神经酰胺增殖促进剂的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及神经酰胺增殖促进剂，其中通过施用含有二氢神经酰胺类的制剂来促进向各种神经酰胺类的转化和增殖。背景技术：2.皮肤具有作为屏障膜的非常重要的作用，避免来自外界的例如微生物、化学物质、和紫外线等生物学、化学、和物理性侵袭并防止例如水分等生物必需组分的损失。角质层位于表皮的最外层并且厚度为约20μm，起到屏障膜的作用。细胞间脂质像砂浆一样将砖块状堆积的角质形成细胞连接在一起以形成强屏障膜。已知神经酰胺构成该角质细胞间脂质中作为关键组分的脂质屏障，并在保持皮肤柔软和清新方面起到关键作用(非专利文献1和非专利文献2)。3.近年来，已经明确，在具有粗糙皮肤、干燥皮肤、和特应性皮炎的患者的皮肤中，这些角质细胞间脂质中的神经酰胺的含量明显低于健康人皮肤的。已试图通过将神经酰胺类施加或补充至粗糙皮肤和受损皮肤以改善皮肤屏障功能和保湿功能。4.另一方面，已试图通过使用大叶桉(eucalyptus robusta smith)、东方香蒲(typha orientalis presl)、野甘草(scoparia dulcis l.)或紫丁香(syringa oblata lindl.)等的提取物作为活性成分来促进神经酰胺产生机制以改善皮肤屏障功能和保湿功能(专利文献1)。5.图1显示神经酰胺的缩写。根据鞘氨醇碱基和构成酰胺侧链的长链脂肪酸的组合，将神经酰胺分类为12种，并可在本说明书中缩写。6.神经酰胺eos类(图1：cer[eos])可被称为神经酰胺1，神经酰胺ns类(图1：cer[ns])可被称为神经酰胺2，和神经酰胺nds类(图1：cer[nds])可被称为二氢神经酰胺2。[0007]此处，作为现有技术，已提出通过施用神经酰胺1、神经酰胺2、和神经酰胺3的混合物来促进神经酰胺生产的效果的报告(非专利文献3)、和使用由水、脂肪酸、胆固醇、和神经酰胺/磷脂构成的制剂的递送系统(专利文献2)。[0008]现有技术文献[0009]专利文献[0010]专利文献1：jp-a-h10-152428[0011]专利文献2：jp-t-2005-522463[0012]非专利文献[0013]专利文献1：downing d.t.,et al.,j.lipid.res.,24,759(1983)[0014]专利文献2：downing d.t.,et al.,j.invest.dermat.,84,410(1985)[0015]专利文献3：m.komorizono.,et al.,aesthetic dermatology,26(2),269(2016)技术实现要素：[0016]发明要解决的问题[0017]然而，专利文献1中所描述的从外界补充神经酰胺的方法限制了神经酰胺的种类，而试图从内部促进神经酰胺产生具有各种问题，例如需要到达存在生产促进剂所作用的转化酶的表皮深处(例如，在丝氨酸棕榈酰转移酶的情况中，到达成核基底层、棘层、和颗粒层)，进一步地，生产能力存在个体差异。因此，已期望更有效的制剂开发。[0018]在非专利文献3中描述的技术中，神经酰胺1、神经酰胺2、和神经酰胺3的昂贵混合物是必需的。在专利文献2中描述的技术中，作为系统构成组分的脂肪酸是必需的，神经酰胺类的具体实例包括昂贵的神经酰胺1、神经酰胺3、神经酰胺6ii、或作为神经酰胺np的前体的植物鞘氨醇(phytosphingosine)，如非专利文献3中所述。如上所述，单独使用神经酰胺的效果、和单独使用二氢神经酰胺2(神经酰胺nds)的效果、和不需要脂肪酸的系统的效果是完全未知的。[0019]在这样的情况下进行了本发明，本发明的目的在于提供在皮肤外用制剂中能够不仅从外界补充神经酰胺、并且还允许各种神经酰胺类增殖的制剂和技术。本公开中的神经酰胺增殖是指促进表皮角质层神经酰胺的生物合成能力和/或合成能力。[0020]用于解决问题的方案[0021]作为考虑到上述情况而进行的深入研究的结果，本发明人发现施用特定的神经酰胺类不仅可以从外界补充神经酰胺，还允许各种神经酰胺类增殖，并完成本发明。[0022]即，本发明包括以下内容。[0023][1]一种神经酰胺增殖促进剂，其包含由以下通式(1)表示的神经酰胺类。[0024][0025](式中，r1表示可具有羟基或双键的碳数为13至21的一价烃基，z表示可具有氢原子、乙酰基或羟基的碳数为14至24的酰基。)[0026][2]根据[1]所述的神经酰胺增殖促进剂，其中所述由通式(1)表示的神经酰胺类是由以下通式(2)表示的神经酰胺类。[0027][0028](式中，r1表示可具有羟基或碳-碳双键的碳数为13至21的一价烃基，z表示可具有氢原子、乙酰基或羟基的碳数为14至24的酰基。)[0029][3]根据[1]或[2]所述的神经酰胺增殖促进剂，其中通式(1)或通式(2)中的r1是碳数为13至21的一价饱和烃基。[0030][4]根据[1]至[3]中任一项所述的神经酰胺增殖促进剂，其还包含胆固醇、植物固醇、聚甘油脂肪酸酯、和多元醇的任何一种以上。[0031][5]根据[1]至[4]中任一项所述的神经酰胺增殖促进剂，其还包含胆固醇、单硬脂酸十甘油酯、丁二醇、和甘油的任何一种以上以及水，其中通式(1)或通式(2)中的r1是碳数为13至21的一价饱和烃基。[0032][6]根据[1]至[5]中任一项所述的神经酰胺增殖促进剂，其中要增殖的神经酰胺类是由以下通式(3)表示的神经酰胺类，[0033][0034](式中，r2表示可具有碳-碳双键和/或羟基的碳数为13至21的一价烃基，r3表示可具有羟基的碳数为13至31的二价饱和烃基，y表示氢原子或介由羟基的o-酰基键，在y为氢原子的情况下，r4不存在，在y为介由羟基的o-酰基键的情况下，r4表示可具有碳-碳双键的碳数为15至25的一价烃基。)[0035][7]根据[1]至[5]中任一项所述的神经酰胺增殖促进剂，其中要增殖的神经酰胺类是由以下通式(4)表示的神经酰胺类，[0036][0037](式中，r5表示具有碳-碳双键的碳数为13至21的一价烃基，x表示碳数为14至24的酰基。)[0038][8]根据[1]至[7]中任一项所述的神经酰胺增殖促进剂，其中分散颗粒的直径为0.45μm以下。[0039][9]根据[1]至[8]中任一项所述的神经酰胺增殖促进剂，其实质上无脂肪酸和/或磷脂，并且仅包含非离子性组分。[0040][10]一种皮肤化妆品、皮肤保护剂、毛发用组合物、唇部护理制剂、皮肤清洁剂、或沐浴剂，其包含根据[1]至[9]中任一项所述的神经酰胺增殖促进剂。[0041][11]一种用于在皮肤角质层中增殖和/或补充各种神经酰胺类的方法，所述方法是通过施用根据[1]至[9]中任一项所述的神经酰胺增殖促进剂来进行的。[0042]发明的效果[0043]如上所述，含有具有特定结构的神经酰胺类的本发明的神经酰胺增殖促进剂可以通过促进各种神经酰胺类的增殖以适当的平衡增加神经酰胺类。此外，由于制剂具有优异的稳定性、安全性、使用感，并且可以任选地在大范围的皮肤/毛发(头皮)用制剂中稀释，作为用于化妆品和药物的原料的用途显著扩大。附图说明[0044][图1]图1是显示神经酰胺的缩写的图。[0045][图2]图2是显示培养和制剂添加试验的图。[0046][图3]图3是显示神经酰胺eos类的定量结果的图。[0047][图4]图4是显示神经酰胺ns类的定量结果的图。[0048][图5]图5是显示神经酰胺nds类的定量结果的图。具体实施方式[0049]用于本发明的神经酰胺类是由下式(1)表示的已知化合物。[0050][0051](式中，r1表示可具有羟基或双键的碳数为13至21的一价烃基，z表示可具有氢原子、乙酰基或羟基的碳数为14至24的酰基。)[0052]通式(1)的化合物可获得自人或猪皮肤、牛脑、或红血球等的哺乳动物提取物、和大豆或小麦等的植物提取物。考虑到纯度，适当地使用通过已知生产方法来获得的合成产物。[0053]由通式(1)表示的化合物的具体实例包括2-十四烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇、2-十六烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇、2-十八烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇、2-二十烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇、2-油酰基氨基十八烷-1,3-二醇、2-亚油酰基氨基十八烷-1,3-二醇、2-(2-羟基十六烷酰基)氨基十八烷-1,3-二醇、2-(3-羟基十六烷酰基)氨基十八烷-1,3-二醇、2-十四烷酰基氨基十六烷-1,3-二醇、2-十六烷酰基氨基十六烷-1,3-二醇、2-十八烷酰基氨基十六烷-1,3-二醇、2-二十烷酰基氨基十六烷-1,3-二醇、2-油酰基氨基十六烷-1,3-二醇、2-亚油酰基氨基十六烷-1,3-二醇、2-(2-羟基十六烷酰基)氨基十六烷-1,3-二醇、和2-十八烷酰基氨基十八烷-1,3,4-三醇等。这些可单独使用一种或其两种以上组合使用。[0054]进一步地，作为用于本发明的神经酰胺类，特别优选使用由以下通式(2)表示的光学活性天然型神经酰胺类。[0055][0056](式中，r1表示可具有羟基或碳-碳双键的碳数为13至21的一价烃基，z表示可具有氢原子、乙酰基或羟基的碳数为14至24的酰基。)[0057]由通式(2)表示的化合物的具体实例包括(2s,3r)-2-十四烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-十六烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-十八烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-十九烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-二十烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-油酰基氨基十八烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-亚油酰基氨基十八烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-(2-羟基十六烷酰基)氨基十八烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-(3-羟基十六烷酰基)氨基十八烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-十四烷酰基氨基十六烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-十六烷酰基氨基十六烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-十八烷酰基氨基十六烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-十九烷酰基氨基十六烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-二十烷酰基氨基十六烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-油酰基氨基十六烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-亚油酰基氨基十六烷-1,3-二醇、(2s,3r)-2-(2-羟基十六烷酰基)氨基十六烷-1,3-二醇、和(2s,3s,4r)-2-十八烷酰基氨基十八烷-1,3,4-三醇。这些可单独使用一种或其两种以上组合使用。[0058]通式(1)或通式(2)中的r1特别优选为碳数为13至21的一价饱和烃基。将其中通式(1)或通式(2)中的r1为碳数为13至21的一价饱和烃基的化合物分类为二氢神经酰胺(神经酰胺nds)(图1中的cer(nds))。[0059]基于神经酰胺增殖促进剂的总量，本发明的神经酰胺增殖促进剂中的这些神经酰胺类的总含量优选为0.001质量％至10质量％、更优选0.01质量％至5质量％。[0060]除了上述神经酰胺类以外，本发明的神经酰胺增殖促进剂优选进一步包含例如胆固醇和植物固醇等固醇类、聚甘油脂肪酸酯类、和多元醇类的一种以上。通过组合使用这些组分，可适当地调节神经酰胺增殖促进剂的组分。[0061]固醇类的更具体的实例包括胆固醇、菜油甾醇(cambersterol)、豆甾醇(stigmasterol)、和谷甾醇(sitosterol)，并且特别优选作为构成角质层的天然组分的胆固醇。当组合使用固醇类时，相对于神经酰胺类，其含量优选为20质量％至150质量％。[0062]聚甘油酸脂肪酸酯类优选具有亲水性-亲油性平衡(h.l.b.)为10以上。聚甘油的脂肪酸酯的聚甘油基团的聚合度优选为5以上、特别优选为8至12。此外，脂肪酸残基优选为碳数为12至24的脂肪酸残基，例如月桂酸残基、肉豆蔻酸残基、棕榈酸残基、硬脂酸残基、山嵛酸残基、异硬脂酸残基、和油酸残基。脂肪酸残基的数量优选大于游离水性基团(liberate aquatic group)的数量。优选地，相对于脂肪酸残基的数量存在5至20个游离羟基。其具体优选实例包括单肉豆蔻酸十甘油酯(hlb14)、单硬脂酸五甘油酯(hlb11)、单硬脂酸十甘油酯(hlb13.5)、单异硬脂酸五甘油酯(hlb11)、和单油酸十甘油酯(hlb13)。可单独地包含这些组分或包含其两种以上的组合。[0063]这些组分起到亲水性表面活性剂的作用。聚甘油的脂肪酸酯类与水难溶性组分和醇类一起容易地形成液晶结构。当在基质的至少一部分中形成液晶结构时，神经酰胺组分作为易于进行经皮吸收的基质存在于皮肤上[0064]用于容易地产生液晶的处理方法的优选实例包括：1)加热并增容含有难溶性的神经酰胺类和醇类的基质构成组分，2)用预先加热并增容的、含有作为表面活性剂的聚甘油的脂肪酸酯和多元醇的、除了基质构成组分以外的非水性组分稀释基质构成组分，和3)将预先加热的水性组分添加至该稀释物，接着冷却。[0065]相对于神经酰胺类的总量，聚甘油的脂肪酸酯的量优选为2至20倍质量。[0066]多元醇类的实例包括1,3-丁二醇、二丙二醇、甘油、二甘油、异戊二醇、1,2-戊二醇、和1,2-己二醇。这些可单独地使用或其两种以上组合使用。特别地，优选使用1,3-丁二醇和甘油。[0067]对多元醇类的含量没有特别限制，但作为神经酰胺类在水中的稳定的分散制剂，优选以相对于神经酰胺类的量为10至50倍的量使用多元醇类。[0068]本发明的神经酰胺增殖促进剂可包含处于分为非水性组分相和水相的状态的、通常用于皮肤和毛发外用制剂的任选组分，，只要不损害本发明的效果即可。这样的任选组分的实例包括：烃类，例如角鲨烷、液体石蜡、轻质液体异构烷烃(light liquid isoparaffin)、重质液体异构烷烃(heavy liquid isoparaffin)、微晶蜡、和固体石蜡；有机硅类，例如二甲基聚硅氧烷、苯基甲基聚硅氧烷、环甲基聚硅氧烷、氨端聚二甲基硅氧烷(amodimethicone)、和聚醚改性硅；酯类，例如霍霍巴油、棕榈蜡、日本蜡、蜂蜡、鲸蜡、辛基十二醇油酸酯、肉豆蔻酸异丙酯、二新戊二醇二异硬脂酸酯、和二异硬脂醇苹果酸酯；脂肪酸类，例如硬脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、异硬脂酸、异棕榈酸、山嵛酸、和油酸；甘油三酯类，例如蓖麻油、椰子油、氢化椰子油、山茶油、小麦胚芽油、异硬脂酸甘油三酯、异辛酸甘油三酯、和橄榄油；多元醇类，例如1,3-丁二醇、甘油、二甘油、二丙二醇、聚乙二醇、1,2-戊二醇、1,2-己二醇、和异戊二醇；有机粉末类，例如结晶纤维素、交联的甲基聚硅氧烷、聚乙烯粉末、和丙烯酸树脂粉末；粉末类，其可为表面处理的，例如滑石、云母、高岭土、碳酸镁、碳酸钙、二氧化钛、铁氧化物、普鲁士蓝(prussian blue)、群青(ultramarine)、云母钛(titanium mica)、高岭土钛(titanium sericite)、和二氧化硅；增稠剂类，例如丙烯酸-甲基丙烯酸烷基酯共聚物和/或其盐、羧乙烯基聚合物和/或其盐、黄原胶、或羟丙基纤维素；活性成分，例如维生素类如视黄醇、维a酸、生育酚、核黄素(riboflavin)、吡哆醇(pyridoxin)、抗坏血酸、抗坏血酸磷酸酯盐，和类固醇类如雌二醇、乙炔雌二醇、和雌三醇；防腐剂类，例如苯氧乙醇、对羟基苯甲酸酯、葡萄糖酸洗必泰(hibitane gluconate)、苯扎氯铵；和uv吸收剂类，例如二甲基氨基苯甲酸酯、肉桂酸酯、和二苯酮(benzophenones)。这些可以单独使用一种或其两种以上组合使用。[0069]然而，需要用碱性剂来调节例如硬脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、异硬脂酸、异棕榈酸、山嵛酸、和油酸等脂肪酸类的ph，并且由例如钠或钾等碱性盐的中和可导致皮肤刺激。因此，除了故意用作皮肤/毛发清洁剂的活性成分以外，不优选使用脂肪酸类，并且优选实质上不含有脂肪酸。此外，从表面活性剂作用等影响本发明的本质的风险的观点来看，优选实质上不含有例如卵磷脂等磷脂。从避免影响产物的ph的风险的来看，优选本发明的神经酰胺增殖促进剂仅含有非离子性组分。非离子性组分主要是指非离子性表面活性剂，其实例包括聚甘油的脂肪酸酯类。[0070]本发明的神经酰胺增殖促进剂可施加至任何用于皮肤/毛发的外用药物的制剂。含有本发明的神经酰胺增殖促进剂的制剂的实例包括皮肤化妆品、皮肤保护剂、毛发用组合物、唇部护理制剂、皮肤清洁剂、和沐浴剂。[0071]本发明的神经酰胺增殖促进剂中，分散颗粒的直径优选为0.45μm以下。当神经酰胺类的粒径落入该范围内时，神经酰胺类可穿过制剂开发中的任何处理膜，这是优选的。为了将神经酰胺类的粒径设定在上述范围内，例如，神经酰胺增殖促进剂优选包含聚甘油脂肪酸酯。[0072]在现有技术中，已知通过施用含有神经酰胺的制剂作为外用制剂来改善皮肤的屏障功能和保湿功能，但本发明的神经酰胺增殖促进剂、特别是通过含有具有二氢鞘氨醇骨架的二氢神经酰胺，具有转化为各种神经酰胺类的效果和/或促进各种神经酰胺类的增殖效果的效果。这种知识完全不为人所知。[0073]根据本发明的神经酰胺增殖促进剂，优选地，增殖由以下通式(3)表示的神经酰胺类(神经酰胺eos类)和由以下通式(4)表示的神经酰胺类(神经酰胺ns类)。[0074][0075](式中，r2表示可具有碳-碳双键和/或羟基的碳数为13至21的一价烃基，r3表示可具有羟基的碳数为13至31的二价饱和烃基，y表示氢原子或介由羟基的o-酰基键，当y为氢原子时，r4不存在，当y为介由羟基的o-酰基键时，r4表示可具有碳-碳双键的碳数为15至25的一价烃基。)[0076][0077](式中，r5表示具有碳-碳双键的碳数为13至21的一价烃基，x表示碳数为14至24的酰基。)[0078]实施例[0079]接下来，将参照实施例和试验例更详细地描述本发明，但本发明不限于这些实施例。[0080]在本实施例中，使用takasago international co.,ltd.制造的神经酰胺nds，使用avanti polar lipids co.,ltd.制造的那些作为除了神经酰胺nds以外的神经酰胺。[0081](实施例1)[0082]根据以下配方制备了光学纯度和化学纯度为95％以上的含有(2s,3r)-2-十八烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇(二氢神经酰胺2＝神经酰胺nds)的神经酰胺分散制剂(神经酰胺组合物)。[0083]在约120℃下均匀溶解由组分(a)构成的脂质组分，随后在相同温度下添加组分(b)进行溶解至透明，然后逐步滴加预先加热至80至90℃的组分(c)。[0084]组分(a)[0085]神经酰胺nds：ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1.00质量份[0086]胆固醇：ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ0.75质量份[0087]组分(b)[0088]单肉豆蔻酸十甘油酯：ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ4.50质量份[0089]1,3-丁二醇：ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ20.00质量份[0090]甘油：ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ10.00质量份[0091]组分(c)[0092]水：ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ63.75质量份[0093](比较例1)[0094]除了不使用神经酰胺nds以外，以与实施例1中相同的配方制备无神经酰胺制剂(安慰剂＝blk)。[0095](实施例2)[0096]使用聚氧乙烯氢化蓖麻油(hco60)代替实施例1的单肉豆蔻酸十甘油酯来制备神经酰胺制剂(神经酰胺组合物)。[0097](实施例3)[0098]使用聚甘油(13)聚氧丁烯(14)十八烷基醚代替实施例1的单肉豆蔻酸十甘油酯来制备神经酰胺制剂(神经酰胺组合物)。[0099](比较例2)[0100]使用神经酰胺np代替实施例1的神经酰胺nds来制备神经酰胺制剂(神经酰胺组合物)。[0101](试验例1)通过神经酰胺增殖促进剂的稀释和滤纸过滤来定量神经酰胺渗透量[0102]在对产生的神经酰胺制剂进行细胞培养试验时，在用注射器式过滤器过滤神经酰胺制剂的磷酸盐缓冲盐水稀释液之前和之后定量神经酰胺的量。[0103]内部标准溶液的制备：[0104]作为内部标准溶液，精确称取约0.40g的硬脂酸乙酯(nakarai规格特级，nacalai tesque,inc.制造)并通过添加四氢呋喃来溶解，以制备具有20ml的精确体积的溶液。[0105]校准曲线的制备：[0106]通过以下方法制备校准曲线。[0107]精确称取约50g的(2s,3r)-2-十八烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇标准产品(该产品用乙醇再结晶三次并干燥，未观察到相关物质)并用四氢呋喃稀释至50ml以制备标准原液。精确称取1ml、2ml和3ml的标准原液，精确添加1ml的内部标准溶液，然后添加甲醇以达到10ml，这用作标准溶液。在以下操作条件下通过液相色谱法对这些溶液的各20μl进行试验，从所得色谱图确定(2s,3r)-2-十八烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇的峰面积与内部标准物质的峰面积的比。将该比绘制在纵轴上，将(2s,3r)-2-十八烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇标准产品的质量与内部标准物质的质量的比绘制在横轴上，从而制备校准曲线。[0108]神经酰胺渗透量的定量[0109]用磷酸盐缓冲盐水10倍稀释实施例1至3的各神经酰胺制剂。在对过滤前的稀释液、和通过用注射器式过滤器(millipore制造，myrex-hv过滤器，0.45μm)过滤稀释液来获得的稀释液进行以下操作。称取10.0ml的稀释液，通过旋转式蒸发器在60℃和200至20mmhg下经15分钟从稀释液去除溶剂。为了干燥和固化样品，添加5ml的四氢呋喃，用超声波照射混合物，接着加热至60℃以获得悬浮液。用四氢呋喃将悬浮液稀释至10ml，称取2ml的上清液，向其添加2ml的内部标准溶液(内部标准物质：硬脂酸乙酯)，用甲醇(wako pure chemical industries,ltd.制造，用于液相色谱法)稀释混合物至10ml以制备试验溶液。对于20μl的试验溶液，通过液相色谱法进行试验，确定(2s,3r)-2-十八烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇的峰面积与内部标准物质的峰面积的比。此外，从预先制备的校准曲线确定质量比，并通过以下计算公式来定量。[0110]计算公式：[0111](2s,3r)-2-十八烷酰基氨基十八烷-1,3-二醇的量(mg)＝a×从校准曲线确定的质量比[0112]a：1ml的内部标准溶液中内部标准物质(硬脂酸乙酯)的量(mg)[0113]在以下条件下通过高效液相色谱法进行测量。检测器：紫外线吸收光度计(测量波长：210nm)，柱：inertsil ods-3(nacalai tesque,inc.制造，4.6mm×25cm)，柱温度：40℃，流动相：甲醇，流速：1.0ml/分钟。[0114]过滤后的神经酰胺渗透量(透过率)如下表1所示。[0115][表1][0116]实施例199.5％实施例268.5％实施例375.7％[0117]从上述结果，发现可通过含有单肉豆蔻酸十甘油酯来制备具有细粒径的神经酰胺增殖促进剂。[0118](试验例2)神经酰胺生长试验[0119]《人角质形成细胞培养和制剂添加试验》[0120]使用未分化和分化后期的培养的人角质形成细胞(kc)进行实验。在含有0.07mm钙的无血清kc生长培养基中培养人角质形成细胞，当kc占据培养皿的总面积的约60％至70％(约60％至70％汇合度)时，收集细胞作为未分化细胞。在含有0.07mm的钙的无血清kc生长培养基中培养kc，当kc占据培养皿的总面积的约70％至80％时(约70％至80％汇合度)，用包含含有1.2mm钙的10％胎牛血清、10μg/ml胰岛素、0.4μg/ml氢化可的松、和50μg/ml维生素c的dmem和ham′s f-12(2:1，v/v)替换培养基，接着培养8天。然后，在包含含有1.2mm钙的10％胎牛血清、10μg/ml胰岛素、0.4μg/ml氢化可的松、和50μg/ml维生素c的dmem培养基中培养3天的细胞用作分化后期的培养的人角质形成细胞(ldk)。[0121]从第0天至第10天、以如图2中所示的过程进行培养，持续10天，在最后一天对各种神经酰胺类进行定量。从培养的第二天至第四天、第六天、第八天、第九天、和第十天，用培养基稀释实施例1中制备的神经酰胺制剂(1％神经酰胺nds溶液)，用孔径为0.45μm的滤纸过滤，分别向其添加15.9μl、79.6μl、和397.7μl(＝10μm、50μm、250μm)。此外，添加79.6μl的比较例1中制备的不含有神经酰胺的blk溶液，接着进行培养。[0122]《神经酰胺增殖试验》[0123]将100μg的各个上述制备的培养溶液和100pmol的内部标准物质混合物(c17(碳数17)-神经酰胺ns＝n-十八烷酰基氨基-c17鞘氨醇、c17-鞘氨醇、c17-二氢鞘氨醇)添加至0.1n hcl水溶液:氯仿:甲醇(体积比1:2:1)的混合溶液并搅拌，然后真空干燥下层的有机相，重复提取干燥操作两次。将所得残余物溶解于200μl的甲醇/乙腈等量混合物，并通过以下液相色谱串联质谱(lc-esi-ms/ms)系统(api 3200qtrap mass,abciex)进行分析。[0124]分析精度的最优化：使用各神经酰胺标准物质的混合物(鞘氨醇碱基的碳数为14至26的神经酰胺nds、和神经酰胺ns)，并调整所有离子源参数和离子化条件以最优化分析精度。[0125]通过hplc(shiseido co.,ltd.制造的hts hplc系统)、用反相kintex c18柱(2.1×50mm,id＝2.6μm)分析10μl的提取样品。用溶剂a(meoh:0.05％甲酸水溶液：80:20)预先平衡柱，将脂质溶解于溶剂b(2-丙醇:0.05％甲酸甲醇溶液：99:1)，利用以0.3ml/分钟的流速施加的梯度，通过电喷雾电离在正模式(positive mode)下检测质谱。将5mm的甲酸铵添加至溶剂a和b二者以促进缓冲作用和灵敏度改善。[0126]在ms/ms中，在第一阶段捕捉各种神经酰胺组分的前体离子(precursor ion)m/z[m+h]+，在第二阶段进行碰撞和分解，对第三阶段的分解中获得的产物离子m/z进行检测。[0127]使用analyst 1.5.1(applied biosystems制造)，通过与获得自内部标准物质的校准曲线进行比较来进行各种神经酰胺的定量，并计算为角质层中神经酰胺量pmol/g。[0128]各种神经酰胺的监测参数示于表2。[0129][表2][0130][0131](试验结果2-1)[0132]神经酰胺eos类的定量结果示于图3。[0133]如图3中明确看出的，确证了在向其添加神经酰胺nds的培养体系中，具有在ω-位置处由亚油酸酯化的碳数为30和32的ω-羟基酸酰胺键的神经酰胺eos类显著增加。注意，#表示相对于未向其添加神经酰胺nds的分化的角质形成细胞培养细胞(ldk)有显著差异p《0.01。[0134](试验结果2-2)[0135]神经酰胺ns类的定量结果示于图4。[0136]如图4中明确看出的，确证了在向其添加神经酰胺nds的培养体系中，具有酰基链长度为14至26的酰胺键并且在鞘氨醇碱基的4-位处具有双键的神经酰胺ns类显著增加。注意，#表示相对于未向其添加神经酰胺nds的分化的培养细胞(ldk)有显著差异p《0.01，*表示相对于未分化的细胞(udk)有显著差异p《0.01。[0137](试验结果2-3)[0138]神经酰胺nds类的定量结果示于图5。[0139]如图5中明确看出的，确证了在向其添加神经酰胺nds的培养体系中，具有酰基链长度为14至26的酰基链长度不同的神经酰胺nds类显著增加。注意，#表示相对于未向其添加神经酰胺nds的分化的培养细胞(ldk)有显著差异p《0.01，*表示相对于未分化的细胞(udk)有显著差异p《0.01。[0140]从上述试验结果，揭示了通过添加含有神经酰胺nds(酰基链长度c18)的神经酰胺制剂，不仅具有不同的酰基链长度的神经酰胺nds增殖，并且例如神经酰胺ns和神经酰胺eos等各种神经酰胺类也增殖。[0141]在比较例2中制备的神经酰胺np制剂中，没有各种神经酰胺类显著增殖的趋势。[0142](实施例4)[0143]根据常规方法，按照下表(表中的单位：质量％)中示出的配方制备100g的含有0.1质量％的神经酰胺nds的神经酰胺增殖用润肤液。[0144][表3][0145]浓缩的甘油3.001,3-丁二醇5.00对羟基苯甲酸酯0.20香料(fragrance)0.01实施例1的神经酰胺组合物10.00纯化水至100.00[0146](实施例5)[0147]根据常规方法，按照下表(表中的单位：质量％)中示出的配方制备100g的含有0.25质量％的神经酰胺nds的神经酰胺增殖用美容液(serum)。[0148][表4][0149]羟乙基纤维素0.50浓缩的甘油5.001,3-丁二醇5.00对羟基苯甲酸酯0.20香料0.01实施例1的神经酰胺组合物25.00纯化水至100.00[0150](实施例6)[0151]根据常规方法，按照下表(表中的单位：质量％)中示出的配方制备100g的含有0.05质量％的神经酰胺nds的神经酰胺增殖用滋润霜。[0152][表5][0153]氢化油6.00硬脂酸3.00鲸蜡醇4.00角鲨烯2.00新戊二醇二癸酸酯8.00聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯(20e.o.)4.00亲脂性单硬脂酸甘油酯2.30硬脂酰基-n-甲基牛磺酸钠1.70浓缩的甘油1.001,3-丁二醇7.00浓缩的甘油3.00对羟基苯甲酸酯0.25香料0.05实施例1的神经酰胺组合物5.00纯化水至100.00[0154](实施例7)[0155]根据常规方法，按照下表(表中的单位：质量％)中示出的配方制备100g的含有0.05质量％的神经酰胺nds的神经酰胺增殖用滋润乳。[0156][表6][0157]硬脂酸1.00异硬脂酸胆固醇酯2.00霍霍巴油4.00角鲨烯8.00山梨醇酐倍半油酸酯0.80聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯(20e.o.)1.201,3-丁二醇5.00对羟基苯甲酸酯0.25l-精氨酸0.40羧乙烯基聚合物0.20香料0.05实施例1的神经酰胺组合物5.00纯化水至100.00[0158](实施例8)[0159]根据常规方法，按照下表(表中的单位：质量％)中示出的配方制备100g的含有0.05质量％的神经酰胺nds的神经酰胺增殖用调理香波。[0160][表7][0161]聚氧乙烯月桂醇醚硫酸钠(polyoxyethylene laureth ether sodium sulfate)14.00月桂酰胺丙基甜菜碱4.00椰子油脂肪酸二乙醇酰胺3.00阳离子化纤维素0.50乙二醇二硬脂酸酯1.00对羟基苯甲酸酯0.25柠檬酸qs香料0.50实施例1的神经酰胺组合物5.00纯化水至100.00[0162](实施例9)[0163]根据常规方法，按照下表(表中的单位：质量％)中示出的配方制备100g的含有0.05质量％的神经酰胺nds的神经酰胺增殖用洗发水。[0164][表8][0165]硬脂基三甲基氯化铵1.00鲸蜡醇3.00甲基聚硅氧烷1.00聚氧乙烯硬脂醚1.00丙二醇5.00对羟基苯甲酸酯0.25氢氧化钠qs柠檬酸qs香料0.50实施例1的神经酰胺组合物5.00纯化水至100.00[0166](实施例10)[0167]根据常规方法，按照下表(表中的单位：质量％)中示出的配方制备100g的含有0.05质量％的神经酰胺nds的神经酰胺增殖用护发素。[0168][表9][0169]硬脂基三甲基氯化铵0.50二硬脂基二甲基氯化铵1.50霍霍巴油2.50鲸蜡醇4.50液体羊毛脂2.00聚氧乙烯硬脂醚1.50浓缩的甘油7.00对羟基苯甲酸酯0.25氢氧化钠qs柠檬酸qs香料0.50实施例1的神经酰胺组合物5.00纯化水至100.00[0170](实施例11)[0171]根据常规方法，按照下表(表中的单位：质量％)中示出的配方制备100g的含有0.05质量％的神经酰胺nds的神经酰胺增殖用生发水。[0172][表10][0173]日本獐牙菜提取物(swertia japonica extract)2.00l-薄荷醇0.10桧木醇0.01香料0.10对羟基苯甲酸酯0.20聚氧乙烯氢化蓖麻油0.50实施例1的神经酰胺组合物5.00纯化水至100.00[0174](实施例12)[0175]根据常规方法，按照下表(表中的单位：质量％)中示出的配方制备100g的含有0.05质量％的神经酰胺nds的神经酰胺增殖用液体沐浴剂。[0176][表11][0177]二丙二醇50.001,3-丁二醇10.00对羟基苯甲酸酯0.20香料1.00实施例1的神经酰胺组合物5.00纯化水至100.00[0178]尽管已使用具体实施方案详细描述了本发明，对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，各种修改和变化是可能的。本技术是基于2020年3月9日提交的日本专利申请(日本专利申请号2020-40142)，前述的全部内容通过引用并入本文。









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