和最终膜融合。在说明性实施例中，接触进行少于15分钟。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括将修饰的t细胞和/或nk细胞引入到受试者中。在说明性实施例中，包含淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)的血细胞来自受试者，因此引入是再引入。在该方面中，在一些实施例中，在接触步骤中接触淋巴细胞的群体(例如t细胞和/或nk细胞)，在引入步骤中对其进行修饰、基因修饰和/或转导并引入到受试者中。[0804]在另一个方面中，本文提供了rip在制备用于修饰受试者的淋巴细胞例如t细胞和/或nk细胞的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒的用途包括使反应混合物中包含受试者的淋巴细胞例如t细胞和/或nk细胞的血细胞与rip离体接触，所述rip在其基因组中包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码car，car包含astr、跨膜结构域和胞内活化结构域，并且任选地，所述一个或多个核酸序列中的另一个编码针对一个或多个rna靶的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性rna分子，并且进一步任选地，所述一个或多个核酸序列中的另一个编码多肽淋巴增生性元件，其中所述接触促进通过rip对至少一些t细胞和/或nk细胞进行基因修饰，从而产生被修饰的和在说明性实施例中被基因修饰的t细胞和/或nk细胞。如本文所述，本文提供了各种接触时间，其可以用于该方面以促进淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)与rip的膜缔合和最终膜融合。在说明性实施例中，接触进行少于15分钟。在说明性实施例中，包含淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)的血细胞来自受试者，因此引入是再引入。在该方面中，在一些实施例中，在接触步骤中接触t细胞和/或nk细胞的群体，在引入步骤中对其进行修饰、基因修饰和/或转导并引入到受试者。[0805]在另一个方面中，本文提供了rip在制备用于修饰受试者的淋巴细胞例如t细胞和/或nk细胞的药物中的用途，其中所述药物的用途包括：[0806]a)使反应混合物中包含受试者的t细胞和/或nk细胞的血细胞与rip离体接触，所述rip在其基因组中包含聚核苷酸，所述聚核苷酸包含一个或多个与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接的核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码car，car包含astr、跨膜结构域和胞内活化结构域，并且任选地，所述一个或多个核酸序列中的另一个编码针对一个或多个rna靶的一个或多个(例如，两个或更多个)抑制性rna分子，并且进一步任选地，所述一个或多个核酸序列中的另一个编码多肽淋巴细胞增生性元件，其中所述接触促进通过rip对至少一些淋巴细胞(例如，t细胞和/或nk细胞)的基因修饰，从而产生被修饰的和在说明性实施例中被基因修饰的t细胞和/或nk细胞；并且任选地[0807]b)将修饰的t细胞和/或nk细胞引入到受试者中，从而修饰受试者的淋巴细胞，例如t细胞和/或nk细胞。[0808]在另一个方面中，本文提供了用于修饰nk细胞和/或t细胞的试剂盒，其包含：[0809]一个或多个第一容器，所述第一容器包含聚核苷酸，通常是基本上纯的聚核苷酸(例如，在根据本文任何实施例的重组反转录病毒颗粒中发现的)，其包含与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接的第一转录单元，其中所述第一转录单元编码包含car的第一多肽；以及一个或多个附加或附件部件，所述附加或附件部件选自：[0810]a)一个或多个包含递送溶液的容器，所述递送溶液与如本文提供的皮下和/或肌内施用相容，在说明性实施例中对如本文提供的皮下和/或肌内施用有效，并且在另外的说明性实施例中适于如本文提供的皮下和/或肌内施用；[0811]b)一个或多个无菌注射器，其与皮下或肌内递送t细胞和/或nk细胞相容，在说明性实施例中对皮下或肌内递送t细胞和/或nk细胞有效，并且在另外的说明性实施例中适于皮下或肌内递送t细胞和/或nk细胞；[0812]c)一个或多个白细胞减少过滤总成；[0813]d)一个或多个如本文提供的透明质酸酶的容器；[0814]e)一个或多个血液袋，例如血液收集袋，在说明性实施例中，包括在袋中或在单独容器中的抗凝血剂、血液处理缓冲袋、血液处理废物收集袋和血液处理细胞样品收集袋；[0815]f)如本文详细公开的t细胞活化元件，例如在含有反转录病毒颗粒的容器中的溶液中或在单独的容器中提供的、或在说明性实施例中与复制缺陷型反转录病毒颗粒的表面缔合的抗cd3；[0816]g)一个或多个包含溶液或介质的容器，所述溶液或介质与t细胞和/或nk细胞的转导相容，在说明性实施例中对t细胞和/或nk细胞的转导有效，并且在另外的说明性实施例中适于t细胞和/或nk细胞的转导；[0817]h)一个或多个包含溶液或介质的容器，所述溶液或介质与冲洗t细胞和/或nk细胞相容，在说明性实施例中对冲洗t细胞和/或nk细胞有效，和/或在另外的说明性实施例中适于冲洗t细胞和/或nk细胞；[0818]i)一个或多个含有ph调节药物药剂的容器；[0819]j)一个或多个含有第二聚核苷酸的容器，所述第二聚核苷酸通常为基本上纯的聚核苷酸(例如在根据本文任何实施例的重组反转录病毒颗粒中发现的)，所述容器包含与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接的第二转录单元，其中所述第二转录单元编码第二多肽，所述第二多肽包含针对不同靶表位的第二car，或者在某些实施例中是针对不同抗原的第二car，在说明性实施例中是在相同靶癌细胞(例如b细胞)上发现的第二car；[0820]k)一个或多个容器，所述容器包含由核酸(例如反转录病毒颗粒)编码的第一car和/或第二car的同源抗原；和[0821]l)与其它试剂盒部件物理或数字相关的说明书，用于其使用，例如用于修饰t细胞和/或nk细胞，用于将修饰的t细胞和/或nk细胞经皮下或肌内递送至受试者，和/或用于治疗受试者的肿瘤生长或癌症。[0822]在另一方面中，本文提供了一种用于修饰nk细胞和/或t细胞的试剂盒，其包含：[0823]一个或多个容器，[0824]其中所述多个容器中的至少一个容器包括：i)多核苷酸(并且在说明性实施例中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(rip))，其各自编码包含经工程改造的t细胞受体或嵌合抗原受体(car)的第一多肽，或ii)t细胞或nk细胞，其各自能够表达car，[0825]其中所述多个容器中的至少一个含有选自以下的一种或多种另外的组分：包含i)细胞因子、ii)由car识别的同源抗原的来源、以及iii)靶细胞耗减试剂的组合物，并且[0826]其中所述多个容器中的至少一个含有适于皮下施用的递送溶液，和/或其中所述试剂盒进一步包含适于皮下递送t细胞和/或nk细胞的一个或多个无菌注射器。[0827]在一些实施例中，试剂盒进一步包含白细胞减少过滤器总成。[0828]在另一个方面中，本文提供了用于修饰nk细胞和/或t细胞的试剂盒，其包含：[0829]一个或多个容器，[0830]其中所述多个容器中的至少一个容器包括i)多核苷酸(在说明性实施例中复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(rip))，其各自编码包含经工程改造的t细胞受体或嵌合抗原受体(car)的第一多肽，或ii)t细胞或nk细胞，其各自能够表达car；和[0831]白细胞减少过滤器总成。[0832]在一些实施例中，所述多个容器中的至少一个容器包括适于皮下施用的递送溶液，和/或其中所述试剂盒进一步包含适于皮下递送t细胞和/或nk细胞的一个或多个无菌注射器。在一些实施例中，多个容器中的至少一个容器包括选自以下的一种或多种另外的组分：包含i)细胞因子、ii)由car识别的同源抗原的来源和iii)靶细胞耗减试剂的组合物。[0833]在一些实施例中，试剂盒进一步包含适于皮下递送t细胞和/或nk细胞的一个或多个无菌注射器，并且其中白细胞减少过滤器总成适于、被配置成和/或有效地处理不超过100ml、50ml或25ml的血液。在一些实施例中，另外的组分是包含细胞因子的组合物，并且其中所述细胞因子不结合至试剂盒中包括的细胞因子受体或由多核苷酸编码的细胞因子受体。在一些实施例中，细胞因子是il-2、il-7、il-15或il-21，或能够结合至细胞因子的天然受体和活化细胞因子的天然受体的这些细胞因子中的任一个的修饰的形式。在一些实施例中，另外的组分是包含同源抗原的来源的组合物。在一些实施例中，来源是编码同源抗原的核酸。在一些实施例中，编码同源抗原的核酸是mrna。在一些实施例中，所述来源是可溶性的同源抗原。在一些实施例中，另外的组分是包含靶细胞耗减试剂的组合物。[0834]在另一个方面中，本文提供了用于修饰nk细胞和/或t细胞的试剂盒，其包含：[0835]一个或多个容器，[0836]其中所述多个容器中的至少一个容器包括i)多核苷酸，并且在说明性实施例中编码包含经工程改造的t细胞受体或嵌合抗原受体(car)的第一多肽的复制缺陷型重组反转录病毒颗粒(rip)，其中car的胞外结构域包括表位标签，或ii)能够表达所述第一多肽的t细胞或nk细胞，和[0837]其中所述多个容器中的至少一个容器包括编码能够结合和在说明性实施例中交联表位标签的多肽的多核苷酸或表达能够结合至表位标签的多肽的细胞。[0838]在一些实施例中，所述多个容器中的至少一个容器包括适于皮下施用的递送溶液，和/或其中所述试剂盒进一步包含适于皮下递送t细胞和/或nk细胞的一个或多个无菌注射器。在一些实施例中，试剂盒包含多核苷酸，其中所述多核苷酸位于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒内，并且其中所述复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面进一步包含活化元件，其中所述活化元件能够活化t细胞和/或nk细胞。在一些实施例中，试剂盒包含t细胞和/或nk细胞，并且其中t细胞和/或nk细胞是同种异体细胞。[0839]在一些实施例中，多个容器中的至少一个容器包括适于皮下施用的递送溶液，并且其中适于皮下施用的递送溶液包含人工基质。在一些实施例中，人工基质包含透明质酸和/或胶原。在一些实施例中，所述多个容器中的至少一个容器包括i)第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码包含第二嵌合抗原受体(car)的第二多肽，或ii)能够表达第二car的t细胞或nk细胞的第二群体。在一些实施例中，第一car能够与cd19结合，并且第二car能够与cd22结合。在一些实施例中，另外的组分包括靶细胞耗减试剂，并且其中所述靶细胞耗减试剂是b细胞耗减试剂，并且在说明性实施例中，其中所述b细胞耗减试剂不是抗-cd19 car。[0840]在另一个方面中，本文提供了用于修饰nk细胞和/或t细胞的试剂盒，其包含：[0841]一个或多个容器，[0842]其中所述多个容器中的至少一个容器包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接的第一转录单元，其中所述第一转录单元编码包含嵌合抗原受体(car)的第一多肽；和[0843]其中所述多个容器中的至少一个容器包括一种或多种选自以下的另外的组分：包含i)细胞因子和ii)用于car的外部表位的结合配偶体或编码所述结合配偶体的多核苷酸的组合物；和[0844]其中所述多个容器中的至少一个含有适于皮下施用的递送溶液，和/或其中所述试剂盒进一步包含适于皮下递送t细胞和/或nk细胞的一个或多个无菌注射器。[0845]在一些实施例中，另外的组分是包含用于car的外部表位的结合配偶体或编码所述结合配偶体的多核苷酸的组合物。在一些实施例中，细胞制剂进一步包含由car识别的同源抗原的来源。在一些实施例中，包含第一转录单元的多核苷酸进一步编码表位，并且其中包含用于car的外部表位的结合配偶体的组合物包括能够结合至该表位的多肽的来源。[0846]在另一个方面中，本文提供了用于修饰nk细胞和/或t细胞的试剂盒，其包含：[0847]一个或多个容器，[0848]其中所述多个容器中的至少一个容器包括多核苷酸，所述多核苷酸包含与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接的第一转录单元，其中所述第一转录单元编码包含嵌合抗原受体(car)的第一多肽；[0849]其中所述多个容器中的至少一个含有选自以下的一种或多种另外的组分：包含i)细胞因子和ii)由car识别的同源抗原的来源，或iii)用于car的外部表位的结合配偶体的组合物；并且其中所述多个容器中的至少一个含有适于皮下施用的递送溶液，和/或其中所述试剂盒进一步包含适于皮下递送t细胞和/或nk细胞的一个或多个无菌注射器。[0850]在一些实施例中，编码car的多核苷酸位于复制缺陷型重组反转录病毒颗粒内。在一些实施方案中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的表面进一步包括活化元件，其中所述活化元件能够活化t细胞和/或nk细胞。在一些实施例中，另外的组分是包含用于car的外部表位的结合配偶体的组合物。在一些实施例中，用于car的外部表位的结合配偶体包括同源抗原的来源。在一些实施例中，同源抗原的来源的组合物是同源抗原、编码同源抗原的核酸或包含编码同源抗原的核酸的细胞。在一些实施例中，包含同源抗原的来源的组合物是编码同源抗原的核酸。[0851]在一些实施例中，包含编码同源抗原的核酸的组合物包含编码同源抗原的mrna。在一些实施例中，包含同源抗原的来源的组合物包含可溶性的同源抗原。在一些实施例中，包含第一转录单元的多核苷酸进一步编码表位，并且其中包含用于car的外部表位的结合配偶体的组合物包括能够结合至表位的多肽的来源。在一些实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒在其表面上进一步包括结合多肽和促融合多肽，其中所述结合多肽能够结合至t细胞和/或nk细胞，并且其中所述促融合多肽能够介导反转录病毒颗粒膜与t细胞和/或nk细胞膜的融合。[0852]在一些实施例中，所述一个或多个含有所述复制缺陷型反转录病毒颗粒的容器包括基本上纯的gmp级的复制缺陷型反转录病毒颗粒。在一些实施例中，每个含有复制缺陷型反转录病毒颗粒的容器包含0.1ml至10ml的体积，或本文任何小体积元件的体积，以及1×106至5×109个反转录病毒颗粒转导单元或1至50个单元，或足够的变暗单元以变暗至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％的靶细胞(例如t细胞)。[0853]在一些实施例中，所述试剂盒包含一个或多个包含适于皮下施用的递送溶液的容器。在一些实施例中，试剂盒包含一个或多个白细胞减少过滤总成。在一些实施例中，试剂盒包含一个或多个适于皮下递送t细胞和/或nk细胞的无菌注射器。在一些实施例中，试剂盒包含[0854]a)一个或多个包含适于皮下施用的递送溶液的容器；和[0855]b)一个或多个适于皮下递送t细胞和/或nk细胞的无菌注射器。[0856]在任何总成方面或包括总成的方法或用途中，有时提供如附图中引用的零件编号，仅作为非限制性实例，如贯穿该示例性实施例部分和本说明书的情况。此外，对管道或特定类型的通道的任何提及作为通道的非限制性实例。[0857]在一个方面中，本文提供了一种白细胞减少过滤总成，其包括：[0858]a)最大体积为100ml、75ml、60ml、50ml、40ml、30ml、20ml、15ml或10ml的反应混合物收集容器；以及[0859]b)白细胞减少过滤器；[0860]在说明性实施例中，白细胞减少过滤器总成进一步包括：[0861]c)收集阀，[0862]d)其中入口通道(例如，入口管道)将第一总成开口连接到包括白细胞减少过滤器的白细胞减少过滤器壳体，其中所述第一总成开口与所述入口管道之间的第一连接接合部相对于所述入口管道具有在5°与80°、70°、60°、50°、45°、40°、30°、25°、20°或10°之间，或在10°与80°、70°、60°、50°、45°、40°、30°、25°、20°或15°之间，或在15°与80°、70°、60°、50°、45°、40°、30°、25°、20°之间，或在20°与80°、70°、60°、50°、45°、40°、30°或25°的角度，并且所述入口管道没有大于80°、75°、70°、65°、60°、55°或50°的接合部，并且其中所述白细胞减少过滤器具有2cm2与5cm2或3cm2与5cm2的有效过滤面积。[0863]在另一方面中，本文提供了一种用于基因修饰哺乳动物有核血细胞的方法，所述方法包括：[0864]a)将5ml至125ml、120ml、100ml、50ml、5ml至40ml、5ml至30ml、5ml至25ml，或10ml至125ml、120ml、100ml、50ml、5ml至40ml、5ml至30ml、5ml至25ml的包含全血细胞的全血输送至包括含有核酸载体拷贝的培育袋的转导总成中以形成反应混合物，其中所述培育袋具有100ml、75ml、60ml、50ml、40ml、30ml、20ml或10ml的最大体积容量，并且其中所述培育袋在第一总成开口处被连接到入口通道(例如入口管道)；[0865]b)使所述全血细胞与所述反应混合物内的所述载体拷贝接触以产生修饰的全血细胞；[0866]c)将所述修饰的全血细胞通过通道输送到反应混合物收集容器；[0867]d)将所述修饰的全血细胞从所述反应混合物收集容器输送到所述白细胞减少过滤器总成的白细胞减少过滤器，以过滤修饰的全血细胞以产生修饰的有核血细胞的富集的级分，其中所述白细胞减少过滤器具有3cm2与5cm2的有效过滤面积；以及[0868]e)在0.5至20ml、15ml、10ml、5ml或2.5ml，或1ml至20ml、15ml、10ml、5ml或2.5ml的递送溶液中收集修饰的血细胞的富集的级分，以形成包含修饰的有核血细胞的悬浮液的细胞制剂。在说明性实施例中，细胞制剂中至少10％的修饰的t细胞和/或nk细胞被聚集。[0869]在本文任何方面的一些实施例中，通过将细胞制剂输送到注射器中来执行收集。在本文任何方面的一些实施例中，所述方法进一步包括在第一皮下位点处向受试者皮下施用细胞制剂。在本文任何方面的一些实施例中，全血来自受试者，并且所述方法进一步包括从受试者收集全血，在说明性实施例中，所述全血可以被收集到全血容器中。在本文任何方面的一些实施例中，从收集全血到施用的整个方法(不包括接触的持续时间)在15分钟至1小时内或在15分钟至45分钟内完成。在本文任何方面的一些实施例中，从输送全血到收集修饰的血细胞的富集的级分的整个方法在15分钟至1小时内或在15分钟至45分钟内完成。在本文任何方面的一些实施例中，从收集全血到施用的整个方法在15分钟至12小时、15分钟至10小时、15分钟至8小时、15分钟至6小时、或15分钟至4小时或少于12、10、8、6、4、2或1小时内完成。[0870]在本文任何方面的一些实施例中，制剂中至少10％的修饰的t细胞和/或nk细胞在它们被施用于受试者时聚集。在本文任何方面的一些实施例中，在接触之前，全血通过转导总成的收集阀经由管道被输送到培育袋，其中收集阀相对于白细胞减少过滤器壳体侧上的入口管道具有5°至80°、70°、60°、50°、45°、40°、30°、25°、20°或10°的角度。在本文任何方面的一些实施例中，通过在与输送修饰的全血细胞的方向相反的方向上注射0.5ml至20ml、0.5ml至10ml、1ml至10ml或3ml至7ml的递送溶液来进行收集，从连接到出口管道的递送溶液注射器，所述出口管道在白细胞减少过滤器壳体相对于第一总成开口的另一侧上的附接接合部处与白细胞减少过滤器总成的入口管道流体连通，其中递送溶液注射器具有25ml、20ml、15ml、10ml、7.5ml、5ml、4ml、3ml、2ml或1ml的最大体积。[0871]在本文任何方面的一些实施例中，所述方法进一步包括在过滤修饰的有核血细胞之后，洗涤修饰的有核血细胞以产生富集的级分。在本文任何方面的一些实施例中，洗涤在输送到第一血液袋中的全血体积的0.25x至3x、或0.75x至2.5x、或0.75至2x的情况下进行。在本文任何方面的一些实施例中，使用注射器进行洗涤。[0872]在本文任何方面的一些实施例中，在连接到与第一总成开口相同的白细胞减少过滤器壳体侧上的入口管道的白细胞减少过滤器总成的细胞样品收集袋中执行收集。在本文任何方面的一些实施例中，反应混合物收集容器、细胞样品收集袋和第一总成开口被配置为使得反应混合物收集容器和细胞样品收集袋可以在第一总成开口处可逆地连接到入口管道。在本文任何方面的一些实施例中，细胞制剂包含嗜中性粒细胞。在本文任何方面的一些实施例中，在收集之前将所述白细胞减少过滤器总成倒置，使得通过向下移动穿过过滤器的流体来收集修饰的血细胞的富集的级分。在本文任何方面的一些实施例中，入口管道是连续管道，其在入口管道的流动路径中不包含角度大于80°、75°、70°、65°、60°、55°或50°的任何接合部。[0873]在本文任何方面的一些实施例中，白细胞减少过滤总成进一步包括：[0874]i)反应混合物收集容器，其最大体积为50ml、40ml、30ml、25ml、20ml、15ml或10ml，或本文提供的任何小体积元件反应混合物体积；[0875]ii)洗涤缓冲液注射器，其最大体积为100ml、75ml、50ml、40ml、30ml、25ml、20ml、15ml或10ml；以及[0876]iii)第二总成开口，[0877]其中所述反应混合物收集容器和所述第一连接接合部被配置成使得所述反应混合物收集容器在所述第一连接接合部处可逆地连接到所述入口管道，并且[0878]其中所述第二总成开口相对于所述入口管道以5°至80°、70°、60°、50°、45°、40°、30°、25°、20°或10°的角度被连接到所述入口管道。[0879]在本文任何方面的一些实施例中，白细胞减少过滤总成进一步包括出口阀，所述出口阀被连接到出口通道(例如，管道)，所述出口通道在来自第一总成开口的白细胞减少过滤器壳体的另一侧的点处与入口通道(例如，管道)流体连通，其中连接到出口阀的递送溶液注射器具有25ml、20ml、15ml、10ml、7.5ml、5ml或2.5ml的最大体积。在本文任何方面的一些实施例中，培育袋包含反应混合物，所述反应混合物包含哺乳动物有核血细胞和核酸载体拷贝。在本文任何方面的一些实施例中，哺乳动物有核血细胞是t细胞、nk细胞、cd4+淋巴细胞、cd8+淋巴细胞、cd56+淋巴细胞、b细胞、树突状细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。在本文任何方面的一些实施例中，哺乳动物有核血细胞包括t细胞、nk细胞、cd4+淋巴细胞、cd8+淋巴细胞和/或cd56+淋巴细胞。在本文任何方面的一些实施例中，哺乳动物有核血细胞包括树突状细胞或巨噬细胞。在本文任何方面的一些实施例中，核酸载体拷贝包括复制缺陷型重组反转录病毒颗粒的群体。在本文任何方面的一些实施例中，转基因编码包含嵌合抗原受体(car)的多肽。[0880]在一些实施例中，本文提供的包括反应混合物的任何用途或方法，所述用途或方法包括或进一步包括：[0881]提供转导总成(301)，所述转导总成包括与任选的管道(354)和培育袋(314)流体连通的第一总成开口(317)、载体容器(311)、全血容器(313)和反应混合物收集容器(315)，[0882]其中通过将1ml至20ml、15ml、10ml、7.5ml、5ml、4ml或3ml、或2ml至20ml、15ml、10ml、7.5ml、5ml、4ml或3ml的rip输送通过第一总成开口(317)和管道(354)并进入培育袋(314)，并且通过将5ml至50ml、40ml、30ml、25ml、20ml、15ml或10ml、或10ml至50ml、40ml、30ml、25ml、20ml或15ml、或15ml至50ml、40ml、30ml、25ml或20ml的包含淋巴细胞的血细胞输送通过第一总成开口(317)和管道(354)并进入培育袋(314)，在培养袋(314)中形成反应混合物，[0883]其中在通过将反应混合物从培育袋(314)输送通过管道(354)和第一总成开口(317)并进入反应混合物收集容器(315)而形成细胞制剂之前，将修饰的淋巴细胞收集在反应混合物收集容器(315)中。[0884]在一些实施例中，所述用途，其中使用白细胞减少过滤器总成(401)形成细胞制剂，所述白细胞减少过滤器总成包括含有反应混合物的反应混合物收集容器(315)、与收集阀(445)流体连通的第一总成开口(417)、入口通道(例如入口管道)(455)、过滤器壳体入口(425)、白细胞减少过滤器壳体(410)、过滤器壳体出口(426)、出口通道(例如出口管道)(456)、出口阀(446)以及废物收集袋(416)和细胞样品收集袋(465)用于收集最大体积为100ml、75ml、60ml、50ml、40ml、30ml、20ml、15ml、10ml或5ml的细胞制剂，其中所述第一总成开口(417)相对于入口通道(例如入口管道)(455)以5°至80°、70°、60°、50°、45°、40°、30°、25°、20°或10°、或10°至80°、70°、60°、50°、45°、40°、30°、25°、20°或15°、或15°至80°、70°、60°、50°、45°、40°、30°、25°、20°、或20°至80°、70°、60°、50°、45°、40°、30°或25°的角度附接，并且入口通道(例如入口管道)(455)不具有大于80°、70°、60°或50°的接合部，并且其中所述白细胞减少过滤器具有1cm2至10cm2，例如2cm2至8cm2或3cm2至5cm2的有效过滤面积。[0885]在使用白细胞减少过滤器总成的某些方法中，所述用途进一步包括：[0886]将反应混合物收集容器(315)中的反应混合物输送通过第一总成开口(417)、入口管道(455)和过滤器壳体入口(425)并进入白细胞减少过滤器壳体(410)，其中未保留在白细胞减少过滤器上的反应混合物的组分穿过过滤器壳体出口(426)，然后穿过出口管道(456)和出口阀(446)并进入废物收集袋(416)；[0887]任选地用洗涤溶液洗涤保留在白细胞减少过滤器(410)上的反应混合物，其中所述洗涤溶液穿过所述过滤器壳体出口(426)和所述出口阀(446)并进入所述废物收集袋(416)；[0888]将所述出口阀(446)和所述收集阀(445)转动到收集位置；[0889]将一定体积的递送溶液通过出口阀(446)输送到出口管道(456)中，然后通过过滤器壳体出口(426)、白细胞减少过滤器壳体(410)、过滤器壳体入口(425)、入口管道(455)、收集阀(445)并进入细胞样品收集袋(465)，其中递送一定体积的递送溶液形成细胞制剂。[0890]在一些实施例中，所述用途，其中所述白细胞减少过滤器总成(400)进一步包括第三总成开口(420)，并且所述用途进一包括将所述细胞制剂从所述细胞样品收集袋(465)收集到细胞样品收集注射器(467)中。在一些实施例中，细胞制剂被皮下施用。在一些实施例中，所述用途进一步包括在将全血输送到血液袋之前从受试者收集全血。[0891]在以下段落中提供的是示例性的方面和实施例，这些方面和实施例可以用于本文提供的任何方面或实施例中或与本文提供的任何方面或实施例组合，除非不相容或以其它方式指出，如本领域技术人员将认识到的。在另一个方面中，本文提供了修饰的，在说明性实施例中基因修饰的，并且在另外的说明性实施例中通过根据本文的任何方法修饰淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)制备的稳定转染的或稳定转录的淋巴细胞(例如t细胞或nk细胞)。[0892]在另一个方面中，本文提供了rip在试剂盒中或在试剂盒的制造中的用途，用于修饰受试者的t细胞和/或nk细胞，其中所述试剂盒的用途包括本文提供的用于修饰t细胞和/或nk细胞的任何方法。在另一个方面中，本文提供了rip在试剂盒中的用途，或在制备用于向受试者递送修饰的淋巴细胞、向受试者施用修饰的淋巴细胞、将修饰的淋巴细胞注射到受试者中和/或在受试者中植入修饰的淋巴细胞的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒的用途包括本文提供的用于递送至受试者、施用至受试者、注射到受试者中和/或在受试者中植入的任何方法。在另一个方面中，本文提供了rip在试剂盒中或在制备用于制备细胞制剂的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒的用途包括本文提供的包括修饰t细胞和/或nk细胞的用于制备细胞制剂的任何方法。本文在另一个方面提供了用于向受试者皮下递送的rip，其中rip的使用包括本文提供的用于皮下递送的包括rip的任何方法。[0893]在以下段落中提供了例示性实施例，例如例示性范围和列表，其可以用于以上提供的或本文中以其它方式提供的任何方面，除非与如本领域技术人员将认识到的不兼容或以其它方式指出。在本说明书中，在本例示性实施例章节之外提供了另外的方面和实施例。[0894]在本文的任何方面，细胞或淋巴细胞是nk细胞，或在说明性实施例中是t细胞。应当理解，在包括采集血液的方面中，这类方法可以包括采集血液衍生的产物或外周血液衍生的产物，其可以是血液样品，例如未分级的血液样品，或者可以包括通过单采血液成分术收集的血细胞(例如白细胞或淋巴细胞)。[0895]在本文包括包含一个或多个转录单元的聚核苷酸的任何方面中，所述一个或多个转录单元可以编码包含le的多肽。在一些实施例中，淋巴增生性元件包含来自细胞因子受体的胞内信号传导结构域，其在说明性实施例中活化janus激酶/信号转导子和转录活化子(jak/stat)途径和/或肿瘤坏死因子受体(tnf-r)相关因子(traf)途径。在说明性实施例中，淋巴增生性元件通常是组成型活性的，因为它组成型活化一个或多个信号传导路径。在说明性实施例中，淋巴增生性元件包含box1和任选的box2 jak结合模体，以及包含酪氨酸残基的stat结合模体。在一些说明性实施例中，淋巴增生性元件不包含胞外配体结合结构域或小分子结合结构域。在一些实施例中，组成型活性信号传导路径包括pi3k路径的活化。在一些实施例中，组成型活性信号传导路径包括plc路径的活化。因此，在某些实施例中，用于本文的任何试剂盒、方法、用途或组合物中的淋巴增生性元件是组成型活性的，并且包括活化jak/stat路径、traf路径、pi3k路径和/或plc路径的胞内信号传导结构域。本文公开的任何多肽淋巴增生性元件，例如但不限于本文在“淋巴增生性元件”章节中公开的那些，或其功能性突变体和/或片段，都可以被编码。在一些实施例中，le包括与至少10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的一段或来自以下的胞内结构域具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的结构域：4-1bb(cd137)、b7-h3、b7-hcdr3、baffr、btla、c100(sema4d)、cd2、cd3d、cd3e、cd3g、cd4、cd7、cd8a、cd8b、cd11a、cd11b、cd11c、cd11d、cd18、cd19、cd27、cd28、针对lck结合缺失的cd28(icδ)、cd29、cd30、cd40、cd49a、cd49d、cd49f、cd69、cd79a、cd79b、cd84、cd96(触觉的)、cd103、cd160(by55)、cd162(selplg)、cd226(dnam1)、cd229(ly9)、与cd83特异性结合的配体、cds、ceacam1、crlf2、crtam、csf2ra、csf2rb、csf3r、epor、fc受体γ链、fc受体ε链、fcer1g、fcgr2c、fcgra2、gads、ghr、gitr、hvem、ia4、icam-1、icos、ifnar1、ifnar2、ifngr1、ifngr2、ifnlr1、il1r1、il1rap、il1rl1、il1rl2、il2ra、il2rb、il2rg、il3ra、il4r、il5ra、il6r、il6st、il7ra、il9r、il10ra、il10rb、il11ra、il12rb1、il12rb2、il13ra1、il13ra2、il15ra、il17ra、il17rb、il17rc、il17rd、il17re、il18r1、il18rap、il20ra、il20rb、il21r、il22ra1、il23r、il27ra、il31ra、itga4、itga6、itgad、itgae、itgal、itgam、itgax、itgb1、itgb2、itgb7、lat、lepr、lfa-1(cd11a/cd18)、light、lifr、lmp1、ltbr、mpl、myd88、nkg2c、nkp80(klrf1)、osmr、ox40、pd-1、prlr、psgl1、pag/cbp、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、slamf4(c244、2b4)、slamf6(ntb-a、ly108)、slamf7、slamf8(blame)、slp-76、tilr2、tilr4、tilr7、tilr9、tnfr2、tnfrsf4、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfrsf14、tnfrsf18、trance/rankl、vla1或vla-6或其功能性突变体和/或片段，或其功能性突变体和/或片段。在本文公开的任何实施例中，淋巴增生性元件可以包括胞外配体结合结构域或小分子结合结构域。在一些实施例中，淋巴增生性元件可以包括跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域可以包括来自以下的跨膜结构域：baffr、c3z、ceacam1、cd2、cd3a、cd3b、cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、cd4、cd5、cd7、cd8a、cd8b、cd9、cd11a、cd11b、cd11c、cd11d、cd27、cd16、cd18、cd19、cd22、cd28、cd29、cd33、cd37、cd40、cd45、cd49a、cd49d、cd49f、cd64、cd79a、cd79b、cd80、cd84、cd86、cd96(触觉的)、cd100(sema4d)、cd103、c134、cd137、cd154、cd160(by55)、cd162(selplg)、cd226(dnam1)、cd229(ly9)、cd247、crlf2、crtam、csf2ra、csf2rb、csf3r、epor、fcer1g、fcgr2c、fcgra2、ghr、hvem(lightr)、ia4、icos、ifnar1、ifnar2、ifngr1、ifngr2、ifnlr1、il1r1、il1rap、il1rl1、il1rl2、il2ra、il2rb、il2rg、il3ra、il4r、il5ra、il6r、il6st、il7ra、il7ra ins ppcl、il9r、il10ra、il10rb、il11ra、il12rb1、il12rb2、il13ra1、il13ra2、il15ra、il17ra、il17rb、il17rc、il17rd、il17re、il18r1、il18rap、il20ra、il20rb、il21r、il22ra1、il23r、il27ra、il31ra、itga1、itga4、itga6、itgad、itgae、itgal、itgam、itgax、itgb1、itgb2、itgb7、kirds2、lepr、lfa-1(cd11a、cd18)、lifr、ltbr、mpl、nkp80(klrf1)、osmr、pag/cbp、prlr、psgl1、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、slamf4(cd244、2b4)、slamf6(ntb-a、ly108)、slamf7、slamf8(blame)、tnfr2、tnfrsf4、tnfrsf8、tnfrsf9、tnfrsf14、tnfrsf18、vla1或vla-6或其功能突变体和/或片段。[0896]在本文包含rip的任何方面的一些实施例中，rip可以包括结合多肽和促融合元件。在一些实施例中，一种或多种病毒包膜蛋白包括结合多肽和促融合元件。在一些实施例中，病毒包膜蛋白是突变的病毒包膜蛋白，其中病毒包膜蛋白的结合多肽已经被突变以减少/消除与靶细胞(例如t细胞)的结合，但其中这类结合由另一种(例如异源的)结合多肽提供，所述另一种(例如异源的)结合多肽在另外的说明性实施列中也是如本文提供的活化元件(例如，结合cd3的多肽)。在一些实施例中，病毒包膜蛋白包括猫内源性病毒(rd114)包膜蛋白、肿瘤反转录病毒双嗜性包膜蛋白、肿瘤反转录病毒单嗜性包膜蛋白、水泡性口炎病毒包膜蛋白(vsv-g)、狒狒反转录病毒包膜糖蛋白(baev)、鼠类白血病包膜蛋白(mulv)、流感糖蛋白ha表面糖蛋白(ha)、流感糖蛋白神经氨酸酶(na)、副粘病毒麻疹包膜蛋白h、副粘病毒麻疹包膜蛋白f、树鼩副粘病毒(tpmv)包膜蛋白h、tpmv包膜蛋白f、尼帕病毒(niv)包膜蛋白h、niv包膜蛋白g、辛德毕斯病毒(sinv)蛋白e1、sinv蛋白e2、和/或这些包膜蛋白中的任一种的功能变体或片段。在一些实施例中，病毒包膜蛋白是niv包膜蛋白g，其中所述niv包膜蛋白g包括seq id no:375的残基y389、e501、w504、e505、v507、q530、e533或i588中的一个或多个突变。在一些实施例中，亨尼帕病毒-g蛋白是具有突变e533a和/或q530a的seq id no:375。在一些实施例中，使一个或多个n-糖基化位点或o-糖基化位点突变以改善假型化和融合。在一些实施例中，一个或多个n-糖基化位点例如但不限于在seq id no:375的n72、n159、n306、n378、n417、n481或n529中的一个或多个处，或在其它亨尼帕病毒-g蛋白的相应谷氨酰胺处被突变为另一种氨基酸例如谷氨酰胺。在一些实施例中，一个或多个o-糖基化位点从丝氨酸或苏氨酸被突变为另一种氨基酸例如丙氨酸。在一些实施例中，在来自seq id no:375的氨基酸103至137的高度o-糖基化柄结构域中的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基被突变为例如丙氨酸。在其它实施例中，可以将亨尼帕病毒-g蛋白的c末端修饰并融合至结合多肽(并且在说明性实施例中活化元件)，例如抗体或抗体模拟物，其在说明性实施例中可以是抗cd3抗体或抗体模拟物。[0897]在本文提供的包括rip的任何方面和实施例中，rip在其表面上包括假型化元件，所述假型化元件能够结合至t细胞和/或nk细胞并促进rip与其的膜融合。在一些实施例中，假型化元件是病毒包膜蛋白。在一些实施例中，病毒包膜蛋白是以下中的一个或多个：猫内源性病毒(rd114)包膜蛋白、肿瘤反转录病毒双嗜性包膜蛋白、肿瘤反转录病毒单嗜性包膜蛋白、水泡性口炎病毒包膜蛋白(vsv-g)、狒狒反转录病毒包膜糖蛋白(baev)、鼠类白血病包膜蛋白(mulv)和/或副粘病毒麻疹包膜蛋白h和f、树鼩副粘病毒(tpmv)包膜蛋白h、tpmv包膜蛋白f、尼帕病毒(niv)包膜蛋白f、niv包膜蛋白g、辛德毕斯病毒(sinv)蛋白e1、sinv蛋白e2或其任何保留结合于静息t细胞和/或静息nk细胞的能力的片段。在说明性实施例中，假型化元件为vsv-g。如本文中其它地方所论述，假型化元件可以包括与t细胞活化元件的融合物，其在说明性实施例中可以是与任何包膜蛋白假型化元件(例如mulv或vsv-g)和抗cd3抗体的融合物。在其它说明性实施例中，假型化元件包括vsv-g和抗cd3scfv与mulv的融合物。[0898]在本文包含rip的任何方面中，rip可以在其表面上包括活化元件。在一些实施例中，表面上的活化元件是膜结合的t细胞活化元件。在一些实施例中，活化元件是能够结合淋巴细胞并且在说明性实施例中t细胞和/或nk细胞的表面上的多肽的多肽。在这些的一些子实施例和本文提供的任何方面的实施例中，[0899]在一些实施例中，t细胞活化元件包括能够结合cd28、cd3、tcrα/β、cd28的抗体或抗体模拟物或促有丝分裂四跨膜蛋白中的一种或多种，或其中所述t细胞活化元件是促有丝分裂四跨膜蛋白。在一些实施例中，t细胞活化元件包含能够结合cd3的抗体或抗体模拟物，并且其中t细胞活化元件被结合到rip的膜。在一些实施例中，膜结合的抗cd3抗体或抗cd3抗体模拟物是抗cd3 scfv、抗cd3 scfvfc或抗cd3 darpin。在一些实施例中，抗cd3抗体或抗cd3抗体模拟物通过gpi锚定物如异源gpi锚定连接序列被结合至膜，其中抗cd3抗体或抗cd3抗体模拟物是具有mulv病毒包膜蛋白的重组融合蛋白，在弗林蛋白酶裂解位点处具有或不具有突变，或其中抗cd3抗体或抗cd3抗体模拟物是具有vsv病毒包膜蛋白的重组融合蛋白，或者其中所述抗cd3抗体或抗cd3抗体模拟物是具有亨尼帕病毒-g包膜蛋白的重组融合蛋白，或者其中所述抗cd3抗体是具有niv病毒包膜蛋白的重组融合蛋白。在一些实施例中，能够结合至cd28的多肽是cd80或其胞外结构域，其结合至cd16b gpi锚定连接序列。[0900]在说明性实施例中，活化元件是能够结合至tcr复合物多肽的t细胞活化元件。在一些实施例中，tcr复合物多肽是cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、tcrα或tcrβ。在一些实施例中，能够与tcr复合物多肽结合的活化元件是能够与cd3d、cd3e、cd3g、cd3z、tcrα或tcrβ中的一种或多种结合的多肽。在说明性实施例中，活化元件活化zap-70。在一些实施例中，活化元件包括能够结合至cd16a、nkg2c、nkg2e、nkg2f或nkg2h的多肽。在另外的实施例中，能够与cd16a结合的多肽包括能够与nkp46、2b4、cd2、dnam、nkg2c、nkg2d、nkg2e、nkg2f或nkg2h中的一种或多种结合。在一些实施例中，活化元件是能够与以下组合中的一种或多种结合的多肽：nkp46和2b4、nkp46和cd2、nkp46和dnam、nkp46和nkg2d、2b4和dnam、或2b4和nkg2d。在一些实施例中，活化元件可以是能够与淋巴细胞的表面上的多肽结合的两种或更多种多肽。在一些实施例中，活化元件可以是能够结合至以下组合中的至少一个的两种或更多种多肽：nkp46和2b4、nkp46和cd2、nkp46和dnam、nkp46和nkg2d、2b4和dnam、或2b4和nkg2d。[0901]在一些实施例中，本文作为单独的方面提供，或作为本文提供的方法、用途和组合物的组分提供，或由本文提供的方法、用途和组合物产生或在本文提供的方法、用途和组合物中使用的是具有变暗的表面多肽的修饰的细胞(在说明性实施例中t细胞)，或具有变暗的表面多肽的任何前述修饰的细胞的群体。此类修饰的cd4+细胞或cd8+细胞或其群体可以是cd3变暗的，并且可以具有以下特征(在本文中被称为“变暗的t细胞特征”)，并且在说明性实施例中，在形成和/或施用细胞制剂时具有以下特征：[0902]i)细胞制剂中至少9％、10％15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％、或在10％至50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在50％至60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在作为低端的9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％和作为高端的99％之间的cd4+细胞是表面cd3-；[0903]ii)细胞制剂中至少18％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％、或在20％至50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在50％至60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在作为低端的18％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％至作为高端的99％之间的cd8+细胞是表面cd3-；[0904]iii)在细胞制剂中为cd4+或cd8+的细胞的群体中，至少10.5％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％、或在10％至50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在25％至50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在50％至60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在作为低端的10.5％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％至作为高端的99％之间是表面cd3-；[0905]iv)细胞制剂中至少1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或11％、或在1.5％至2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或11％之间、或在5％至6％、7％、8％、9％、10％或11％之间；或在1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％至11％之间的细胞(不包括rbc)是表面cd3-cd4+；[0906]v)细胞制剂中至少0.65％、0.75％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％；在0.65％至0.75％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％之间；在1％至1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％之间；或在作为低端的0.65％、0.75％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％或4.5％至作为高端的5％之间的细胞(不包括rbc)是表面cd3-cd8+；[0907]vi)细胞制剂中少于13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的细胞(不包括rbc)是表面cd3+和cd4+或cd8+(“总cd3+细胞百分比”)；[0908]vii)在细胞制剂中为cd4+或cd8+的细胞的群体中，小于89％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％、或在89％至50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％之间、或在75％至50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％之间、或在50％至40％、30％、20％、10％、5％或1％之间、或在1％至5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％或89％之间是表面cd3+；[0909]viii)细胞制剂中的cd4+和/或cd8+细胞的cd3的表面表达低于从健康受试者或健康受试者的群体采集的血液中cd4+和/或cd8+细胞上的cd3的表面表达，其中所述细胞制剂中cd3的表面表达降低至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％、或在10％至20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在50％至60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在作为低端的10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％至作为高端的99％之间；和/或[0910]ix)与在不接触基因载体(并且在说明性实施例中rip)的情况下的总cd3+细胞百分比相比，在接触基因载体(并且在说明性实施例中rip)后，总cd3+细胞百分比减少至少19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。[0911]在一些实施例中，本文作为单独的方面提供，或作为本文提供的方法、用途和组合物的组分提供，或由本文提供的方法、用途和组合物产生或在本文提供的方法、用途和组合物中使用的是具有变暗的表面多肽的修饰的细胞(在说明性实施例中修饰的nk细胞)，或具有变暗的表面多肽的修饰的细胞的群体。此类修饰的细胞，例如修饰的nk细胞或其群体，可以具有变暗的cd16a、nkp46、2b4、cd2、dnam、nkg2c、nkg2d、nkg2e、nkg2f或nkg2h中的一种或多种，并且可以具有以下特征(在本文中被称为“变暗的nk细胞特征”)，并且在说明性实施例中在形成和/或施用细胞制剂时具有以下特征：[0912]i)在细胞制剂中至少9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％、或在10％至50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在50％至60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在作为低端的9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％至作为高端的99％之间的cd56+细胞是表面cd16a-、nkp46-、2b4-、cd2-、dnam-、nkg2c-、nkg2d-、nkg2e-、nkg2f-和/或nkg2h-；[0913]ii)在细胞制剂中为cd56+的细胞的群体中，至少10.5％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％、或在10％至50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％、或在25％至50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在50％至60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在作为低端的10.5％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％至作为高端的99％之间是表面cd16a-、nkp46-、2b4-、cd2-、dnam-、nkg2c-、nkg2d-、nkg2e-、nkg2f-和/或nkg2h-；[0914]iii)细胞制剂中至少1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或11％、或在1.5％至2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或11％之间、或在5％至6％、7％、8％、9％、10％或11％之间；或在1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％至11％之间的细胞(不包括rbc)是cd56+和表面cd16a-、nkp46-、2b4-、cd2-、dnam-、nkg2c-、nkg2d-、nkg2e-、nkg2f-和/或nkg2h-[0915]iv)细胞制剂中小于13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的细胞(不包括rbc)是表面cd16a+、nkp46+、2b4+、cd2+、dnam+、nkg2c+、nkg2d+、nkg2e+、nkg2f+和/或nkg2h+和cd56+(“cd16a、nkp46、2b4、cd2、dnam、nkg2c、nkg2d、nkg2e、nkg2f和/或nkg2h细胞的总百分比”)；[0916]v)在细胞制剂中为cd56+的细胞的群体内，小于89％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％、或在89％至50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％之间、或在75％至50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％之间、或在50％至40％、30％、20％、10％、5％或1％之间、或在1％至5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％或89％之间是表面cd16a+、nkp46+、2b4+、cd2+、dnam+、nkg2c+、nkg2d+、nkg2e+、nkg2f+和/或nkg2h+和cd56+；[0917]vi)与从健康受试者或健康受试者的群体收集的血液中的cd56+细胞上的cd16a、nkp46、2b4、cd2、dnam、nkg2c、nkg2d、nkg2e、nkg2f和/或nkg2h的表面表达相比，细胞制剂中的cd56+细胞分别具有较低的cd16a、nkp46、2b4、cd2、dnam、nkg2c、nkg2d、nkg2e、nkg2f和/或nkg2h的表面表达，其中细胞制剂中cd16a、nkp46、2b4、cd2、dnam、nkg2c、nkg2d、nkg2e、nkg2f和/或nkg2h的表面表达降低至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或在10％至20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％之间、或在50％至60％、70％、80％、90％、95％或99％之间，或在作为低端的10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％至作为高端的99％之间；和/或[0918]vii)与在不接触基因载体(并且在说明性实施例中rip)的情况下，总cd16a、nkp46、2b4、cd2、dnam、nkg2c、nkg2d、nkg2e、nkg2f和/或nkg2h细胞的百分比相比，在接触基因载体(并且在说明性实施例中rips)后，总cd16a、nkp46、2b4、cd2、、nkg2c、nkg2d、nkg2e、nkg2f和/或nkg2h细胞的百分比减少至少19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。[0919]在本文的任何方面中，在包括变暗的t细胞特征或变暗的nk细胞特征的说明性实施例中，修饰的细胞可以最近在之前的7、6、5、4、3、2或1天内被活化。[0920]在本文任何细胞制剂方面或实施例的一些实施例中，或在包括细胞制剂的任何方法或使用方面中，或在任何群体实施例中，其中的一些修饰的cd4+、修饰的cd8+、修饰的cd56+、修饰的t细胞和/或修饰的nk细胞在细胞聚集体中。在一些实施例中，细胞制剂中至少1％、2％、3％、4％、5％、7.5％、10％、15％、20％或25％,或在1％至10％、15％、20％、25％、50％和75％之间的白细胞、修饰的cd4+细胞、修饰的cd8+细胞、修饰的cd56+细胞、修饰的t细胞和/或修饰的nk细胞在细胞聚集体中。在一些实施例中，细胞聚集体的直径大于15μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm或60μm，或直径在25μm至50μm、60μm、75μm、100μm、125μm、150μm、200μm或250μm之间。在一些实施例中，修饰的细胞是聚集体，所述聚集体包含至少4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000或10,000个白细胞或5个至500个、5个至250个、5个至100个、10个至500个、10个至250个或10个至100个白细胞。此外，在一些实施例(包括紧接前一实施例的子实施例)中，细胞制剂中至少1％、2％、3％、4％、5％、7.5％、10％、15％、20％或25％，或在1％至10％、15％、20％、25％、50％和75％之间的白细胞、修饰的t和/或nk细胞是聚集体，所述聚集体包含或包含至少4、5、6、8、或5至500、5至250、5至100、10至500、10至250、或10至100个白细胞、修饰的t细胞和/或nk细胞。此外，在一些实施例中，细胞制剂包括修饰的t细胞和/或nk细胞的聚集体，在一些实施例中连同未修饰的t细胞和/或nk细胞和/或其它白细胞，其能够被孔径为至少15μm、20μm、25μm、30μm、40μm、50μm或60μm的粗过滤器保留。在某些说明性实施例中，至少5％的白细胞、t细胞、nk细胞、修饰的t细胞和/或修饰的nk细胞在细胞聚集体中。在某些子实施例中，细胞聚集体的直径大于40μm和/或能够被孔直径为至少40μm的粗过滤器保留。在一些子实施例中，细胞聚集体包括5个至500个白细胞或修饰的t细胞。[0921]在本文中包括向受试者施用细胞、群体或细胞制剂的任何方面或实施例的一些实施例中，基因修饰的细胞的持久群体，并且在说明性实施例中基因修饰的t细胞和/或nk细胞，或衍生自所述修饰的细胞的后代细胞或基因修饰的后代细胞的群体，在施用后在受试者中保持持续至少1、2、3、4、5、6、7、14、17、21或28天或1、2或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或1、2、3、4或5年。在一些实施例中，至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的经基因修饰的细胞(并且在说明性实施例中car-t细胞)表达包含转基因的第一多肽，并且在说明性实施例中表达经工程改造的t细胞受体或car。在一些实施例中，表达包含转基因的第一多肽的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的经基因修饰的细胞在血液中和/或在肿瘤(例如实体瘤)的位点处循环，并且经基因修饰的细胞中的其余部分是皮下的。在一些实施例中，持久群体是皮下的，在血液中循环，和/或位于肿瘤例如实体瘤的位点。在一些实施例中，皮下区域不包含人工基质组分。[0922]在一些实施例中，持久群体可通过组织学检测。在一些实施例中，持久群体皮下保持持续至少或高达14、21、28、50、60、90天，并且可通过组织学检测。在一些实施例中，通过fac，例如针对car或去除标签(例如etag)的facs，例如作为2个基因修饰的细胞/μl血液，或通过qpcr，例如转基因的qpcr或测序或穿过car的嵌合连接，或对于用人类经工程改造的细胞，例如人类car-t细胞、人类rnase p(hrnasep)处理的非人类受试者，可检测到持久群体。在一些实施例中，在血液中可检测到持久群体。[0923]在本文提供的任何方面的一些实施例中，包括但不限于本文上文在该示例性实施例部分中提供的方法和用途方面，修饰的细胞，例如修饰的t细胞和/或nk细胞或其群体具有变暗的表面多肽，其在说明性实施例中可以是tcr复合物多肽，并且在说明性子实施例中cd3。在说明性实施例中，此类变暗的细胞(包括其群体)表现出本文提供的变暗的t细胞特征和/或变暗的nk细胞特征中的任一种。[0924]在本文提供的任何方面的一些实施例中，包括但不限于上文在该示例性实施例部分中提供的方法和用途方面，如本文所公开的，一些(例如，至少5％、7.5％或10％)修饰的细胞(例如修饰的t细胞和/或nk细胞或其群体)或其群体在聚集体中。[0925]在本文提供的任何方面的一些实施例中，包括但不限于上文在该示例性实施例部分中提供的方法和用途方面，细胞形成群体，其可以是如本文所公开的持久群体。[0926]在任何持久群体或后代细胞的群体的方面或实施例中，或在本文包括持久群体或后代细胞的群体的任何方面或实施例中，修饰的细胞(诸如修饰的t细胞和/或nk细胞)和在说明性实施例中经基因修饰的t细胞和/或nk细胞的数量包括至少100、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、或1×1012个细胞，或1×103至1×104、1×105、1×106、1×107、1×108或1×109个细胞。在一些实施例中，施用于受试者的细胞制剂中存在的修饰的细胞和在说明性实施例中修饰的t细胞和/或nk细胞在受试者中增殖至少5、10、15、20、25、50、75、100、250、500、750、1,000、2,500、5,000或10,000倍，例如以形成持久群体或后代细胞的群体。[0927]在一些实施例中，持久群体或后代细胞的群体表达经工程改造的t细胞受体或car，并且持久群体或后代细胞的群体通过持久临床应答间接检测。例如，这类持久性可以通过检测稳定的疾病、部分应答或完全应答来检测，其中应答的持续时间为临床应答的初始观察后的至少3、6、9、12、18或24个月，其在一些实施例中，对于在施用细胞(并且在说明性实施例中，施用经工程改造的t细胞或car-t疗法)之前经历进行性疾病的患者来说是稳定的疾病。[0928]在本文提供的包括采集血液的步骤的任何方面中，所采集的血液的体积可以是例如5ml至600ml。更多体积和范围在本说明书中其它地方提供，并且在一些实施例中，包括本文提供的小体积元件。在一些实施例中，当使用过滤器(在说明性实施例中白细胞减少过滤器)处理所采集的血液时，施加到过滤器的血液样品的体积为600、500、400、300、200、150、120、100、75、50、40、30、25、20、15、10或5ml或更小。在说明性实施例中，施加到过滤器的血液样品的体积为50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1ml或更小。[0929]在本文提供的任何方面的一些实施例中，在说明性实施例中可以在注射器中的细胞制剂具有0.5ml至20ml、15ml、10ml、5ml或1ml；或1ml至20ml、15ml、10ml、5ml、4ml、3ml、2ml或更少；或2ml至20ml、15ml、10ml、7ml或5ml；或5ml至20ml、15ml或10ml、或3ml至12ml、或小于3ml的体积。在本文提供的任何方面或实施例的一些实施例中，其中从受试者收集血液，所收集的血液具有在2.5ml至75ml、60ml、50ml、40ml、30ml、25ml、20ml、15ml、10ml或5ml之间，或在5ml至75ml、60ml、50ml、40ml、30ml、25ml、20ml、15ml或10ml之间，或在10ml至75ml、60ml、50ml、50ml、40ml、30ml、25ml或20ml之间，或在15ml至75ml、60ml、50ml、50ml、40ml、30ml、25ml或20ml之间，或在20ml and 75ml、60ml、50ml、40ml、30ml或25ml之间，或在25ml至75ml、70ml、60ml、50ml、40ml和30ml之间，或在作为低端的5ml、10ml或15ml至作为高端的20ml之间的体积。在一些实施例中，当使用过滤器(在说明性实施例中白细胞减少过滤器)处理所采集的血液时，施加到过滤器的血液样品或其级分的体积可以为2.5ml至75、50、40、30、25、20、15或10。在说明性实施例中，施加到过滤器的全血液样品或其级分的体积在10ml至50ml、25ml、20ml、15ml之间。在说明性实施例中，施加到过滤器的全血液样品或其级分的体积为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1ml或更小。在本文提供的任何方面或实施例的一些实施例中，所述反应混合物的体积在2.5ml至75ml、60ml、50ml、40ml、30ml、25ml、20ml、15ml、10ml或5ml之间，或在5ml至75ml、70ml、60ml、50ml、40ml、30ml、25ml、20ml或10ml之间，或在10ml至75ml、70ml、60ml、50ml、40ml、30ml、25ml、20ml或15ml之间，或在15ml至75ml、70ml、60ml、50ml、40ml、30ml、25ml或20ml之间，或在20ml至75ml、70ml、60ml、50ml、40ml、30ml或25ml之间，或在25ml至75ml、70ml、60ml、50ml、40ml和30ml之间。本段落中的细胞制剂、采集的血液和反应混合物的体积在本文中被称为“小体积元件”。在包含小体积元件的实施例的说明性子实施例中，所述细胞制剂适于皮下递送，其中修饰的细胞(诸如修饰的细胞制剂中的修饰的t细胞和/或nk细胞)的数目为1.5×104至1.5×109、1×109、1×108或1×107，或1×105至1.5×108，或1×105至1×107，或1×106至1×108，或2×106至1×108，或者在说明性实施例中3×104至3×107，1×105至3×107，或1×106至3×107个修饰的t细胞、nk细胞、cd4+细胞、cd8+细胞和/或cd56+细胞。[0930]在一些实施例中，在血液处理袋或其它培育袋中进行接触步骤，例如其中将全血或其级分加入到包含rip的培育袋中以形成反应混合物，或其中将rip加入到包含全血的培育袋中以形成反应混合物。[0931]在任何包封的基因载体(例如基因载体颗粒)的说明性实施例中，并且在说明性实施例中反转录病毒颗粒、本文提供的方面或包括基因载体颗粒的任何其它方面中，基因载体颗粒基本上不含由基因载体颗粒的核酸编码的蛋白质转录物，例如基本上不含由基因载体基因载体颗粒的核酸编码的经工程改造的t细胞受体或car。[0932]在一些实施例中，在培育之前、期间或之后，将样品如血液样品或反应混合物施加到白细胞减少过滤器，例如以除去不与淋巴细胞缔合的rip。在一些实施例中，从反应混合物中去除至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的不与淋巴细胞缔合的rip。在一些实施例中，反应混合物以0.25至1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5ml/min，或0.5ml/min至2ml/min的流速在白细胞减少过滤器上过滤。在一些实施例中，使用注射器在白细胞减少过滤器上过滤反应混合物。在一些实施例中，当过滤反应混合物时，注射器相对于与白细胞减少过滤器流体连通的通道(例如管道)的角度小于80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°或45°。在一些实施例中，在去除rip期间，血细胞和修饰的淋巴细胞不以大于70°、75°或80°的角度跨越接合部移动。在一些实施例中，白细胞减少过滤器具有3cm2至5cm2的有效过滤面积，并且在这些或其它实施例中，过滤器中的孔的直径在2μm至6μm之间。在一些实施例中，在将反应混合物通过白细胞减少过滤器过滤之后由白细胞减少过滤器保留的细胞用体积为反应混合物的体积的0.25倍至3倍的洗涤缓冲液洗涤。在一些实施例中，rip的去除在包括注射器的过滤器总成、与注射器流体连通的白细胞减少过滤器和与白细胞减少过滤器流体连通的一个或多个袋内执行。在一些实施例中，在包括第二注射器和第二袋的过滤器总成内执行rip的去除，其中所述第二袋与所述白细胞减少过滤器流体连通。[0933]在本文提供的包括多核苷酸(例如编码car和/或le的分离的多核苷酸)的任何方面中，这类多核苷酸或分离的多核苷酸可以被包含在一个或多个容器中，并且例如在0.1ml至10ml的溶液中。这类多核苷酸可以包含基本上纯的gmp级重组载体(例如复制缺陷型反转录病毒颗粒)。在一些实施例中，这类多核苷酸包含重组裸dna载体。在说明性实施例中，这类多核苷酸是具有1×106至5×109、1×107至1×109、5×106至1×108、1×106至5×107、1×106至5×106或5x107至1x108个反转录病毒转导单元(tu)或tu/ml，或至少100、1,000、2,000或2,500tu/ng p24的复制缺陷型反转录病毒颗粒的容器。[0934]在一些实施例中，当白细胞减少过滤器用于对采集的血液进行分级时，过滤器的孔径小于10μm、7.5μm、5μm、4μm或3μm或为0.5μm至4μm或2μm至6μm。在一些实施例中，白细胞减少过滤器总成可以收集和/或保留血液样品中至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％的白细胞。在说明性实施例中，白细胞减少过滤器总成可以收集血液样品中99％、99.9％或99.99％的白细胞。在一些实施例中，至少75％、80％、85％、90％或95％、或75％至99.99％、80％至99.99％、85％至99.99％、90％至99.99％、或95％至99.99％的非白细胞细胞通过过滤器并且不被收集。[0935]在本文提供的任何方面中，包括与任选的培育组合的接触步骤可以进行(或可以发生)14、12或10小时或更短时间，或在说明性实施例中进行8、6、4、3、2或1小时或更短时间，或在某些另外的说明性实施例中进行小于8小时、小于6小时、小于4小时、2小时、小于1小时、小于30分钟或小于15分钟，但在每种情况下，至少存在初始接触步骤，其中使反转录病毒颗粒和细胞在转导反应混合物中的悬浮液中接触。在其它实施例中，可以将反应混合物培育15分钟至12小时、15分钟至10小时、15分钟至8小时、15分钟至6小时、15分钟至4小时、15分钟至2小时、15分钟至1小时、15分钟至45分钟或15分钟至30分钟。在其它实施例中，可以将反应混合物培育30分钟至12小时、30分钟至10小时、30分钟至8小时、30分钟至6小时、30分钟至4小时、30分钟至2小时、30分钟至1小时、或30分钟至45分钟。在其它实施例中，可以将反应混合物培育1小时至12小时、1小时至8小时、1小时至4小时或1小时至2小时。在另一个说明性实施例中，接触仅在初始接触步骤(在反应混合物，包括在悬浮液中游离的反转录病毒颗粒和在悬浮液中的细胞，中没有任何进一步的培育)和在反应混合物中没有任何进一步的培育之间进行，或者在反应混合物中进行5分钟、10分钟、15分钟、30分钟或1小时的培育。在某些实施例中，所述接触可以进行(或可以发生)作为范围的低端的30秒或1、2、5、10、15、30或45分钟，或1、2、3、4、5、6、7或8小时至作为范围的高端的10分钟、15分钟、30分钟或1、2、4、6、8、10、12、18、24、36、48和72小时。在说明性实施例中，所述接触可以进行(或可以发生)仅接触作为范围的低端的30秒或1、2、5、10、15、30或45分钟或1小时至作为范围的高端的2、4、6和8小时。在一些实施例中，在将rip添加至待修饰、基因修饰和/或转导的细胞之后，可立即洗掉rip，使得接触时间实施持续洗掉rip所花费的时间长度。因此，通常，接触至少包括初始接触步骤，其中在转导反应混合物中的悬浮液中使反转录病毒颗粒与细胞接触。可在不预先活化的情况下进行这类方法。[0936]在本文提供的方法的说明性实施例中，具有任选的培育的接触步骤在32℃至42℃的温度下(例如在如本文更详细提供的37℃下)进行。在其它说明性实施例中，具有任选的培育的接触步骤在低于37℃的温度下进行，例如在1℃至25℃、2℃至20℃、2℃至15℃、2℃至6℃、或3℃至6℃下进行。在这些温度下与接触步骤相关的任选的培育可以进行持续本文所述的任何时间长度。在说明性实施例中，与这些温度相关的任选的培育进行1小时或更短时间，例如0至55分钟(即55分钟或更短时间)、0至45分钟(即45分钟或更短时间)、0至30分钟(即30分钟或更短时间)、0至15分钟(即15分钟或更短时间)、0至10分钟(即10分钟或更短时间)、0至5分钟(即5分钟或更短时间)、5至30分钟、5至15分钟或10至30分钟。在另外的说明性实施例中，冷接触和培育在2℃至15℃的温度下进行0至55分钟、0至45分钟、0至30分钟、0至15分钟、0至10分钟、0至5分钟、5至15分钟或10至30分钟。在其它另外的说明性实施例中，冷接触和培育在1℃至25℃、2℃至20℃、2℃至15℃、2℃至6℃或3℃至6℃的温度下进行5至30分钟。[0937]在包括在紧接上述提供的较冷温度下的接触步骤的某些实施例中，二次培育通常通过在任选的洗涤步骤之后将细胞悬浮在包含重组载体(在说明性实施例中反转录病毒颗粒)的溶液中来进行。在说明性实施例中，二次培育在32℃与42℃之间的温度下(例如在37℃下)进行。任选的二次培育可以进行本文所述的任何时间长度。在说明性实施例中，任选的二次培育进行6小时或更短时间，例如1至6小时、1至5小时、1至4小时、1至3小时、1至2小时、2至4小时、30分钟至4小时、10分钟至4小时、5分钟至4小时、5分钟至1小时、1分钟至5分钟或少于5分钟。因此，在一些说明性实施例中，任选地，t细胞和/或nk细胞活化元件在rip的表面上，接触在2℃至15℃，和任选地在2℃至6℃下进行少于1小时，任选地在此之后，tnc在32℃至42℃下培育5分钟至8小时，或在说明性实施例中，培育5分钟至4小时，并且任选地在此之后，修饰的t细胞和/或nk细胞在过滤器上收集以形成细胞制剂。[0938]在一些实施例中，在血液、tnc或pbmc与重组核酸载体(其在说明性实施例中是复制缺陷型反转录病毒颗粒)接触的时间和修饰的细胞悬浮并因此配制在递送溶液中以形成细胞制剂的时间之间经过不超过16小时、14小时、12小时、8小时、4小时、2小时或1小时，或者作为范围的低端的5、10、15、30、45或60分钟至作为范围的高端的1.5、2、4、6、8、10、12、14和16小时，例如经过5分钟至16小时、5分钟至12小时、5分钟至8小时、5分钟至6小时、5分钟至4小时、5分钟至3小时、5分钟至2小时、或5分钟至1小时。在一些实施例中，当细胞与复制缺陷型反转录病毒颗粒接触时至当修饰的细胞被配制在递送溶液中时之间的时间可以是1至16小时、1至14小时、1至12小时、1至8小时、1至6小时、1至4小时或1至2小时。在一些实施例中，在从受试者采集血液的时间至将修饰的淋巴细胞再引入到受试者中的时间之间经过不超过16小时、14小时、12小时、8小时、4小时、2小时或1小时。在一些实施例中，在从受试者采集血液时至将修饰的淋巴细胞再引入到受试者中时之间的时间可以是1至16小时、1至14小时、1至12小时、1至8小时、1至6小时、1至4小时或1至2小时。[0939]在本文提供的包括施用步骤的任何方面，在说明性实施例中，施用的细胞在施用之前例如使用本文提供的包括接触和配制步骤的任何方法被离体处理持续少于24、18、12、10、8、6、4、2或1小时或30分钟或15分钟，或持续15分钟至24、18、12、10、8、6、4、2、1或0.5小时，或持续1小时至24、18、12、10、8、6、4或2小时。因此，在某些实施例中，此类离体时间可以是从受试者采集血液与向受试者静脉内、肌内、瘤内、腹膜内施用和在说明性实施例中皮下施用修饰的淋巴细胞(在说明性实施例中衍生自来自受试者的淋巴细胞)之间的时间。[0940]在本文任何相关方面的一些实施例中，在被用于或包括在本文提供的任何方法或组合物中之前，包括但不限于被引入到或再引入回到受试者中，或在被用于制备细胞制剂之前或在被用于制备细胞制剂时，一些或全部的t细胞和nk细胞尚未表达重组核酸或尚未将重组核酸整合到细胞的基因组中。在一些实施例中，当修饰的淋巴细胞被引入或再引入回到受试者中时，和在说明性实施例中当被皮下或肌内引入或再引入回到受试者中时，或者当用于制备细胞制剂时，至少25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的修饰的t细胞和nk细胞不表达car或转蛋白酶，和/或不具有与其细胞膜相关的car。在其它实施例中，本文提供了细胞制剂，其中细胞制剂中至少25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的修饰的t细胞和/或nk细胞包含重组病毒反转录酶和/或整合酶。在说明性实施例中，当修饰的淋巴细胞被引入或再引入回到受试者中时，并且在说明性实施例中当被皮下或肌内引入或再引入回到受试者中时，或者当用于制备细胞制剂时，至少25％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的修饰的t细胞和nk细胞不表达car，和/或不具有与其细胞膜相关的car。在说明性实施例中，当淋巴细胞被引入或再引入到受试者中时，并且在说明性实施例中当被皮下或肌内引入或再引入回到受试者中时，或当用于制备细胞制剂时，至少25％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的被修饰的t细胞和nk细胞不表达重组mrna(例如，编码car)。在一些实施例中，细胞制剂中大于50％、60％、70％、75％、80％或90％的细胞、nk细胞和/或t细胞是活的。[0941]在一些实施例中，当淋巴细胞被引入或再引入到受试者中时，并且在说明性实施例中当被皮下或肌内引入或再引入到受试者中时，或当用于制备细胞制剂时，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的被修饰的t细胞和nk细胞不具有稳定整合到其基因组中的重组核酸。在说明性实施例中，当淋巴细胞被引入或再引入到受试者中时，并且在说明性实施例中当被皮下或肌内引入或再引入到受试者中时，或当用于制备细胞制剂时，至少25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的被修饰的t细胞和nk细胞不具有稳定整合到其基因组中的重组核酸。在本文包括修饰的、基因修饰的、转导的和/或稳定转染的淋巴细胞的任何方面的一些实施例中，当淋巴细胞被引入或再引入回到受试者中时，并且在说明性实施例中被皮下或肌内引入或再引入回到受试者中时，或当制备细胞制剂时，任何百分比的淋巴细胞可以被修饰、基因修饰、转导和/或稳定地转染。在一些实施例中，至少4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的淋巴细胞被修饰。在说明性实施例中，作为范围的低端的4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％和70％的淋巴细胞被修饰，并且作为范围的高端的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％的淋巴细胞被修饰。在一些实施例中，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的修饰的淋巴细胞未被基因修饰、转导或稳定转染。在说明性实施例中，至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的修饰的淋巴细胞未被基因修饰、转导或稳定转染。在一些实施例中，作为范围的低端的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％和70％的被修饰的淋巴细胞未被基因修饰、转导或稳定转染，并且作为范围的高端的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的被修饰的淋巴细胞(例如，10％至95％)未被基因修饰、转导或稳定转染。含有重组核酸的被基因修饰的淋巴细胞可以将重组核酸置于染色体外或整合到基因组中。在一些实施例中，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的被基因修饰的淋巴细胞具有染色体外重组核酸。在说明性实施例中，至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的经基因修饰的淋巴细胞具有染色体外重组核酸。在一些实施例中，作为范围的低端的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％和70％的修饰或基因修饰的淋巴细胞具有染色体外重组核酸，并且作为范围的高端的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％或全部的修饰的或基因修饰的淋巴细胞(例如，10％至95％)具有染色体外重组核酸。在一些实施例中，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的被修饰或被基因修饰的淋巴细胞未被转导或稳定转染。在说明性实施例中，至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或全部的被修饰或被基因修饰的淋巴细胞未被转导或稳定转染。在一些实施例中，作为范围的低端的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％和70％的修饰或基因修饰的淋巴细胞被转导或稳定转染，并且作为范围的高端的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％或全部的修饰或基因修饰的淋巴细胞未被转导或稳定转染。[0942]在本文公开的包括皮下或肌内递送细胞制剂的某些实施例中，以与皮下或肌内递送相容、对皮下或肌内递送有效和/或适于皮下或肌内递送的方式来配制细胞，使得与在皮下递送时相比，如果静脉内递送，则可以植入较少的被修饰的或被基因修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，与当皮下或肌内递送时相比，当静脉内递送时植入少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的淋巴细胞。在一些实施例中，溶液包含未修饰的淋巴细胞、修饰的淋巴细胞和基因修饰的淋巴细胞中的至少两种。在一些实施例中，溶液包含比修饰的淋巴细胞更多的未修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，被修饰、基因修饰、转导和/或稳定转染的t细胞和nk细胞的百分比为至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。如在本文实例中所述，在本文提供的用于转导全血中的淋巴细胞的例示性方法中，1％至20％，或1％至15％，或5％至15％，或7％至12％或约10％的淋巴细胞被基因修饰和/或转导。在一些实施例中，淋巴细胞不与重组核酸载体如rip接触，并且未被修饰。在说明性实施例中，淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。[0943]在本文任何方面的一些实施例中，其中向受试者施用制剂，在施用第一细胞制剂后1天至1个月、2个月、3个月、6个月或12个月之间的第二、第三、第四等时间点向受试者施用第二制剂，其中第二制剂可以与第一制剂相同，或者可以包括本文提供的任何制剂。i)细胞因子，ii)能够结合cd3、cd28、ox40、4-1bb、icos、cd9、cd53、cd63、cd81和/或cd82的抗体、抗体模拟物或多肽，和/或iii)由car识别的同源抗原的来源，并且任选地其中所述细胞因子是il-2、il-7、il-15或il-21，或这些细胞因子中能够结合至细胞因子的天然受体和活化细胞因子的天然受体的任何细胞因子的修饰的形式。[0944]在本文包括细胞混合物或细胞制剂的任何方面的一些实施例中，可以富集细胞混合物中的任何细胞。例如，用于过继细胞疗法的细胞，例如一个或多个t和/或nk细胞的细胞群体，可以在配制用于递送之前富集。在一些实施例中，所述一种或多种细胞群体可以在所述细胞混合物与重组核酸载体如复制缺陷型反转录病毒颗粒接触后富集。在一些实施例中，富集一个或多个细胞群体可以与本文公开的任何基因修饰的方法同时进行，并且在说明性实施例中，用复制缺陷型反转录病毒颗粒进行基因修饰。[0945]在本文包括单核细胞(如pbmc)或tnc的任何方面的一些实施例中，单核细胞或tnc可以分别通过密度梯度离心或白细胞减少过滤器总成的反向灌注从更复杂的细胞混合物如全血中分离。在一些实施例中，可以通过选择表达一种或多种表面分子的细胞来富集特定的细胞谱系，例如nk细胞、t细胞和/或t细胞子集，包括初始的效应、记忆性、抑制性t细胞和/或调节性t细胞。在说明性实施例中，一种或多种表面分子可以包括cd4、cd8、cd16、cd25、cd27、cd28、cd44、cd45ra、cd45ro、cd56、cd62l、ccr7、kir、foxp3和/或tcr组分如cd3。使用与针对一种或多种表面分子的抗体缀合的珠粒的方法可以用于使用基于磁性、密度和大小的分离来富集期望的细胞。在这类基于抗体的阳性选择方法的过程中，一种或多种细胞表面分子的结合可以导致信号转导和结合细胞的生物学的改变。例如，使用附着有cd3抗体的珠粒选择t细胞可能会导致cd3信号转导和t细胞活化。在其它实例中，结合和信号转导可能导致细胞的进一步细胞分化，如初始t细胞或记忆性t细胞。在一些实施例中，阳性选择不用于富集期望的细胞，例如当优选的是不接触期望的细胞而是保持不接触时。在本段落的实施例中提供的用于阳性选择的这些方法中的任何一种可以在接触步骤之前、期间或之后进行。[0946]在本文包括细胞混合物或细胞制剂的任何方面的一些实施例中，一种或多种不合需要的细胞群体可以被耗尽，使得细胞混合物或细胞制剂中的期望的细胞被富集。在一些实施例中，所述一种或多种细胞群体可以在与重组核酸载体如复制缺陷型反转录病毒颗粒接触之前通过阴性选择而耗尽。在一些实施例中，在细胞混合物与重组核酸载体如复制缺陷型反转录病毒颗粒接触后，一种或多种细胞群体可以通过阴性选择而耗尽。在一些实施例中，耗尽一个或多个细胞群体可以在本文公开的基因修饰(并且在说明性实施例中，用复制缺陷型反转录病毒颗粒进行的基因修饰)的任何方法之前或同时进行。[0947]在一些实施例中，不合需要的细胞包括癌细胞。来自多种类型的癌症的癌细胞可以进入血液，并且可以使用本文提供的方法与淋巴细胞一起以低频率无意地进行基因修饰。在一些实施例中，癌细胞可以衍生自任何癌症，包括但不限于：肾细胞癌、胃癌、肉瘤、乳腺癌、淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤如弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金b细胞淋巴瘤(b-nhl)、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、间皮瘤、肺癌(例如，小细胞肺癌)、黑色素瘤、白血病、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、急性淋巴细胞性白血病(all)、急性髓细胞性白血病(aml)或慢性髓细胞性白血病(cml)，或本公开中所列的任何癌症。在说明性实施例中，car-癌细胞可以来源于淋巴瘤，并且在说明性实施例中来源于b细胞淋巴瘤。[0948]在一些实施例中，不合需要的细胞可以包括单核细胞。在一些实施例中，可以通过将细胞混合物与固定的单核细胞结合底物(例如标准塑料组织培养塑料、尼龙或玻璃棉或葡聚糖凝胶树脂)培育来耗尽单核细胞。在一些实施例中，培育可以在37℃下进行至少1小时，或通过使细胞混合物通过树脂进行。在培育后，收集悬浮液中所需的非粘附细胞用于进一步处理。在本文提供的淋巴细胞的快速离体处理的说明性实施例中，全血、tnc或pbmc不与固定的单核细胞结合底物一起培育。[0949]在一些实施例中，不合需要的细胞可以通过表达一种或多种表面分子的细胞的阴性选择而耗尽。在说明性实施例中，表面分子是肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原，或以其它方式在癌细胞上表达。在说明性实施例中，表面分子可以包括axl、ror1、ror2、her2(erbb2)、前列腺干细胞抗原(psca)、psma(前列腺特异性膜抗原)、b细胞成熟抗原(bcma)、α-胎蛋白(afp)、癌胚性抗原(cea)、癌症抗原-125(ca-125)、ca19-9、钙网膜素、嗜铬粒蛋白、蛋白黑色素-a(由t淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；mart-1)、myo-d1、肌特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(nse)、muc-1、上皮膜蛋白(ema)、上皮肿瘤抗原(eta)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(mage)、mage-al、高分子量-黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)、胎盘碱性磷酸酶，突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同功酶型的二聚体形式m2(肿瘤m2-pk)、cd19、cd20、cd22、cd23、cd24、cd27、cd30、cd33、cd34、cd37、cd38、cd40、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd45、cd70、cd99、cd117、cd123、cd138、cd171、gd2(神经节苷脂g2)、epha2、cspg4、fap(成纤维细胞活化蛋白)、κ、λ、5t4、αvβ6整合素、整合素ανβ3(cd61)、半乳糖凝集素、k-ras(v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因)、ral-b、b7-h3、b7-h6、caix、egfr、egp2、egp40、epcam、胎儿achr、frα、gd3、hla-a1+mage1、hla-a1+ny-eso-1、hla-dr、il-11rα、il-13rα2、lewis-y、muc16、ncam、nkg2d配体、prame、存活素、tag72、tems、vegfr2、egfrviii(表皮生长因子变体iii)、精子蛋白17(sp17)、间皮素、pap(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺素、tarp(t细胞受体γ交替阅读框蛋白)、trp-p8、steap1(前列腺1的六跨膜上皮抗原)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、nyeso1或pdl-1等。[0950]在另外的说明性实施例中，表面分子是血癌抗原，例如cd19、cd20、cd22、cd25、cd32、cd34、cd38、cd123、bcma、taci或tim3。在一些实施例中，可以通过珠粒从细胞混合物如全血、pbmc或tnc中耗尽不合需要的细胞。在一些实施例中，不合需要的细胞可以通过基于柱的分离来耗尽。在这些实施例中，与细胞表面分子结合的配体或抗体附着于珠粒或柱。在一些实施例中，附着于珠粒的抗体可以结合与car相同的抗原。在一些实施例中，附着于珠粒的抗体可以结合与car相同抗原的不同表位，所述car将在患者体内表达。在说明性实施例中，附着于珠粒的抗体可以结合与car相同抗原的相同表位。在一些实施例中，珠粒可以具有多于一种的附着的抗体，该抗体结合至不合需要的细胞的表面上的抗原。在一些实施例中，可以组合使用附着有不同抗体的珠粒。在一些实施例中，珠粒可以是磁珠。在一些实施例中，在将细胞混合物与带有附着的抗体的磁珠培育后，可以通过磁分离来耗尽不合需要的细胞。在一些实施例中，珠粒不是磁性的。[0951]在一些实施例中，表达一种或多种表面分子的不合需要的细胞可以通过抗体包被的珠粒从细胞混合物如全血、pbmc或tnc中耗尽并通过大小分离。在一些实施例中，珠粒是聚苯乙烯。在说明性实施例中，珠粒的直径为至少约30μm、约35μm、约40μm、约50μm、约60μm、约70μm或约80μm。在一些实施例中，在重组核酸载体(其在说明性实施例中为rip)与细胞混合物一起培育期间，将抗体包被的珠粒加入到细胞混合物中。在这些实施例中，形成包括以下的反应混合物：(a)细胞混合物，例如来自全血、富集的tnc或分离的pbmc；(b)编码感兴趣的转基因如car的重组核酸载体，如rip；和(c)抗体包被的珠粒，其结合至在不合需要的细胞的表面上表达的一种或多种表面分子或抗原。在一些实施例中，反应混合物可以培育少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或45分钟或少于1、2、3、4、5、6、7或8小时。在一些实施例中，在培育后，可以进行基于密度梯度离心的细胞富集程序以富集耗尽了与抗体包被的珠粒复合的不合需要的细胞的总单核细胞。在其它实施例中，反应混合物可以通过过滤器以耗尽与抗体包被的珠粒复合的不合需要的细胞。在一些实施例中，过滤器可以具有比珠粒的直径小或者小约5μm、10μm或15μm的孔径。这类过滤器可以捕获结合到珠粒上的不合需要的细胞，并允许期望的细胞向下游流动到具有较小孔径的白细胞减少过滤器总成。[0952]在一些实施例中，通过红细胞抗体玫瑰花结疗法(ea-玫瑰花结疗法)，可以从含有淋巴细胞和红细胞的细胞混合物如全血中耗尽不合需要的细胞。在一些实施例中，在重组核酸载体(其在说明性实施例中是rip)与细胞混合物一起培育的时间期间，将介导ea-玫瑰花结疗法的抗体加入到细胞混合物中。在说明性实施例中，形成包含以下的反应混合物：(a)淋巴细胞和红细胞的细胞混合物，例如来自全血；(b)重组核酸载体，例如rip，其编码感兴趣的转基因，并且在另外的说明性实施例中为car；(c)针对不需要的细胞的表面上的抗原的第一抗体，例如肿瘤抗原，例如血癌抗原cd19、cd20、cd22、cd25、cd32、cd34、cd38、cd123、bcma、taci或tim3；(d)针对红细胞的表面上的抗原的第二抗体，如血型糖蛋白a；和(e)使第一抗体和第二抗体交联的第三抗体。在另外的说明性实施例中，反应混合物可以包括针对不合需要的细胞的表面上的多于一种抗原的抗体。在一些实施例中，抗体可以结合至与car相同的抗原。在一些实施例中，将该反应混合物培育少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或45分钟或少于1、2、3、4、5、6、7或8小时。在说明性实施例中，在培育后，进行基于密度梯度离心的pbmc富集程序，以分离总pbmc减去通过ea-玫瑰花结疗法耗尽或去除的群体。在说明性实施例中，在培育后，进行基于密度梯度离心的pbmc富集程序，以分离总pbmc减去将与红细胞一起沉淀的通过ea-玫瑰花结疗法耗尽或去除的群体。[0953]在本文包括血细胞的任何方面的某些实施例中，反应混合物中的血细胞包含占反应混合物中白细胞的百分比的至少10％的嗜中性粒细胞和至少0.5％的嗜酸性粒细胞。[0954]在本文包括反应混合物和/或细胞制剂的任何方面的某些实施例中，反应混合物和/或细胞制剂包含占反应混合物或细胞制剂中细胞的百分比的至少5％、10％、20％、25％、30％或40％的嗜中性粒细胞，或者占反应混合物或细胞制剂中白细胞的百分比的20％至80％、25％至75％、或40％至60％的嗜中性粒细胞。[0955]在本文包括反应混合物和/或细胞制剂的任何方面的某些实施例中，反应混合物和/或细胞制剂包含占反应混合物或细胞制剂中白细胞的百分比的至少0.1％嗜酸性粒细胞，或0.25％至8％或0.5％至4％的嗜酸性粒细胞。[0956]在本文包括血细胞的任何方面的某些实施例中，在接触之前不对反应混合物中的血细胞进行pbmc富集程序。[0957]在本文包括反应混合物的任何方面的某些实施例中，通过将重组反转录病毒颗粒加入到全血中来形成反应混合物。[0958]在本文包括反应混合物的任何方面的某些实施例中，通过将重组反转录病毒颗粒加入到包含有效量的抗凝血剂的基本上全血中来形成反应混合物。[0959]在本文包括反应混合物的任何方面的某些实施例中，所述反应混合物在封闭式细胞处理系统中。在这类反应混合物、用途、修饰的t细胞或nk细胞和在说明性实施例中基因修饰的t细胞或nk细胞、或用于修饰和/或基因修饰t细胞和/或nk细胞的方法的某些实施例中，反应混合物中的血细胞是全血或pbmc，并且任选地反应混合物与封闭式细胞处理系统中的白细胞减少过滤器总成接触，并且在任选的另外实施例中，白细胞减少过滤器总成包括大于25ml体积的白细胞减少过滤器(例如hematrate过滤器)或25ml或更小体积的白细胞减少过滤器(例如acrodisc过滤器)。在一个方面中，本文提供了一种包括t细胞和/或nk细胞、rip和大体积白细胞减少过滤器(例如，hematrate过滤器)或小体积白细胞减少过滤器(例如，acrodisc过滤器)的组合物。在另一方面中。在一些实施例中，施加到大体积白细胞减少过滤器的血液样品的体积为120ml、100ml、75ml、50ml、40ml、30ml、25ml、20ml、15ml、10ml或5ml或更小。在一些实施例中，血液样品被施加到包括小体积白细胞减少过滤器(例如，acrodisc过滤器)的白细胞减少过滤器总成。在一些实施例中，施加到小体积白细胞减少过滤器的血液样品的体积为20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1ml或更少，或在2ml至20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4和3ml之间。[0960]在本文包括反应混合物的任何方面的某些实施例中，反应混合物包含抗凝血剂。例如，在某些实施例中，抗凝血剂选自由柠檬酸葡萄糖、edta或肝素组成的群组。在某些实施例中，抗凝血剂不是柠檬酸葡萄糖酸。在某些实施例中，抗凝血剂包括有效量的肝素。[0961]在本文包括反应混合物的任何方面的某些实施例中，在接触期间反应混合物在血液袋中。[0962]在本文包括反应混合物的任何方面的某些实施例中，所述反应混合物在接触之前与封闭式细胞处理系统中的t淋巴细胞和/或nk细胞富集过滤器接触，并且其中所述反应混合物包括粒细胞，其中所述粒细胞占所述反应混合物中的白细胞的至少10％，或者其中所述反应混合物包括为t细胞的至少10％的粒细胞，其中所述被修饰的和在说明性实施例中被基因修饰的淋巴细胞(例如，t细胞或nk细胞)在接触后经受pbmc富集过程。[0963]在本文包括反应混合物中的血细胞的任何方面的某些实施例中，反应混合物中的血细胞是pbmc，并且在包括在反应混合物中的任选的培育的接触之后，反应混合物与封闭式细胞处理系统中的白细胞减少过滤器总成接触。[0964]在本文包括未分级的全血的任何方面的某些实施例中，未分级的全血不同于脐带血。[0965]在本文的包括反应混合物的任何方面的某些实施例中，在接触之前、在重组反转录病毒颗粒和血细胞接触时、在包括在反应混合物中的任选的培育的接触期间和/或在包括在反应混合物中的任选的培育的接触之后，使反应混合物与封闭式细胞处理系统中的白细胞减少过滤器总成接触，其中t细胞和/或nk细胞、或被修饰的和在说明性实施例中被基因修饰的t细胞和/或nk细胞进一步经受pbmc富集程序。[0966]在本文作为或包括方法的任何方面的某些实施例中，所述方法进一步包括将修饰的t细胞和/或nk细胞皮下施用于受试者。任选地，在这类某些实施例中，修饰的t细胞和/或nk细胞以进一步包含嗜中性粒细胞的细胞制剂递送。此外，任选地，在这类某些实施例中，嗜中性粒细胞以对于安全静脉内递送过高的浓度存在于细胞制剂中，和/或细胞制剂包括5％、10％、15％、20％或25％的嗜中性粒细胞。在本文包括收集、接触和施用步骤的方法中的任一个的一些实施例中，修饰的淋巴细胞在从受试者收集包含淋巴细胞的血液的时间起的14小时、12小时、8小时、6小时、4小时、2小时、1小时或30分钟内被引入回到受试者中。在说明性实施例中，此类方法包括皮下施用。在说明性实施例中，此类方法包括使用单采血液成分术收集血细胞，或通过例如白细胞减少过滤器的过滤器过滤血细胞或修饰的淋巴细胞。[0967]在一些实施例中，反应混合物包含抗凝血剂，其中淋巴细胞在接触它们时在来自受试者的未分级的全血中。在一些实施例中，细胞制剂包含1×106至1×108个修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，反应混合物包含按体积计至少25％的未分级的全血。在一些实施例中，反应混合物处于封闭式细胞处理系统中，其中当所述反应混合物处于所述封闭式细胞处理系统中的白细胞减少过滤器总成中时发生所述接触，并且其中所述细胞制剂中的所述血细胞为总有核细胞(tnc)。[0968]在一些实施例中，所述t细胞和/或nk细胞活化元件位于rip的表面上，所述接触在2℃至15℃，并且任选地在2℃至6℃下进行持续小于8小时、6小时、4小时、2小时或1小时，任选地在此之后，所述tnc在32℃至42℃下培育持续5分钟至4小时，并且任选地在此之后，在过滤器上收集所述修饰的t细胞和/或nk细胞以形成所述细胞制剂。在一些实施例中，反应混合物包含按体积计至少25％的未分级的全血和有效量的抗凝血剂。在一些实施例中，抗凝血剂选自由柠檬酸葡萄糖、edta和肝素组成的群组。在一些实施例中，抗凝血剂不是柠檬酸葡萄糖。在一些实施例中，抗凝血剂包括有效量的肝素。[0969]在本文包括方法的任何方面的某些实施例中，所述方法进一步包括在透明质酸酶的存在下将修饰的t细胞和/或nk细胞皮下施用于受试者。在另外的说明性子实施例中，修饰的t细胞和/或nk细胞是从受试者获得的。[0970]在这些实施例的另外的子实施例(包括在透明质酸酶的存在下将被修饰的和在说明性实施例中被基因修饰的t细胞和/或nk细胞皮下施用于受试者)中，将被修饰的t细胞和/或nk细胞以1ml至5ml的体积皮下递送至受试者。在另外的子实施例中，t细胞和/或nk细胞在从受试者抽取的血液中，并且修饰的t细胞和/或nk细胞被递送回到受试者中，并且在另外的实施例中，在从受试者抽取血液的时间起1-14、1-8小时、1-6小时、1-4小时、1-2小时或1小时内被递送回到受试者中。[0971]在本文的包括反应混合物的任何方面的某些实施例中，在接触之前、在重组反转录病毒颗粒和血细胞接触时、在包括在反应混合物中的任选的培育的接触期间和/或在包括在反应混合物中的任选的培育的接触之后，使反应混合物与封闭式细胞处理系统中的白细胞减少过滤器总成接触。[0972]在本文任何方面的一些实施例中，当t细胞或nk细胞与复制缺陷型反转录病毒颗粒结合以形成反应混合物时，至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、大部分、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％的t细胞是静息t细胞，或者至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、大部分、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％的nk细胞是静息nk细胞。[0973]在本文包括修饰细胞的任何方面中，一个或多个细胞不经历离心接种程序，例如至少30分钟的不经历至少800g的离心接种。[0974]在本文包括方法的任何方面的一些实施例中，所述方法进一步包括将修饰的t细胞和/或nk细胞施用于受试者，任选地其中所述受试者是血细胞的来源。在这些的一些子实施例以及本文的任何方法和用途的实施例中，包括在本例示性实施例章节中的那些，条件是其不会不相容或已陈述，修饰的、基因修饰的和/或转导的淋巴细胞(例如t细胞和/或nk细胞)或其群体在被引入或再引入到受试者中之前经历4次或更少的离体细胞分裂。在一些实施例中，在从受试者采集血液的时间与将修饰的淋巴细胞再引入到受试者中的时间之间经过不超过8小时、6小时、4小时、2小时或1小时。在一些实施例中，在采集血液之后且再引入血液之前的所有步骤都是在封闭系统中进行，任选地其中在整个处理期间人工监测封闭系统。在一些实施例中，溶液中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的修饰的淋巴细胞可以在其表面上包括假型化元件或t细胞活化抗体。在一些实施例中，假型化元件和/或t细胞活化抗体可以通过例如t细胞受体结合到修饰的淋巴细胞的表面，和/或假型化元件和/或t细胞活化抗体可以存在于修饰的淋巴细胞的质膜中。[0975]在本文包括基因修饰和/或转导的任何方面中，abc转运体抑制剂和/或底物，在另外的子实施例中，外源abc转运体抑制剂和/或底物在基因修饰和/或转导之前、期间、或之前和期间都不存在。[0976]在上文提供的任何试剂盒中，第一和/或第二聚核苷酸可以包含本文提供的任何自驱动car。在下文和本文的详细描述中，在该例示性实施例章节之外提供了另外的试剂盒方面和实施例。[0977]对于本文提供的包括注射器的任何方面，在说明性实施例中，注射器与肌内递送(并且在说明性实施例中皮下递送)相容、对肌内递送(并且在说明性实施例中皮下递送)有效和/或适于肌内递送(并且在说明性实施例中皮下递送)，和/或对肌内注射有效、对皮下注射有效、适于肌内注射和/或适于皮下注射。例如，注射器可以具有规格在20至22之间且长度在1英寸至1.5英寸之间用于肌内递送的针，以及规格在26至30之间且长度在0.5英寸至0.625英寸之间用于皮下递送的针。[0978]在本文包括编码car和le的多核苷酸(例如，多核苷酸、rip、细胞制剂、群体、基因修饰的淋巴细胞、反应混合物、包含用于复制缺陷型反转录病毒颗粒的可包装rna基因组的哺乳动物包装细胞系、试剂盒、rip在制备用于基因修饰和/或转导淋巴细胞的试剂盒中的用途、用于基因修饰和/或转导t细胞或nk细胞的方法，用于向受试者施用基因修饰的淋巴细胞的方法)的任何方面和其它实施例的某些实施例中，所述多核苷酸可以包括或编码本文在“自驱动car方法和组合物”章节中公开的任何自驱动car实施例。[0979]在一些实施例中，自驱动car实施例可以是一种多核苷酸，所述多核苷酸包括第一转录单元和第二转录单元，所述第一转录单元可操作地连接到在t细胞或nk细胞中的至少一种中可诱导的诱导型启动子，所述第二转录单元可操作地连接到组成型t细胞或nk细胞启动子，其中所述第一转录单元和所述第二转录单元被发散地排列，其中所述第一转录单元编码le，并且其中所述第二转录单元编码car，其中所述car包含astr结构域、跨膜结构域和胞内活化结构域。[0980]在一些实施例中，自驱动car实施例可以是一种多核苷酸，所述多核苷酸包括第一序列，所述第一序列包含一个或多个第一转录单元，所述第一转录单元与在t细胞或nk细胞中的至少一种中可诱导的诱导型启动子可操作地连接，其中所述一个或多个第一转录单元中的至少一个包括编码包含le的第一多肽的第一多核苷酸序列，其中所述淋巴增生性元件在t细胞或nk细胞中的至少一种中具有组成型活性，其中所述淋巴增生性元件包含跨膜结构域，并且其中所述一个或多个第一转录单元不包括包含信号肽酶裂解位点的信号序列。[0981]在一些实施例中，自驱动car实施例可以是一种多核苷酸，所述多核苷酸包括在反向方向的第一序列和在正向方向的第二序列，所述第一序列包含可操作地连接到在t细胞或nk细胞中的至少一种中可诱导的诱导型启动子的一个或多个第一转录单元，所述第二序列包含可操作地连接到组成型t细胞或nk细胞启动子的一个或多个第二转录单元，其中所述一个或多个第一转录单元的5'端与所述一个或多个第二转录单元的5'端之间的核苷酸的数目小于所述一个或多个第一转录单元的3'端与所述一个或多个第二转录单元的3'端之间的核苷酸的数目，其中所述多核苷酸进一步包括5'ltr和3'ltr，并且其中所述反向方向和正向方向是相对于由5'ltr和3'ltr建立的5'至3'方向，其中所述一个或多个第一转录单元中的至少一个编码le，并且其中所述一个或多个第二转录单元中的至少一个编码car，其中所述car包含astr结构域、跨膜结构域和胞内活化结构域。[0982]在一些实施例中，自驱动car实施例可以是一种多核苷酸，所述多核苷酸包括一个或多个第一转录单元和一个或多个第二转录单元，所述第一转录单元可操作地连接到在t细胞或nk细胞的至少一种中可诱导的诱导型启动子，所述第二转录单元可操作地连接到组成型t细胞或nk细胞启动子，其中所述一个或多个第一转录单元的5'端与所述一个或多个第二转录单元的5'端之间的核苷酸的数目小于所述一个或多个第一转录单元的3'端与所述一个或多个第二转录单元的3'端之间的核苷酸的数目，其中所述一个或多个第一转录单元中的至少一个编码le，并且其中所述一个或多个第二转录单元中的至少一个编码car，其中car包括astr、跨膜结构域和胞内活化结构域。[0983]在一些实施例中，对于包括多核苷酸的任何方面，所述多核苷酸包括可操作地连接到诱导型启动子的一个或多个第一转录单元，其中所述一个或多个第一转录单元中的至少一个编码le，所述多核苷酸可以进一步包括第二序列，所述第二序列包括可操作地连接到组成型t细胞或nk细胞启动子的一个或多个第二转录单元，其中一个或多个第二转录单元中的至少一个包含编码包含car的第二多肽的第二多核苷酸序列，其中car包含astr、跨膜结构域和胞内活化结构域。在说明性实施例中，诱导型启动子是nfat应答启动子。在一些实施例中，第一转录单元和第二转录单元在正向方向上通过250chs4隔离子(seq id no:358)分离。在一些实施例中，rip是慢病毒颗粒。[0984]在本文的自驱动car方法和组合物部分中公开了将与前面段落中的任何自驱动car实施例的任何组合一起使用的更多细节和实施例。[0985]在本文包括容器和/或反应混合物中的重组反转录病毒颗粒的任何方面中，重组反转录病毒颗粒以0.1至50、0.5至50、0.5至20、0.5至10、1至25、1至15、1至10、1至5、2至15、2至10、2至7、2至3、3至10、3至15或5至15或至少0.1、0.5、1、2、2.5、3、5、10或15的moi存在于容器和/或反应混合物中，或者以至少0.1、0.5、1、2、2.5、3、5、10或15的moi存在于反应混合物中。对于试剂盒和分离的反转录病毒颗粒实施例，这类moi可以基于1、2.5、5、10、20、25、50、100、250、500或1,000ml假定1×106个靶细胞/ml，例如在全血的情况下，假定1×106个pbmc/ml血液。[0986]在本文包括使细胞与反转录病毒颗粒接触的任何方面中，在反应中存在足够的反转录病毒颗粒以获得0.1至50、0.5至50、0.5至20、0.5至10、1至25、1至15、1至10、1至5、2至15、2至10、2至7、2至3、3至10、3至15、或5至15或至少0.1、0.5、1、2、2.5、3、5、10或15的moi，或获得至少0.1、0.5、1、2、2.5、3、5、10或15的moi。[0987]在本文包括基因修饰的t细胞和/或nk细胞的任何方面中，至少5％、至少10％、至少15％或至少20％的t细胞和/或nk细胞是基因修饰的，或5％至85％之间，或5％至20％、25％、50％、60％、70％、80％或85％之间，或者在作为范围的低端的5％、10％、15％、20％或25％至作为范围的高端的20％、25％、50％、60％、70％、80％或85％之间。[0988]在本文包括rip的任何方面中，rip是慢病毒颗粒。在另外的说明性实施例中，修饰的细胞是修饰的t细胞或修饰的nkt细胞。[0989]在本文包括包含一个或多个转录单元的聚核苷酸的任何方面中，所述一个或多个转录单元可以编码包含car的多肽。在一些实施例中，car是微环境受限的生物(mrb)-car。在其它实施例中，car的astr结合至肿瘤相关抗原。在其它实施例中，car的astr是微环境受限的生物(mrb)-astr。[0990]在某些实施例中，本文提供的包括包含与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接的核酸序列的聚核苷酸的任何方面和实施例，所述聚核苷酸编码至少一种多肽淋巴增生性元件。在说明性实施例中，多肽淋巴增生性元件是本文公开的任何多肽淋巴增生性元件。在一些实施例中，本文提供的任何或全部的核酸序列可以与核糖开关可操作地连接。在一些实施例中，核糖开关能够结合核苷类似物。在一些实施例中，核苷类似物是抗病毒药物。[0991]在本文提供的包括rip的任何方面中，在一些实施例中，rip在其表面上包含核酸，所述核酸编码由经生物验证的单克隆抗体识别的结构域。[0992]在本文包括反应混合物中的血细胞的任何方面的某些说明性实施例中，所述反应混合物中的血细胞是通过pbmc富集程序产生并包含pbmc的血细胞，或说明性实施例中的血细胞是pbmc。在说明性实施例中，包括pmbc富集的这类实施例不与其中反应混合物包括至少10％全血的实施例组合。因此，在本文的某些说明性实施例中，反应混合物中的血细胞是来自pbmc富集程序的pbmc细胞级分，向其中添加反转录病毒颗粒以形成反应混合物，并且在其它说明性实施例中，反应混合物中的血细胞来自全血，向全血中添加反转录病毒颗粒以形成反应混合物。[0993]在本文提供的包括或任选地包括编码抑制性rna分子的核酸序列的任何方面和实施例中，抑制性rna分子靶向例如在本文的抑制性rna分子部分中鉴定的任何基因(例如，编码mrna的)靶。[0994]在本文提供的试剂盒、递送溶液和/或细胞制剂中的任一个的说明性实施例中，尤其是那些对肌内递送(并且在说明性实施例中皮下递送)有效或适于肌内递送(并且在说明性实施例中皮下递送)的实施例中，递送溶液和/或细胞制剂是储库制剂，或者细胞制剂是促进细胞聚集的细胞的乳液。在一些实施例中，储库递送溶液包含有效量的藻酸盐、水凝胶、plga、交联的透明质酸和/或聚合物透明质酸、peg、胶原和/或葡聚糖，以形成储库制剂。在一些实施例中，递送溶液和/或细胞制剂被设计用于受控释放或延迟释放。在一些实施例中，递送溶液和/或细胞制剂包括形成人工胞外基质如水凝胶的组分。[0995]在本文提供的包括或任选地包括细胞混合物、递送溶液或细胞制剂的任何方面和实施例中，所述细胞混合物、递送溶液或细胞制剂可以具有ph和离子组合物，所述ph和离子组合物提供这样的环境，在该环境中细胞可以存活例如持续至少1小时，并且通常可以存活持续至少4小时。在一些实施例中，ph可以在ph 6.5至ph 8.0、ph 7.0至ph 8.0或ph 7.2至ph 7.6之间。在一些实施例中，例如，当rip具有编码mrb-car的多核苷酸时，ph可以在ph 6.0至ph 7.0之间，例如ph 6.2至ph 7.0,或ph 6.4至ph 7.0,或ph 6.4至ph 6.8。在一些实施例中，细胞混合物、递送溶液或细胞制剂可以通过缓冲液如磷酸盐缓冲液或碳酸氢盐维持，所述缓冲液以有效维持目标范围内的ph的浓度存在。在一些实施例中，细胞混合物、递送溶液或细胞制剂可以包括具有例如0.8至1.0或约0.9或0.9％的盐如氯化钠的盐的盐水组合物。在一些实施例中，递送溶液是pbs或包括pbs。在本文的递送溶液和所得的细胞制剂的一些实施例中，na+的浓度在110mm至204mm之间，cl-的浓度在98mm至122mm之间，和/或k+的浓度在3mm至6mm之间。[0996]在本文提供的任何试剂盒、递送溶液和/或细胞制剂的说明性实施例中，尤其是那些对肌内递送(并且在说明性实施例中皮下递送)有效或适于肌内递送(并且在说明性实施例中皮下递送)的实施例中，递送溶液包含本文公开的一种或多种组分，例如分子(离子)、大分子(例如，dna、rna、肽和多肽)和/或其它细胞，其可以影响基因修饰的t细胞和/或nk细胞，例如本文提供的基因修饰的t细胞和/或nk细胞。因此，在一些实施例中，本文提供的递送溶液和/或细胞制剂包含有效量的抗原，如本文进一步详细讨论的。在一些实施例中，此类制剂不包括经基因修饰的t细胞和/或nk细胞。在说明性实施例中，此类制剂包括基因修饰的t细胞和/或nk细胞(特别是在本文的方面和其它实施例中提供的那些)，或与包括基因修饰的t细胞和/或nk细胞(特别是在本文的方面和其它实施例中提供的那些)的制剂共同施用。在一些实施例中，本文提供的递送溶液和/或细胞制剂包括有效量的一种或多种细胞因子，如il-2、il-7、il-15、il-21,或其适于皮下递送和/或保留细胞因子活性的修饰的形式。在说明性实施例中，此类修饰的细胞因子能够结合至细胞因子的天然受体(例如，野生型受体)和活化细胞因子的天然受体(例如，野生型受体)。在说明性实施例中，修饰的细胞因子具有优先偏置的细胞因子活性。在一些实施例中，细胞制剂和/或递送溶液包含有效量的能够结合cd2、cd3、cd28、ox40、4-1bb、icos、cd9、cd53、cd63、cd81和/或cd82的抗体或多肽。在一些实施例中，这些细胞因子、抗体或多肽与水凝胶的组分交联。在一些实施例中，连同此类其它组分一起递送的修饰的t细胞包括编码car和le的多核苷酸，并且在说明性实施例中，多核苷酸编码car,但不编码淋巴增生性元件。在说明性实施例中，递送溶液和/或细胞制剂不含dmso，并且从未冷冻过。在一些实施例中，细胞制剂在递送装置内，所述递送装置与人类受试者的肌内或皮下递送相容、适合于人类受试者的肌内或皮下递送或对人类受试者的肌内或皮下递送有效。在一些实施例中，此类装置具有针，所述针具有如本文所提供的有效用于肌内或皮下递送细胞的尺寸。一旦皮下递送，在本文提供的任何方面和实施例中的皮下制剂就形成包含修饰的淋巴细胞和/或til的皮下反应混合物。在一个方面中，本文提供了一种皮下反应混合物，所述皮下反应混合物包含本文提供的修饰的淋巴细胞中的任一个和本文提供的一种或多种其它细胞制剂组分。因此，在一些方面中，本文提供了一种皮下反应混合物，所述皮下反应混合物包含本文提供的修饰的t细胞和/或nk细胞、或经基因修饰的t细胞和/或nk细胞、和/或til和i)细胞因子、ii)能够结合cd2、cd3、cd28、ox40、4-1bb、icos、cd9、cd53、cd63、cd81和/或cd82的抗体或多肽和/或iii)由car识别的同源抗原的来源。此类组合物可以包括本文提供的其它或特异性皮下制剂组分中的任一种。在一些实施例中，皮下反应混合物包含嗜中性粒细胞。在一些实施例中，皮下反应混合物包含人工基质。在一些实施例中，人工基质包含透明质酸和/或胶原。在一些实施例中，皮下反应混合物中至少25％、50％、75％或90％的cd4+细胞和/或cd8+细胞是表面cd3-。[0997]在说明性实施例中，递送溶液和包含该递送溶液的细胞制剂含有钙和/或镁。钙的浓度可以例如在0.5mm至2mm之间。镁的浓度可以例如在0.5mm至2mm之间。在一些实施例中，递送溶液不含钙和镁。[0998]在一些实施例中，递送溶液和细胞制剂含有人血清白蛋白和/或肝素。在一些实施例中，递送溶液和细胞制剂含有高达5％的hsa。在一些实施例中，递送溶液是包含2％hsa的pbs。在一些实施例中，递送溶液是包含2％hsa的dpbs。在一些实施例中，递送溶液是包含30-100u/ml、40-100u/ml、30-60u/ml或60-80u/ml肝素的盐水溶液，含有或不含0.5-5％、1-5％或1-2.5％hsa。[0999]在一些实施例中，递送溶液为或包括适合于注射到受试者中的多电解质溶液。在一些实施例中，递送溶液可以是或包括在容器(例如单剂量容器)中的无菌的、无热原的等渗溶液。在某些实施例中，这类溶液适合于或适于静脉内施用或腹膜内施用以及皮下和/或肌内施用。在一些实施例中，递送溶液可以包括用于注射到受试者中的多分析物溶液，其中每100ml含有526mg的氯化钠，usp(nacl)；502mg的葡萄糖酸钠c6h11nao7)；368mg的醋酸钠三水合物，usp(c2h3nao2·3h2o)；37mg的氯化钾，usp(kcl)；和30mg的氯化镁，usp(mgcl2·6h2o)，其中ph被调节至7.4(6.5至8.0)。在说明性实施例中，递送溶液不含抗微生物剂。在一些实施例中，用氢氧化钠调节ph。在一些实施例中，多电解质注射溶液可以是可从各种商业供应商获得的ph 7.4的plasma-lyte a注射液。[1000]在一些实施例中，递送溶液或细胞制剂包括形成人工胞外基质如水凝胶的组分。在一些实施例中，贮库递送溶液包含有效量的藻酸盐、胶原和/或葡聚糖以形成贮库制剂。在一些实施例中，用于制备形成凝胶的生物材料并且可以被包括在本文提供的递送溶液和细胞制剂中的聚合物由聚(乙二醇)(peg)及其与脂肪族聚酯的共聚物组成，所述脂肪族聚酯为例如聚(乳酸)(pla)、聚(d,l-乳酸-共-羟基乙酸)(plga)、聚(ε-己内酯)(pcl)和聚膦腈。在一些实施例中，用于制备形成凝胶的生物材料并且可以被包括在本文提供的递送溶液和细胞制剂中的聚合物包括基于聚(n-(2-羟丙基甲基丙烯酰胺乳酸酯)和聚(乙二醇)(p(hpmam-lac)-peg)的热敏三嵌段共聚物，其能够在生理环境中自发自组装(vermonden等人,2006年,langmuir 22:10180-10184)。[1001]在一些实施例中，在本文的递送溶液或细胞制剂中使用的水凝胶含有透明质酸(ha)。这类ha可以具有可被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-1-碳二亚胺盐酸盐修饰的羧酸基团，以优选在n-羟基琥珀酰亚胺的存在下与蛋白质、肽、聚合物和连接子上的胺基团反应，如在本文提供的被修饰的淋巴细胞上发现的那些。在一些实施例中，在本文提供的一些细胞制剂实施例中，抗体、细胞因子和肽可以使用这类方法与ha化学缀合以产生作为细胞乳剂共注射的水凝胶。此外，在一些实施例中，递送溶液和细胞制剂中的ha是聚合物(例如，healon)和/或被交联(例如瑞蓝玻尿酸(restylane)(abbive/allergan))，例如通过其-oh基团与试剂(例如戊二醛)轻度交联，以减少在皮下注射后材料的局部分解代谢。在一些实施例中，在本文的递送溶液和细胞制剂中使用的ha可以具有可变的长度和粘度。在一些实施例中，在本文的递送溶液和细胞制剂中使用的ha可以进一步与其它糖胺聚糖如硫酸软骨素(例如viscoat)或聚合物或表面活性剂交联。本领域技术人员将认识到，可以调节基质的孔隙率和交联度，以确保细胞(例如本文中的修饰的淋巴细胞)能够迁移通过水凝胶。因此，当在本文的细胞制剂中使用时，基质如水凝胶基质可以被配置为用于或适于允许细胞迁移通过基质。在一些实施例中，剪切模量为或为约2.5kpa、约3kpa、约3.5kpa或约4kpa。[1002]在一些实施例中，所述细胞制剂包含已被耗尽或基本上被耗尽的血细胞，或其中表达靶抗原的至少50、60、75、80、90、95或99％的细胞已被耗尽。在一些实施例中，靶抗原是由car识别的抗原。在一些实施例中，使用本文提供的任何耗尽方法耗尽细胞。[1003]在一些实施例中，用与重组核酸载体(在说明性实施例中，重组反转录病毒颗粒)缔合的第二修饰的淋巴细胞或其群体来配制细胞制剂，所述重组核酸载体包含多核苷酸，所述多核苷酸包含一个或多个转录单元，所述一个或多个转录单元与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接，或用所述聚核苷酸进行基因修饰，其中所述一个或多个转录单元编码第二多肽，所述第二多肽包含car，所述第二car识别由第一car识别的肿瘤抗原的不同表位或识别与第一car不同的肿瘤抗原。在说明性实施例中，修饰的淋巴细胞包括修饰的t细胞和/或nk细胞。[1004]在一些实施例中，本文提供了一对细胞制剂，或一对重组核酸载体(在说明性实施例中，复制缺陷型反转录病毒颗粒)用于制备这类细胞制剂对的用途，其中所述一对细胞制剂的每个细胞制剂用修饰的淋巴细胞的群体配制，每个群体与不同的重组核酸载体(在说明性实施例中为不同的重组反转录病毒颗粒)缔合，每个群体包含不同的多核苷酸，所述多核苷酸包含一个或多个转录单元，所述转录单元与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接，或用所述多核苷酸进行基因修饰，其中每个群体的一个或多个转录单元编码不同的多肽，所述多肽包含识别相同肿瘤抗原的不同表位或各自识别不同肿瘤抗原的不同car。[1005]在一些实施例中，本文提供的递送溶液和/或细胞制剂包含如本文提供的聚集剂。在一些实施例中，递送溶液和/或细胞制剂包含细胞基质，例如透明质酸基质和/或胶原基质。这类细胞制剂可以是离体细胞制剂或定位在受试者的肌肉内或皮下的体内细胞制剂。在说明性实施例中，透明质酸和/或胶原基质位于皮下，并且在一些实施例中，这类基质是在受试者中发现的天然皮下基质。当包括外源性淋巴细胞例如如本文提供的肿瘤浸润淋巴细胞和/或修饰的淋巴细胞，任选地包括本文提供的其它细胞制剂组分时，在受试者皮下发现或定位的这类基质可以被认为是人工淋巴结。因此，本文提供的用于向受试者皮下施用细胞制剂的方法，其中所述细胞制剂包含聚集剂和/或细胞基质，和/或其中仅包含受试者的天然基质组分的基质围绕经皮下递送的修饰的淋巴细胞形成，可以被称为用于形成人工淋巴结的方法，并且这类所得的结构可以被视为人工淋巴结。在一些实施例中，所述组合物包含位于皮下的人工基质如透明质酸和/或胶原基质中的修饰的t细胞和/或nk细胞和/或til。[1006]在一些实施例中，不合需要的细胞可以是表位掩蔽靶细胞，其表达car和car结合的抗原。在一些实施例中，在使用本文提供的方法对细胞进行基因修饰之后，可以通过使表位掩蔽靶细胞与car-t细胞接触来耗尽、去除或杀死所述表位掩蔽靶细胞，所述car-t细胞将car表达至在本文提供的方法中靶细胞不掩蔽的不同表位或抗原。在这些实施例中，这类第一car和第二car可以被称为car对。在一些实施例中，表达两种或更多种分离的car的细胞，以及在说明性实施例中在两个细胞群体中表达的两种car，可以用于杀死仅掩蔽表位之一的表位掩蔽靶细胞。在一些实施例中，分别转导或转染两个细胞群体，使得每个群体表达第一car或第二car。在说明性实施例中，表达第一或第二car的表位掩蔽靶细胞不掩蔽第二和第一car分别结合的表位。在一些实施例中，第一和第二car可以结合至在表位掩蔽靶细胞上表达的相同抗原的不同表位。在其它实施例中，第一和第二car可以结合至在相同表位掩蔽靶细胞上表达的不同抗原，包括本文其它处公开的任何抗原。在一些实施例中，第一和第二car可以结合至选自cd19、cd20、cd22、cd25、cd32、cd34、cd38、cd123、bcma、taci或tim3的不同抗原的不同表位或不同抗原。在一些实施例中，在本文的试剂盒中提供了含有单独的聚核苷酸的两个容器，所述聚核苷酸各自编码针对在相同靶细胞上表达的两个不同表位或抗原的car对中的一个car。在其它实施例中，一个car可以是与癌症抗原结合的胞外配体或受体，并且另一个可以是衍生自抗体片段的car。在其它实施例中，两个car都可以是针对不同癌症抗原的胞外配体或受体。在一个实例中，car是bcma，并且april是针对taci和bcma受体的配体结合蛋白。在另外的说明性实施例中，第一car可以结合至cd19，并且第二car可以结合至cd22，二者都在b细胞和淋巴瘤上表达。在说明性实施例中，分别配制表达第一car的修饰的细胞群体和表达第二car的修饰的细胞群体。在一些实施例中，将单独的细胞制剂在不同位点引入或再引入回到受试者中。在一些实施例中，将单独的细胞制剂在相同位点单独引入或再引入回到受试者中。在其它实施例中，将修饰的细胞群体组合成一种制剂，任选地将其引入或再引入回到受试者中。在其中细胞群体被组合的说明性实施例中，细胞群体直到洗涤步骤之后才被组合，在洗涤步骤中，细胞被从重组核酸载体上洗掉。[1007]在本文包括修饰的或基因修饰的t细胞或nk细胞或用于产生它们的试剂盒或组合物的任何方面的一些实施例中，表达car的基因修饰的t细胞和/或nk细胞的增殖和存活可以通过将car的astr结合的抗原加入到包含基因修饰的t细胞和/或nk细胞的组合物如细胞制剂或环境如皮下环境或肌内环境中来促进。在某些说明性实施例中，用编码car的核酸对基因修饰的t细胞和/或nk细胞进行基因修饰，但不用编码le的核酸进行基因修饰。在一些实施例中，在本文提供的细胞制剂和方法中，可以将抗原添加到包含修饰的和/或基因修饰的t细胞和/或nk细胞的细胞制剂中，或与它们共同施用。在一些实施例中，抗原是蛋白质抗原。在一些实施例中，抗原是编码蛋白质抗原的mrna。在一些实施例中，抗原可以是可溶性的。在一些实施例中，抗原可以被固定在人工基质如水凝胶的表面上。在说明性实施例中，抗原可以在靶细胞的表面上表达。在一些实施例中，这类靶细胞大量存在于全血中，并且天然存在于细胞制剂中而不必添加。在一些实施例中，全血中存在的b细胞、分离的tnc和细胞制剂中天然存在的分离的pbmc可以是表达针对cd19或cd22的car的t细胞和/或nk细胞的靶细胞，这两种细胞都在b细胞上表达。在其它实施例中，这类靶细胞不存在于全血中或不大量存在于全血中，并且需要外源性地添加到本文提供的细胞制剂中。在一些实施例中，可以使用本领域中已知的方法从受试者，例如从肿瘤样品中分离或富集靶细胞。在其它实施例中，修饰来自受试者的细胞以表达靶抗原。在说明性实施例中，在靶细胞上表达的抗原可以包括含有该抗原的全部或部分蛋白质。在另外的说明性实施例中，在靶细胞上表达的抗原可以包括包含该抗原的蛋白质的全部或部分胞外结构域。在一些实施例中，在靶细胞上表达的抗原可以是与将它锚定到细胞表面的跨膜结构域的融合物。在一些实施例中，可以使用本文其它处公开的任何跨膜结构域。在一些实施例中，在靶细胞上表达的抗原可以是与柄结构域的融合物。在一些实施例中，可以使用本文其它处公开的任何柄结构域。在说明性实施例中，抗原可以是与cd8柄和跨膜结构域的融合物(seq id no:24)。[1008]在一些实施例中，用编码抗原的重组核酸载体修饰第一细胞混合物中的细胞并且在说明性实施例中修饰来自受试者的第一细胞混合物中的细胞，并且修饰来自受试者的单独的第二细胞混合物中的细胞，且在说明性实施例中来自同一受试者的第二混合物中的细胞，以表达结合抗原的car。在另外的说明性实施例中，细胞混合物中的任一种或两种是全血、分离的tnc或分离的pbmc。在说明性实施例中，第一细胞混合物可以用编码her2的胞外结构域和pdgf的跨膜结构域的融合蛋白的重组核酸载体修饰，并且第二细胞混合物可以用编码针对her2的car的重组核酸载体修饰。然后可以将细胞配制成递送溶液以形成细胞制剂。因此，在一个方面中，本文提供了一对这类细胞混合物或一对细胞制剂，其各自包含细胞混合物或细胞制剂中的一种，其通常在本文提供的用于保持细胞制剂的任何脉管如细胞袋中物理分离。任选地，以不同的car效应细胞与靶细胞的比率向受试者施用细胞制剂。在一些实施例中，在配制或施用时效应细胞与靶细胞的比率为或为约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。在说明性实施例中，抗原与修饰的t细胞和/或nk细胞皮下或肌内共同给药。[1009]在本文包括修饰或基因修饰的t细胞或nk细胞或者用于基因修饰t细胞和/或nk细胞的方法、组合物和试剂盒的任何方面的一些实施例中，在不存在与它们的同源抗原结合的car分子的情况下，通过在基因修饰的t细胞或nk细胞内交联car分子，可以促进表达car的基因修饰的t细胞和/或nk细胞的增殖和存活。因此，在一些实施例中，t细胞或nk细胞可以包含由抗体结合并与同一t细胞或nk细胞上的第二car的表位标签交联的表位标签。在一些实施例中，car的胞外结构域可以包括表位标签。在说明性实施例中，表位标签可以在柄结构域中。在一些实施例中，表位标签可以是his5(hhhhh；seq id no:76)、hisx6(hhhhhh；seq id no:77)、c-myc(eqkliseedl；seq id no:75)、flag(dykddddk；seq id no:74)、strep标签(wshpqfek；seq id no:78)、ha标签(ypydvpdya；seq id no:73)、ryirs(seq id no:79)、phe-his-his-thr(seq id no:80)或weaaareaccreccara(seq id no:81)。在说明性实施例中，表位标签可以是hisx6标签(seq id no:77)。在一些实施例中，可以通过添加结合表位标签的可溶性抗体或抗体模拟物，或在说明性实施例中通过添加在其表面上表达结合表位标签的抗体或抗体模拟物的细胞(本文也被称为通用饲养细胞)来交联和活化car。在一些实施例中，相同的通用饲养细胞(例如表达抗hisx6抗体的通用饲养细胞)可以与表达与不同抗原结合但包括相同表位标签(例如hisx6)的car的细胞一起使用。在一些实施例中，car可以通过添加编码一种或多种结合表位标签的抗体或抗体模拟物的mrna进行交联和活化。在一些实施例中，mrna可以编码可溶的、膜结合的或可溶的和膜结合的两者的抗体或抗体模拟物。[1010]在一个方面中，本文提供了一种细胞制剂(即递送组合物)，其包含用肿瘤浸润淋巴细胞(til)和/或修饰的或未修饰的淋巴细胞(在说明性实施例中t细胞和/或nk细胞)配制的递送溶液，其中所述细胞制剂与皮下或肌内递送相容、对皮下或肌内递送有效和/或适于皮下或肌内递送。在本文提供的用于细胞制剂中的任何一种的一些实施例中，所述细胞制剂在受试者中定位于皮下，或所述细胞制剂的大部分定位于皮下。在一些实施例中，细胞制剂在受试者中定位于皮下或肌内，或大部分细胞制剂在受试者中定位于皮下或肌内。在一些实施例中，其中所述细胞制剂包含til，所述细胞制剂可以进一步包含修饰的淋巴细胞，所述被修饰的淋巴细胞通过以下中的任一种或两种修饰：与包含聚核苷酸的重组核酸载体(在说明性实施例中rip)缔合，所述聚核苷酸包含一个或多个转录单元，所述转录单元与在t细胞和/或nk细胞中有活性的启动子可操作地连接；或通过用所述聚核苷酸基因修饰，其中所述一个或多个转录单元编码包含第一car的第一多肽。在一些实施例中，其中所述细胞制剂包含til，所述细胞制剂进一步包含由til识别的肿瘤抗原的来源。在一些实施例中，til与核酸载体接触。[1011]除了本文提供的任何方法方面和实施例之外，本文进一步提供了用途方面和实施例，包括试剂盒用于进行所述方法的用途，或核酸载体(在说明性实施例中rip)在制备用于进行所述方法的试剂盒中的用途，其中试剂盒的用途是进行所述方法方面或实施例的步骤。例如，在一个方面中，本文提供了一种用于制备细胞制剂的方法，其包括在接触步骤中包括核酸载体(并且在说明性实施例中rip)的c/f步骤。此类方法可以任选地包括上述施用步骤或本文的任何施用步骤。因此，本文进一步提供了核酸载体(并且在说明性实施例中，复制缺陷型重组反转录病毒颗粒)在制造用于制备细胞制剂的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒的用途包括执行c/f步骤和任选的“a”步骤。类似地，对于本文提供的任何用途方面和实施例，本文进一步提供了方法方面和实施例，包括如用途方面或实施例中所叙述的方法。[1012]以下非限制性实例仅借助于说明例示性实施例而提供，且绝不限制本公开的范围及精神。此外，应理解，本文所公开或主张的任何发明涵盖本文所描述的任何一个或多个特征的所有变体、组合及排列。任何一个或多个特征可明确地自权利要求排除，即使未在本文中明确地阐述特定排除。还应理解，除非所属领域的一般技术人员将理解，否则根据本文公开的特定方法或所属领域中已知的其它方法，用于方法中的试剂的公开内容意图与(及为其提供支持)涉及试剂的用途的方法同义。另外，除非所属领域的一般技术人员将理解，否则说明书和/或权利要求公开一种方法，本文所公开的试剂中的任一或多个可用于所述方法。[1013]实例[1014]实例1.用于转导实验的材料和方法[1015]本实例提供用于本文中的后续实例中所公开的实验中的材料和方法。300mm nacl ph 8.0的最终产物。在装载到mustang-q树脂(pall)上并用2m nacl洗脱后，用pbs乳糖稀释病毒，并由tff按照上述进行处理。[1022]通过连续稀释来滴定慢病毒颗粒且通过转导至293t和/或jurkat细胞中来分析转基因表达，且使用lenti-xtmqrt-pcr滴定试剂盒(#631235)或来自takara的p24分析法elisa试剂盒(lenti-xtmp24快速滴定试剂盒#632200)，通过用于慢病毒基因组的facs或qpcr来分析转基因表达。拷贝数针对含有慢病毒和人类rnasep的靶序列的质体标准品进行校准。[1023]实例中使用的基因组质体。[1024]以下慢病毒基因组载体编码如所指示的相关基因和特征：[1025]f1-3-23编码包含抗cd19scfv、cd8柄和跨膜区以及来自cd3z的胞内结构域和随后的t2a和etag的cd19 car(acd19:cd8:cd3z-t2a-etag)。[1026]f1-3-247编码cd19 car和多肽淋巴增生性元件，所述多肽淋巴增生性元件由以下组成：kozak型序列gccgccaccat/ug(g)(seq id no:331)的氨基至羧基末端，其在“t/u”残基处具有t并且具有任选的最后一个g，cd8信号肽malpvtalllplalllhaarp(seq id no:72)(其中来自kozak型序列的序列atgg也编码cd8信号肽的前四个核苷酸)，flag-tag(dykddddk；seq id no:74)，连接子(gstsgs；seq id no:349)、抗cd19scfv、cd8柄和跨膜区以及来自cd3z的胞内结构域，随后是t2a和包括e006-t016-s186-s050部分的淋巴增生性元件，所述e006-t016-s186-s050部分编码包含包括亮氨酸拉链模体和etag的c-jun的变体的胞外结构域、csf2ra的跨膜结构域、mpl的胞内结构域和cd40的胞内结构域，其中淋巴增生性元件的每个部分通过ggs连接子连接。[1027]f1-3-635编码具有发散的转录单元的双顺反子慢病毒基因组载体，其具有图10中示意图所示的一般结构。第一转录单元在nfat响应的最小il-2启动子的控制下编码淋巴增生性元件e006-t016-s186-s050，所述最小il-2启动子全部以反向方向编码。第二转录单元编码由抗-cd19scfv、cd8柄和跨膜区以及来自cd3z的胞内结构域组成的cd19 car。第一转录单元和第二转录单元在反向方向上通过b-血红蛋白polya间隔子a(seq id no:357)分离。[1028]f1-3-637编码具有发散的转录单元的双顺反子慢病毒基因组载体，其具有图10中示意图所示的一般结构。第一转录单元在nfat响应的最小il-2启动子的控制下编码淋巴增生性元件e006-t016-s186-s050，所述最小il-2启动子全部以反向方向编码。第二转录单元编码由抗-cd19scfv、cd8柄和跨膜区以及来自cd3z的胞内结构域组成的cd19 car。第一转录单元和第二转录单元在正向方向上由250chs4隔离子(seq id no:358)分离。[1029]f1-3-748编码具有发散的转录单元的双顺反子慢病毒基因组载体，其具有图10中示意图所示的一般结构。第一转录单元在nfat响应的最小il-2启动子的控制下编码淋巴增生性元件e016-t016-s186-s050，所述最小il-2启动子全部以反向方向编码。第二个转录单元编码cd19 car，其由抗-cd19scfv、cd8柄和跨膜区以及来自cd3z的胞内结构域，随后是t2a荧光素酶和萤火虫荧光素酶组成。第一转录单元和第二转录单元在正向方向上由250chs4隔离子(seq id no:358)分离。[1030]f1-4-713编码具有发散的转录单元的双顺反子慢病毒基因组载体，其具有图10中示意图所示的一般结构。第一转录单元在nfat响应的最小il-2启动子的控制下编码淋巴增生性元件e006-t016-s186-s050，所述最小il-2启动子全部以反向方向编码。第二转录单元编码由抗-cd19scfv、cd8柄和跨膜区以及来自cd3z的胞内结构域组成的cd22 car。第一转录单元和第二转录单元在正向方向上由250chs4隔离子(seq id no:358)分离。[1031]f1-5-221编码膜结合的cd19蛋白嵌合体，所述膜结合的cd19蛋白嵌合体由人cd19胞外结构域、跨膜结构域和由ef1-a启动子驱动的人pdgfr的胞内结构域的前5个氨基酸组成。[1032]f1-6-744编码具有发散的转录单元的双顺反子慢病毒基因组载体，其具有图10中示意图所示的一般结构。第一转录单元在nfat响应的最小il-2启动子的控制下编码淋巴增生性元件e016-t016-s186-s050，所述最小il-2启动子全部以反向方向编码。第二转录单元编码her2 car，所述her2 car由抗her2scfv、cd8柄和跨膜区、cd137胞内结构域和来自cd3z的胞内活化结构域，随后是t2a和etag组成。第一转录单元和第二转录单元在正向方向上由250chs4隔离子(seq id no:358)分离。[1033]实例中使用的所有小鼠均按照机构动物护理和使用委员会批准的方案处理。[1034]实例2.通过将全血暴露于重组反转录病毒颗粒4小时，然后通过过滤分离tnc，对未受刺激的淋巴细胞进行有效的基因修饰。[1035]通过反应混合物的4小时培育来有效地基因修饰未受刺激的人类t细胞(包括nkt细胞)，所述反应混合物包括全血和由vsv-g假型化的反转录病毒颗粒且在其表面上显示t细胞活化元件。随后在白细胞减少过滤器上从转导反应混合物中捕获总有核细胞(tnc)，洗涤，并通过白细胞减少过滤器总成的反向灌注收集。细胞处理工作流程如图1d所示，除了不进行170d和180d的任选步骤，将步骤160d的最终细胞置于培养物中，并且只有部分过程在封闭系统中进行。使用流式细胞术通过etag的表达来评估cd3+细胞的转导。[1036]如实例1中所述，通过深度过滤、tff、benzonase处理、渗滤和调配的组合来纯化病毒上清液，以产生以下用于本实例的不含非人类动物蛋白的基本上纯的病毒颗粒：用vsv-g假型化并展示t细胞活化元件的f1-3-23，ucht1-scfvfc-gpi(f1-3-23gu)。[1037]购买在vacutainer管中的三份10ml新鲜全血液样品品(stemexpress，san diego)，每ml血液中含有16个usp单位的na-肝素，并在50ml锥形瓶中混合。在moi为5的情况下(假设1×106个pbmc/ml血液)，将重组慢病毒颗粒f1-3-23gu(2.9ml)直接添加到30ml的全血液样品品中，以启动慢病毒颗粒与全血中淋巴细胞的接触，并在37℃、5％co2下且在每小时温和混合下培育4小时以破坏任何沉淀。在培育4小时后，根据制造商的说明书，使用血液过滤系统(cook regentec)(一种白细胞减少过滤器总成)，通过处理血液来分离tnc。然后通过将90ml的dpbs+2％hsa通过白细胞减少过滤器总成来洗涤tnc。通过用20ml的x-vivo15再灌注将tnc回收到烧瓶中。然后在t75烧瓶中在37℃和5％co2下培养tnc。任何时候都不向样品中添加外源性细胞因子。在第7天收集样品，以基于活细胞上的etag和cd3表达来确定转导效率，如使用基于前向和侧向散射的淋巴细胞门通过fac分析所确定的。[1038]图5示出了在转导全血后第7天cd3+etag+细胞的facs概况。与前面实例中的令人惊讶的结果一致，用vsv-g假型化并展示抗d3-scfvfc的反转录病毒颗粒与含na-肝素的全血培育4小时足以有效地对淋巴细胞进行基因修饰。此外，使用白细胞减少过滤器总成的快速tnc分离步骤可有效分离包括转导的cd3+t细胞和nkt细胞的tnc，如通过17.99％的对cd3和etag的染色阳性的淋巴细胞所证明的。[1039]实例3.与静脉内递送相比，皮下递送修饰的pbmc显著增强了car细胞植入和肿瘤杀伤。[1040]在本实例中，使用例示性方法来修饰从新鲜分离的全血富集的未刺激的pbmc以表达car和le，并在采血后约13小时内向小鼠施用。细胞处理工作流程如图1a所示，除了不执行170a的任选步骤，并且仅在封闭系统中执行步骤120a和130a。令人惊讶的是，与静脉内注射相比，通过皮下注射递送被修饰的pbmc显著增强了car细胞植入和体内肿瘤杀伤。[1041]材料与方法[1042]编码用vsv-g假型化的f1-3-247并展示t细胞活化元件，ucht1-scfvfc-gpi(f1-3-247gu)的重组慢病毒颗粒通过使用5质体方案在6.6升中等规模转染f1xt细胞来生产，并且通过深度过滤、tff、benzonase处理、渗滤和调配的组合来纯化，以产生如实例1所述的不含非人类动物蛋白的基本上纯的病毒颗粒。[1043]在知情同意的情况下，获得了来自2名健康志愿者的全血，并在单独的日期进行处理。将血液采集到多个100mm的vacutainer管中(becton dickenson；364606)，其包含1.5ml的柠檬酸葡萄糖酸溶液a抗凝血剂(acd外周血)。对于每名志愿者，汇集来自vacutainer管的血液(对于供体a为204ml，对于供体b为198ml)，并且分配至2个标准500ml采血袋中。[1044]为了富集pbmc，根据制造商的说明书，来自每个志愿者的2个血液袋中的血液在密闭系统中通过用ficoll-paquetm(general electric)使用cs-900.2试剂盒(biosafe；1008)密度梯度离心在sepax 2s-100装置(biosafe；14000)上，用2个洗涤周期依次处理，以从每次运行中获得45ml的分离的pbmc。sepax 2工艺中使用的洗涤溶液为生理盐水(chenixin pharm)+2％人血清白蛋白(hsa)(sichuan yuanda shuyang pharmaceutical)。最终的细胞再悬浮溶液为45ml的完全optmizertm ctstm t细胞扩增sfm(optmizertm ctstm t-细胞扩增基础培养基1l(thermo fisher，a10221-03)，其补充有26ml的optmizertm ctstm t细胞扩增补充剂(thermo fisher，a10484-02)、25ml的ctstm免疫细胞sr(thermo fisher，a2596101)和10ml的ctstm glutamaxtm-i抑制剂(thermo fisher，a1286001))。sepax 2机器上的每个处理步骤为约1小时20分钟。从供体a获得3×108个活pbmc，并且从供体b获得1.6×108个活pbmc。[1045]为了转导，将新鲜富集的pbmc接种在50ml的管中，并加入完全optmizertm ctstm t-细胞扩增sfm，以使细胞密度达到1.0×106个细胞/ml。在转导前，未添加抗cd3、抗cd28、il-2、il-7或其它外源性细胞因子来活化或以其它方式离体刺激pbmc。将f1-3-247gu病毒颗粒以1或5的moi(取决于样品)添加到未受刺激的pbmc中。转导反应混合物在标准加湿组织培养培育箱中在37℃和5％co2下培育四(4)小时。在4小时暴露后，细胞以400g沉淀10分钟，并通过将细胞在40ml的dpbs+2％hsa溶液中再悬浮并以400g离心10分钟洗涤3次，然后在5ml dpbs+2％hsa溶液中再悬浮并计数。[1046]作为体内研究的对照，通过体外测定来确定转导效率。将每种转导的1.0×106个细胞接种于24孔组织培养板的孔中，置于1ml的完全optmizertm ctstm t细胞扩增sfm中，并在37℃和5％co2的标准加湿组织培养培育箱中培育。任何时候都不向样品中添加外源性细胞因子。在第6天采集样品，以根据etag和cd3表达测定转导效率，如通过使用基于前向和侧向散射的淋巴细胞门的fac分析所测定的。[1047]对于体内研究，转导(或以其它方式修饰)的pbmc的样品以每200μl dpbs+2％has的1.0×106和5.0×106个pbmc重新悬浮用于给药。采集血液、富集pbmc、转导或以其它方式修饰pbmc以及制备用于给药的pbmc的总耗时对于供体a为12小时40分钟并且对于供体b为13小时。[1048]通过上述方法转导的效应pbmc体内肿瘤的增殖/存活和靶杀伤[1049]选择使用b-ndg小鼠的异种移植物模型，以探查用f1-3-247转导的人pbmc体内存活、增殖和杀伤表达cd19的肿瘤的能力。b-ndg是一种缺乏成熟t细胞、nk细胞和b细胞的小鼠的品系，并且是迄今为止所描述的免疫缺陷最严重的小鼠品系之一。通常进行免疫系统的这些细胞组分的去除，以使人pbmc能够植入，而没有来自宿主的先天的、体液的或适应性的免疫反应。在正常情况下，稳态细胞因子的浓度仅在人类接受放疗或淋巴耗尽化疗后出现，这是因为缺少鼠胞外共同γ链，而该链能够使过继转移的人类细胞接受这类细胞因子。同时，也可以利用这些动物来植入肿瘤异种移植物靶标，以检查car杀死靶标表达肿瘤的效力。虽然在效应细胞产物中存在异种反应性t细胞受体抗原最终将导致移植物抗宿主病，但这些模型能够对动物药理学和急性耐受性进行短期评估。[1050]利用表达内源性人cd19的raji细胞(atcc，manassas，va)提供抗原以刺激car效应细胞，并且生成均匀的靶肿瘤，以测定car效应细胞杀伤表达cd19的肿瘤的效果。在与matrigel人工基底膜联合皮下施用到nsg小鼠中的情况下，raji细胞迅速生长。[1051]在雌性nod-prkdcscidil2rgtm1/bcgen(b-ndg)小鼠(beijing biocytogen co.ltd.)的后腹建立皮下(sc)肿瘤异种移植物。简而言之，将培养的raji细胞在dpbs(thermo fisher)中洗涤，计数，重悬于冷dpbs中，并与适当体积的matrigel ecm(corning；最终浓度为5mg/ml)以0.5×106个细胞/200μl matrigel的浓度在冰上混合。在注射前，使用标准认可的脱毛(nair)麻醉为动物做好注射准备。将200μl的在ecm中的细胞悬浮液皮下注射到6周龄小鼠的后腹中。[1052]将来自供体a的修饰的pbmc静脉内递送至小鼠。在肿瘤接种后14天，通过尾静脉注射向携带raji肿瘤(其平均体积为150mm3)的小鼠静脉内给药200μl的来自供体a的pbmc，如下：ag1接受1×106个未转导的pbmc(n＝5)，ag2接受1×106个用moi为1的f1-3-247gu转导的pbmc(n＝6)，ag3接受5×106个用moi为1的f1-3-247gu转导的pbmc(n＝6)，ag4接受1×106个用moi为5的f1-3-247gu转导的pbmc(n＝6)，并且ag5接受5×106个用moi为5的f1-3-247gu转导的pbmc(n＝6)。[1053]来自供体b的修饰的pbmc经皮下而非静脉内被递送至小鼠。在肿瘤接种后18天，携带raji肿瘤(其平均体积为148mm3)的小鼠在与肿瘤相对的侧腹皮下给药100μl的来自供体b的pbmc，如下：bg1接受5×106个未转导的pbmc(n＝5)，bg2接受5×106个用moi为1的f1-3-247gu转导的pbmc(n＝5)，bg3接受1×106个用moi为5的f1-3-247gu转导的pbmc(n＝6)，并且bg4接受5×106个用moi为5的f1-3-247gu转导的pbmc(n＝6)[1054]每周使用卡尺测量肿瘤2或3次，并使用以下等式计算肿瘤体积:(最长直径*最短直径2)/2。在第7天(或第8天)、第14天、第21天、第28天和第35天，从每只小鼠收集约100μl的血液，用于facs和qpcr分析。[1055]结果[1056]从2名健康志愿者采集人类全血，并通过sepax 2s-100装置上的ficoll-paquetm富集pbmc。fac分析用于表征富集的pbmc的细胞组成，随后将其转导并体内递送至小鼠。表2示出了表达选择标记物的细胞的百分比。应当注意，除了t细胞和nk细胞，这些富集的pbmc包括分别来自供体a和b的6.9％和21.9％的cd14+细胞(巨噬细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞)，以及分别来自供体a和b的1.9％和9.8％的cd19+细胞(b细胞)。[1057]表2.表达选择标记物的新鲜富集的pbmc的百分比。[1058][1059]用f1-3-247gu对富集的pbmc进行基因修饰，以表达cd19的car和由ef1-α启动子组成性驱动的包括e006-t016-s186-s05部分(表1)的淋巴增生性元件。为了对pbmc进行基因修饰，将细胞与编码f1-3-247的慢病毒颗粒一起培育4小时，所述慢病毒颗粒是用vsv-g假型化的，并且在其表面上也显示出ucht1-scfvfc-gpi。在不存在外源性细胞因子的情况下，将每个转导反应的样品在体外培养6天，并使用流式细胞术以cd3+etag+活细胞的百分比测定转导效率。在1和5的moi下，来自供体a的pbmc的转导效率分别为4.5％和51.2％。在1和5的moi下，来自供体b的pbmc的转导效率分别为15.7％和24.8％。与前面的实例一致，这些结果表明pbmc被有效转导。[1060]对于本实例的体内组，向携带cd19肿瘤的b-ndg免疫缺陷小鼠给药经过4小时暴露于f1-3-247gu而被修饰的pbmc。在给药前，从未对这些pbmc进行扩增或以其它方式体外培养。而是，修饰的pbmc用于在从志愿者采集全血后13小时内对小鼠给药。传统上，来自供体a的修饰的pbmc通过静脉施用被给药，而来自供体b的修饰的pbmc在肿瘤相对侧皮下给药。[1061]在car-t给药后，每周检查一次这些转导的pbmc在体内植入的能力，持续最多五周。图6和7示出了如通过cd3+etag+细胞的流式细胞术检测到的每60μl血液的car-t细胞的数目。如图6所示，当与未转导的pbmc(ag1)相比时，用f1-3-247gu转导并静脉内递送的pbmc即使在5的moi下进行转导也未表现出明显的植入，并且递送了5×106个细胞(ag5)。相比之下，如图7所示，当用f1-3-247gu转导的pbmc经皮下递送时，在所有小鼠中观察到显著的植入。例如，在car-t给药后21天，在接受未转导的pbmc(bg1)的小鼠中，每60μl血液的car-t细胞的平均数目仅为103，但在各自接受转导的pbmc的bg2、bg3和bg4中分别为7.3×105、4.2×105和7.9×105个car-t细胞/60μl血液。[1062]随着时间的推移，检查了这些转导的pbmc在体内杀死已建立的raji肿瘤的能力。如图8所示，用f1-3-247gu转导并静脉内递送的pbmc可以表现出适度的抑制肿瘤进展的能力。这在样品ag2、ag4和ag5中可见。相比之下，如图9所示，用f1-3-247gu转导并经皮下递送的pbmc可以导致肿瘤负荷的显著降低。在bg2组、bg3组和bg4组中的所有小鼠中观察到这种肿瘤消退。[1063]这些结果共同证明，被分离、被离体操作以表达car和淋巴增生性元件并在初始采血后13小时内在体内递送的pbmc可以在体内植入并促进肿瘤消退。令人惊讶的是，与静脉内递送相比，皮下递送修饰的pbmc可以导致显著更好的植入和肿瘤消退。[1064]实例4.用编码双顺反子慢病毒基因组载体的重组反转录病毒颗粒转导活化的pbmc，以产生自驱动car。[1065]在本实例中，用来自实例3的两种代表性双顺反子载体(f1-3-635和f1-3-637)转导pbmc，并与两种单顺反子载体(f1-3-23和f1-3-247)进行比较。随着时间的推移，用表达用于cd19 car的cd19靶标的raji细胞反复刺激转导的pbmc。这种刺激导致淋巴增生性元件的诱导表达和转导细胞的扩增。[1066]在本实例中使用的构建体是f1-3-23、f1-3-247、f1-3-635和f1-3-637。重组慢病毒颗粒通过使用4载体包装系统瞬时转染30ml的f1xt产生，并如实例1所述通过peg沉淀纯化。将每份样品重悬浮在0.3ml的含3mg/ml hsa的pbs中。[1067]在第0天，根据制造商的说明书，使用ficoll-paque(ge healthcare life sciences)通过密度梯度离心从血沉棕黄层(san diego blood bank)中富集来自单个供体的pbmc，然后裂解红细胞。将1.5×106个存活的pbmc在3ml的完全optmizertm ctstm t细胞扩增sfm中接种到g-rex 6孔板(wilson wolf，80240m)的孔中，所述sfm补充有100iu/ml(il-2)、10ng/ml il-7和50ng/ml抗cd3抗体(317326，biolegend)，以活化pbmc用于进行病毒转导。在37℃和5％co2下培育过夜后，将包括上述构建体的慢病毒颗粒以5的moi直接添加到活化的pbmc中，并在37℃和5％co2下培育过夜。第二天，用完全optmizertm ctstm t细胞扩增sfm使每个孔中的培养基体积达到30ml，并将板放回培育箱。[1068]在第7天从每个孔中收集细胞，洗涤，并在1ml的完全optmizertm ctstm t细胞扩增sfm中以0.5×106个细胞再接种到g-rex 24孔板的孔中。将表达由cd19 car识别的cd19的1×106个raji添加到指定为“喂养”的样品中，或未将raji细胞添加到指定为“未喂养”的样品中。使用完全optmizertm ctstm t细胞扩增sfm使每个孔中的体积达到最多7ml。在此或后续细胞培养步骤中，未添加il-2、il-7或其它外源性细胞因子。每隔一天通过取出3ml的培养基并用含有1×106个raji细胞的新鲜培养基替换，将raji细胞添加到喂养的转导的pbmc样品中，直至第15天。在第15天转导的pbmc的细胞密度非常高，因此修改喂养方案。从第15天开始，将1.0×106个car+细胞再接种到新g-rex 24孔板的孔中，加入1×106个raji细胞，并用完全optmizertm ctstm t细胞扩增培养基使体积达到7ml。[1069]为了分析car+t和nk细胞的扩增，在每个时间点取出100ul的细胞并进行染色以用于cd3、etag和cd19 car表达。流式细胞术用于计数总的活细胞，以及表达cd3、etag和cd19 car的细胞的百分比。通过将淋巴细胞门中的总活细胞乘以cd3+car+细胞的百分比来计算总的cd3+car+细胞。etag％是从活的cd3+car+群体中测定的。[1070]结果[1071]在本实例中，用含有双顺反子慢病毒基因组载体的病毒颗粒转导活化的pbmc，所述双顺反子慢病毒基因组载体在反向方向的nfat应答性最小il-2启动子的控制下编码包含e标记的淋巴增生性元件e006-t016-s186-s050的第一转录单元，随后是隔离子，以及在正向方向的ef1-a启动子的控制下编码第一代cd19 car的第二转录单元。然后每隔一天用表达car靶标的细胞(在这种情况下为表达cd19的raji细胞)刺激这些转导的pbmc(本文中被称为“喂养”)，或保持未喂养。如图11所示，活化由第二转录单元表达的car导致由第二转录单元诱导表达e标记的淋巴增生性元件。在本实例中，表达etag的细胞的百分比在刺激后24小时增加，然后到刺激后48小时减少至接近原始百分比，此时通过喂养再次刺激细胞。六次喂养中的每一次都重复该模式。[1072]通过隔日喂养活化组成型表达的car导致e标记的淋巴增生性元件的诱导表达，其随后导致cd3+car+细胞的增殖。用f1-3-635转导的pbmc在23天内扩增超过15,000倍，如图12a所示。用f1-3-637转导的pbmc在23天内扩增超过3,000倍，如图12b所示。相比之下，用f1-3-23转导的pbmc(其具有cd19 car但缺乏淋巴增生性元件)在第23天扩增小于40倍，如图12c所示。用组成型表达淋巴增生性元件的f1-3-247转导的pbmc扩增了190,000倍，如图12d所示。值得注意的是，通过用f1-3-635、f1-3-637和f1-3-247转导的pbmc的最大扩增发生在第15天至第23天之间的8天期间。这可能是因为细胞在第15天之前处于高密度，并且在每次后续喂养时以1.0×106个car+细胞/孔再接种细胞，允许细胞有扩增的空间。相比之下，在没有添加细胞因子和通过喂养活化car的情况下，在用f1-3-635或f1-3-637转导的pbmc中未诱导淋巴增生性元件的表达，并且这些细胞的扩增(显示在图13中)和百分比活力(显示在图14中)不大于用f1-3-23转导的pbmc。然而，与用f1-3-23转导的细胞相比，用f1-3-247转导的pbmc(其组成型表达淋巴增生性元件)确实扩增到更大程度，并且从第10天到第23天，存活率保持在约50％。在未喂养的样品中，用f1-3-635或f1-3-637转导的pbmc显示出与第9天之前用f1-3-247转导的pbmc类似的初始扩增和百分比活力。这种效应可能是由于使用抗cd3抗体活化pbmc导致的nfat应答性启动子的转录，其通过cd3z活化nfat。[1073]本实例证明了包含具有发散的转录单元的双顺反子慢病毒基因组载体的病毒颗粒可以用于转导淋巴细胞以产生仅在抗原的存在下增殖和存活的自驱动car t细胞，所述发散的转录单元包含在car刺激的诱导型启动子的转录控制下编码淋巴增生性元件的第一转录单元和在组成型t细胞或nk细胞启动子的转录控制下编码car的第二转录单元。因此，自驱动car t细胞会对抗原表达细胞产生免疫应答，并且当自驱动car t细胞消除并耗尽抗原表达细胞以刺激car t细胞时，免疫应答就会消失。[1074]实例5.通过将全血暴露于编码双顺反子基因组载体的慢病毒颗粒4小时，随后进行pbmc富集程序并经皮下施用而制造的自驱动car在小鼠模型中显示出对抗全身性人伯基特淋巴瘤的功效[1075]在本实例中，使用编码双顺反子基因组载体的复制缺陷型重组(rir)反转录病毒颗粒，通过rpoc细胞处理方法对未刺激的人t细胞和nkt细胞进行基因修饰，以产生表达针对cd19或cd22的car和淋巴增生性元件的自驱动car细胞。细胞处理工作流程如图1c所示执行，除了没有执行170c的任选步骤，并且并非在封闭系统中执行所有步骤。将自驱动pbmc皮下注射到患有全身性raji-luc肿瘤的nsg·mhc i/ii敲除小鼠中。评估小鼠的肿瘤负荷和生存率。[1076]在本实例中使用的重组慢病毒颗粒包含f1-3-637或f1-4-713双顺反子慢病毒基因组载体。在实例4中描述了f1-3-637。除了分别针对f1-3-637和f1-4-713的cd19和cd22的car的astr外，两种构建体是相同的。用vsv-g对两种反转录病毒颗粒进行假型化，显示t细胞活化元件ucht1-scfvfc-gpi，并通过使用5质体方案以10升中等规模转染f1xt细胞来生产，如实例1所述。通过深度过滤、tff、benzonase处理、渗滤和调配的组合来纯化病毒上清液，以产生不含非人类动物蛋白的基本上纯的病毒颗粒(f1-3-637gu和f1-4-713gu)。[1077]在知情同意的情况下，将来自健康志愿者的全血采集到含有肝素的管中。将75ml转移到2个血液袋的每一个中。在全血与反转录病毒颗粒接触之前，未进行血细胞分级或富集。向一个血液袋中加入3.75×108tu的f1-3-637gu(7.31ml)，并且向另一个血液袋中加入3.75×108tu的f1-3-713gu(13.07ml)，使得在假定存在1.0×106个cd3+细胞/ml血液的情况下以5的moi加入病毒。将袋倒置5次以混合内容物，然后在37℃、5％co2下培育4小时。在4小时接触时间后，使用cs-900.2试剂盒(biosafe；1008)在sepax 2 s-100装置(biosafe；14000)上，根据制造商的说明书，使用2个清洗周期，用ficoll-paquetm(general electric)对pbmc进行富集密度梯度离心，以从每次运行中获取45ml的分离的pbmc。在sepax 2工艺中使用的洗涤和最终再悬浮溶液为生理盐水(chenixin pharm)+2％人血清白蛋白(hsa)(sichuan yuanda shuyang pharmaceutical)。对细胞进行计数，并且将来自每次转导的7.5×107个细胞以400g沉淀5分钟，并且以2.5×107个细胞/ml再悬浮在3ml生理盐水+2％hsa中。[1078]在小鼠模型中检查了抗cd19、抗cd22以及抗cd19和抗cd22两者的组合自驱动car以治疗全身性人伯基特淋巴瘤的模型的能力。在本研究中使用了雌性nsg-(kbdb)null(ia)null(mhc i&ii双敲除)小鼠。第4天，每只小鼠通过静脉内尾静脉注射接种在100μl的pbs中的3.0×105个raji-萤光素酶细胞，用于肿瘤发生。raji细胞自然表达cd19和cd22。将25只小鼠随机分配到5组(5只小鼠/组)中，以用于以皮下施用在200μl的pbs中的测试制品。每组中的小鼠在第0天接受下列测试制品：g1，pbs；g2，5.0×106个未转导的pbmc；g3，5.0×106个用f1-3-637gu转导的pbmc；g4，5.0×106个用f1-4-713转导的pbmc；以及g5，2.5×106个用f1-3-637gu转导的pbmc和2.5×106个用f1-4-713gu转导的pbmc。[1079]通过生物发光成像(perkinelmer，ivis lumina series ii)评估小鼠的肿瘤生长，并使用livingimage软件进行分析。如图15所示，到皮下递送这些自驱动car后第15天，单独用f1-3-637gu转导的pbmc或用f1-3-637gu转导的pbmc与用f1-4-713gu转导的pbmc联合使全身性raji肿瘤消退。类似地，单独用f1-3-637gu转导的pbmc到第28天使全身性raji肿瘤消退。相比之下，接受未转导的pbmc或pbs且仍存活的小鼠在第14天至第28天具有显著的肿瘤负荷，如通过大于108p/s的总平均通量所示。[1080]存活分析在图16中示出。g4和g5中的所有5只小鼠均存活8周。在g3中，发现一只小鼠在第30天死亡，并且另一只在第50天死亡，两者均在肿瘤负荷在第15天消退并具有gvhd的组织学体征后发生。相比之下，来自g2和g1的小鼠均未分别存活到第49天和第16天。[1081]本实例证明，当与全血培育4小时时，编码双顺反子基因组载体并在其表面上显示活化元件ucht1-scfvfc-gpi的慢病毒颗粒可以转导pbmc。当皮下递送时，这些转导的pbmc(其为表达淋巴增生性元件的自驱动car和针对cd19或cd22的car)能够在体内扩增并消除全身性raji肿瘤。当将针对单独的cd19、单独的cd20或针对cd19和cd22的car的组合的自驱动car被递送至小鼠时，观察到这种清除全身raji肿瘤的能力。[1082]实例6.通过将白细胞减少过滤器上的tnc暴露于重组反转录病毒颗粒4小时，对未刺激的淋巴细胞进行基因修饰。[1083]在本实例中，并列比较了包括捕获tnc的2种不同细胞处理工作流程对淋巴细胞的基因修饰。第一种细胞处理工作流程(“1d”)如实例2所述并如图1d所示，除了不进行170d和180d的任选的步骤，将步骤160d的最终细胞置于培养物中，并且仅在封闭系统中进行部分过程。在该第一种过程中，通过在37℃、5％co2下培育反应混合物4小时，未刺激的人t细胞和nkt细胞被有效地基因修饰，所述反应混合物包括全血和反转录病毒颗粒，所述反转录病毒颗粒被vsv-g假型化并在其表面上显示t细胞活化元件。随后在白细胞减少过滤器上从转导反应混合物中捕获总有核细胞(tnc)，洗涤，并通过白细胞减少过滤器总成的反向灌注进行收集。第二种细胞处理工作流程(“1b”)如图1b所示，除了不进行170b和180b的任选的步骤，将步骤160b的最终细胞置于培养物中，并且仅在封闭系统中进行部分过程。在此过程中，将全血通过白细胞减少过滤器以捕获tnc，并且通过在过滤器上培育反应混合物4小时对未刺激的人t细胞和nkt细胞进行有效的基因修饰，所述反应混合物包含tnc和在第一种细胞处理中使用的相同反转录病毒颗粒。在过滤器上放置4小时后，洗涤细胞并通过白细胞减少过滤器总成的反向灌注来收集细胞。在每种情况下，将转导的tnc与ril-2一起置于培养物中。通过使用流式细胞术表达car多肽，在第6天评估了cd3+细胞的转导。通过在第7天产生ifnγ来测试car-t功能。[1084]编码用vsv-g假型化的f1-3-637(如实例4所述)并显示t细胞活化元件ucht1-scfvfc-gpi(f1-3-637gu)的重组慢病毒颗粒通过使用5质体方案以10升中等规模转染f1xt细胞来产生。如实例1所述，通过深度过滤、tff、benzonase处理、渗滤和调配的组合来纯化病毒上清液，以产生不含非人类动物蛋白的基本上纯的f1-3-637gu病毒颗粒。[1085]对于细胞处理工作流程1d，将来自健康人类供体的12ml的肝素化全血转移至血液袋(cs50，origen)。在5的moi的情况下(假设1×106个pbmc/ml血液)，将1.17ml的重组慢病毒颗粒f1-3-637gu(5.13×107tu/ml)直接添加到12ml全血液样品品中，以启动慢病毒颗粒与全血中淋巴细胞的接触，并在37℃、5％co2下且每小时温和混合下培育4小时以破坏任何沉淀。在培养4小时后，通过白细胞耗尽过滤器处理血液来分离tnc。然后，通过将50ml的ns-hsa2％-肝素50u/ml通过白细胞减少过滤器(ap-4952，pall)总成来洗涤tnc。通过用8ml ns-hsa2％再灌注将tnc回收到20ml注射器中，以400g离心5min，并重新悬浮在完全optmizertm ctstm t-细胞扩增sfm(“cts培养基”)。在每孔含10ng/ml rhil-2的3ml的cts培养基中培养3×106个细胞。在第2天和第4天添加23ml附加cts培养基和10ng/ml rhil-2。[1086]对于细胞处理工作流程1b，将来自健康人类供体的12ml的肝素化全血转移至血液袋中。通过经由处理血液来分离tnc。然后，通过将10ml的ns-hsa2％-肝素50u/ml通过白细胞减少过滤器，对tnc进行三次洗涤。将1.17ml的重组慢病毒颗粒f1-3-637gu(5.13×107tu/ml)与650μl的hsa和780μl的cts培养基混合，并在0、1、2和3小时时将650μl的该病毒溶液(其被维持在37℃)加入到过滤器中。将白细胞耗尽过滤器与转导混合物在37℃、5％co2下培育4小时。然后通过将50ml的ns-hsa2％-肝素50u/ml通过来洗涤tnc。通过用8ml ns-hsa2％再灌注将tnc回收到20ml注射器中，以400g离心5分钟，再悬浮在cts培养基中并计数(第0天)。将1.5×106个活tnc接种到在补充有10ng/ml rhil-2的3ml cts培养基中的g-rex 6孔板(wilson wolf，80240m)的孔中。[1087]在第6天收获一些孔中的细胞，并通过流式细胞术分析转导效率和细胞表面标记物。为了通过ifnγ释放分析car-t细胞功能，在第6天，使细胞保持未处理或以5:1的pbmc:靶标的比率用pma(100mm)+离子霉素(1μg/ml)、cho-s或raji靶细胞处理，并在37℃、5％co2下培育。在16小时后，收获细胞培养上清液并通过elisa分析ifnγ。[1088]两种细胞处理均从来自同一供体的12ml的肝素化全血开始。对于过程1b，在第0天从白细胞减少过滤器中回收的活tnc是10.3×106个细胞，并且对于过程1d是5.0×106个细胞。这些结果表明，在37℃、5％co2下进行4小时的转导反应会导致tnc粘附至过滤器。这种粘附阻碍了回收，并导致了替代工艺的开发，例如那些包括在接触步骤之前更短的培养期、降低的温度和/或从白细胞减少过滤器上洗脱细胞的工艺(如在图1e和图1f中所述的)。在补充有rhil-2的cts培养基中培养6天后，收获的tnc的细胞表面标记物表达在图17中示出。在由方法1b和1d处理的细胞中，cd56+细胞、cd3+cd4+和cd3+cd8+细胞的百分比大致相当。如通过cd3和car表达测定的转导的t细胞的百分比对于在全血中的转导为10.30％(1b)，并且对于在过滤器上的转导为14.28％(1d)。这表明，当细胞被转导同时在过滤器上进行集中时，转导效率提高了38％。图18显示，由过程1b或1d转导的tnc通过以相似程度分泌ifnγ对raji细胞(其表达由f1-3-637编码的抗cd19car的cd19靶标)或pma的刺激作出反应，并且该水平高于背景，表明通过这些方法由f1-3-637gu反转录病毒颗粒转导的t细胞是功能性的。[1089]这些结果显示图b1和图d1是用于细胞疗法的可行的rpoc工作流程。虽然在37℃下对白细胞减少过滤器上的浓缩细胞进行4小时的转导反应可能会导致提高的转导效率，但细胞粘附至过滤器会阻碍细胞从过滤器上的回收。不受理论的束缚，据信这些贴壁细胞是被活化并因此表达粘附分子的t细胞。据信这些细胞中的很高百分比也被转导。因此，对该工艺的改进包括抑制细胞粘附至过滤器的方法，例如减少培育的时间和/或温度，以及改变洗涤和/或递送溶液以促进结合至过滤器的细胞的释放。[1090]实例7.当皮下施用时，通过将全血暴露于编码双顺反子基因组载体的慢病毒颗粒4小时，然后进行tnc富集程序或pbmc富集程序制造的自驱动car可以消除鼠模型中的全身性人伯基特淋巴瘤[1091]在本实例中，使用编码双顺反子基因组载体的复制缺陷型重组(rir)反转录病毒颗粒，通过rpoc细胞处理方法从肝素化全血对从外周血新鲜提取的未刺激的人t细胞和nkt细胞进行基因修饰，以产生表达针对cd19的car的自驱动car细胞和淋巴增生性元件，从而比较接种纯化的pbmc与tnc的效果。细胞处理工作流程如图1c和图1d所示执行，除了没有执行170c、170d和180d的任选步骤，并且并非在完全封闭系统中执行所有步骤。将修饰的pbmc或tnc或对照皮下注射到携带全身性raji-luc肿瘤的nsg小鼠中。评估小鼠的肿瘤负荷和生存率。[1092]在本实例中使用的重组慢病毒颗粒包含f1-3-637双顺反子慢病毒基因组载体。在实例4中描述了f1-3-637。反转录病毒颗粒用vsv-g假型化，显示t细胞活化元件ucht1-scfvfc-gpi，并通过使用5质体方案以10升中等规模转染f1xt细胞来生产，如实例1所述。通过深度过滤、tff、benzonase处理、渗滤和调配的组合来纯化病毒上清液，以产生不含非人类动物蛋白的基本上纯的病毒颗粒(f1-3-637gu)。[1093]在经知情同意的情况下，将来自健康志愿者的全血采集到含有肝素的管中。对于每个实验组使用50ml。在肝素化全血与反转录病毒颗粒接触之前，未进行血细胞分级或富集。将2.5×108tu的f1-3-637gu(4.87ml病毒，含5.13×107tu/ml病毒颗粒)分两组加入到50ml的肝素化血液中，使得根据1.0×106个cd3+细胞/ml血液的假设，以5的moi加入病毒。将袋倒置5次以混合内容物，然后在37℃、5％co2下培育4小时。在4小时接触时间之后，将50ml的未与病毒接触的对照血液(“g2”)和50ml f1-3-637gu接触的血细胞样品(“g4”)分别加载到hematrate白细胞减少过滤器上，用盐水hsa肝素洗涤，并用盐水hsa洗脱。对于pbmc的富集，50ml未与病毒接触的对照血液(“g3”)和50ml f1-3-637gu接触的血细胞样品(“g5”)使用cs-900.2试剂盒(biosafe；1008)在sepax 2s-100装置(biosafe；14000)上，根据制造商的说明书使用2个清洗周期，使用ficoll-paquetm(general electric)通过密度梯度离心单独地富集，以从每次运行中获得45ml的分离的pbmc。在sepax 2工艺中使用的洗涤和最终再悬浮溶液为生理盐水(chenixin pharm)+2％人血清白蛋白(hsa)(sichuan yuanda shuyang pharmaceutical)。对细胞进行计数，在生理盐水+2％hsa中将来自每组的2.5×107个细胞稀释至2.5×107个细胞/ml。在4小时培育后，还采集来组g2、g3、g4和g5中的每一个的细胞的样品，用于通过流式细胞术进行分析，如实例8中所论述。[1094]在小鼠模型中检测了抗cd19自驱动car-t细胞治疗全身性人伯基特淋巴瘤的模型的能力。在本研究中使用了雌性nsg小鼠。第4天，每只小鼠通过静脉内尾静脉注射接种在100μl的pbs中的3.0×105个raji-萤光素酶细胞，用于肿瘤发生。raji细胞自然表达cd19。将25只小鼠随机分配到5组(5只小鼠/组)中，以用于以200μl皮下施用测试制品。每组中的小鼠在第0天接受下列测试制品：g1，pbs；g2，5×106个未诱导的tnc；g3，5.0×106个未诱导的pbmc；g4，5.0×106个用f1-3-637转导的tnc；以及g5，5×106个用f1-3-637gu转导的pbmc。[1095]通过生物发光成像(perkinelmer，ivis lumina series ii)评估小鼠的肿瘤生长，并使用livingimage软件进行分析。如图19中所示，到给药后第20天，用f1-3-637gu转导的tnc和pbmc两者清除了全身性raji肿瘤。相比之下，接受用pbs模拟转导的tnc或pbmc对照的小鼠中的肿瘤负荷在研究期间继续增加，如通过总通量测量的。g3中的肿瘤负荷在第27天显示一些肿瘤消退。这被认为是移植物相对于宿主疾病的结果。[1096]本实例证明，当与全血培育4小时时，编码双顺反子基因组载体并在其表面上显示活化元件ucht1-scfvfc-gpi的慢病毒颗粒可以转导pbmc或tnc，并且可有效地施用于受试者以引发抗肿瘤效应。当皮下递送时，转导的pbmc和tnc都能够在体内扩增并消除全身性raji肿瘤，转导的pbmc和tnc是表达淋巴增生性元件的自驱动car和针对cd19的car。[1097]实例8.使包含t细胞的细胞的群体与在其表面上显示cd3 t细胞活化元件的病毒颗粒接触导致在其表面上表达tcr复合物的细胞百分比降低。[1098]在该实例中，将不同组合物的细胞群体与不同浓度的显示出针对cd3的t细胞活化元件的病毒颗粒接触4小时，并且通过流式细胞术分析tcr复合物的表面表达并定量。在全血、pbmc和tnc中鉴定表面cd3表达的下调以及cd3-cd4+和cd3-cd8+细胞群体的出现。[1099]在第一实验中，将如实例3中所述产生的f1-3-247gu慢病毒颗粒的剂量滴定添加到全血中，以观察增加的病毒浓度对表面cd3表达的丧失的影响。收集来自健康志愿者的全血，并将100μl等分到96个深层孔板的孔中。将在pbs-4％乳糖中的120μl f1-3-247gu病毒颗粒以2.74e+07、1.37e+07、6.86e+06、2.74e+06、1.37e+06、2.74e+05或零(pbs-4％乳糖对照)tu/ml的最终浓度添加到孔中(n＝6)。将反应在37℃和5％co2下培育4小时。在4小时接触后，通过裂解rbc对细胞进行最低限度处理；不执行pbmc或tnc分离步骤。然后用抗cd3-percp(sk7)(bd，347344)、抗cd8-fitc(sk1)(bd，347313)和抗cd4-pe(sk3)(bd，347327)对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。[1100]在图20中示出了具有用于接触的病毒浓度的代表性facs概况。图20a是fsc相对于ssc的图，该图示出了门控、“细胞”，其用于分析细胞以表达cd3、cd4和cd8。如图20b中所示，cd3+cd4+细胞的百分比降低，并且cd3-cd4+细胞的百分比随着病毒浓度的增加而增加。类似地，如图20c中所示，cd3+cd8+细胞的百分比降低，并且cd3-cd8+细胞的百分比随着病毒浓度的增加而增加。[1101]第一实验的结果在图21中的表中更详细地示出。右侧的列示出了在不与病毒接触的情况下每个细胞群体的平均百分比和标准偏差(n＝6)。在与病毒接触后，偏离平均值大于3个标准偏差的群体的百分比的增加或减少被认为是显著的。[1102]a行显示，随着病毒浓度的增加，cd3+cd4+细胞占总细胞的百分比在11.1％至3.0％的范围内。当与无病毒接触相比时，观察到cd3+cd4+细胞的百分比显著降低，使得对于除了最低浓度的测试的病毒外的所有病毒，在通过病毒接触后，少于10％的总细胞是cd3+cd4+。[1103]b行显示，随着病毒浓度的增加，cd3-cd4+细胞占总细胞的百分比在1.7％至9.7％的范围内。当与无病毒接触相比时，观察到cd3-cd4+细胞的百分比显著增加，使得对于所有浓度的测试的病毒，在通过病毒接触后，超过1.5％的总细胞是cd3-cd4+。[1104]c行显示，随着病毒浓度的增加，cd3-cd4+细胞占cd4+细胞的百分比在13.5％至76.4％的范围内。当与无病毒接触相比时，观察到cd3-cd4+细胞的百分比显著增加，使得对于所有浓度的测试的病毒，在通过病毒接触之后，超过9％的cd4+细胞是cd3-。cd3-细胞占cd4+细胞的百分比被计算为％cd3-cd4+/[(％cd3-cd4+)+[(％cd3+cd4+)]。[1105]d行显示，随着病毒浓度的增加，cd3+cd8+细胞占总细胞的百分比在2.6％至0.1％的范围内。当与无病毒接触相比时，观察到cd3+cd8+细胞的百分比的显著降低，使得对于除了最低浓度的测试的病毒外的所有病毒，在通过病毒接触后，少于2.5％的总细胞是cd3+cd8+。[1106]e行显示，随着病毒浓度的增加，cd3-cd8+细胞占总细胞的百分比在0.7％至3.2％的范围内。当与无病毒接触相比时，观察到cd3-cd8+细胞的百分比显著增加，使得对于所有浓度的测试的病毒，在通过病毒接触后，超过0.6％的总细胞是cd3-cd8+。[1107]f行显示，随着病毒浓度的增加，cd3-cd8+细胞占cd8+细胞的百分比在21.7％至97.4％的范围内。当与无病毒接触相比时，观察到cd3-cd8+细胞的百分比显著增加，使得对于所有浓度的测试的病毒，在通过病毒接触后，超过18％的cd8+细胞是cd3-。cd3-细胞占cd8+细胞的百分比被计算为％cd3-cd8+/[(％cd3-cd8+)+[(％cd3+cd8+)]。[1108]g行显示，随着病毒浓度的增加，cd3-和(cd4+或cd8+)细胞占cd4+细胞和cd8+细胞的总数的百分比在15.2％至80.8％的范围内。当与无病毒接触相比时，观察到cd3-和(cd4+或cd8+)细胞的百分比显著增加，使得对于所有浓度的测试的病毒，在通过病毒接触后，cd4+细胞和cd8+细胞总数中超过10.5％是cd3-和(cd4+或cd8+)。cd3-和(cd4+或cd8+)细胞占cd4+细胞和cd8+细胞总数的百分比被计算为[(％cd3-cd4+)+(％cd3-cd8+)]/[(％cd3-cd4+)+(％cd3-cd8+)+(％cd3-cd4+)+(％cd3-cd8+)]。[1109]h行显示，随着病毒浓度的增加，cd3+和(cd4+或cd8+)细胞占cd4+细胞和cd8+细胞的总数的百分比在84.8％至19.2％的范围内。当与无病毒接触相比时，观察到cd3-和(cd4+或cd8+)细胞的百分比显著增加，使得对于所有浓度的测试的病毒，在通过病毒接触后，cd4+细胞和cd8+细胞总数中超过10.5％是cd3-和(cd4+或cd8+)。cd3-和(cd4+或cd8+)细胞占cd4+细胞和cd8+细胞总数的百分比被计算为[(％cd3-cd4+)+(％cd3-cd8+)]/[(％cd3-cd4+)+(％cd3-cd8+)+(％cd3-cd4+)+(％cd3-cd8+)]。[1110]i行显示，随着病毒浓度的增加，总cd3+细胞占总细胞的百分比在13.7％至3.1％的范围内。当与无病毒接触相比时，观察到总cd3+细胞的百分比的显著降低，使得对于除了最低浓度的测试的病毒之外的所有病毒，在通过病毒接触后，少于13％的总细胞是cd3+。[1111]j行显示，随着病毒浓度的增加，病毒接触与无病毒接触之间的总cd3+细胞的百分比降低在15％至80.9％的范围内。当与无病毒接触相比时，观察到总cd3+细胞的百分比显著降低，使得与没有病毒接触相比，对于除了最低浓度的测试的病毒以外的所有病毒，在病毒接触后观察到％cd3+细胞减少超过19％。cd3+细胞的百分比降低被计算为[(对于无病毒，％总cd3+)–((对于具有病毒，％总cd3+)]/(对于无病毒，％总cd3+)。[1112]在第二实验中，从实例7中的实验中获得细胞。简而言之，将2.5×108tu(4.87ml的5.13×107tu/ml的病毒)的f1-3-247gu rip添加到含有50ml的肝素化血液(4.6×106tu/ml最终浓度)的2个袋中的每个袋中。将反应混合物在37℃和5％co2下培育4小时。加工一个袋中的血液以富集tnc，而加工另一个袋中的血液以富集pbmc，如实例7中所述。在细胞准备用于流式细胞术之前，不进行进一步的培育或处理。对细胞进行人类cd3(okt3 brilliant violet 421,biolegend 317344)、cd4(okt4 pe/cyanine5,biolegend 317412)和cd8(rpa-t8 brilliant violet 510,biolegend 301048)染色。[1113]在此第二实验中，在分析cd3、cd4和cd8的表达之前，通过门控基于fsc-a和fsc-h的单线态细胞和基于fsc-a和ssc-a的淋巴细胞来分析细胞。在图22中的表中更详细地示出了第二实验的结果。在样品中再次观察到cd3的表面表达的显著降低。如c行中所示，在cd4+群体内，对于pbmc和tnc制剂，在病毒接触后，cd3-细胞的百分比分别为78.2％和86.8％。如f行中所示，在cd8+群体内，对于pbmc和tnc制剂，在病毒接触后，cd3-细胞的百分比分别为83.2％和89.9％。如g行中所示，在cd4+和cd8+t细胞群体的集合群体中，对于pbmc和tnc制剂，在病毒接触后，cd3-细胞的百分比分别为80.0％和88.0％。如h行中所示，在cd4+和cd8+t细胞群体的集合群体中，对于pbmc和tnc制剂，在病毒接触后，cd3+细胞的百分比分别为20.0％和12.0％。最后，如j行中所示，对于pbmc和tnc制剂，未处理的样品与通过病毒接触的样品之间的cd3+细胞减少百分比分别为79.7％和86.5％。当比较实验之间的cd3+或cd3-群体百分比时，在cd4+和/或cd8+群体中观察比在cd3表达占总细胞的百分比(如在a、b、d和e行中)观察提供更大的精度，后者对不同的血液供体、细胞处理方法和fac门控更敏感。[1114]在第三实验中，将1.17×109tu(5.9ml的1.98×108tu/ml的病毒)编码用vsv-g假型化的vp221并展示t细胞活化元件ucht1-scfvfc-gpi(vp221gu)的重组慢病毒颗粒加入到20ml的肝素化血液中(4.51×107tu/ml最终浓度)。将反应混合物在37℃和5％co2下培育4小时。随后在白细胞减少过滤器上从转导反应混合物中捕获总有核细胞(tnc)，洗涤，并通过白细胞减少过滤器总成的反向灌注收集。细胞处理工作流程如图1d所示，除了不进行170d和180d的任选步骤外，在封闭的系统中仅进行部分过程，并且处理步骤160d的一部分最终细胞以用于流式细胞术。对细胞进行人类cd4(okt4 pe/cyanine5,biolegend 317412)和cd8(rpa-t8 brilliant violet 605,biolegend 301040)和抗tcr复合物的下列抗体之一；cd3(hit3a pacific blue,biolegend 300330)、cd3(ucht1 brilliant violet 421,biolegend 300434)、cd3(sk7 brilliant violet 421,biolegend 344834)、cd3(okt3 brilliant violet 421,biolegend 317344)或tcr(ip26 brilliant violet 785,biolegend 306742)染色。[1115]类似于在本实例中的第一实验中使用的门控，“细胞”门控用于分析第三实验中细胞的cd3、cd4和cd8的表达。当用okt3、ucht1、sk7和hit3a染色时，未处理的样品与通过病毒接触的样品之间的cd3+细胞的减少百分比分别为89.2％、99.8％、95.5％和92.4％。使用ucht1(在病毒表面上显示的相同抗体)进行的染色显示出可检测表面cd3表达的最大降低，这表明可能存在被病毒掩蔽的某些表位。然而，这些结果表明，无论询问的cd3表位如何，cd3的表面表达都显著降低。此外，当用ip26染色时，tcr的百分比降低为83.5％，指示在与显示结合cd3的t细胞活化元件的重组反转录病毒颗粒接触之后，整个tcr复合物的表面表达减少。在与反转录病毒颗粒接触之后，在每个实验中已经观察到tcr复合物的表面表达的这种减少或变暗，其中将包括t细胞的细胞的群体与显示能够结合至cd3的活化元件的反转录病毒颗粒接触。此外，这种变暗发生在接触在全血中发生时或血液在接触之前或之后被分级成pbmc或tnc时。基于这些结果，本发明人认为能够交联tcr的任何活化元件还将导致tcr复合物的表面表达的减少。这与tcr复合物的活化一致，导致受体复合物的内化。[1116]实例9.皮下注射的淋巴细胞的生物分布分析证实，与静脉内注射的淋巴细胞相比，植入和持久性显著更好[1117]在该实例中，通过皮下注射或静脉内注射递送的淋巴细胞的生物分布通过生物发光成像并排比较。[1118]通过在5的moi下培育包括全血和基本上纯的不含非人类动物蛋白的f1-3-748gu病毒颗粒的反应混合物4小时，有效地对人类t细胞和nkt细胞进行基因修饰。f1-3-748双顺反子载体编码cd19 car、淋巴增生性元件和荧光素酶，如实例1中更详细公开的。本实例中的病毒颗粒用vsv-g假型化，并且在其表面上显示t细胞活化元件。在培育后，在白细胞减少过滤器上从转导反应混合物中捕获tnc，洗涤，并且通过反向灌注白细胞减少过滤器总成在2％hsa生理盐水中收集。rpoc细胞处理工作流程如图1d所示，除了不执行170d和180d的任选步骤外，并且仅在封闭的系统中执行部分过程。然后将悬浮在200μl 2％hsa生理盐水中的500万个修饰的tnc注射到6-8周龄的雌性b-ndg小鼠中，所述小鼠具有平均150mm3的已建立的实体raji肿瘤。静脉内注射五只小鼠，并且在与肿瘤相对的侧腹中皮下注射五只小鼠。用f1-3-748转导的tnc的体内生物分布表达荧光素酶，随后进行生物发光成像(perkinelmer,ivis lumina series ii)并用livingimage软件分析。[1119]在图23中示出了来自每组的代表性小鼠的ivis图像。如图23a中所示，当tnc被皮下注射时，在第3天时未检测到表达荧光素酶转基因的经基因修饰的淋巴细胞。到第5天，在注射的位点处观察到经转导的淋巴细胞。第9天的图像显示在注射的部位处转导的淋巴细胞增加，但在小鼠的其它部位可检测到转导的淋巴细胞，表明一些表达转基因的细胞从注射部位迁移出来。表达荧光素酶转基因的细胞的量在注射的皮下位点处或附近似乎保持很高，在该区域显示转导的细胞扩增和持久性，并且这些细胞的区域似乎增加并从该注射位点发出，形成似乎是以注射位点处或附近为中心的细胞浓度梯度。到第13天，转导的淋巴细胞存在于注射部位处的扩展区域以及肿瘤中，并且到第17天，可以在整个身体中观察到转导的淋巴细胞，尽管在肿瘤和施用部位周围的较大区域中表达转基因的细胞的密度仍然比小鼠的更远端区域中的细胞密度更高。这些数据表明，当淋巴细胞被rpoc过程修饰时，大部分(如果不是全部)反转录、dna整合和转基因表达发生在皮下注射部位。这些淋巴细胞在注射位点增殖持续约5至10天，并且随后迁移到循环中并运输至肿瘤。一旦进入肿瘤，这些也表达cd19 car的淋巴细胞就明显接合raji靶，并继续稳健增殖。令人惊讶地，并且明显相反的是，当tnc被静脉内注射时，经基因修饰的淋巴细胞在小鼠中不被vis检测到，如图23b中所示。[1120]实例10.当皮下施用时，通过rpoc细胞处理方法修饰以表达car的淋巴细胞形成三级淋巴样结构，植入并杀死分散在整个身体中的靶细胞[1121]在该实例中，pbmc通过与编码car和淋巴增生性元件的rip的4小时培育而有效地进行基因修饰。然后将修饰的pbmc皮下注射到工程化为缺乏鼠淋巴细胞的小鼠中，但用人类pbmc静脉内重构，使得小鼠是淋巴丰富的。该模型用于第一实验中，以评估耗尽car靶细胞并皮下引入的经基因修饰的pbmc在淋巴丰富的宿主中移植的能力。在第二实验中也使用了该模型，以评估皮下引入的基因修饰的pbmc(未耗尽car靶细胞)形成三级淋巴样结构和杀死血液中car靶细胞的能力。[1122]如实例3所述产生重组f1-3-247gu慢病毒颗粒。f1-3-247编码cd19 car，所述cd19 car由抗cd19scfv、cd8柄和跨膜区以及来自cd3z的胞内结构域，随后是t2a和淋巴增生性元件组成，该淋巴增生性元件包括e006-t016-s186-s050部分，其编码含有c-jun的变体(包括亮氨酸拉链模体和etag)的胞外结构域、csf2ra的跨膜结构域、mpl的胞内结构域和cd40的胞内结构域，其中淋巴增生性元件的每个部分通过ggs连接子连接。[1123]在第一实验中使用的耗尽cd19+细胞的新鲜pbmc和在第二实验中使用的新鲜pbmc(未耗尽cd19+细胞)从stemexpress获得。在每种情况下，将f1-3-247gu病毒颗粒以2.5的moi添加到在锥形管中的pbmc中，并且在37℃和5％co2下培育4小时。在4小时接触后，将细胞以418g沉淀10分钟，并用pbs+2％hsa洗涤3次。将细胞以3×107细胞/ml的浓度再悬浮于pbs+2％hsa中。任何时候都不向样品中添加外源性细胞因子。[1124]在本实例中，将10和7周龄的雌性免疫缺陷nsg-mhc1/2-dko(nsg-(kbdb)null(ia)null,jackson laboratories)小鼠分别用于第一实验和第二实验中。为了测试用f1-3-247gu修饰的pbmc在淋巴丰富的宿主中的活性，通过在尾静脉中在pbs-hsa(1000万个pbmc)中以5.0x107个细胞/ml iv注射200μl的人pbmc，用人免疫系统重构这些小鼠。在每个实验内，iv和sc施用的pbmc为供体匹配的。[1125]对于第一实验，皮下注射用f1-3-247gu转导或用pbs模拟转导的200μl pbs-hsa中的600万个pbmc。在每个组中包括5只小鼠。在第21天从小鼠采集血液用于血清细胞因子的分析，并且在第27天用于通过流式细胞术的分析。[1126]通过对人cd45染色来评估iv注射的人pbmc移植和重构nsg-mhc1/2-dko小鼠的免疫系统的能力。图24a中的图显示了在iv接受人pbmc且无皮下pbmc后27天来自代表性小鼠的血液中的cd45表达。除了表达cd45的内源性鼠细胞外，还检测到大量的人cd45+细胞的群体。这些结果证实nsg-mhc1/2-dko小鼠的免疫隔室用人细胞重构。图24b中的图显示，在用耗尽cd19并用f1-3-247gu基因修饰的pbmc皮下给药27天后，可以在淋巴丰富的小鼠中检测到表达cd19 car的显著数量的t细胞。虽然cd8+和cd4+t细胞两者都存在，但存在多大约11倍的cd8+细胞。[1127]皮肤和皮下组织用苏木精和曙红(h&e)以及针对cd4、cd8和cd68的抗体染色，以研究皮下施用的修饰的pbmc的分布。图26a显示在给药后第1天来自样品的h&e染色的载玻片。图26a中的箭头指向散布在整个皮下区域中的小淋巴细胞，其与已经皮下递送和保留的细胞一致。图26b显示在皮下施用后第7天，皮肤的表皮是完整的，没有溃疡或皮肤急性炎症的迹象，如在皮内施用后可能发生的。图26b中的箭头指向具有确定边界和类似淋巴结的结构的三级淋巴样结构(tls)。免疫组织化学证实这些tls包括cd4+淋巴细胞、cd8+淋巴细胞和cd68+抗原呈递细胞。这些结构有助于次级淋巴器官外t细胞和nk细胞的成熟和教育。在第4天时未观察到tls，因此很可能在第4天与第7天之间形成。图26c显示出，这些tls在第14天内持续增长。当在较高的放大率下观察时，鉴定多核巨细胞、活化的单核细胞和主动分裂的淋巴细胞。图26d显示在第21天时，淋巴细胞的残余区域存在于皮下区域中，但tls不再存在。这些结果与实例9的图23a中所见的生物分布一致，其显示了在第9天与第17天之间从注射部位分散的修饰的细胞，以及在实例3的图7中在第14天与第35天之间在血液中存在的大量的修饰的细胞。重要的是，这些数据也支持包含用组成型活性淋巴增生性元件修饰的淋巴细胞的tls可以消退。[1128]在第二实验中，检查了3种不同剂量的用f1-3-247gu转导以表达cd19 car并经皮下施用的pbmc植入和杀死静脉内引入的pbmc的能力。将100万、100,000或10,000个修饰的pbmc重新悬浮于100μl的pbs-hsa中并皮下注射。作为对照，一组小鼠接受模拟转导的pbmc，并且另一组小皮下接受pbs。所有小鼠静脉内接受1000万个pbmc。在每个组中包括5只小鼠。在第21天时从小鼠采集血液，用于通过流式细胞术定量人cd3-cd19+细胞。如上所述处理另外5只小鼠，其中皮下施用100万个修饰的pbmc，并且在第1天、第4天、第7天、第14天和第21天时采集组织样品用于组织学。[1129]在图25中示出了在第21天对于每组小鼠每ml血液的人cd3-cd19+细胞的数目。平均而言，皮下接受单独的pbs的小鼠具有大约880个cd19+细胞/ml血液。平均而言，皮下接受100万个模拟转导的pbmc的小鼠具有大约600个cd19+细胞/ml血液。平均而言，接受用f1-3-247gu转导的100万个pbmc的小鼠具有大约60个cd19+细胞/ml血液。因此，用编码cd19car的基因构建体转导pbmc和皮下施用100万个细胞导致靶细胞减少10倍。当小鼠仅给药100,000个pbmc时，观察到相似的结果。此外，当仅皮下给药10,000个pmc时，观察到靶细胞的2.3倍减少。[1130]本实例显示，使用rpoc细胞过程进行基因修饰并皮下注射的淋巴细胞在淋巴丰富的宿主中扩增、植入和杀死靶细胞。在该实例中，将淋巴细胞工程化为表达car和淋巴增生性元件。在第一实验中，cd19(由car识别的抗原)在它们被转导之前从pbmc中被耗尽。这表明，在转导反应或皮下环境中不一定存在由car识别的抗原，以使基因修饰的细胞扩增和植入。如在第二实验中所证明的，这些细胞不仅移植和扩增，而且它们在功能上是活性的，并且即使在小鼠中皮下给药10,000个总pbmc的低剂量时也能杀死靶细胞。[1131]实例11.当皮下施用时，通过将全血暴露于慢病毒载体4小时随后进行tnc富集程序制备的针对her2的car消除了小鼠中人胃癌异种移植物模型中的实体瘤[1132]在本实例中，使用编码双顺反子基因组载体的复制缺陷型重组(rir)反转录病毒颗粒，通过rpoc细胞处理方法从肝素化的全血对从外周血新鲜提取的未刺激的人t细胞和nkt细胞进行基因修饰，以产生表达针对her2的第二代car和淋巴增生性元件的自驱动car细胞。细胞处理工作流程如图1d所示执行，除了没有执行170d和180d的任选步骤，并且并非在完全封闭的系统中执行所有步骤。将修饰的tnc或对照皮下注射到在相对腹部中具有已建立的皮下实体n87肿瘤的nsg小鼠中。评估小鼠的肿瘤负荷和生存率。[1133]在本实例中使用的重组慢病毒颗粒包括f1-6-744双顺反子慢病毒基因组载体。在实例1中描述了f1-6-744。反转录病毒颗粒用vsv-g假型化，显示t细胞活化元件ucht1-scfvfc-gpi，并通过使用5质体方案以10升中等规模转染f1xt细胞来生产，如实例1所述。通过深度过滤、tff、benzonase处理、渗滤和调配的组合来纯化病毒上清液，以产生不含非人类动物蛋白的基本上纯的病毒颗粒(f1-6-744gu)。[1134]收集来自具有知情同意的健康受试者的全血。在使63.6ml的肝素化的全血与7ml的f1-6-744gu反转录病毒颗粒以8.05e+08tu(1.14e+07tu/ml最终)接触之前，未进行血细胞分级或富集。将袋倒置5次以混合内容物，然后在37℃、5％co2下培育4小时。随后在hematratetm白细胞减少过滤器上从转导反应混合物中捕获总有核细胞(tnc)，洗涤，并通过白细胞减少过滤器总成的反向灌注收集。细胞处理工作流程如图1d所示，除了不进行170d和180d的任选步骤，并且只有部分过程在封闭的系统中进行。[1135]表达内源性人her2的nci-n87细胞用于在小鼠中产生人胃癌异种移植模型。在7-8周龄的雌性nod-prkdcscidil2rgtm1/bcgen(b-ndg)小鼠(beijing biocytogen co.ltd.)的后腹中建立皮下(sc)肿瘤异种移植物。简而言之，将培养的n87细胞在dpbs(thermo fisher)中洗涤，计数，重悬于冷dpbs中，并且与适当体积的matrigel ecm(corning；最终浓度为5mg/ml)以1.0×107个细胞/100μl matrigel的浓度在冰上混合。在注射前，使用标准认可的脱毛(nair)麻醉为动物做好注射准备。皮下注射100μl的在ecm中的细胞悬浮液。[1136]当肿瘤平均为146mm3时，小鼠在与肿瘤相对的腹部中皮下给药200μl的测试制品。一组小鼠接受100万修饰的tnc,而另一组小鼠接受500万个修饰的tnc。对照组仅接受500万未修饰的tnc或pbs。在每组中有五只小鼠。每周使用卡尺测量肿瘤2次，并使用以下等式计算肿瘤体积：(最长直径*最短直径2)/2。[1137]随着时间的推移，检查了测试制品在体内消退已确定的n87肿瘤的能力。如图27所示，用f1-6-744转导并经皮下递送的tnc导致给药后20天开始的肿瘤负荷的快速和显著减少。到给药后30天，通过卡尺测量无法检测到肿瘤。当给药100万或500万个转导的细胞时，观察到类似的肿瘤消退，这表明给药甚至更少的细胞也会导致肿瘤消退。相比之下，由于被认为是独立于car的移植物抗肿瘤同种异体反应，给药未诱导的tnc的小鼠在稍后的时间点表现出部分肿瘤消退(未显示)。最后，在用单独的pbs给药的对照小鼠中，肿瘤继续生长。所有小鼠存活至第34天，此时实验结束。[1138]本实例证明，当与全血培育4小时时，编码双顺反子基因组载体并在其表面上显示活化元件ucht1-scfvfc-gpi的慢病毒颗粒可以转导淋巴细胞。在如图1d所示的过程中，可以使用白细胞减少过滤器总成来富集这些淋巴细胞。当皮下递送时，单剂量的这些转导的tnc(它们是表达淋巴增生性元件的自驱动car和针对her2的car)能够在皮下环境中缺乏抗原的情况下在体内扩增，并且消除实体n87肿瘤。[1139]所公开的实施例、实例及实验不意图限制本发明的范围或表示以下实验为执行的全部或唯一的实验。已努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确度，但应计入一些实验性误差及偏差。应理解，可在不改变实验意图说明的基本方面的情况下对如所描述的方法进行变化。[1140]所属领域的技术人员可在本公开的范围及精神下设计许多修改及其它实施例。实际上，可在不改变本公开的基本方面的情况下由所属领域的技术人员对所描述的材料、方法、图式、实验、实例及实施例进行变化。所公开实施例中的任一个可结合其它所公开的实施例来使用。[1141]在一些情况下，参考特定实施例描述一些概念。然而，所属领域的一般技术人员了解，可在不背离如以下权利要求书所阐述的发明内容的范围的情况下进行各种修改及改变。因此，说明书及图式应视为呈说明性意义而非限制性意义，且所有这些修改意图包括在本发明的范围内。[1142]表1.淋巴增生性部分p1-p2、p1、p2、p3和p4的结构域的部分、名称和氨基酸序列。[1143][1144][1145][1146][1147][1148][1149][1150][1151][1152][1153][1154][1155][1156][1157][1158][1159][1160][1161][1162]









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