新型高乌甲素衍生物及其用途的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及一种属于二萜类生物碱(diterpenoid alkaloid)系列的新型高乌甲素衍生物、其制备方法以及利用骨生成促进活性的药学用途。背景技术：2.乌头碱(aconitin)是中药药材附子(aconiti lateralis radix)的成分之一，其为属于生物碱系列的化合物，是一种毒性很强的物质。但，与将附子煎为汤药时毒性降低的现象类似，如果直接加热该化合物，它会通过脱乙酰化或脱苯甲酰化作用，转化为毒性较弱的苯甲酰乌头或乌头原碱等化合物。基于该原理，通过热处理减轻了毒性的附子(加工附子或精制附子)一直被用作减轻神经痛患者的炎症和疼痛的药材(xu等,j ethnopharmacol 2006)。3.此外，属于诸如乌头碱的二萜生物碱系列的，具有类似化学结构的如脱氧乌头碱、中乌头碱、次乌头碱和高乌甲素等，数百种的各种生物碱类化合物正在通过半合成以及结构确认被研究，它们的生理活性也相继被揭示(turabekova等,environ toxicol pharmacol.2008)。例如，陕西科技大学公开了将位于高乌甲素第4位碳的2-乙酰氨基苯甲酰基除去，并连接各种肉桂衍生物(cinnamic derivatives)会显示出抗癌活性的结果，在同一所大学，通过改变第4位和第8位、第9位的官能团合成了各种化合物(梁承等，cn107540680a，2018年1月5日公开)。俄罗斯的vladimirovich博士也确认了在高乌甲素的第4位连接各种芳香族化合物的衍生物的炎症作用(s.v.vladimirovich,wo 2017/209653a1)。4.在众多生物碱化合物中，已知高乌甲素具有抗心律失常、抗炎、抗氧化、抗癌及抗癫痫等多种功效(wang等,chem pharm bull.2009)。本发明人在研究高乌甲素的新的药理活性的过程中，通过水解高乌甲素制备了一种新结构的化合物，并发现新型化合物促进骨生成(osteogenesis)，因此完成了本发明。技术实现要素：5.发明所要解决的问题6.本发明的目的在于，提供一种具有骨生成促进功能和骨质疏松症治疗能力的新型高乌甲素衍生物、其制备方法以及包含其作为有效成分的用于预防、改善或治疗骨疾病的药物组合物。7.用于解决问题的方案8.为了实现上述目的，本发明的一个方面，提供一种由以下化学式1表示的化合物、其立体异构体、其水合物、其溶剂合物或其药学上可接受的盐。9.【化学式1】[0010][0011]根据本发明的一个具体例，在上述化学式1中，r1和r2各自独立地选自氢、c1-c6烷基、硫代烷基、芳基烷基、羟烷基、二羟烷基、羟烷基芳基烷基、二羟烷基芳基烷基、烷氧基烷基、酰氧基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、烷氧基羰基氨基烷基、酰基氨基烷基、芳基磺酰胺基烷基、烯丙基、二羟基烷基烯丙基、二氧戊环烯丙基、羰基烷氧基烷基(caralkoxyalkyl)、甲基、乙基、异丙基、叔丁基和苯基组成的组。其中，“烷‑”或“烷基”是支链型或线型，优选为c1-c3烷基，此时碳链可以任意地，被醚(-o-)键介入。[0012]根据本发明的一个具体例，上述化学式1的化合物为(2ar,2a1s,3s,4as,8s,11s,11bs,12s)-6-乙基-4a,8-二羟基-3,11-二甲氧基-十四氢-8，11a,5-(表乙烷[1,1,2]三基)环戊[7,1]茚并[5,4-b]偶氮嗪-1,2-二酮((2ar,2a1s,3s,4as,8s,11s,11bs,12s)-6-ethyl-4a,8-dihydroxy-3,11-dimethoxy-tetradecahydro-8,11a,5-(epiethane[1,1,2]triyl)cyclopenta[7,1]indeno[5,4-b]azosine-1,2-dione)(化学式2)。[0013]【化学式2】[0014][0015]在本发明中，上述化学式1的化合物不仅包括由化学式1表示的化合物及其药学上可接受的盐，还包括其水合物、溶剂合物、立体异构体以及放射性衍生物。[0016]上述“药学上可接受的盐”是指在纯粹的医学判断的范围内不会引起过度的毒性、刺激、过敏反应等，适合与人及低等动物的组织接触使用，而且不会对母体化合物的生物活性和物理化学性质带来不利影响的盐。上述药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，在文献(s.m.berge et al.,j.pharmaceutical sciences,66,1,1977)中对其进行了详细描述。盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化期间，在同一反应体系中制备，或单独与无机碱或有机碱反应制备。合适的附加盐形态为，例如，如铵盐、锂盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等的碱金属盐及碱土金属盐(钙盐等)；与有机碱的盐，例如，伯、仲、叔脂肪族和芳香族胺，例如，甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、四种丁胺异构体、二甲胺、二乙胺、二乙醇胺、二丙胺、二异丙胺、二正丁胺、吡咯烷、哌啶、吗啉、三甲胺、三乙胺、三丙胺、奎宁环、吡啶、喹啉和异喹啉、苄星、n-甲基-d-葡糖胺、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇、海巴明盐(hydrabamine salt)、以及与精氨酸、赖氨酸等氨基酸的盐等。[0017]在本发明中，上述化学式1的化合物的水合物或溶剂合物可以通过常规方法制备，例如，可以将化学式1的碱性化合物溶解在如水、甲醇、乙醇、丙酮、1,4-二噁烷等溶剂中，加入游离酸或游离碱，然后结晶化或重结晶化制备。[0018]此外，上述化学式1的化合物可以具有一个或多个不对称中心，并且对于这种化合物而言，可以存在对映异构体或非对映异构体。因此，本发明的化合物中，包括各异构体或这些异构体的混合物。此外，可以通过常规方法分离或拆分不同的异构体，或者可以通过常规合成方法或通过立体特异性或不对称合成获得任意异构体。此外，本发明的化合物包括由上述化学式表示的化合物的放射性衍生物，这些放射性化合物在生物研究领域是有用的。[0019]在本发明中，上述化学式1的化合物可以通过包括以下步骤的方法制备：[0020]步骤(a)，使高乌甲素与氧化剂反应；以及[0021]步骤(b)，在碱的存在下，使(a)的生成物与有机溶剂反应。[0022]根据本发明的一个具体例，上述步骤(a)的高乌甲素可以是高乌甲素溴化氢，在这种情况下，步骤(a)可以进一步包括在使高乌甲素与氧化剂反应之前除去溴化氢的过程。例如，如以下反应式1中所示，可以在碱的存在下，使用二氯甲烷(ch2cl2)进行从高乌甲素溴化氢中除去溴化氢的过程。[0023]【反应式1】[0024][0025]此后，如以下反应式2所示，通过与氧化剂反应，上述高乌甲素被氧化，可以生成高乌甲素衍生物(lad)。上述氧化剂可以选自溶于二甲基甲酰胺(dmf)中的二乙酸苯碘(phi(oac)2或乙酸铅(ii)(pb(ch3co2)2)、乙酸铅(ii)(pb(ch3co2)4)、臭氧以及hio4组成的组。[0026]【反应式2】[0027][0028]在本发明中，上述合成的高乌甲素衍生物(lad)可以在碱的存在下与有机溶剂反应，生成上述化学式1的化合物。上述碱可以选自氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯和氢氧化钾组成的组，上述有机溶剂可以是脂肪族醇或烷氧基醇。[0029]上述脂肪族醇是指由通式ch3(ch2)noh(n为0或正整数)表示的醇，烷氧基醇是指由通式ch3(ch2)no(ch2)nch3(n为彼此独立的0或正整数)表示的醇。例如，上述脂肪族醇具体可以是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇等，烷氧基醇可以是甲氧基甲醇、甲氧基乙醇、乙氧基乙醇等。[0030]例如，如以下反应式3所示，上述高乌甲素衍生物(lad)可以在氢氧化钠存在下，与乙醇反应生成化学式1的化合物(qg3030)。[0031]【反应式3】[0032][0033]在本发明中，通过上述方法合成的化学式1的化合物可以通过常规的分离和纯化过程进行分离和纯化，例如用有机溶剂稀释和洗涤，然后将有机层减压浓缩进行分离，并且在必要时，可以通过柱层析和使用各种溶剂的重结晶方法对其进行纯化。[0034]本发明人在研究具有抗炎、抗氧化、抗癌等功效的高乌甲素的新的药理活性的过程中，通过水解高乌甲素合成了上述化学式1的新型化合物，并确认了该化合物具有促进骨生成的活性。[0035]因此，本发明的另一方面，提供一种用于预防或治疗骨相关疾病的药物组合物，其包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分。[0036]在上述药物组合物中，由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐包括其水合物、溶剂合物、立体异构体以及放射性衍生物。[0037]根据本发明的一个具体例，上述化学式1的化合物促进干细胞分化为成骨细胞，增加选自runx2(矮小相关转录因子2)、bmp2(骨形态发生蛋白2)以及骨钙素(osteocalcin)组成的组的骨形成标志物的表达，可以帮助骨生成。上述干细胞，可以使用间充质干细胞、造血干细胞、脂肪干细胞、骨髓干细胞等。[0038]在本发明中，上述骨疾病可以选自骨质疏松症(osteoporosis)、骨折(bone fracture)、类风湿性关节炎、牙周炎、骨软化症(osteomalacia)、骨质减少症(osteopenia)、骨萎缩(bone atrophy)、骨关节炎(osteoarthritis)、骨缺损、骨质溶解(osteolysis)以及骨坏死组成的组，优选可以是骨折和骨质疏松症。[0039]在本说明书中所使用的术语，“骨折”是指支撑身体的骨骼由于交通事故、摔伤、工伤事故和其他物理刺激而断裂的状态。[0040]在本说明书中所使用的术语，“骨质疏松症”是指构成骨的矿物质(尤其钙)和基质减少，使骨组织的微观结构退化，最终使骨折风险不断增加的状态。骨质疏松症的种类有原发性骨质疏松症，如绝经后骨质疏松症和老年性骨质疏松症，以及由影响骨生成和减少的疾病、药物、饮酒和吸烟等引起的继发性骨质疏松症。[0041]本发明的药物组合物除了包含上述化学式1的化合物作为有效成分外，还可以进一步包含在药剂制备中常规使用的合适的载体、赋形剂和稀释剂。可包含在本发明药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂有乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。[0042]在制剂化本发明的药物组合物时，使用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来制备。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂，通过在本发明的组合物中混合至少一种以上的赋形剂而制备，例如赋形剂有淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)、明胶等。此外除了简单的赋形剂外，还使用如硬脂酸镁和滑石粉等润滑剂。用于口服给药的液体制剂相当于混悬剂、口服溶液剂、油剂、糖浆剂等，除了常用的单纯稀释剂水、液体石蜡外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶液、混悬剂、油剂、冻干制剂和栓剂。非水溶剂和悬浮剂可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、如橄榄油的植物油和如油酸乙酯的可注射酯等。[0043]本发明的药物组合物可以口服或肠胃外给药，本发明组合物的优选给药量虽然根据患者的状况和体重、疾病的程度、药物形式、给药途径和时间段而不同，但可由本领域技术人员适当地选择。例如，上述化学式1的化合物的给药量可根据患者的年龄、体重、性别、给药形式、健康状况和疾病程度而有所不同，以体重为70公斤的成人患者为准，一般1日可以给药0.01mg至5000mg。上述给药量能够按一日一次至分多次给药，并且上述给药量不以任何方面限制本发明的范围。[0044]此外，本发明提供一种骨疾病的治疗方法，其包括将所述药物组合物施用于需要治疗的个体的步骤。骨疾病的种类及药物组合物的给药量与用于预防或治疗上述骨疾病的药物组合物中所述相同。[0045]在本发明中，当口服给药用于预防或治疗骨疾病的药物组合物时，用于口服给药的药物组合物可以是用于口服给药的固体制剂、半固体制剂或液体制剂。用于口服给药的固体制剂例如有片剂、丸剂、硬质或软质胶囊剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、溶液或混悬液重构型粉剂、锭剂、饼剂(wafer)、口服(oral strip)糖衣丸(dragee)和咀嚼型口香糖(chewable gum)等，但不限于此。用于口服给药的液体制剂包括液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、酏剂、酒精剂(spirits)、芳香水剂、柠檬剂、浸膏剂(extracts)、沉淀剂、酊剂以及药油剂。[0046]在本发明中，用于预防或治疗骨疾病的药物组合物作为注射剂使用时，可以直接注射到骨疾病部位，当制剂化为注射剂时，可以包括与血液等渗的无毒缓冲溶液作为稀释剂，例如ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液等。除缓冲溶液外，注射剂还可以含有其他稀释剂或添加剂。[0047]此外，根据本发明的一个具体例，可以将如胶原海绵的赋形剂与上述药物组合物混合后，移植到骨折部位来治疗个体。[0048]本发明的另一方面，提供一种用于预防或改善骨相关疾病的食品组合物，其包含由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分。[0049]在上述食品组合物中，由上述化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐包括其水合物、溶剂合物以及立体异构体。[0050]由于上述食品组合物与用于预防或治疗上述骨疾病的药物组合物使用相同的成分，因此省略了两者之间的重复内容，以避免说明书的过多描述。[0051]在本发明中，上述食品组合物能够以粉末、颗粒、片剂、胶囊、糖浆、饮料或丸的形式提供，除了作为有效成分的由化学式1表示的化合物之外，还可以与其他食品或食品添加剂一起使用，并且可以根据常规方法适当地使用。有效成分的混合量可以根据其使用目的，例如预防、保健或治疗性处置来适当决定。[0052]上述食品组合物中所含有效成分的有效量可根据上述药物组合物的有效量使用，但以保健和卫生为目的或调节健康为目的而长期摄入的情况下，可以在上述范围以下，可以肯定的是，有效成分能够以超过上述范围的量使用，因为在安全性方面没有问题。[0053]上述食品组合物包括食品生产过程中通常添加的成分，例如，蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂和香味剂。上述碳水化合物的例子为单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖、低聚糖等；和多糖，例如糊精、环糊精等的常规糖、以及糖醇，例如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等。作为香味剂，可以使用天然香味剂和合成香味剂。例如，当将本发明的食品组合物制备成饮剂时，除了本发明的有效成分之外，还可以进一步包括枸橼酸、高果糖浆、砂糖、葡萄糖、乙酸、苹果酸、果汁等。[0054]本发明的另一个方面，提供一种用于在试管内诱导成骨细胞分化的组合物，其使用由上述化学式1表示的化合物。[0055]根据本发明的一个具体例，当用由上述化学式1表示的化合物处理间充质干细胞，钙和矿物质的生成增加，因此可以促进干细胞向成骨细胞的分化。[0056]发明效果[0057]本发明的高乌甲素衍生物诱导干细胞向成骨细胞的分化，施用于骨质疏松动物模型时增加骨密度，注射到骨折动物模型的骨折部位时，其促进骨生成，可以促进骨折创伤的恢复，且诱导骨生成，因此其能够有效地用于预防、改善或治疗与骨相关的疾病，例如骨折和骨质疏松症。附图说明[0058]图1示出了根据本发明一个例子的高乌甲素衍生物(qg3030)的结构。[0059]图2a是用高乌甲素衍生物(qg3030)处理间充质干细胞后，确认钙(茜素红)和矿物质生成(von kossa)水平的结果。[0060]图2b是用图表来表示图2a的染色结果的图。[0061]图3a是用不同浓度的高乌甲素衍生物(qg3030)处理间充质干细胞特定时间后，确认runx2表达变化的结果。[0062]图3b是用不同浓度的高乌甲素衍生物(qg3030)处理间充质干细胞特定时间后，确认bmp-2表达变化的结果。[0063]图4a是用不同浓度的高乌甲素衍生物(qg3030)处理间充质干细胞特定时间后，通过荧光显微镜确认骨钙素表达变化的结果。[0064]图4b是用图表来表示图4a的荧光水平的图。[0065]图5a是用高乌甲素衍生物(qg3030)处理间充质干细胞后，确认各种磷酸化酶的磷酸化水平的结果。[0066]图5b是用图表来表示在图5a中确认的磷酸化水平的图。[0067]图6是用高乌甲素衍生物(qg3030)和各种磷酸化酶抑制剂共同处理间充质干细胞后，确认钙水平的结果。[0068]图7a是用高乌甲素衍生物(qg3030)处理间充质干细胞0至24小时后，确认磷酸化erk(perk)水平的结果。[0069]图7b是用高乌甲素衍生物(qg3030)处理间充质干细胞7日后，确认磷酸化erk(perk)水平的结果。[0070]图7c是用高乌甲素衍生物(qg3030)处理间充质干细胞14日后，确认磷酸化erk(perk)水平的结果。[0071]图8a是用高乌甲素衍生物(qg3030)和erk抑制剂(pd98059)共同处理间充质干细胞后，通过荧光显微镜确认runx2表达变化的结果。[0072]图8b是用图表来表示图8a的荧光水平的图。[0073]图8c是用高乌甲素衍生物(qg3030)和erk抑制剂(pd98059)共同处理间充质干细胞后，确认磷酸化erk(perk)水平的结果。[0074]图9a是显示将高乌甲素衍生物(qg3030)施用于骨质疏松动物模型的日程和实验组种类的图。[0075]图9b是将高乌甲素衍生物(qg3030)施用于骨质疏松动物模型后，确认股骨的骨横截面的图。[0076]图9c是将高乌甲素衍生物(qg3030)施用于骨质疏松动物模型后，确认股骨的骨密度的图。[0077]图10a是将高乌甲素衍生物(qg3030)施用于骨质疏松动物模型后，确认骨生成水平的图。[0078]图10b是将高乌甲素衍生物(qg3030)施用于骨质疏松动物模型后，确认runx2表达水平的图。[0079]图11示意性地显示了将高乌甲素衍生物(qg3030)施用于骨折动物模型的方法。[0080]图12a是将高乌甲素衍生物(qg3030)施用于骨折动物模型后，确认大鼠长骨的骨横截面的结果。[0081]图12b是将高乌甲素衍生物(qg3030)施用于骨折动物模型后，确认大鼠长骨的骨生成度的结果。[0082]图13是将高乌甲素衍生物(qg3030)施用于骨折动物模型后，确认骨生成水平(a)和胶原蛋白表达水平(b)的结果。具体实施方式[0083]以下，将通过实施例更详细地描述一个以上的具体例。然而，这些实施例是为了说明一个以上的具体例，本发明的范围不限于这些实施例。[0084]制备例：qg3030的制备[0085]1-1.制备高乌甲素[0086]在高乌甲素·溴化氢(10.08g，0.017mol)中，加入二氯甲烷(500ml)和氢氧化钠溶液(naoh 10g+水100g)，使用分液漏斗分离水层和有机层。将分离出的有机层用水洗涤数次，并用无水硫酸镁干燥，然后蒸馏得到了所需的高乌甲素，收率为89％(8.90g)。[0087]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ10.98(s,1h),8.60(d,j＝8.4hz,1h),7.86-7.83(m,1h),7.42(t,1h),6.95(t,1h),3.52-3.37(m,2h),3.36-3.35(m,2h),3.36(s,j＝7.1hz,3h),3.22(s,3h),3.13(s,3h),3.11-3.09(m,2h),2.60-2.46(m,10h),2.15(s,3h),2.14-1.73(m,6h),1.74-1.68(m,1h),1.74-1.70(m,1h),1.06(t,j＝6.8hz,3h)；[0088]13c-nmr(cdcl3,100mhz)δ169.02,167.39,141.6,134.34,131.07,122.31,120.19,115.76,90.10,84.62,84.13,82.89,78.57,75.56,61.48,57.89,56.52,56.10,55.50,50.85,49.86,48.97,48.51,47.61,44.76,36.28,31.83,26.77,26.20,25.53,24.12,13.53；[0089]hrms(es+):c32h44n2o8的m/z计算值:585.3098[m+h]+。[0090]测试值(found)：585.3176。[0091]1-2.由高乌甲素制备高乌甲素衍生物(lad)[0092]在将二乙酸苯碘(phi(oac)2(14.07g,0.044mol)溶于二甲基甲酰胺(dmf，150ml)的溶液中，缓慢加入高乌甲素(8.9g，0.015mol)并搅拌10分钟。待反应完结，用乙酸乙酯(ea)稀释溶液，并使用饱和碳酸氢钠(nahco3)水溶液对其进行萃取。有机层用水洗涤数次以除去二甲基甲酰胺后，用无水硫酸镁干燥，并减压蒸馏。将得到的粗品(crude product)通过柱层析(乙醚:乙酸乙酯:己烷＝3:2:5)分离得到所需的高乌甲素衍生物(lappaconitine derivative，lad)(3s,6s,7s,9s,11s,16s)-1-乙基-6,9,11-三甲氧基-8,13-二氧代十二氢-2h-3,6a,14-(表乙烷[1,1,2]三基)-7,10-甲环十[b]偶氮嗪-3(4h)-基-2-乙酰氨基苯甲酸酯((3s,6s,7s,9s,11s,16s)-1-ethyl-6,9,11-trimethoxy-8,13-dioxododecahydro-2h-3,6a,14-(epiethane[1,1,2]triyl)-7,10-methanocyclodeca[b]azosin-3(4h)-yl2-acetaminobenzoate)，收率为25.7％(2.3g)。[0093]1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ10.99(s,1h),8.62(d,j＝8.4hz,1h),7.89(d,j＝9.6hz,1h),7.47-7.43(m,1h),7.01-6.99(m,1h),3.88-3.64(m,4h),3.65(s,3h),3.41(s,3h),3.18(s,3h),2.90-2.25(5,4h),2.20(s,3h),2.19-1.80(m,4h),1.15(t,j＝7.0hz,3h)；[0094]13c-nmr(cdcl3,100mhz)δ211.85,204.31,169.10,167.40,162.18,143.74,141.74,134.61,131.07,122.41,120.30,115.45,86.92,82.75,81.45,78.21,76.28,60.73,58.17,57.37,54.35,52.98,50.19,48.78,46.06,45.92,38.41,32.06,25.56,25.39,25.36,12.72；[0095]hrms(es+):c32h42n2o8的m/z计算值:583.3018[m+h]+。[0096]测试值(found)：583.2941。[0097]1-3.由lad制备qg3030[0098]将lad(2.3g)、氢氧化钠溶液(naoh 0.7g+水5.1g)和乙醇(51ml)放入100ml的三颈圆底烧瓶中，回流1小时。反应终止后，蒸馏乙醇，用乙酸乙酯进行柱层析，得到最终化合物qg3030{(2ar,2a1s,3s,4as,8s,11s,11bs,12s)-6-乙基-4a,8-二羟基-3,11-二甲氧基-十四氢-8，11a,5-(表乙烷[1,1,2]三基)环戊[7,1]茚并[5,4-b]偶氮嗪-1,2-二酮}，收率为62.5％。[0099]1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ8.88(s,1h),4.65(s,1h),4.35(s,1h),4.27-4.20 9m,1h),4.10-4.00(m,1h),3.60(s,1h),3.35(s,3h),3.20(s,3h),3.10-.2.99(m,1h),2.85-2.19(m,6h),1.99-1.50(m,7h),1.05(t,j＝7.0hz,3h)；[0100]13c-nmr(cdcl3,100mhz)δ201.20,149.88,148.78,83.25,79.92,79.50,67.87,62.74,60.20,58.10,53.23,49.55,48.86,47.88,46.92,42.39,38.43,13.56；[0101]hrms(es+):c22h31no6的m/z计算值:406.2151[m+h]+。[0102]测试值(found)：406.2242；x-射线结构。[0103]1-4.确认qg3030的结构[0104]将在上述制备例1-4中得到的qg3030用水重结晶，通过x射线衍射(x-ray diffraction)得到适当的晶体后，使用其确认x射线结构(x-ray diffractometer，r-axis rapid)。结果如图1和表1所示。[0105]【表1】[0106][0107]实验例1：确认qg3030的功效(体外)[0108]1-1.确认msc中qg3030的骨细胞分化能力[0109]参与骨生成的成骨细胞(osteoblast)是根据外部刺激以及各种与信号转导相关的转录因子，由间充质干细胞(mesenchymal stem cells,msc)分化产生的(garg等人,orthop surg.2017)。因此，测试了qg3030是否可以诱导人msc分化为成骨细胞。[0110]从美国atcc购入正常人的msc，使用msc特异性培养基(gibco)进行培养。用胰蛋白酶分离培养的细胞，离心后以3×104/孔的浓度接种到24-孔板中。次日，将msc培养基换成实验用培养基dmem培养基(dmem/10％fbs/青霉素/链霉素)，用单独qg3030(0.1μm)或阳性对照组oim(成骨诱导培养基；stempro骨生成分化试剂盒，赛默飞世尔科技公司)处理细胞。此后，每日将细胞培养基更换为新鲜的dmem培养基，用qg3030或oim处理，培养3周。培养终止后，用识别钙的茜素红(alizarin red)和识别矿物质的钙盐染色液(von kossa)对细胞进行染色。[0111]由染色结果可以确认，与成骨细胞分化的阳性对照组oim相同，qg3030在人msc中诱导钙和矿物质生成(图2a和图2b)。该结果表明qg3030可以在细胞水平上将msc分化为成骨细胞。[0112]1-2.确认在msc中的runx2和bmp2的表达变化[0113]runx2(矮小相关转录因子2；核心结合因子，cbfa1)是骨生成中最重要的转录调节因子，已知在骨生成过程中，参与成骨细胞分化、基质生成以及矿化(mineralization)(bruderer m等,eur cell mater.2014)。此外，runx2本身可以被bmp(骨形态发生蛋白)调节，上述bmp是细胞因子的一种(sun j等，mol med rep.2015)。因此，确认了qg3030是否诱导与骨生成相关的特异性因子的表达来诱导骨生成。[0114]将msc以3×104/孔的浓度接种在24-孔板中并培养24小时，次日起，将qg3030以不同浓度(0.001μm、0.01μm和0.1μm)每日处理一次，持续7天和14天。实验终止后，将msc用runx2和bmp-2抗体染色，并通过荧光显微镜观察。[0115]由结果可知，qg3030即使在低浓度(0.001μm＝1nm)下也强烈诱导runx2和bmp-2的表达，并且这种趋势随着浓度增加而变强(图3a和图3b)。该结果在分子水平上说明，qg3030可以通过诱导人msc分化为成骨细胞，参与骨生成。[0116]1-3.确认在msc中的骨钙素的表达变化[0117]骨钙素(osteocalcin)仅在成骨细胞中表达(lee等，cell 2007)并用作骨生成的有用的生物标志物(biomarker)(bharadwaj等，osteoporosis international.，2009)。因此，确认了qg3030对作为成骨细胞特异性标志物的骨钙素表达的影响。[0118]以与上述实验例1-3相同的方式进行实验后，将msc用骨钙素抗体染色并通过荧光显微镜确认。结果，即使在低浓度(0.001μm)下，qg3030也在处理第7日强烈诱导骨钙素的表达，其水平与阳性对照组oim处理组相似(图4a和图4b)。[0119]1-4.确认msc向成骨细胞的分化机制[0120]为了研究qg3030使msc分化为成骨细胞的机制，调查了相关的信号转导。[0121]对使用实验用dmem培养基培养的msc处理qg3030(1μm)或对照组化合物(dmso)并培养24小时。回收细胞后，按照磷酸化酶抗体阵列试剂盒(r&d systems)中规定的方法进行实验，该试剂盒含有特异性识别43种磷酸化酶的磷酸化形式的抗体。之后，使用imagej(nih，美国)程序分析样品。[0122]由分析结果可以确认，与作为对照组的dmso相比，qg3030强烈增加了信号转导分子，例如erk、akt和wnk1等的磷酸化(phosphorylation)(图5a和图5b)。[0123]1-5.确认msc向成骨细胞的分化机制[0124]为了进一步研究qg3030使msc分化为成骨细胞的机制，进行了使用磷酸化酶抑制剂的实验。[0125]培养msc后，同时处理磷酸化酶抑制剂(1μm)和qg3030(1μm)，次日更换培养基后，再次同时处理磷酸化酶抑制剂和qg3030。重复此操作3周后，使用茜素红对msc进行染色。[0126]由结果可以确认，与qg3030单独处理组相比，在使用抑制erk、p38或akt的抑制剂处理的实验组中，qg3030的成骨细胞分化能力受到抑制(图6)。该结果表明qg3030通过激活这些酶的信号转导，参与msc分化为成骨细胞。[0127]1-6.确认msc中对erk的磷酸化造成的影响[0128]根据现有的研究，包括erk和p38在内的map-激酶信号传导机制在成骨细胞分化中起重要作用(greenblatt等，mb，annu rev cell dev biol.2013)。与现有的研究一致，上述实施例1-5的结果证实了，qg3030具有通过erk和p38 map-激酶将msc分化为成骨细胞的可能性(图6)。此外，实验例1-4的结果证实了，qg3030通过erk的磷酸化，而非通过p38的磷酸化来分化为成骨细胞的可能性(图5a和图5b)。因此，确认了对msc处理qg3030后，根据经过时间的erk磷酸化的水平。[0129]结果，可以确认在qg3030处理30分钟内，被磷酸化的erk(perk)水平显著增加，尤其，即使在qg3030处理24小时后，被磷酸化的erk(perk)水平也增加(图7a)。[0130]此外，为了确认qg3030是否长期诱导erk的磷酸化，对msc处理不同浓度(0.001、0.01和0.1μm)的qg3030，并在7日和14日后确认被磷酸化的erk(perk)水平。结果，在所有处理qg3030的实验组中，被磷酸化的erk(perk)水平显著增加，尤其是即使在低浓度下，与阳性对照组oim相比，被磷酸化的erk(perk)的水平也增加的更多。这种趋势一直持续到qg3030处理14日后，由此确认了qg3030可以长时间增加erk的磷酸化(图7b和图7c)。[0131]该结果表明，根据qg3030的erk信号转导机制的长期激活，可能是qg3030的成骨细胞分化能力的核心机制。[0132]1-7.确认erk抑制剂对qg3030增加runx2表达的影响[0133]erk诱导runx2的磷酸化，以增加转录活性，并且可以参与稳定性(stability)以增加runx2蛋白质的量(greenblatt等，mb，annu rev cell dev biol.2013)。因此，通过qg3030增加erk磷酸化能够诱导runx2的表达，从而可以参与msc分化为成骨细胞。为了证明此，对msc处理qg3030(0.1μm)和rk抑制剂pd98059(50μm)后，确认了runx2的表达水平。[0134]由结果可知，在qg3030处理12小时内runx2的表达显著增加，但与erk抑制剂pd98059一起处理，runx2的表达显著减少。即使在qg3030处理24小时后，这种趋势也是相同的(图8a和图8b)。[0135]此外，正如预期的那样，qg3030的处理增加了在msc中erk的磷酸化水平，其被pd98059的处理所抑制(图8c)。[0136]上述结果表明，qg3030诱导erk活化是骨生成活性的主要机制。[0137]实验例2：确认qg3030的功效(体内)[0138]2.1.使用骨质疏松动物模型，确认qg3030的治疗能力[0139]在卵巢切除(ovariectomy，ovx)小鼠动物模型中，确认了qg3030的骨质疏松症治疗能力，该模型通常用作骨质疏松症动物模型。[0140]作为阳性对照组，将一种通过促进骨生成机制作为治疗骨质疏松症治疗剂的，属于甲状旁腺激素(parathyroid hormone，pth)系列的特立帕肽(forteo；礼来公司)和一种作为骨吸收抑制剂的，属于阿仑膦酸盐(alendronate)系列的福美加(fosamax；默克公司)皮下给药。对阴性对照组，口服水(h2o)，qg3030以5或30mg/kg的浓度口服给药(图9a)。持续10周每日给药，然后测量骨密度(bone mineral density，bmd)。[0141]测量结果显示，与阴性对照组相比，在qg3030给药组中，骨密度显著增加，显示了骨质疏松症治疗效果，qg3030的效果与福美加相似，且明显优于特立帕肽(图9b及图9c)。[0142]此外，由组织染色结果可知，qg3030在卵巢切除小鼠的股骨中诱导骨生成(图10a)，并且确认了显著增加参与骨生成的转录因子runx2的表达(图10b)。实验结果总结在以下表2中。表2中，bmd表示骨密度，tv表示总体积(total volume)，bv表示骨体积(bone volume)，tb.th表示骨小梁厚度(trabecular thickness)以及tb.n表示骨小梁数量(trabecular number)。[0143]【表2】[0144][0145]2.2.使用骨折动物模型，确认qg3030的治疗能力[0146]在sd(sprague dawley)大鼠的长骨上，通过直径为2mm的钻孔诱导骨缺损，并将与赋形剂(胶原蛋白海绵，)混合的qg3030(6、30和150μg/10μl)植入骨缺损部位内，评价骨再生功效(图11)。此时，在阳性对照组中处理bmp2(骨形态发生蛋白-2)，在阴性对照组中处理dmso(表3)。[0147]【表3】[0148]动物组浓度动物编号伪对照组(sham) 5骨折+dmso胶原海绵+dmso(10ul)5骨折+bmp2胶原海绵+bmp2(1ug/10ul)5骨折+qg3030(low)胶原海绵+qg3030(6ug/10ul)5骨折+qg3030(middle)胶原海绵+qg3030(30ug/10ul)5骨折+qg3030(high)胶原海绵+qg3030(150ug/10ul)5[0149]由移植4周后读取微型ct图像的结果可知，qg3030在所有浓度下都表现出与bmp2相似的骨再生能力(图12a)。[0150]为了统计量化qg3030的骨再生能力，将骨生成程度以三维图像呈现后设置roi(感兴趣区域)，以骨体积比(骨体积/总体积)(bv/tv，％)、骨小梁厚度(trabecular thickness)(tb.th，mm)、骨小梁数量(trabecular number)(tb.n，1/mm)和骨小梁距离(trabecular separation)(tb.sp，mm)参数进行分析。[0151]由结果可知，与处理dmso的阴性对照组相比，作为骨生成指标的骨体积比bv/tv在bmp2处理组(阳性对照组)和qg3030处理组(低、中、高浓度)中，以相同的水平增加(图12b)。[0152]此外，在用于评价形成的骨组织的骨质量的骨厚度tb.th、骨组织数量tb.n和骨组织距离tb.sp的分析中，在除tb.th.以外的tb.n和tb.sp中，与dmso处理组相比，可以确认在bmp2处理组(阳性对照组)和qg3030处理组(低、中、高浓度)中，以呈现统计学上显著的方式形成了优质的骨组织(图12b)。有趣的是，虽然统计学上显著性不大，与bmp2相比，qg3030生成更优质的骨骼。统计学上显著指标为*《0.05，**《0.01，***《0.001。[0153]为了证明在组织水平上的根据qg3030的骨再生，对细胞(h&e，苏木精&伊红)、胶原蛋白(马松三色染色)、i型胶原蛋白和骨钙素(osteocalcin)进行了组织染色。由结果可知，上述标志物在处理qg3030(低、中、高浓度)的骨缺损部位(用实线表示)中表达，其效果与bmp2相似(图13)。[0154]本实验例的骨再生结果证明qg303o具有与bmp2同样优异的骨再生能力。[0155]通过以上结果，确认了本发明的qg303o化合物在msc中诱导钙和矿物质的生成，增加runx2、bmp-2和骨钙素的表达，并诱导erk活化，从而可以诱导分化为成骨细胞。此外，当施用于骨质疏松动物模型时其增加骨密度，并在骨折动物模型中诱导骨生成，因此qg3030化合物不仅可以用于骨质疏松等骨相关疾病，还可以有效地用于物理性创伤引起的非疾患性骨折治疗。[0156]制剂例[0157]另一方面，根据本发明的新型化合物qg3030可以根据目的以各种形式制剂化。以下为例举包含根据本发明的新型化合物qg3030作为活性成分的组合物的制剂化方法，但本发明不限于此。[0158]1.片剂(直接加压)[0159]将5.0mg活性成分过筛后，与14.1mg的乳糖、0.8mg的交聚维酮usnf和0.1mg的硬脂酸镁混合并加压制成片剂。[0160]2.片剂(湿法造粒)[0161]将5.0mg活性成分过筛后，混入16.0mg的乳糖和4.0mg的淀粉(starch)。将0.3mg的聚山梨醇酯80溶解在纯水中后，将适量的该溶液加入到上述混合物中以将其雾化。干燥后，将细颗粒过筛并与2.7mg的胶体二氧化硅和2.0mg的硬脂酸镁混合。将细颗粒加压制成片剂。[0162]3.粉末和胶囊剂[0163]将5.0mg活性成分过筛后，与14.8mg的乳糖、10.0mg的聚乙烯吡咯烷酮、0.2mg的硬脂酸镁混合。使用合适的装置将混合物填充到坚固的no.5明胶胶囊中。[0164]4.注射剂[0165]通过将100mg的活性成分、180mg的甘露醇和26mg的na2hpo4/h2o溶解在2974mg的蒸馏水中制备注射剂。









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