保护以对抗血清型9、序列型16的猪链球菌的疫苗的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及保护猪以对抗血清型9、序列型16的猪链球菌细菌的致病性感染。背景技术：2.猪链球菌(streptococcus s(s.suis))是猪中接触传染性细菌性疾病的主要病原体之一。病原体可引起多种临床综合征，包括脑膜炎、关节炎、心包炎、多发性浆膜炎、败血病、肺炎和猝死。s.suis是革兰氏阳性兼性厌氧球菌，最初被定义为兰斯斐尔德(lancefield)类群r、s、r/s或t。以后，提出了一种基于位于细胞壁中的类型特异性荚膜多糖抗原的新分型系统。这产生了包含35种血清型的系统(rasmussen和andresen,1998,“16s rdna sequence variations of some streptococcus suis serotypes”,int.j.syst.bacteriol.48,1063-1065)，其中的血清型2、9、1、7和1/2最为普遍。然而，公认的荚膜血清型是毒力的不良标志物。因而，开发了一种替代系统来帮助了解s.suis感染的流行病学和血清分型方法的生物学相关性，即所谓的多位点序列分型(mlst)，如king等在journal of clinical microbiology,oct.2002,p.3671-3680(development of a multilocus sequence typing scheme for the pig pathogen streptococcus suis:identification of virulent clones and potential capsular serotype exchange”)中所描述的。在该研究中鉴定了在人群中占主导地位的92种序列类型，其中st复合体st1、st27和st87，每一种都包含多种序列类型。亦参见位于牛津大学的猪链球菌mlst网站(https://pubmlst.org/ssuis/)(jolley等，wellcome open res 2018,3:124(网站由wellcome trust)资助)，其指king等，纸质并使得能够容易地鉴定任何猪链球菌菌株的序列类型。3.猪群中猪链球菌的控制看来似乎非常困难。猪链球菌是猪的机会共生体。显然，并不是在每一次感染时都触发免疫系统。紧跟在这之后的是，猪链球菌是充分被有荚膜的病原体，并使用毒力因子库来逃避宿主免疫系统。这些特征已共同向开发有效疫苗来对抗这种重要病原体提出了挑战。最近，关于抗猪链球菌的疫苗的综述文章已经发表(mariela segura:“streptococcus suis vaccines:candidate antigens and progress,in expert review of vaccines，第14卷，2015，第12期，第1587-1608页)。在这个综述中，已搜集并比较了临床现场信息(clinical field information)和实验数据，以概述抗猪链球菌的疫苗开发的现状，如下文所概述的。4.当前使用的疫苗主要是全细胞菌苗。然而，现场报告描述了在疾病控制和管理中的困难，且特别地“疫苗失败(vaccine failures)”是常见的。携带者猪是主要的传染源，且垂直传递和水平传递两者都与疾病在畜群中的扩散有关。在应激性条件下，如断奶和运输，将携带者动物与易感动物混合通常导致临床疾病。早期投药的断奶和分开的早期断奶实践没有消除猪链球菌感染。因此，预防疾病的有效控制措施的关键将在于预防/补救性预防(metaphylactic)程序(在允许的场合)和接种。目前，现场免疫工作已集中在商业或自体菌苗的使用上。这些疫苗策略已应用于小猪或母猪。自断奶及以后，由于与断奶亦及后来常见的运输相关的应激，小猪更易感猪链球菌感染。因此，经常使用母猪的分娩前(prepartum)免疫来对小猪尝试且传递被动免疫，并在一生中早期的这些应激性情况下提供抗猪链球菌的保护。此外，母猪接种成本较低且劳动强度较低，因而代表了小猪接种的经济备择方案。然而，可用的结果似乎表明用菌苗进行母猪接种也是一个有争论的问题。在很多情况下，接种的母猪，甚至当在分娩前接种两次时，对接种的反应也不良或根本没有反应，这导致传递到幼崽的母体免疫低。而且即使母体免疫以足够的水平传递，在很多情况下，母源性抗体仍然太低以致于无法在4-7周龄的最关键时期中提供保护。5.在小猪中，在现场频繁地使用自体菌苗，尤其是在欧洲。它们是从有临床问题的农场分离的强毒株制备的，并应用于同一农场。自体菌苗的缺点之一是缺乏疫苗安全性数据并且可能发生严重的不利反应。采样错误(由于仅使用一头或两头猪或一个或两个样品)可能导致不能鉴定与最近的暴发有关的菌株或血清型。这种失败在地方性畜群中可能尤其成问题。最后，自体菌苗最重要的困境是对它们的实际功效尚缺少研究。由于自体疫苗的应用是根据经验性的，所以使用这些疫苗获得的结果不一致也就不令人惊讶了。6.本领域还描述了其他实验性疫苗。kai-jen hsueh等表明(“immunization with streptococcus suis bacterin plus recombinant sao protein in sows conveys passive immunity to their piglets”,bmc veterinary research,bmc series–open,inclusive and trusted,13:15,2017年1月7日)菌苗+亚基可能是成功接种母猪以给予其小猪保护性免疫的基础。7.在本领域中也已预期活减毒疫苗。猪链球菌血清型2的未被有荚膜的同基因突变体已被清楚地表明是无毒性的。然而，基于未被有荚膜的血清型2突变体的活疫苗制剂仅诱导对抗死亡率的部分保护，且未能阻止用野生型菌株攻击的猪中临床病征的发展(wisselink hj,stockhofe-zurwieden n,hilgers la等，“assessment of protective efficacy of live and killed vaccines based on a non-encapsulated mutant of streptococcus suis serotype 2.”vet microbiol.2002,84:155–168.)8.在最近两三年中，已经报道了抗原性或免疫原性猪链球菌分子的广泛清单，并且已通过使用来自感染的猪或人的恢复期血清和/或实验室产生的免疫血清的免疫蛋白质组学发现了这些中的大多数。wo2015/181356(idt biologika gmbh)已显示，igm蛋白酶抗原(完整蛋白或仅相当于全部蛋白约35％的高度保守的mac-1结构域)可以在任选与含菌苗的最初接种(prime vaccination)组合的施用两剂igm蛋白酶抗原的接种方案中的小猪中引发保护性免疫应答。要指出的是，wo2017/005913(intervacc ab)也描述了igm蛋白酶抗原(特别是与核苷酸酶融合的igm蛋白酶多肽)的用途。然而，仅已显示了能够引起血清应答(seroresponse)的性质。在这个国际专利申请中未显示igm蛋白酶抗原的保护作用。9.最近wo 2019/115741(转让给当前申请人)已公开。在该专利申请中，显示igm蛋白酶抗原可有效防止血清型9的猪链球菌的致病性感染。然而，保护不是很高，并且似乎与普通菌苗疫苗可获得的水平相当，即，在人工攻击实验中减少约50％的死亡和阳性血液分离(不排除在实践中保护将处于更高水平)。乍一看，这种有点令人失望的保护似乎与也是在人工挑战实验中的rieckmann等，vaccine,3(2019)100046(“vaccination with the immunoglobulin m-degrading enzyme of streptococcus suis,idessuis,leads to protection against a highly virulent serotype 9strain”)报道的用igm蛋白酶抗原获得的针对血清型9的猪链球菌感染的高水平保护相矛盾。10.发明目的11.本发明的一个目的是发现一种组合物和疗法，其在保护猪以对抗包括血清型9在内的各种血清型的猪链球菌中更有效。技术实现要素：12.众所周知，使用igm蛋白酶抗原可以在各种血清型中获得非常好的保护，包括血清型1、2、9和14。在这方面，wo 2019/115741中报道的关于可获得的针对血清型9的保护水平的结果似乎与rieckmann中报道的结果相冲突。然而，经过仔细检查，似乎在rieckmann研究中使用了序列型94的猪链球菌菌株。在wo2019/115741中，尽管未指明，但使用了序列型16的猪链球菌菌株。这是稍后通过根据king等人描述的多位点序列分型(见上文)对使用的攻击菌株进行分型发现的。显然，针对后一种类型(血清型9、序列型16的s.suis)，igm蛋白酶抗原提供的保护水平显著降低。其原因尚不清楚，但非常不利，因为在很多国家，尤其是荷兰等欧洲国家，序列型16的猪链球菌是猪链球菌血清型9细菌中最普遍的致病类型(willemse等，scientific reports,2019,9:15429,“clonal expansion of a virulent streptococcus suis serotype 9lineage distinguishable from carriage subpopulations”)。因此，尽管igm蛋白酶可能产生跨血清型的广泛保护，但发现在有效保护方面存在差距，特别是对血清型9、序列型16的猪链球菌而言。13.在发现这个差异后，发现这个差异可以通过联合使用猪链球菌的igm蛋白酶抗原和血清型9、序列型16的猪链球菌菌苗来弥补，以保护猪以对抗血清型9、序列型16的猪链球菌的致病性感染，并且可以达到比仅用igm蛋白酶可获得的水平更高的保护水平(特别是在人工攻击模型中，相对于未接种疫苗的对照动物，其死亡数字和血液分离评分远低于50％)。这是非常出乎意料的，因为两种抗原重叠(菌苗本身也包含所有其亚基)，并且每种抗原本身提供的保护较少，而其组合提供的保护水平可达到使用最有效的已知疫苗可获得的针对其他s.suis菌株的保护水平，即，基于igm蛋白酶抗原的疫苗能够针对各种不同(非血清型9、序列型16)猪链球菌菌株提供某种水平的保护。因此，表明联合使用的抗原提供了比预期更好的保护作用。已经表明，这种效果是通过同时施用两种抗原产生的，无论是作为单独的单一疫苗(通过两次单独的施用)，还是当配制在一种(单一)疫苗中用于一次施用以一次性施用两种抗原时。14.换句话说，本发明还涉及猪链球菌的igm蛋白酶抗原，用于其中igm蛋白酶与血清型9、序列型16的猪链球菌菌苗同时施用的方法中，用于保护猪以对抗血清型9、序列型16的猪链球菌的致病性感染。或者，在备选方案中，本发明涉及血清型9、序列型16的猪链球菌菌苗，用于其中所述菌苗与猪链球菌的igm蛋白酶抗原同时施用的方法中，用于保护猪以对抗血清型9、序列型16的猪链球菌的致病性感染。所述同时施用可以是两种单独的制剂(一种含有igm蛋白酶抗原，另一种含有菌苗)的两种单独施用的形式，或者在一种单一制剂中包含两种抗原的一种单一组合疫苗一次施用。15.使用本发明，可以弥补对猪链球菌的保护作用。本发明不仅能够实现针对包含作为重要代表的序列型16的血清型9的猪链球菌的最佳可能保护，而且还能实现一种方法以实现对所有血清型的非常广泛的保护。已证明igm蛋白酶抗原可提供跨血清型的广泛保护，并且当使用当前的抗原组合时，该保护将固有地存在。16.本发明还涉及是一种试剂盒，其包含猪链球菌的igm蛋白酶抗原，血清型9、序列型16的猪链球菌菌苗，以及药学上可接受的载体的组合。17.本发明还涉及一种单一疫苗组合物，其包含猪链球菌的igm蛋白酶抗原，血清型9、序列型16的猪链球菌菌苗，以及药学上可接受的载体的组合。18.本发明还涉及猪链球菌的igm蛋白酶抗原和血清型9、序列型16的猪链球菌菌苗，其用于制备用于保护猪以对抗血清型9、序列型16的猪链球菌的致病性感染的疫苗的用途。19.最后本发明涉及一种保护猪以对抗血清型9、序列型16的猪链球菌的致病性感染的方法，其通过向所述猪施用猪链球菌的igm蛋白酶抗原和血清型9、序列型16的猪链球菌菌苗。20.定义21.猪链球菌的igm蛋白酶抗原是特异性降解猪igm(而不是猪igg或猪iga；seele等人,journal of bacteriology,2013,195 930-940；和vaccine 33:2207-2212；2015年5月5日)的酶，称为idessuis的蛋白质，或其免疫原性部分(一般具有全长酶的至少约30-35％的长度)。完整酶具有约100-125kda的重量，对应于约1000-1150个氨基酸，大小取决于s.suis的血清型。在wo 2015/181356中，给出了代表猪链球菌的igm蛋白酶抗原的几个序列，即seq id no：1、seq id no：2、seq id no：6、seq id no：7和seq id no：5，后者是全长酶的免疫原性部分(表示为mac-1结构域，即，sed id no：7的氨基酸80-414)。全长酶的免疫原性部分的其他例子在wo2017/005913中给出。特别地，所述igm蛋白酶可以是根据wo2015/1818356的seq id no：1的蛋白酶或在重叠区域中具有至少90％，或甚至91、92、93、94、95、96、97、98、99％一直到100％序列同一性的蛋白质。可以用使用带有默认参数的blastp算法的blast程序确立氨基酸序列同一性。预期各种血清型的猪链球菌的igm蛋白酶具有高于90％的序列同一性，特别是预期为91、92、93、94、95、96、97、98、99％一直到100％。例如，为了在抗原重组生产系统中最优化得率而制备的人工蛋白质与完整酶相比可能导致较低的氨基酸序列同一性，例如85％、80％、75％、70％或甚至60％，同时保持所需的免疫原性功能，并且被理解为是在本发明的意义上的猪链球菌的igm蛋白酶抗原。22.疫苗是适于向受试者应用的构成，其包含一种或多种免疫学有效量的抗原(即，能够充分刺激目标受试者的免疫系统以至少减少野生型微生物攻击的负面影响)，通常与药学上可接受的载体组合，其在向受试者施用后诱导免疫反应以治疗感染，即，帮助预防、改善或治愈感染或由所述感染引起的任何疾病或病症。23.抗微生物的致病性感染的保护与获得保护性免疫相同，即，帮助预防、改善或治愈该微生物的致病性感染或由该感染引起的病症，例如预防或减少由病原体的致病性感染引起的实际感染或一种或多种临床病征。24.菌苗是用作疫苗的已杀死细菌的混悬液。25.抗原的组合是在一种疫苗接种策略中联合使用这些(个体不同的)抗原，或者通过将不同抗原结合到一种疫苗制剂中，或者通过使用单独的抗原制剂来同时施用单独的制剂。26.单一疫苗组合物是形成单一实体的疫苗，如包含组合在单一混合物中的疫苗所有成分的单一液体。27.药学上可接受的载体是生物相容性介质，即，在施用后不会在所治疗的受试者中引起明显不良反应，在施用包含载体的组合物后能够将抗原呈递给受试者的免疫系统。此类药学上可接受的载体可以是例如含有水和/或任何其他生物相容性溶剂的液体或固体载体，如通常用于获得冻干疫苗(基于糖和/或蛋白)，任选地包含免疫刺激剂(佐剂)。根据相应疫苗的预期用途或所需性质，任选地添加其他物质，如稳定剂、粘度调节剂或其他组分。具体实施方式28.尽管本发明组合的两种抗原可以分开施用，但在一个进一步的实施方式中，猪链球菌的igm蛋白酶抗原和猪链球菌菌苗包含在用于向猪施用的单一组合物中。发现当两种抗原都存在于可以通过单次施用进行施用的单一组合物中时，组合的效果得到改善。29.在另一个实施方式中，用于根据本发明用途的组合物包含猪链球菌血清型2的igm蛋白酶抗原。尽管已知igm蛋白酶能够诱导血清型2和9之间的交叉保护(参见关于igm蛋白酶的wo 2019/115741)，但发现血清型2的igm蛋白酶和血清型9的菌苗的组合有利于获得针对血清型9、序列型16的猪链球菌的保护作用。伴随的优点是该组合在各种血清型之间提供广泛的交叉保护，如已知针对血清型2的igm蛋白酶抗原的2、9、7和14。相应地，还对于试剂盒、单一疫苗、用于制备疫苗的抗原的用途和治疗方法，以上在发明内容部分中的所有内容均被标识为同一发明概念的其他实施方式，抗原有利地选自血清型2的igm蛋白酶。30.在又一个实施方式中，在至多35日龄向猪施用所述抗原。如上所述，猪链球菌是猪的共生和机会致病菌。特别地在应激下，细菌可引出致病性感染并诱导疾病。在现代猪生产条件下，在猪达到35日龄时或之后诱导主要应激，例如，由小猪断奶(3-4周)和其后不久幼小小猪的运输所诱导的。为了保护以抗猪链球菌的致病性感染，因此，猪需要在非常幼小的龄期就接受其疫苗，一般在它们达到28日龄之前。发现通过在最多28日龄在猪中使用组合抗原，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35日的任何龄期，可以获得足够的保护。如本领域中已知的，特别是从wo2017/005913，自出生日及以后，可以在幼猪中从出生之日起获得针对igm蛋白酶抗原(wo2017/005913)和菌苗(如通常在断奶之前的仔猪中应用)的阳性免疫应答。这意味着，这意味着，通过目前显示在3-5周龄猪中的实际保护作用，可以理解的是，甚至在更幼小的龄期也能获得保护。31.在另一个实施方式中，在猪断奶的年龄之间施用抗原。换言之，在仔猪实际断奶之前(通常在3-4周龄)施用抗原。已经表明，通过在这个早期阶段施用抗原，可以获得针对血清型9、序列型16的猪链球菌的致病性感染的保护，这种感染是在断奶后2-3周的短窗口内由应激引起的。公认的是，wo2015/181356显示了使用igm蛋白酶作为抗原的成功疫苗接种。然而，该疫苗用于5-7周龄且在9周龄时接受攻击感染的仔猪，因此远在断奶/运输后2-3周(即，5-7周龄)的风险期(即，致病性猪链球菌感染的高峰期)之后。因此，在没有任何实际情况下的有效性证明(即，在断奶和运输应激后2-3周的窗口中攻击感染)的情况下，wo 2015/181356中描述的疫苗策略在实际情况下是否有效仍然值得怀疑。32.所有上述实施方式也相应地是如上文在发明内容部分中定义的本发明的其他代表性实施方式，即，igm蛋白酶抗原和菌苗、试剂盒和单一疫苗的各自用途、制备用途和保护方法。33.现在将基于以下实施例进一步解释本发明。34.实施例35.本研究的目的是测试igm蛋白酶抗原和血清型9、序列型16的菌苗(在本实施例中为猪链球菌血清型2的igm蛋白酶抗原)的组合施用是否能够提供针对血清型9、序列型16的猪链球菌攻击的保护，以使得在wo2019/115741中使用的人工攻击模型中，保护水平优于单独使用已知igm蛋白酶或常用菌苗获得的保护水平(即，攻击后死亡数量和血液再分离减少约50％以上)。36.使用的抗原是现有技术中描述的抗原。igm蛋白酶对应于如wo2019/115741中所描述的抗原，即如seele等在vaccine33:2207-2212；2015年5月5日，第2.2段中所述的e.coli表达的ridessuis igm蛋白酶抗原，但是没有his-标签。该菌苗是一种普通的氯甲酚杀死的猪链球菌。37.研究设计38.该研究设计与wo2019/115741中的相同，但是在当前设置中，igm蛋白酶的剂量显著降低(80μg对比230μg)。此外，疫苗接种和攻击发生在两周前，以更符合致病性猪链球菌感染的关键时期。这意味着在目前设置中，如果有的话，将更难以达到与wo2019/115741中描述的研究中可获得的相同的疫苗有效性。39.在这项研究中，使用36头3周龄大的仔猪。将仔猪分配到三组(均匀分布在不同窝中)，每组12头仔猪。第1组和第2组在3周龄和5周龄时用两种不同组合疫苗中的每一种进行了两次肌内接种。第一组接种单一疫苗组合物(每剂2ml)，所述组合物包含猪链球菌血清型2的igm蛋白酶抗原(以80μg/剂)和血清型9、st16的猪链球菌菌苗(以2x109个细胞/剂)在水包油佐剂中的组合。第二组每次接种两种单独的疫苗，一种在颈部右侧，含有igm蛋白酶(相同剂量)，一组在颈部左侧，含有菌苗(以相同剂量)，两者均在与第1组使用的相同的水包油佐剂中配制。第3组仍未接种疫苗。在7周龄时，用s.suis血清型9、序列型st16的毒性培养物对猪进行气管内攻击。40.攻击后，每天观察猪链球菌感染的临床症状，如抑郁、运动问题和/或神经症状，持续11天，并使用常规评分系统评分，从0分(无症状)到3分严重病例。将达到人道终点的动物安乐死。在接种疫苗和攻击之前，收集血清用于抗体测定。在攻击前后定期收集肝素血以重新分离攻击菌株。41.结果42.没有一种疫苗会引起任何不可接受的部位或全身反应，因此可以认为是安全的。在攻击前，第1组中的一只动物变得瘸腿，并接受了相应治疗。该动物没有恢复，因此被安乐死并被排除在研究之外。43.安乐死前期间(第11天)的攻击后数据如表1所示。与对照相比，两种疫苗接种方案的平均临床评分、存活时间、攻击后死亡动物的数量以及可以从血液中重新分离病原体的动物数量似乎都有所改善。如wo2019/115741中所报道的，针对血清型9、st16菌株的攻击保护水平似乎与用igm蛋白酶可获得的针对血清型2菌株的同源攻击的水平相当，并且似乎在‘741专利中发现的针对血清型9、st16的保护获得了显著认可。这表明在两种抗原之间具有协同效应。当其在单一疫苗中组合使用时，这种效果似乎更加明显，特别是给出更低的临床评分和更高的平均存活时间。44.表1：攻击后数据45.组别临床评分存活时间(天数)攻击后死亡阳性血液分离1149.42/112/112228.53/123/123525.08/129/1246.结论47.本研究设计比wo2019/115741中使用的设计更临界。因此，即使在使用替代疫苗时会达到相当的有效性，这也表明替代疫苗比wo2019/115741中描述的疫苗(即，单价igm蛋白酶或菌苗疫苗)有所改进。然而，发现使用新型组合疫苗，可以达到显著提高的疫苗有效性，表明抗原具有协同相互作用。当抗原组合在单独(单一)制剂中时，这些效果似乎更高。









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