用于组装核酸的方法与流程

有机化合物处理,合成应用技术用于组装核酸的方法1.相关申请的交叉参考2.本技术根据35usc§119(e)要求于2020年3月3日提交的美国申请序列号62/984,670的权益，所述美国申请的全部内容通过引用整体并入本文。技术领域3.本发明涉及以低错误率合成并构建核酸的方法。背景技术：4.dna组装是合成生物学和基因工程的关键技术，其吸引了巨大努力来改进dna组装方法的效率、保真度和简单性。各种dna组装方法是已知的并具有特别的优势。gibson组装方法利用dna序列的互补性(gibson等人,2009)，而golden gate组装基于限制性消化和连接方法。dna合成的一个重要方面是在dna序列中实现和维持序列保真度，即产生具有非常低错误率的dna分子非常重要。起始寡核苷酸的化学合成将错误输入到合成序列中，然后所述错误随着期望dna分子的组装和扩增而传播。5.通过使用错误校正酶来减少由合成寡核苷酸构建的合成dna中的错误，已经实现了提高dna合成和组装的保真度的目标。虽然错误校正酶的使用已经是重要的发展，但其使用也有缺点。此外，目前的方法通常依赖于在dna芯片或其它固相装置上合成期望dna分子，从而使得所述方法基本上不太适于自动化合成。这些方法也很耗时，并且在dna合成中效率较低。仍然需要组装由合成寡核苷酸产生的且具有非常高的序列保真度的dna分子并且不需要使用错误校正酶的新方法。技术实现要素：6.本发明提供了组装具有期望序列的dna分子的方法。所述方法涉及使dna连接酶与要组装的多个短寡核苷酸接触，以及进行连接酶链式反应，以由此产生一组多核苷酸。所述多个寡核苷酸中的寡核苷酸与所述多个寡核苷酸中的至少另一个寡核苷酸的序列重叠并互补，并且所述多个寡核苷酸中的至少50％寡核苷酸的长度为8-22个核苷酸。使一组多核苷酸任选地在混合物中与dna聚合酶和dntp接触以连接所述一组多核苷酸，并由此通过聚合酶链式组装产生具有期望序列的dna分子。可以使用聚合酶链式组装反应或另一种寡核苷酸组装反应(例如，osos)任选地组装所述dna片段，并任选地通过pcr扩增。7.在第一方面，本发明提供了组装具有期望序列的dna分子的方法。所述方法涉及使dna连接酶与多个短寡核苷酸接触以产生混合物，所述多个短寡核苷酸具有要组装的所述dna分子的所述期望序列的至少一部分。所述多个短寡核苷酸中的至少一部分短寡核苷酸与所述多个短寡核苷酸中的至少另一个短寡核苷酸的序列的一部分重叠并互补，并且所述短寡核苷酸中的至少两个短寡核苷酸在与其互补序列结合时彼此邻接。所述多个短寡核苷酸中的至少50％短寡核苷酸的长度可以为8-30个核苷酸。所述方法还涉及对所述混合物进行连接酶链式反应，由此产生一组多核苷酸；以及使所述一组多核苷酸与dna聚合酶和dntp接触，以连接所述一组多核苷酸，并且由此组装所述具有所述期望序列的dna分子。8.在一个实施例中，所述一组多核苷酸通过聚合酶循环组装和/或通过dna组装反应(例如，osos反应)连接。在一个实施例中，所述方法涉及在所述使所述短寡核苷酸与所述dna连接酶接触之前或同时，使所述多个短寡核苷酸与激酶接触。在一个实施例中，所述dna连接酶是热稳定dna连接酶，例如，t4 dna连接酶或taq连接酶。所述邻接的短寡核苷酸可以具有第一短寡核苷酸的磷酸化5'端核苷酸和第二短寡核苷酸的3'端核苷酸上的3'羟基。所述方法可以包含使用所述聚合酶链式反应扩增所述具有所述期望序列的dna分子。在一个实施例中，所述方法在溶液中进行。在各个实施例中，所述具有所述期望序列的dna分子的长度可以为100-10,000个碱基对或100-5,000个碱基对。在一个实施例中，所述期望序列进一步包括通用5'侧接序列和通用3'侧接序列。所述方法还可以涉及将所述多组多核苷酸的多个池组合以通过pca(聚合酶循环组装)连接所述多核苷酸。9.在一个实施例中，可以完成所述聚合酶链式反应的至少10次循环以用于扩增所述具有所述期望序列的dna分子。在各个实施例中，所述多个短寡核苷酸可以含有至少10个短寡核苷酸、或至少20个短寡核苷酸、或2个到250个短寡核苷酸。在一个实施例中，所述多个短寡核苷酸的长度为10-18个核苷酸。所述多个短寡核苷酸中的至少50％短寡核苷酸的长度可以为10-18个核苷酸。在另一个实施例中，在开始所述方法时，所述多个寡核苷酸中的至少75％寡核苷酸的长度为6-18个、或10-18个或16-18核苷酸。所述方法可以在不使用限制性酶的情况下进行。通过所述方法产生的经组装期望序列dna分子的错误率可以小于每2000个碱基对1个错误或小于每14000个碱基对1个错误。所述错误率可以在不使用错误校正酶的情况下在所述方法中获得。10.在一些实施例中，所述多个短寡核苷酸包括于寡核苷酸的至少15个池中。所述方法可以完全在体外完成。在一些实施例中，所述寡核苷酸可以是8聚体或16聚体。在所述方法中组装的所述dna分子可以是无瘢痕的，即可以以无瘢痕组装方式组装。在一个实施例中，所述多个短寡核苷酸包括多于64个短寡核苷酸。所述方法可以在不使用接头、衔接子或间隔子dna分子的情况下进行。在所述方法中，所述连接酶链式反应可以具有变性、退火和连接的至少5次循环。在任何实施例中，所述多个短寡核苷酸可以具有多于64个短寡核苷酸。并且在各个实施例中，所述混合物中少于10％或少于1％寡核苷酸的长度超过20个或超过30个核苷酸。附图说明11.图1是本发明的一个实施例的总体图示。示出了方法的各方面，包含在方法中的单链寡核苷酸、退火、连接和通过连接酶连接的邻接寡核苷酸。还描绘了任选的进一步组装和/或扩增。12.图2是琼脂糖凝胶的图示，其示出了240bp产物的形成。示出了由七组重叠的14×8聚体组装240bp产物的结果。13.图3是琼脂糖凝胶的图示，其展示了将来自16聚体池的gfp组装成901bp gfp序列的结果。泳道1示出了来自32×16聚体的六个池的合成，然后将所有均放置到一个池中以进行pca和pcr。泳道2示出了来自64×16聚体的2个子池的合成，并且然后将其放置到一个池中以进行lcr。lcr之后是pca和pcr(lcr-》pca-》pcr)。14.图4a-4b。图4a是琼脂糖凝胶的图示，其展示了组装1927bp和1609bp的结果。ha和na(分别)来自30聚体池和40聚体池。泳道1：用16聚体的子池，用lcr进行组装，其中每个子池含有64个与相邻子池重叠(128bp)的16聚体寡核苷酸。泳道2示出了全部使用16聚体进行lcr。泳道3：全部使用30聚体进行lcr。泳道4：全部使用40聚体进行lcr。方案如实例1所示。图4b是琼脂糖凝胶的图示，其示出了使用lcr然后使用pca和pcr由八个16聚体和四个16聚体的池形成的ha和na的组装体的稀释度。lcr的稀释度1-4为2.5x、5x、10x和20x。15.图5示出了凝胶，其展示通过lcr然后通过pca和pcr扩增进行的对由16聚体的26个重叠池组装的10kb dna产物的组装。16.图6是琼脂糖凝胶的图示，其展示了由16聚体、18聚体或22聚体组装32个gc含量可变的构建体的结果，每个构建体在1个池中组装。每个凝胶的柱1-8示出了根据每个凝胶上的柱1-8组装的构建体的大小：1.200bp；2.400bp；3.600bp；4.800bp；5.1000bp；6.1200bp；7.1500bp；8.1800bp。根据实例1的方案对寡核苷酸进行lcr-pca-pcr。17.图7是琼脂糖凝胶的图示，其示出了针对16聚体、18聚体和22聚体组装的错误率和无错误构建体百分比。er表示错误率，％efc表示所获得的无错误构建体百分比。用16聚体达到的总错误率为11,000个碱基对1个错误，并且无错误构建体的百分比为88-97％。具体实施方式18.本发明提供了组装具有期望序列的dna分子的方法。所述方法涉及使dna连接酶与多个短寡核苷酸接触，以由此在混合物中产生一组多核苷酸或dna片段，所述多个短寡核苷酸包括要组装的dna分子的至少一部分。所述多个寡核苷酸中的至少一部分寡核苷酸与所述多个寡核苷酸中的至少另一个寡核苷酸的序列重叠并互补，并且所述多个寡核苷酸中的至少50％寡核苷酸的长度可以为8-22个核苷酸。所形成的混合物可以与dna聚合酶和dntp接触，并且任选地进行dna组装反应(例如，osos或pca)以连接一组dna片段，并由此通过聚合酶链式组装产生具有期望序列的dna分子。因此，所述方法可以应用于分级dna组装方法。可以使用连接酶链式反应来连接所述多个寡核苷酸，并且可以使用聚合酶循环组装(pca)和/或osos组装来组装dna片段，并且任选地使用pcr或另一种dna扩增程序来扩增。19.多核苷酸和dna片段的合成重点在于在合成中使用较长的寡核苷酸，以便使形成更大片的dna的能力最大化，并且由此优化合成。据信，较长的寡核苷酸是有益的，因为所述寡核苷酸跨重复区域的能力更强，并且由于pcr和其它dna组装或扩增反应中较高的熔融温度(tm)，所述寡核苷酸能够在组装反应中提供更大的特异性。然后使用错误校正酶(例如，错配核酸内切酶)对这些过程产生的寡核苷酸或dna片段进行错误校正，以去除错误并提高期望dna序列的准确性。在错误校正之后，可以使用dna扩增程序组装和/或扩增dna片段。20.虽然已认为连接酶链式反应(lcr)需要较长的寡核苷酸来为溶液中寡核苷酸的退火提供充足的机会，但是本发明人意外地发现，当对如本文所公开的短寡核苷酸进行连接酶链式反应时，获得的产物dna序列的序列保真度更高。序列保真度显著增加，以至于意外消除了进行错误校正步骤的需要，例如使用错误校正酶来校正错配核苷酸对以及实现更高序列保真度的步骤。本发明人还发现，当在溶液中对短寡核苷酸进行连接酶链式反应时，可以获得所描述的益处。在任何实施例中，所述方法可以在不使用任何类型的限制性酶(例如，限制性核酸内切酶)的情况下进行。在任何实施例中，所述方法可以完全在体外进行，即在不使用克隆或在不需要在活生物体中克隆核酸的情况下进行。在任何实施例中，所述方法可以在溶液中进行，即在所述方法(或其任何步骤)中没有任何寡核苷酸(或形成多核苷酸的任何部分)或反应组分与dna芯片、珠粒、表面或其它固相结合或固定在其上。因此，在一些实施例中，整个形成的寡核苷酸或dna片段在溶液中，即在所述方法中的任何点，甚至起始寡核苷酸或种子寡核苷酸(例如，表示多核苷酸链的末端)均没有与固体载体结合。因此，所述方法非常适于自动化合成，并提供高产率的高保真产物dna。可以进行任何实施例，使得没有反应组分固定在固相上。21.连接是指以共价键共价连接多核苷酸序列以形成单一序列。连接酶可以催化第一寡核苷酸的5'-p端与第二寡核苷酸的3'-oh端之间形成共价磷酸二酯键。第一寡核苷酸和第二寡核苷酸中的任一个或两者可以退火到互补链，并且在连接酶的作用下，携带5'-p和3'-oh的核苷酸可以彼此相邻。在其它实施例中，连接还可以涵盖共价连接寡核苷酸的其它方式，例如使用化学方式。如本文所使用的，术语寡核苷酸(oligo)用于表示寡核苷酸(oligonucleotide)。22.方法23.所述方法通常涉及提供一个或多个池，所述池含有本文所描述的多种任何长度的短寡核苷酸。在一些实施例中，可以用激酶处理短寡核苷酸以添加5'磷酸基团，但是5'磷酸基团还可以在化学寡核苷酸合成期间添加或在进行合成反应(例如，lcr)的同时添加。因此，短寡核苷酸可以在短寡核苷酸与dna连接酶接触之前或同时，或者在lcr之前或之后与激酶接触。在一些实施例中，反应可以任选地在热循环仪上进行，以将初始寡核苷酸或短寡核苷酸连接在一起，因此形成更大的寡核苷酸或dna片段。在一个实施例中，这可以通过对所述多个短寡核苷酸进行连接酶循环反应(lcr)来完成。然后，所得dna片段(或更大的寡核苷酸)可以进行进一步组装和/或扩增反应，以构建更大的dna分子或扩增其数量。术语多核苷酸是指由核苷酸单元构成的聚合物。术语寡核苷酸是指具有至多30个核苷酸的多核苷酸。dna片段是指具有超过30个核苷酸的多核苷酸。24.短寡核苷酸可以以池或组的形式提供，以用于合成dna片段或较长的寡核苷酸。在任何实施例中，短寡核苷酸可以使用化学合成方法合成。一组包括将被连接成较长的寡核苷酸分子的所有寡核苷酸，所述较长的寡核苷酸分子随后可以被进一步组合以制成更大的dna片段或寡核苷酸。一组可以包括于具有重叠寡核苷酸的单个池中，或者可以包括于多于一个的池中，所述一组将在所述方法中组合以形成较长的寡核苷酸。一个或多个池中的短寡核苷酸可以包括一组，并且一组中的寡核苷酸可以与所述一组中的至少另一个寡核苷酸的至少一部分，或所述池或所述一组中的两个寡核苷酸，或所述池或所述一组中的多于两个寡核苷酸重叠并互补(就watson-crick碱基配对而言)。在一个实施例中，寡核苷酸可以以多组的形式提供，其中每组包括于两个池中。在不同实施例中，寡核苷酸可以在单个池中组装，或者通过组合两个池来组装。可以将所述两个池组合并进行lcr，并任选地进行pca和/或osos和/或pcr，并且由此产生较长的寡核苷酸或dna片段。然后，寡核苷酸或dna片段的一个或多个池还可以进行lcr，以及任选地osos和/或pca和/或pcr。因此，可以进行分级组装，以得到具有确定和期望序列的产物dna分子。确定和期望的序列可以是在方法开始之前决定的特定的和预定义序列，并且短寡核苷酸可以被设计成在方法中产生特定的确定和期望序列。25.短寡核苷酸一起可以包括要组装并具有期望序列的dna分子的序列的至少一部分。所述方法可以根据需要使用尽可能多的池来执行。在各个实施例中，可以利用本文所描述的大小的短寡核苷酸的一个池、或两个池、或多于2个池、或多于4个池、或多于8个池、或多于20个池或多于25个池。在各个实施例中，池可以含有至少8个短寡核苷酸、或至少16个短寡核苷酸、或至少32个短寡核苷酸、或至少64个短寡核苷酸、或8-32个短寡核苷酸或8-64个短寡核苷酸。在各个实施例中，可以将聚乙二醇或甘油或甜菜碱或山梨糖醇或其任何组合添加到进行lcr的混合物中，或者添加到进行pca和/或osos和/或pcr的混合物中，以组装期望序列dna分子。26.本发明的方法可以将具有期望序列的dna分子组装作为无瘢痕dna分子。无瘢痕dna意指不具有通过或从合成dna的过程引入的任何核苷酸(例如，来自接头分子的残基核苷酸)的dna，或者产物dna不具有存在不存在于原始短寡核苷酸之一中的任何核苷酸，例如产物dna不具有存在于两个寡核苷酸连接的接合处的任何此类核苷酸。期望序列无瘢痕dna分子可以对应于天然序列、合成序列，或者可以是工程化序列。所述方法还可以在反应中连接短寡核苷酸，其中所有短寡核苷酸都存在于溶液中，即在一些实施例中，不存在组合的寡核苷酸或没有寡核苷酸连接到固相(例如，dna芯片、珠粒或微阵列)。在一些实施例中，对寡核苷酸进行连接酶链式反应，其中反应中的所有寡核苷酸都存在于溶液中；或者其中任何两个退火的寡核苷酸均不存在于固相或固体载体上或连接到固相或固体载体。所述方法还可以同时组装寡核苷酸或期望序列dna片段和/或dna分子，即其中单个反应将寡核苷酸组装成较长的寡核苷酸或dna片段。因此，同时组装不同于顺序组装寡核苷酸的方法，即在所述方法中，第二寡核苷酸退火到第一寡核苷酸，并且然后第三寡核苷酸退火到第二寡核苷酸，并且依此类推，因为寡核苷酸是按顺序添加到正在生成的双链体或链的末端。在同时反应中，将形成较长的寡核苷酸或dna片段或产物dna分子的所有寡核苷酸同时存在于溶液中。并且同时存在于溶液中的多个寡核苷酸(或所有寡核苷酸)参与反应，退火并在连接酶作用下进行连接。同时反应也可以是一步反应。在任何实施例中，可以在不使用限制性酶或限制性核酸内切酶的情况下进行所述方法并合成dna分子。在任何实施例中，期望序列dna分子并非环状dna。在任何实施例中，期望序列dna分子任选地并非载体dna。27.在任何实施例中，所述方法不使用接头或间隔子序列或寡核苷酸。接头或衔接子dna或序列可以是可以与其它dna或寡核苷酸分子的末端连接的短寡核苷酸。接头、衔接子或间隔子分子或序列还可以用于从固体载体释放多核苷酸，或将多核苷酸与固体载体连接或将多核苷酸拴系到其上。这些分子或序列可以提供粘性末端和/或突出端，以便进行连接。接头、衔接子或间隔子dna序列还可以包括例如限制性位点、识别位点(例如，切口核酸内切酶)、poly-u序列，或者可以是具有一个或多个尿嘧啶残基的序列。接头、衔接子或间隔子dna或序列是不存在于在所述方法中组装的期望序列dna分子中的任何核苷酸或核苷酸序列。在所述方法的任何实施例中，所述方法中使用的寡核苷酸均不包括接头、衔接子或间隔子序列。在任何实施例中，所述方法不涉及使用接头、衔接子或间隔子dna或序列。这是所述方法的另外的优势，并且因此使得所述方法更适于自动化合成。28.通过所述方法组装并具有期望序列的dna分子可以是任何dna分子。在各个实施例中，具有期望序列的dna分子的长度为100-5,000bp，或者长度为100-10,000bp，或者长度为5,000-10,000bp，或者长度为5,000-15,000bp，或者长度为10,000-15,000bp，或者长度为10,000-20,000bp，或者长度为10,000-25,000bp，或者长度超过1kb或超过2kb或超过3kb或超过5kb，或者长度超过10kb，或者长度超过15kb，或者长度超过20kb。29.错误率30.本发明的方法可以产生期望序列dna分子，其错误率小于每2,000个碱基对1个错误、或小于每5,000个碱基对1个错误、或小于每7,500个碱基对1个错误、或小于每10,000个碱基对1个错误、或小于每11,000个碱基对1个错误、或小于每12,000个碱基对1个错误、或小于每13,000个碱基对1个错误、或小于每14,000个碱基对1个错误、或小于每15,000个碱基对1个错误、或小于每16,000个碱基对1个错误、或小于每17,000个碱基对1个错误、或小于每20,000个碱基对1个错误、或小于每25,000个碱基对1个错误。在任何实施例中，所述方法允许在不使用任何错误校正酶的情况下，产生本文所描述的具有非常低错误率的dna分子。错误校正酶是用于纠正dna合成中错误的酶。在一个实施例中，错误校正酶可以标识双链体dna分子中的错配，并且可以根据错配结果启动双链切割。双链切割可以在错配位点处或其附近进行。错配可以被相同或其它酶(例如，核酸外切酶)切除，并且dna在没有序列错误的情况下并以正确序列重新组装。错误校正酶的一个实例是本领域普通技术人员已知的错配核酸内切酶(例如，cel i和/或cel ii)。错误校正酶的其它(非限制性)实例包含绿豆核酸内切酶、t7核酸内切酶i和核酸内切酶v中的任何一种或多种。31.寡核苷酸32.在所述方法的各个实施例中，使dna连接酶与多个短寡核苷酸接触以形成混合物，所述多个短寡核苷酸具有dna分子的期望序列的至少一部分。所述方法中使用的多个初始或短寡核苷酸的长度可以是2-250个或2-100个或6-30个核苷酸(nt)，但长度也可以是6-10nt、或6-12nt、或6-13nt、或6-14nt、或6-15nt、或6-17nt、或6-18nt、或6-19nt、或6-20nt、或6-22nt、或6-25nt、或6-30nt、或6-35nt、或5-16nt、或5-17nt、或5-18nt、或5-19nt、或7-10nt、或7-12nt、或7-15nt、或7-17nt、或7-18nt、或7-19nt、或7-20nt、或7-25nt、或7-30nt、或7-35nt、或8-12nt、或8-15nt、或8-17nt、或8-18nt、或8-19nt、或8-20nt、或8-21nt、或8-22nt、或8-25nt、或8-30nt、或8-35nt、或10-22nt、或16-18nt、或15-19nt、或14-20nt、或小于18nt、或小于17nt、或小于16nt、或小于15nt或小于12nt。初始或短寡核苷酸可以包括在一个或多个寡核苷酸池中。在各个实施例中，每个寡核苷酸池或组(或与dna连接酶接触的混合物)中至少25％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％或至少97％初始或短寡核苷酸可以处于本文所描述的任何大小范围内。在任何实施例中，池中的或与dna连接酶接触的寡核苷酸可以重叠，例如，重叠3nt、或4nt、或5nt、或6nt、或7nt、或8nt、或9nt、或10nt或超过10nt，或寡核苷酸长度的约一半，其可以向上取整或向下取整或任选地处于一半长度中的1nt、2nt或3nt内。因此，在一些实施例中，寡核苷酸是8聚体并与至少部分互补的8聚体有4nt的重叠，或者寡核苷酸是16聚体并与至少部分互补的寡核苷酸有8nt的重叠。在其它实施例中，所述多个短寡核苷酸中的短寡核苷酸重叠至少3nt、或至少4nt、或至少5nt、或至少6nt、或至少7nt、或至少8nt或至少9nt。在另一实施例中，所述多个短寡核苷酸中的短寡核苷酸可以重叠重叠的寡核苷酸中的较短寡核苷酸的长度的约一半；例如，16聚体可以重叠8nt。当使用不同长度的短寡核苷酸时，其可以重叠重叠的寡核苷酸中的较短寡核苷酸的长度的一半。在任何实施例中，在dna连接酶和初始或短寡核苷酸的混合物中(或在用于进行连接酶链式反应的池中)少于10％、或少于5％、或少于3％或少于1％短寡核苷酸大于30nt、或29nt、或25nt、或22nt、或20nt、或18nt、或17nt或16nt。33.在一些实施例中，可以使用混合物大小。在各个实施例中，每个池中的寡核苷酸可以具有所描述的以所描述的任何所述百分比量存在的任何所述长度范围。在任何实施例中，短寡核苷酸或长寡核苷酸可以是5'磷酸化的。5'磷酸化还可以通过使寡核苷酸与合适的激酶接触来完成，这可以在连接酶链式反应步骤之前完成。寡核苷酸还可以用5'-p预合成。但是可以使用任何提供5'-磷酸化寡核苷酸的方法。在一个实施例中，激酶可以是t4多核苷酸激酶(t4pnk)，但是可以使用任何合适的激酶。34.在所述方法或dna组装反应的任何实施例中，在dna连接酶和所述多个短寡核苷酸的混合物中可以不存在大于16nt、或大于22nt、或大于25nt或大于30nt的核酸；或其中混合物中少于10％、或少于5％、或少于3％、或少于1％(以寡核苷酸的摩尔量或数量计)寡核苷酸的长度大于22nt、或25nt或30nt。35.在各个实施例中，所述方法可以利用一个或多个池中的寡核苷酸。在各个实施例中，一个池或一组可以含有2-250个或2-150个或2-125个短寡核苷酸，所述短寡核苷酸可以在寡核苷酸池或寡核苷酸对池中组合。在其它实施例中，8-250个或8-150个或8-125个短寡核苷酸可以包括于一个池或一组中，并用于启动所述方法。在更多实施例中，所述多个短寡核苷酸可以包括以下一个或多个池大小或组大小：至少15个寡核苷酸、或至少20个寡核苷酸、或至少为50个寡核苷酸、或超过64个寡核苷酸、或超过65个寡核苷酸、或至少75个寡核苷酸、或至少100个寡核苷酸、或15-250个寡核苷酸、或20-250个寡核苷酸、或30-250个寡核苷酸、或40-250个寡核苷酸、或50-250个寡核苷酸、或20-200个寡核苷酸、或30-200个寡核苷酸、或40-200个寡核苷酸、或50-200个寡核苷酸、或15-150个寡核苷酸、或20-150个寡核苷酸、或30-150个寡核苷酸、或40-150个寡核苷酸或50-150个寡核苷酸。36.在所述方法中，寡核苷酸可以一起存在以形成混合物。混合物可以在合适的缓冲液中含有寡核苷酸，并且寡核苷酸可以退火到混合物中的互补寡核苷酸。在一些实施例中，重叠为寡核苷酸的长度的约一半。因此，16nt的寡核苷酸可以在混合物中与另一个寡核苷酸重叠8nt。在其它实施例中，重叠可以大于或小于寡核苷酸的长度的一半，例如，重叠可以是寡核苷酸的长度的一半加上或减去1nt、或2nt、或3nt、或4nt或5nt。37.当绘制出所述多个短寡核苷酸(或一组dna片段)并放置在彼此附近时，其可以包括要组装并具有期望序列的产物dna分子的序列的至少一部分(或整个序列)。在一些实施例中，短寡核苷酸的至少一部分短寡核苷酸与所述多个短寡核苷酸中的至少另一个短寡核苷酸的序列的一部分重叠并互补。可以将所述多个寡核苷酸分成一个或多个池以包括寡核苷酸组。在一些实施例中，除了末端(短)寡核苷酸可以与仅另一个短寡核苷酸重叠之外，所述多个短寡核苷酸中的短寡核苷酸与所述多个短寡核苷酸中的两个其它短寡核苷酸重叠。末端短寡核苷酸是那些将包括要组装的产物核酸分子的5'端和3'端(或者将包括侧接序列的5'端和3'端，如果存在的话)的寡核苷酸。任选地，末端短寡核苷酸并非任何侧接序列的一部分。38.尽管短寡核苷酸可以具有本文所叙述的任何长度，但在各个实施例中，至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％短寡核苷酸与两个其它短寡核苷酸重叠。当与其互补序列结合时，短寡核苷酸中的至少两个短寡核苷酸彼此邻接，如图1所描绘的，邻接的寡核苷酸与互补序列结合，并且第一寡核苷酸的5'核苷酸与互补序列上的核苷酸结合，而所述核苷酸和与第二寡核苷酸的3'核苷酸结合的核苷酸相邻，或者反之亦然，即第一寡核苷酸和第二寡核苷酸彼此邻接或相邻。在任何实施例中，结合可以指沃森-克里克碱基配对(watson-crick base pairing)或通过碱基对之间的氢键结合。在短寡核苷酸退火到互补序列并彼此邻接的情况下，其可以通过dna连接酶共价连接。第一寡核苷酸的5'-p可以通过连接酶与第二寡核苷酸的3'-oh连接。在一些实施例中，重叠包括与相邻寡核苷酸连接的寡核苷酸的长度的约一半(例如，16聚体可以与一个或两个相邻寡核苷酸重叠8bp)。在一些实施例中，至少75％、或至少80％、或至少90％短寡核苷酸可以与混合物中的互补寡核苷酸序列结合，并且当如此结合时，三种寡核苷酸中的两种将彼此邻接。39.在一些实施例中，dna连接酶可以与所述多个初始或短寡核苷酸(或与一组dna片段)接触以产生混合物。可以使用的dna连接酶的实例包含t4 dna连接酶(来自噬菌体t4)，但是可以使用任何合适的dna连接酶，所述dna连接酶将催化一个退火寡核苷酸的3'羟基末端与直接相邻的退火寡核苷酸的5'磷酸末端之间形成共价磷酸二酯键，由此连接寡核苷酸以产生共价键和更长的寡核苷酸或双链dna片段。dna连接酶的另外的实例包含(但不限于)t3 dna连接酶、t7 dna连接酶、taq dna连接酶和9°ntmdna连接酶。在一些实施例中，dna连接酶可以是热稳定dna连接酶，即在高于70℃的温度下是稳定的；但是在其它实施例中，热稳定连接酶可以在高于90℃、或高于93℃、或高于94℃、或90-100℃的温度下并且在选自至少30秒、或至少60秒、或30-60秒到至少30分钟到至少60分钟的任何时间段内是稳定的。热稳定dna连接酶在暴露于至少70℃或85℃的温度下持续20分钟或30分钟或1小时后还可以保持活性。在各个实施例中，接触可以包含atp和/或nad，或其它辅因子或所使用的具体连接酶的要求。40.期望序列dna分子可以是任何序列。在任何实施例中，所述方法可以是序列非依赖性的，这意味着针对用于作用和产生期望序列dna分子的所述方法，没有必须存在的特定所需序列。在各个实施例中，在所述方法中合成的期望序列dna分子可以是至少20bp、或至少30bp、或至少40bp、或至少60bp、或40-60bp或20-100bp。由于所述方法可以应用分级组装，任何大小的期望序列dna分子可以在所述方法中组装，例如，大于1kb或1-3kb或大于10kb或1-10kb或1-12kb的dna分子。期望序列dna分子还可以包括侧接序列，例如utr、启动子、内含子或侧接同源序列。在各个实施例中，期望序列dna分子的gc含量可以为至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％或30-60％。41.连接酶链式反应42.连接酶链式反应(lcr)(也称为连接酶循环反应)是一种dna组装方法，并且可以任选地与随后的多核苷酸组装反应(例如，pca、osos或重叠延伸pcr(oe-pcr))和dna产物的扩增(例如，通过pcr的扩增)配对。lcr涉及反应步骤中的变性、退火以及通过邻接寡核苷酸的连接酶连接的步骤，所述步骤可以循环并因此重复进行。在lcr中，使dna连接酶与退火到第三寡核苷酸的第一邻接寡核苷酸和第二邻接寡核苷酸接触，所述第三寡核苷酸具有与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸中的至少一个(或两者)的一部分互补并重叠的序列(图1)。第一寡核苷酸5'端处的核苷酸可以通过dna连接酶与第二寡核苷酸3'端处的核苷酸连接。第一寡核苷酸5'端处的核苷酸可以被磷酸化，并且第二寡核苷酸3'端处的核苷酸可以具有3'-oh，以由此为邻接的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸上的连接酶提供5'-p和3'-oh底物。经连接的寡核苷酸(现在是更长的寡核苷酸)和(互补的)第三寡核苷酸现在可以变性，并且可以重复循环。在各个实施例中，可以在lcr方案中进行至少2次、或至少5次、或至少10次、或至少15次、或至少20次、或至少25次变性、退火和连接循环。因此，lcr可以涉及使dna连接酶与三个或更多个多核苷酸接触以形成混合物，对多核苷酸进行退火使得在退火到第三(互补)多核苷酸时，第一多核苷酸和第二多核苷酸彼此邻接，所述第三(互补)多核苷酸具有与第一多核苷酸和第二多核苷酸之一或两者互补的序列，并在第一多核苷酸与第二多核苷酸之间进行连接以产生核酸产物。然后，多核苷酸任选地进行变性和退火，并且过程可以任选地重复。43.lcr之后可以进行dna组装和/或扩增程序，所述过程利用热稳定dna聚合酶(例如，taq聚合酶)来组装或扩增由成功连接得到的寡核苷酸，例如，pca、osos、oe-pcr或pcr方案(或其任何组合和变体)。在不同实施例中，lcr可以在有或没有引物的情况下进行。在本发明中，可以对本文所描述的任何大小的短寡核苷酸进行lcr、pca、osos或oe-pcr，例如(但不限于)长度少于30个核苷酸、或少于22个核苷酸、或少于20个核苷酸、或少于15个核苷酸、或少于12个核苷酸的寡核苷酸，或者长度超过6个核苷酸、或超过12个核苷酸、或超过13个核苷酸的短寡核苷酸，或者长度为19个核苷酸、或18个核苷酸、或16个核苷酸的或少于16个核苷酸、或8-18个核苷酸、或8-17个核苷酸、或8-16个核苷酸或8-15个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施例中，任何这些反应还可以包含更长的互补序列，在一些实施例中，所述互补序列的长度可以是混合物中的短寡核苷酸的2-4倍。但是本文所描述的任何寡核苷酸长度都可以用于lcr或其它dna组装和/或扩增反应。在一些实施例中，退火和/或连接可以在参与连接反应的寡核苷酸中之一或两者的熔融温度或接近熔融温度下进行，例如在1℃、或2℃、或3℃或5℃内。在各个实施例中，可以用至少2个、或至少3个、或至少8个寡核苷酸、或至少16个寡核苷酸、或至少32个寡核苷酸、或至少64个寡核苷酸、或8-32个寡核苷酸或8-64个寡核苷酸进行lcr，并且寡核苷酸可以是本文所阐述的任何长度。lcr可以包含(或在其之前进行)供体寡核苷酸的5'-p的磷酸化，使得连接酶可以将供体的5'-p与受体寡核苷酸的3'-oh连接。在一个实施例中，通过使寡核苷酸与激酶，例如本文所描述的任何激酶接触来进行磷酸化。在一些实施例中，所述方法是在等温下进行的，即温度不以确定寡核苷酸组装次序的梯度变化。在一些实施例中，lcr可以在等温下进行。在各个实施例中，可以在不使用核酸外切酶的情况下进行lcr、pca、osos和pcr中的任一种。44.为了简要描述lcr反应：一组中的寡核苷酸进行热分离或变性。然后降低温度，并且寡核苷酸退火到寡核苷酸组中的其互补链。寡核苷酸被设计成使得要连接的两个寡核苷酸将同一互补链上直接退火以彼此相邻并邻接，所述互补链具有每个寡核苷酸的互补序列。第一寡核苷酸在其5'端核苷酸上具有磷酸基团，并且第二寡核苷酸在其3'端核苷酸上具有3'羟基，因此为连接酶提供了5'-p和3'-oh底物。然后连接酶将邻接的寡核苷酸共价连接成与互补链结合的一个(现在更大的)多核苷酸。在随后的循环中，所连接的多核苷酸然后被热分离并再次退火到互补链，再次在直接相邻的寡核苷酸附近并与其邻接，并再次通过连接酶连接。然后可以进行一次或更多次另外的变性、退火和连接循环。可以任选地包含5'核苷酸的磷酸化步骤。在各个实施例中，可以在lcr方案中包含至少10次、或至少15次、或至少19次、或至少20次或至少25次循环。lcr通常产生双链体dna。实例1中提供了lcr方案的实例。45.osos“一次一步”是用于使用dna聚合酶、dntp和(任选地)拥挤剂组装dna的pcr型反应，并且可以(任选地)包含扩增重叠的寡核苷酸以形成核酸产物。关于这些反应的细节可以在例如于2014年10月16日公开的us 2014/0308710中找到，所述文献特此通过引用整体并入，包含所有表、附图和权利要求书。在一个实例中，实例1中示出了osos方案。然而，求助于本公开的普通技术人员将认识到，方案可以根据要组装的具体核酸进行变化和调整。虽然在此方案中，反应将循环9次，但在其它实施例中，所述反应可以循环至少5次、或至少10次、或至少12次、或至少15次、或至少19次、或至少20次或至少25次。osos涉及退火阶段、延伸阶段和变性阶段的循环。在osos中，阶段中的任何一个或多个阶段都可以是时间变化的阶段。时间变化的阶段是在循环之间变化或改变的一定时间段内进行的阶段。循环的时间变化的阶段(例如，如方案中的步骤5所示的时间变化的延伸阶段)可以相对于前一循环的相同阶段或相对于循环的第一此类阶段或相对于所述方法的第一循环的阶段，在时间上有所增加或减少。例如，在一个实施例中，每次循环的延伸阶段是时间变化的阶段。时间的变化可以是增加约10秒/循环、或约12秒/循环、或约14秒/循环、或约15秒/循环、或约17秒/循环或约20秒/循环。在一些实施例中，在反应中用引物进行osos，并且在其它实施例中，在没有引物的情况下进行osos，并且引物可以任选地是末端引物。可以使用引物或末端引物，例如，如果扩增也是期望的。在各个实施例中，引物的长度可以是至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或4-6个、或4-8个或6-15个核苷酸。在任何实施例中，拥挤剂可以是聚乙二醇(例如，peg 8000)，其可以在反应缓冲液中以大于0.0188％、或大于0.025％或大于0.375％的浓度提供。46.因此，在一个实施例中，osos反应可以涉及在单一步骤中由一组重叠的寡核苷酸组装核酸分子。反应可以涉及以下一个或多个步骤：在反应容器中将一组至少五个重叠的寡核苷酸与dna聚合酶、dntp的混合物和(任选地拥挤剂)组合以形成组装混合物；对组装混合物进行至少25次循环，每次循环包括在介于50℃与77℃之间进行的退火阶段，在介于50℃与77℃之间进行的延伸阶段，以及在高于90℃下进行的变性阶段；并且由此在单一步骤中由一组重叠的寡核苷酸组装核酸分子。47.聚合酶循环组装(pca)是本领域普通技术人员已知的，并且是一种用于由较短的片段组装较大核酸分子的方法。可以用lcr反应的产物进行pca。类似于如何存在能够使dna聚合酶填充整个模板序列的正向引物和反向引物，pca采用类似的技术，但是使用多种寡核苷酸。pca利用dna杂交和退火，并使用dna聚合酶以基于具有互补序列的单链寡核苷酸(或突出端)以精确的次序组装dna序列。pca可以将寡核苷酸或dna片段(任选地至少30个核苷酸或至少60个核苷酸)组装成更大的dna分子。使用涉及退火、延伸和变性阶段的循环反应，可以组装更大的dna分子。在任何实施例中，pca反应可以在没有引物(例如，末端引物)的情况下进行。但是在一些实施例中，此类引物可以用于pca方案，例如，如果扩增是期望的。48.在一些实施例中，lcr中使用的dna连接酶是热稳定连接酶。例如，当使用热稳定dna连接酶时，其可以是t4 dna连接酶或taq连接酶。但是还可以使用其它连接酶，例如，pfu dna连接酶或其它连接酶。在一个实施例中，热稳定连接酶可以在高于45℃的温度下维持其活性至少一小时。在一些实施例中，所述方法中使用的热稳定连接酶在约45-65℃或45-80℃下具有活性，持续任选地至少一小时。在一些实施例中，连接酶在65℃下的半衰期为至少48小时和/或在95℃下的半衰期大于1小时。在一些实施例中，连接酶的活性是nad依赖性的，并且在此类情况下，nad存在于反应混合物中。“活性的”意指在标准反应条件下进行的用于评估酶的反应的至少50％的活性。49.在一些实施例中，在所述方法中(或在可以用于所述方法的lcr、pca、osos、oe-pcr反应中)要连接的所述多个或一组寡核苷酸存在于溶液中，即在一些实施例中，所述多个或所述一组寡核苷酸中没有寡核苷酸固定在微阵列、dna芯片、珠粒或结合一个或多个寡核苷酸的其它固体载体上或与其结合，也没有任何反应组分如此固定或结合。在一个实施例中，要组装成较长寡核苷酸或期望序列dna片段或dna分子的所有短寡核苷酸都存在于溶液中。由于所述方法可以使用溶液中的寡核苷酸来应用，因此其易于自动化。50.由连接酶链式反应产生的较长寡核苷酸或dna片段可以通过任何dna组装技术，例如osos和/或聚合酶循环组装(pca)进一步组装。在各个实施例中，本文所公开的lcr反应或方法可以作为单个步骤或一步反应进行，这意味着一旦将反应组分放置到反应容器中，便进行反应并组装期望序列dna分子，无需重新打开容器，并且任选地在使用时，在随后的dna组装反应(例如，pca和/或pcr反应)期间也不必打开容器。在任何实施例中，在lcr之后可以进行dna组装反应(例如，osos)。lcr之后还可以进行pca反应。lcr之后还可以进行pca反应，以及任选地dna组装反应。在任何实施例中，在一系列反应之后可以进行pcr以进行扩增。当使用pca和/或pcr时，短寡核苷酸和dna连接酶可以形成混合物，并且在进行lcr之后，所得较长寡核苷酸或dna片段可以与dna聚合酶和dntp以及任何其它必要的组分接触，以连接所述一组较长寡核苷酸或dna片段，并且由此组装具有期望序列的dna分子。51.示例性实施例52.在一个实施例中，在所述方法中组装期望序列dna分子，其中dna连接酶和短寡核苷酸的混合物含有2-250个长度为8-30或8-22个核苷酸的短寡核苷酸。在一个实施例中，lcr之后是pca和pcr。在其它实施例中，期望序列dna分子由8-150个长度为8-30或8-22个核苷酸的短寡核苷酸组装。短寡核苷酸可以任选地包括存在于混合物中的至少50％、或至少75％、或至少90％多核苷酸(以摩尔比率或w/w计)。在此实施例中，所述方法可以完全在溶液中进行。任选地，混合物中可以不存在长度超过30个核苷酸的寡核苷酸，但是任选地还可以存在更长的寡核苷酸，其中混合物中少于10％、或少于5％、或少于3％或少于1％(以摩尔比计)寡核苷酸的长度超过30nt。在特定实施例中，短寡核苷酸是8聚体或16聚体，或者长度为8-16个核苷酸。在本文的任何实施例中，经组装的dna分子的错误率可以小于每10,000个核苷酸1个错误。在任何实施例中，期望序列dna分子的gc含量可以为至少30％或30-60％。53.在一个实施例中，所述方法涉及使dna连接酶与多个长度为8-22个核苷酸的短寡核苷酸接触以形成混合物。至少50％短寡核苷酸的长度可以是8-22个核苷酸或10-22个核苷酸；或者任选地，dna连接酶混合物中的至少70％、或至少90％或100％短寡核苷酸的长度可以是8-22或10-22个核苷酸。在特定实施例中，短寡核苷酸的长度为8聚体、或16聚体或8-16个核苷酸。在此实施例中，所述方法可以完全在溶液中进行。任选地，混合物中不存在长度超过22个核苷酸的寡核苷酸，但是也任选地，在少量较长的多核苷酸中可以存在较长的寡核苷酸，例如，混合物中少于10％、或少于5％、或少于3％或少于1％(以寡核苷酸的数量计)寡核苷酸的长度超过20nt或22nt。在特定实施例中，短寡核苷酸是8聚体或16聚体，或者长度为8-16个核苷酸。在本文的任何实施例中，经组装的dna分子的错误率可以小于每8,000或10,000个核苷酸1个错误。54.在另一个实施例中，所述方法涉及使dna连接酶与多个长度为14-20个核苷酸或长度为16-18个核苷酸的短寡核苷酸接触以形成混合物。至少50％、或至少75％或至少90％短寡核苷酸的长度可以是16-18个核苷酸、或15-19个核苷酸或14-20个核苷酸。在特定实施例中，短寡核苷酸是16聚体、或17聚体或18聚体。在此实施例中，所述方法可以完全在溶液中进行。任选地，混合物中不存在长度超过20个核苷酸的寡核苷酸，但是也任选地，在少量较长的多核苷酸中可以存在较长的寡核苷酸，例如，混合物中少于10％、或少于5％、或少于3％或少于1％(以寡核苷酸的数量计)寡核苷酸的长度超过20nt。在本文的任何实施例中，经组装的dna分子的错误率可以小于每8,000、或9,000或10,000个核苷酸1个错误。55.在任何实施例中，在所述方法中，期望序列dna分子可以通过由14×8聚体的重叠的组组装。可以使用不同数量的组，例如，五个、七个或九个。56.在一个实施例中，在所述方法中，期望序列dna分子由含有32个寡核苷酸的6个池、或64个寡核苷酸的2个池、或111寡核苷酸的1个池的混合物组装。lcr之后任选地进行osos和/或pca和/或pcr。57.在一个实施例中，在所述方法中，期望序列dna分子由含有多于65个短寡核苷酸的混合物组装。58.在所述方法的任何实施例中，混合物可以含有短寡核苷酸，例如所述短寡核苷酸重叠所述短寡核苷酸的长度的约一半，例如重叠长度在1-2个核苷酸内。例如，在所述方法的任何实施例中，混合物可以含有作为8聚体并重叠4nt、或16聚体并重叠8nt、或重叠3-5nt的8聚体并或重叠7-9nt的16聚体的短寡核苷酸。59.在所述方法的任何实施例中，用64个寡核苷酸、或用多于65个寡核苷酸或用多于65个寡核苷酸进行lcr。60.在任何实施例中，lcr之后可以是具有时间变化的阶段的dna组装反应(例如，osos)，其中时间变化的阶段是延伸阶段，并且延伸阶段增加15秒/循环。61.实例162.此实例示出了具有约50％gc含量的随机产生的合成序列的240bp dna片段的合成。使用t4 dna连接酶将含有具有4bp重叠的寡核苷酸的14个8聚体(14×8聚体)的七个重叠池连接，以形成60聚体的七个池，其中这些池与相邻池中的寡核苷酸重叠。在lcr之后，将这些60聚体的七个池放置到一个池中，并通过聚合酶链式组装反应组装最终的240bp产物。图2指示了240bp产物。使用用于克隆平端pcr产物的zeropcr克隆试剂盒(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(thermofisher,waltham,ma))对最终240bp产物的96个克隆进行克隆和桑格测序(sanger sequencing)以进行验证(表1)。63.使用声学液体处理系统以25nl体积形成两个池以分配流体，其中将水添加到16ul，浓度为约30nm/寡核苷酸。向每个16ul池中添加10ul含呈1:1比率的t4pnk混合物和lcr混合物的主混合物，并充分混合，并根据以下方案在热循环仪中温育约5小时，以进行磷酸化、变性和退火以及lcr。t4pnk混合物含有2ul水、2ul 10x t4 dna连接酶缓冲液和1ul t4pnk。lcr混合物具有1.5ul水、2.5ul 10x taq连接酶缓冲液和1ul taq连接酶。t4pnk-lcr方案如下：64.1. 37℃30分钟65.2. 98℃2分钟66.3. 85℃2分钟，斜升1℃/秒67.4. 50℃5分钟，斜升0.1℃/秒68.5. 37℃5分钟69.6. 95℃10秒70.7. 85℃1分钟，斜升1℃/秒71.8. 55℃1分钟，斜升1℃/秒72.9. 50℃2分钟73.10. 45℃5分钟74.11. 转到6，9x75.12. 95℃10秒76.13. 65℃5分钟77.14. 55℃10分钟78.15. 50℃5分钟79.16. 45℃5分钟80.17. 转到12，19x81.18. 50℃30分钟82.19. 10℃0(永远)83.在pnk-lcr方案之后，将20ul pca混合物(具有dna聚合酶(芬兰万塔的finnzymes oy公司(finnzymes oy,vantaa,finland))和50mm tmac(四甲基氯化铵)并且不具有引物的pcr混合物)添加到具有6ul主混合物的孔的每个孔中，如上所述。使用以下方案进行十次osos“一次一步”(pcr型方案)循环：84.1. 98℃1分钟85.2. 98℃30秒86.3. 68℃1分钟87.4. 60℃1分钟88.5. 55℃1分钟，增加15秒/循环89.6. 50℃1分钟90.7. 转到2，9x91.8. 72℃5分钟92.9. 10℃0(永远)93.将20ul pcr混合物(具有引物)添加到进行pca反应的孔中的每个孔中。94.使用以下方案进行pcr：95.1. 98℃1分钟96.2. 98℃30秒97.3. 72℃45秒，增加15秒/循环98.4. 55℃1分钟，增加15秒/循环99.5. 转到2，9x100.6. 98℃30秒101.7. 72℃4分钟102.8. 65℃6分钟103.9. 转到6，19x104.10. 72℃5分钟105.11. 10℃0(永远)106.然后将产物加载到凝胶上，以用于确认期望dna分子的形成，如图2所示。107.表1108.总读数95fl读数(240bp)60部分读数(遗漏3)(183bp)27部分读数(遗漏5')(不同)8fl上存在错误1(snp c-》a)er14400109.如表1所示，最终组装的克隆和测序确认揭示总错误率为每14,400bp 1个错误。这比在使用标准40聚体的合成dna构建体中(在没有暴露于酶错误校正步骤的情况下)获得的序列保真度高大约14倍。这导致约95％的无错分子(％efm)率百分比，其中％efm描述了如果全部测序，预期无错的每个克隆体的菌落百分比。110.实例2111.此实例示出了由16聚体、30聚体和40聚体合成gfp片段。所使用的方案与实例1中提供的方案相同。首先，使用短寡核苷酸(16聚体)的池构建gfp的901bp序列。在taq连接酶的情况下，以不同稀释度使用了不同数量的16聚体。池大小为32×16聚体的6个池、64×16聚体的2个池和111×16聚体的一个池。使用t4多核苷酸激酶对寡核苷酸进行5'磷酸化，并使用连接酶链式反应组装，随后进行pca和pcr以组装并扩增dna产物。如图3a所示，实现所有池大小的成功组装。凝胶已完成，并且图3a中提供了对于组装的确认。112.进行了测序以确认所得dna分子的序列。对于经组装的dna分子的子组，观察到错误率为每8500bp 1个错误。因此证明了使用涉及lcr和pca/pcr的方法可以组装高度复杂的短寡核苷酸混合物。为了进行比较，30聚体和40聚体被合成，并在所述方法中用于组装和扩增由30聚体和40聚体的单个池组装的gfp，以进行lcr。lcr之后是osos和pcr。所述方法还成功地组装了所有池大小，证明了所述方法的稳健性。113.[所得凝胶描绘于图3b中。][0114]实例3[0115]为了证明所述方法可以组装更大的dna分子，使用所述方法组装了具有载体末端的流感ha(1927bp)和na(1609bp)的核酸。进行了各种池化场景并成功组装了dna分子，包含拆分成五个子池(每个子池含有64个与相邻子池重叠(128bp)的寡核苷酸)的16聚体，作为单个池的16聚体、作为单个池的30聚体以及作为单个池的40聚体。经组装的核酸分子的测序确认显示出92％和89％ha和na被组装为无错分子。这与由60聚体组装的分子相比，其中37％和29％ha和na分子被组装为无错分子。所得凝胶描绘于图4a中。[0116]实例4[0117]此实例示出了在包含8×16聚体寡核苷酸和4×16聚体的各种池化场景下，使用16聚体组装3100bp ha和2800bp na核酸构建体，发现使用所公开的包含lcr的方法成功组装特定序列期望dna分子，并且随后进行聚合酶循环组装(pca)步骤，然后进行另一个pcr步骤，所有步骤均根据实例1中的方案进行。结果展示于图4b中。[0118]实例5[0119]此实例示出了使用如实例1所示的方案，使用16聚体的26个重叠池，使用lcr然后使用pca和pcr进行最终组装进行的对枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)基因组序列的10kb部分的组装。图5展示了10kb产物的形成。[0120]实例6[0121]此实例证明了与其它方法相比，本发明方法显著提高了序列保真度。由16聚体、18聚体和22聚体组装了三十二个dna构建体，其大小在200bp到1800bp的范围内，并且gc含量的程度不同。gc百分比为30％、40％、50％或60％(gc4组)。凝胶描绘于图6中。如图6所示，所有较小大小寡核苷酸和所有gc含量水平的组装都非常稳健和成功。图7展示了从16聚体和18聚体开始获得的最高序列保真度。









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