负荷成瘾生产菌株的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明提供了一种用于合成产物的微生物生产细胞，其进一步包含负荷成瘾基因线路，其表达赋予合成产物的那些细胞选择性生长和/或存活优势；同时限制非/低生产性逃逸细胞的增殖。背景技术：2.越来越多的世界化学品生产依赖于微生物，所述微生物被基因工程化以发挥细胞工厂的功能，并为给定分子的生物合成量身定制。采用这些细胞工厂的生产过程通常始于生产生物的少量细胞的起始培养物，其在大发酵罐(高达1000000l体积)中经历细胞数量的生长和扩增期。在一些设置中，给定分子的生产在生长期和随后的时期(分批和补料分批培养)都进行；并且可替代地，生产可以是连续的。恒化发酵罐允许生产生物在不断稀释的发酵液中生长，由此从培养物中取出产物和细胞，同时补充新鲜的营养培养基。在工业规模上，这种生产过程可以持续操作1-2个月，然后在干净的罐中开始新的培养。在此工业中使用的发酵方法和设备非常相似，既用于生产多种商品小分子，也用于生产治疗性蛋白质，因此这些方法遇到相似的问题。在其他应用中，微生物细胞可被工程化以产生非天然分子，所述非天然分子在培养细胞的环境中赋予商业优势。3.为给定分子的生物合成分配有限代谢资源而工程化的细胞工厂承受非自然负荷；通常体现在生长较慢。这种负荷对不能合成产物分子(非生产或低生产)的细胞施加了选择压力，当生产运行持续较长时间时(例如在恒化器中)，这个问题尤其突出。工业发酵中的这种非生产细胞是非常不希望的，因为它们消耗营养、氧气和空间。由于低生产和非生产细胞生长更快，因此它们比生产细胞具有更强的选择优势。在生长的细胞培养物中，适合度的此类改善可能导致生产细胞随时间推移的显著退出竞争。从最佳生产状态的这种偏离是丢弃发酵液和将资源花费在清洁、灭菌上的最终原因，更不用说营养物，以新的生产微生物补充发酵罐。此类非生产细胞来源于经历多次生长分裂的原始生产生物的细胞中出现的基因突变。4.由于无法避免在生产生物的细胞中发生基因突变和非基因适应，从而导致生产运行过程中细胞产物形成的下降，因此需要用于消除或减缓生产中非生产细胞生长的方法。优选地，此类消除方法足够有效，它们防止观察到的从生产状态的偏离，从而延长工业发酵的寿命。5.本发明解决了如何剥夺细胞工厂的非生产成员的适合度优势的问题；如随时间推移延缓它们在生产性细胞工厂成员中的增殖，从而提高细胞工厂的生产率。技术实现要素：6.本发明的第一方面提供了一种经基因工程化以合成产物的微生物生产细胞，其中所述细胞进一步包含：[0007]-可操作地连接到负荷感应启动子的必需基因，[0008]其中所述启动子相对于所述必需基因是异源的；其中产物的合成赋予所述细胞负荷和/或适合度代价，并且其中相对于所述负荷感应启动子未被诱导时所述必需基因的基础水平表达，当所述负荷感应启动子被所述负荷和/或适合度代价诱导时，所述必需基因的表达被上调。[0009]本发明的第二方面提供了一种产物生物合成的方法，其包括以下步骤：[0010]-提供本发明的微生物生产细胞，[0011]-将所述细胞引入包含用于生产所述产物的底物的培养基中，[0012]-回收所述产物。[0013]本发明的第三方面提供了可操作地连接到负荷感应启动子的必需基因的用途，其用于提高来源于单细胞的微生物生产细胞培养群体的产物收率，其中所述启动子相对于所述必需基因是异源的；其中产物的产生赋予所述细胞负荷，并且其中相对于当所述负荷感应启动子未被诱导时的所述必需基因的基础水平表达，当所述负荷感应启动子被所述负荷诱导时的所述必需基因的表达被上调。[0014]本发明的第四方面提供了本发明的微生物生产细胞用于生产生物合成产物的用途。附图说明[0015]图1：示出亲代菌株大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)(灰线)的细胞和用hgh-gfp生产质粒peg34转化的亲代菌株(黑线；peg34)的细胞随时间推移生长(如光密度所测量：od 630nm)的图。在hgh-gfp表达诱导条件下测量每个菌株的四个重复培养物的生长；误差条描绘平均值的标准误差(n＝4)。[0016]图2：示出亲代菌株大肠杆菌bl21(de3)(黑线)的细胞和来源于亲代菌株的非生产负荷成瘾大肠杆菌菌株s5.0#3、s7.0#8和s9.0#8(如所指出的那样；其中必需基因folp-glmm分别由pyccv、pycjx和pmutm控制)的细胞随时间推移生长(如光密度所测量：od 630nm)的图。测得的生长速率基于四次重复培养(n＝4)的平均值。[0017]图3：示出含有hgh-gfp生产质粒peg34(黑线)或对照质粒peg0(灰线)的负荷成瘾菌株s9.0#8的细胞随时间推移生长(如光密度所测量：od 630nm)的图。在hgh-gfp表达诱导条件下测量每个菌株的四个重复培养物的生长；误差条描绘平均值的标准误差(n＝4)。[0018]图4：示出亲代菌株大肠杆菌bl21(de3)(黑线)的细胞和含有并表达hgh-gfp生产质粒peg34的三种负载成瘾菌株：s5.0#3、s7.0#8和s9.0#8(如所指出的那样)的细胞随时间推移生长(如光密度所测量：od 630nm)的图。在hgh-gfp表达诱导条件下测得的生长速率基于四次重复培养(n＝4)的平均值。[0019]图5：在以下hgh-gfp生产菌株的培养物的第一次和第六次培养转移(种子1和6)期间测量的gfp/od值(y轴)的直方图：s3.6(pibpa)、s6.6(pgrpe)、s7.6(pycjx)和s10.6(pybbn)，其包含各自的负荷感应启动子和驱动必需基因folp-glmm表达的四种变体rbs编码序列之一。包括非负荷成瘾大肠杆菌菌株beg34和亲代菌株大肠杆菌bl21(de3)、beg0的培养物作为对照。对在hgh-gfp表达诱导条件下生长的培养物进行测量。误差条描绘平均值的标准误差(n＝4)。[0020]图6：在以下hgh-gfp生产菌株的培养物的系列培养转移(种子1至12)后测量的gfp/od值(y轴)的直方图：s3.6#2(pibpa)、s6.6#6(pgrpe)、s7.6#8(pycjx)和s10.6#7(pybbn)，其包含各自的负荷感应启动子和驱动必需基因folp-glmm表达的四种变体rbs编码序列之一。包括非负荷成瘾大肠杆菌菌株beg34和亲代菌株大肠杆菌bl21(de3)的培养物作为对照。对在hgh-gfp表达诱导条件下生长的培养物进行测量。误差条描绘平均值的标准误差(n＝3)。[0021]图7：od/min的直方图，作为负荷成瘾hgh-gfp生产菌株s3.6#2、s6.6#6、s7.6#8和s10.6#7与非负荷成瘾hgh-gfp生产大肠杆菌菌株beg34和亲代菌株大肠杆菌bl21-de3(beg0)相比的生长速率的量度。各个菌株的生长速率基于在hgh-gfp表达诱导条件下在种子0测量的7个重复培养物；误差条表示平均值的标准误差(n＝7)。[0022]图8：示出在hgh-gfp生产菌株的培养物的系列培养转移(种子1、4至9)后测量的gfp/od值(y轴)减去空质粒对照beg0-空菌株的测量值的图。菌株显示为：(a)s7.6#8(pycjx)、(b)s13.6#2(pfsxa)和(c)s13.6#2evo(pfsxa)，各自包含驱动必需基因folp-glmm表达的各自的负荷感应启动子(灰线)，和非负荷成瘾hgh-gfp生产大肠杆菌菌株beg34(黑线)。对在hgh-gfp表达诱导条件下生长的培养物进行测量。误差条描绘平均值的标准误差(n＝5)。[0023]图9：示出在hgh-gfp生产菌株的培养物的系列培养转移(种子1、4至9)后测量的gfp/od值(y轴)减去空质粒对照beg0-空菌株的测量值的图。菌株显示为：(a)s15.6.7(prrnb)和(b)s16.6.6(prrne)，各自包含驱动必需基因folp-glmm表达的各自的负荷感应启动子(灰线)，和非负荷成瘾hgh-gfp生产大肠杆菌菌株beg34(黑线)。对在hgh-gfp表达诱导条件下生长的培养物进行测量。误差条描绘平均值的标准误差(n＝5)。[0024]图10：示出在hgh-gfp生产菌株s29.6#3的培养物的系列培养转移(种子2至5，以及7)后测量的相对hgh-gfp生产(y轴)减去平行空质粒对照beg0菌株的测量值的图。与非负荷成瘾hgh-gfp生产大肠杆菌菌株beg34(灰点)相比，菌株s29.6#3包含驱动必需基因folp-glmm表达的渗透应力感应启动子ppoxb(黑色方块)。在72小时后分析连续传代7次。对在hgh-gfp表达诱导条件下生长的培养物进行测量。误差条描绘平均值的标准误差(对于s29.6#3，n＝5并且对于beg34，n＝8)。[0025]图11：示出每分钟金黄色葡萄球菌(s.aureus)裂解速率的直方图，归一化为大肠杆菌培养物od，作为与非负荷成瘾溶葡萄球菌酶生产大肠杆菌菌株bendu5cam相比，包含负荷感应启动子pgrpe和驱动必需基因folp-glmm表达的四种变体rbs编码序列之一的溶葡萄球菌酶生产菌株s6.4#5的培养物的分泌溶葡萄球菌酶生产速率的量度。在系列培养转移(种子1和7)后，在溶葡萄球菌酶表达诱导条件下生长的培养物上测量所述速率。误差条描绘平均值的标准误差(n＝3)。[0026]图12：示出与亲代非负荷成瘾甲羟戊酸生产大肠杆菌菌株bl21(de3)-pmevt相比，在系列培养转移(种子2、5和6)后测量的由负荷成瘾甲羟戊酸生产菌株s19.1#1(pcspd)和s9.1.4(pmutm)的培养物合成的甲羟戊酸滴度(g/l)的图。负荷感应启动子pcspd和pmutm各自与驱动必需基因folp-glmm表达的四种变体rbs编码序列之一组合。对在mevt表达诱导条件下生长的培养物进行测量。误差条描绘平均值的标准误差(n＝3)。[0027]图13：示出毕赤酵母(pichia pastoris)菌株egs31的培养物的人血清白蛋白(hsa)生产滴度的柱状图，所述菌株egs31包含在aox1启动子控制下的hsa编码alb1基因的cdna版本的基因组整合拷贝，和可操作地连接到kanmx选择基因的pdi1启动子。培养物在选择条件(由750μg/ml g418激活成瘾性)或非选择条件(成瘾性未激活)下生长。“成瘾性未激活”培养物的hsa滴度设定为100％，而“成瘾性激活”培养物的滴度显示为其百分比。[0028]图14a和14b：示出毕赤酵母菌株egs31的负荷成瘾版本的培养物的人血清白蛋白(hsa)生产滴度的柱状图，每个菌株包含在aox1启动子控制下的hsa编码alb1基因的cdna版本的基因组整合拷贝，和可操作地融合到负荷响应启动子fpr2或rpl3或rpl6a的kanmx选择基因。培养物在非选择条件(成瘾性未激活)下或在选择条件(用150或750μg/ml g418激活成瘾性)下生长约30个细胞分裂期([a]种子1)，或在进一步10个细胞分裂([b]种子2)后。平均hsa滴度以种子1“egs31”培养物中滴度的百分比显示。误差条描绘平均值的标准误差(n＝4)。具体实施方式[0029]缩写、术语和定义：[0030]负荷是指一般和/或产物特异性代谢毒性、代谢负荷和/或代谢消耗；其是经基因工程化以合成产物的微生物细胞在生产条件下在生产产物期间所经历的，并且其导致适合度代价，所述适合度代价可以通过在生产条件下在生产产物期间测量细胞的最大指数生长速率(沿生长曲线)与在可比生产条件下生长时不能进行所述生产的亲代微生物细胞相比的百分比降低来量化。[0031]负荷感应启动子是指由所述“负荷”诱导的启动子，并且当被诱导时，与所述微生物生产细胞的基本上不合成生产细胞的产物或少合成其至少50％的突变体衍生物相比，当在生产条件下培养时，所述负荷感应启动子可以上调微生物生产细胞中与其可操作地连接的基因的表达。这种突变体衍生物包括在长期培养来源于所述生产细胞的细胞群体后分离的非生产性逃逸突变体。负荷感应启动子的非限制性示例包括大肠杆菌基因htpg、ibpa、clpb、yccv、grpe、ycjx、ldha、mutm、ybbn、prlc、groes、fxsa、htpx、rrnb、rrne、cspd、kate、xtha、uspe、gadb、ahpc、katg、grxa、oxys、poxb、trxc的启动子(详情参见表2)和它们在其他革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中的同源版本；并且对于酿酒酵母(s.cerevisiae)，负荷感应启动子的非限制性示例包括基因kar2、pdi1、saa1、fpr2、rpl3、rpl6a、rpl28、ogg1、rad51、rad54的启动子(详情参见表2)。负荷感应启动子还可以是此类天然启动子的杂合、混杂或截短版本，只要此类启动子仍保持对负荷的反应。[0032]负荷成瘾微生物细胞是指被工程化以包含基因线路的微生物细胞，所述基因线路包含可操作地连接到细胞的必需基因的所述“负荷感应启动子”。[0033]负荷成瘾微生物生产细胞是指经基因工程化以合成期望产物的微生物细胞，所述细胞经进一步基因工程化以包含基因线路，所述基因线路包含可操作地连接到细胞的“必需基因”的所述“负荷感应启动子”。期望产物可以是由所述工程化微生物细胞中的核酸分子编码的蛋白质，或由待由所述细胞表达的一种或多种核酸分子编码的异源途径的产物。[0034]本发明的期望产物包括(但不限于)当由基因工程化微生物生产细胞合成时，给生产细胞带来适合度代价(负荷)的产物。非限制性示例包括有机酸、萜类化合物、类异戊二烯、聚酮化合物、醇、糖、维生素、醛、羧酸、脂肪酸、氨基酸、肽、酶、治疗性蛋白质及其前体(如人生长激素)、胰岛素、胰高血糖素样肽-1、单克隆和多克隆抗体、单片段抗体。[0035]必需基因(或必需基因操纵子)是指微生物生产细胞中的一个或多个基因，如果所述基因被下调，将导致微生物生产细胞在生产条件下的生长速率降低。优选地，无论这些生产条件的营养组成如何，必需基因对于生长都是必需的，由此支持细胞生长的此类必需基因的充分表达将不依赖于生产条件下提供的特定抑制剂或营养物的存在与否。标准实验室条件下必需基因的非限制性示例包括folp-glmm、glmm、muri、asd、thya、rpod、nusg、rpsu、accd、degs、flda、ftsn、hflb、lola、mray、mred、mura、murb、murf、nadd、rplv和rpsg，并且对于地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)或枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)：glmm、ylan、infa和dapa，并且对于酿酒酵母，非限制性示例包括ura3、fol1、med7、rrp40、nop8、pgi1和nep1。例如，合适的基因编码负责合成细胞壁组分的酶。此外，本发明上下文中使用的必需基因优选地既不编码待由生产菌株表达的期望产物；也不编码有助于在待由生产菌株表达的异源途径中合成期望产物或其中间体的蛋白质。[0036]条件必需基因是允许微生物生产细胞中的负荷成瘾系统通过在必需条件下(如添加抗生素或去除营养物)培养细胞而被“激活”的基因。[0037]必需基因基础表达水平是当“负荷感应启动子”未被诱导时，可操作地连接到负荷成瘾微生物生产细胞中的“负荷感应启动子”的“必需基因”(如上定义)的转录水平。必需基因可操作地连接的负荷感应启动子相对于所述必需基因是异源的，在某种意义上，所述启动子不是所述必需基因的天然启动子(即使所述启动子可能存在于同一基因组中)，并且因此在自然界中没有发现与所述必需基因可操作地连接。必需基因的所述基础(即未诱导的)水平表达是足以支持细胞在生产条件下(或在指数生长期)生长的水平，所述水平等于或小于其中所述必需基因可操作地连接到其天然启动子的对应细胞生长速率的10％、20％、50％、90％或95％。[0038]适合度代价：通过在可比生产条件下生长时，相对于缺乏或不能表达编码产物或产物生物合成代谢途径的一种或多种基因的亲代微生物细胞(微生物生产细胞从其衍生)的最大指数生长速率，比较非负荷成瘾微生物生产细胞(即缺乏可操作地连接到必需基因的负荷感应启动子，但包含并表达编码产物或编码产物生物合成的代谢途径的一种或多种基因)的最大指数生长速率来量化。[0039]生产条件是指待在生产过程中使用的特定培养条件，并且可以涉及用于通过微生物生产细胞生产期望产物的培养基和/或其他培养条件(例如温度、ph、搅拌、通气等)。[0040]核糖体结合位点(rbs)、翻译起始区或翻译强度元件是指控制特定信使rna翻译强度的5'非翻译区的基因区。[0041]具体实施方式：[0042]i.负荷成瘾微生物生产细胞[0043]本发明的第一方面提供了一种经基因工程化以合成产物的微生物生产细胞，其中所述细胞进一步包含：[0044]a.可操作地连接到负荷感应启动子的必需基因，[0045]其中所述启动子相对于所述必需基因是异源的；其中产物的产生赋予所述细胞负荷和/或适合度代价，并且其中相对于所述负荷感应启动子未被诱导时所述必需基因的基础水平表达，当所述负荷感应启动子被所述负荷和/或适合度代价诱导时，所述必需基因的表达被上调。[0046]根据一个实施方式，本发明的微生物生产细胞包含：[0047]b.编码产物或编码产物合成代谢途径的一个或多个基因，[0048]其中任选地，所述一个或多个基因可操作地连接到组成型或诱导型启动子。[0049]根据一个实施方式，本发明的所述微生物生产细胞的所述负荷和/或适合度代价通过相对于缺乏或不能表达编码产物或编码产物合成代谢途径的一种或多种基因并且所述微生物生产细胞从其衍生的亲代微生物细胞的最大指数生长速率，比较包含编码产物或编码产物合成代谢途径的一种或多种基因但缺乏可操作地连接到必需基因的负荷感应启动子的微生物生产细胞的最大指数生长速率来量化，其中各个细胞在基本上相同的生产条件下培养。所述微生物生产细胞的负荷和/或适合度代价优选地对应于选自≥5％、≥10％、≥15％、≥20％、≥25％、≥35％和≥45％中的量化最大指数生长速率的百分比降低。[0050]根据本发明的负荷成瘾微生物生产细胞可以是任何原核或真核微生物，如细菌、酵母和丝状真菌。[0051]在一个实施方式中，本发明的微生物生产细胞是原核生物。合适的细菌的非详尽列表给出如下：属于选自埃希氏杆菌属(escherichia)、乳杆菌属(lactobacillus)、乳球菌属(lactococcus)、棒状杆菌属(corynebacterium)、芽孢杆菌属(bacillus)、醋酸杆菌属(acetobacter)、不动杆菌属(acinetobacter)、假单胞菌属(pseudomonas)；丙酸杆菌属(proprionibacterium)、拟杆菌属(bacteroides)和双歧杆菌属(bifidobacterium)的属的物种。[0052]在另一个实施方式中，本发明的微生物生产细胞是真核生物，如酵母或真菌。在某些实施方式中，真核生物可以是酵母属(saccharomyces)、komagataella属或曲霉属(aspergillus)的成员。[0053]合适的酵母的非详尽列表给出如下：属于酵母属的酵母，例如酿酒酵母、克鲁弗酵母(s.kluyveri)、贝酵母(s.bayanus)、少孢酵母(s.exiguus)、s.sevazzi、葡萄汁酵母(s.uvarum)；属于克鲁维酵母属(kluyveromyces)的酵母，例如马克斯克鲁维酵母乳酸变种(k.lactis k.marxianus var.marxianus)、耐热克鲁维酵母(k.thermotolerans)；属于假丝酵母属(candida)的酵母，例如产朊假丝酵母(c.utilis)、热带假丝酵母(c.tropicalis)、白色假丝酵母(c.albicans)、解脂假丝酵母(c.lipolytica)、易变假丝酵母(c.versatilis)；属于毕赤酵母属(pichia)的酵母，例如树干毕赤酵母(p.stipidis)、巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)、嗜山梨醇毕赤氏酵母(p.sorbitophila)，或其他酵母属，例如隐球菌属(cryptococcus)、德巴利酵母属(debaromyces)、汉逊酵母属(hansenula)、耶氏酵母属(yarrowia)、接合酵母属(zygosaccharomyces)或裂殖酵母属(schizosaccharomyces)。[0054]合适的丝状真菌的非详尽列表给出如下：属于青霉属(penicillium)、根霉菌属(rhizopus)、镰孢菌属(fusarium)、梭链孢属(fusidium)、赤霉菌属(gibberella)、毛霉属(mucor)、被孢霉属(mortierella)、木霉属(trichoderma)、嗜热真菌属(thermomyces)、链霉菌属(streptomyces)和曲霉菌属(aspergillus)的丝状真菌。更具体地，丝状真菌可以选自尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、黑曲霉(a.niger)、泡盛曲霉(a.awamori)、米曲霉(a.awamori)和构巢曲霉(a.nidulans)。[0055]由本发明的微生物生产细胞合成的一种或多种产物是带来细胞负荷和适合度代价(反映为生长速率的降低)的产物，所述一种或多种产物包括氨基酸、有机酸、萜类化合物、类异戊二烯、聚酮化合物、醇、糖、维生素、醛、羧酸、脂肪酸、肽、酶、治疗性蛋白质及其前体(如人生长激素)、胰岛素、胰高血糖素样肽-1、单克隆和多克隆抗体、单片段抗体。在一个实施方式中，所述产物不是本发明的微生物生产细胞的天然产物，因此不是由衍生所述微生物生产细胞的亲代细胞产生的。在一个实施方式中，编码产物或编码产物合成代谢途径的一种或多种基因对于本发明的微生物生产细胞是异源的；其中所述一种或多种基因可以是转基因。[0056]ii.本发明的微生物生产细胞的特征[0057]ii.i适合度代价-生产负荷[0058]微生物细胞中期望产物的异源表达或产生期望产物的途径给细胞带来了负荷。负荷还可以来自天然产物的过量生产，例如在诱变后选择的微生物菌株的细胞中。负荷可被描述为导致细胞生长较慢的适合度代价(实施例1；图1)。这可能是由于微生物细胞在生产条件下在本发明产物的生物合成期间所经历的一般和/或产物特异性代谢毒性、潜在有限细胞资源和代谢物的使用和/或消耗增加。特别是在工业规模的发酵过程中，适合度代价和较慢生长的组合对发酵罐中的细胞群体施加了选择压力，随着时间的推移，由于遗传突变或非遗传变异导致的非生产性细胞的积累，导致产物收率下降(实施例2，图6中的beg34)。[0059]在本发明中，编码产物或编码产物生物合成代谢途径的一种或多种基因在微生物生产细胞中的存在和表达赋予了适合度代价(负荷)。[0060]在微生物生产细胞上生产产物的适合度代价通过相对于缺乏编码产物或产物生物合成代谢途径的一种或多种基因的亲代微生物细胞(微生物生产细胞从其衍生)的生长速率，比较非负荷成瘾微生物生产细胞(即缺乏可操作地连接到必需基因的负荷感应启动子，但包含并表达编码产物或编码产物生物合成的代谢途径的一种或多种基因)的生长速率来量化。所述微生物生产细胞的负荷和/或适合度代价优选地对应于选自≥5％、≥10％、≥15％、≥20％、≥25％、≥35％和≥45％，更优选至少5％的量化生长速率的百分比降低。[0061]优选地，当在基本上相同的条件(选择这些条件以接近地模拟最终将发生大规模发酵的条件)下培养时，通过测量它们的最大指数生长速率，对相应的微生物细胞进行相对生长速率的量化。[0062]ii.ii必需基因[0063]本发明的微生物生产细胞包含编码其表达是细胞生长和/或存活所需的蛋白质的必需基因。[0064]优选地，必需基因及其表达不会间接导致生产细胞期望产物的产量下降。此外，本发明上下文中使用的必需基因不编码或导致待在微生物生产细胞中表达的异源途径的期望产物或中间体的合成。[0065]必需基因优选地是非条件必需基因，使得无论生长培养基的组成或培养细胞的条件如何，所述基因的表达对于细胞生长和/或存活都是必需的。[0066]在本发明的一个实施方式中，当生产细胞是原核生物如大肠杆菌时，非条件必需基因选自folp-glmm、glmm、muri、asd、thya、usa、rpod、nusg、rpsu、accd、degs、flda、ftsn、hflb、lola、mray、mred、mura、murb、murf、nadd、rplv和rpsg。[0067]在本发明的另一个实施方式中，当生产细胞是原核生物，如芽孢杆菌菌株时，非条件必需基因选自glmm、ylan、infa和dapa。[0068]在本发明的一个实施方式中，必需基因是导致合成营养缺陷型生长所需的产物或对生长抑制剂如抗生素、特异性毒素、原毒素等具有抗性所需的蛋白质产物的条件性必需基因。[0069]在本发明的一个实施方式中，当生产细胞是真核生物时，非条件的必需基因选自fol1、med7、rrp40、nop8、pgi1、nep1；并且条件必需基因选自ura3、leu2、trp1、his3。[0070]当必需基因是条件性必需的时，则必须调整生产细胞的生长培养基/生长条件的组成，如使用缺乏特定营养物或补充有生长抑制剂的生长培养基。[0071][0072][0073][0074][0075]****bl：通过https://www.genome.jp/kegg-bin/show_organism？org＝bli访问[0076]***根据本发明的必需基因是编码与由表中列出的相应必需基因编码的蛋白质具有至少70％、80％、90％、95％或甚至100％氨基酸同源性的蛋白质的基因。[0077]**biocyc/ecocyc数据库集合是途径/基因组数据库的大型在线集合-由https://biocyc.org/访问[0078]*sgd是“酵母基因组数据库”‑通过https://yeastgenome.org/访问[0079]基因的必要性可以通过创建细胞来确定，在所述细胞中相应的基因被敲除，其中非条件性基因敲除将导致细胞生存力的丧失，或生长失败，而与生长条件无关；而条件性基因敲除将导致生长失败或细胞生存力的丧失，这取决于培养的组成培养基/条件。[0080]合适的必需基因可以通过进行测试测定来鉴定，所述测试测定将经测定的必需基因的天然启动子替换为诱导型启动子，如l-阿拉伯糖诱导型pbad(在大肠杆菌中)、木糖诱导型pxyl(在枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌中)或半乳糖诱导型pgal(在酿酒酵母或毕赤酵母中)或plac(在大肠杆菌或乳杆菌中)。在这种必需基因测定中，使用标准方法将包含诱导型启动子的整合dna构建体染色体整合到宿主微生物细胞中。在原核生物的情况下，整合dna优选地含有rbs目录(例如，表3)，以指导必需基因以不同的速率翻译，从而说明不同启动子的不同基线表达水平和必需基因所需的不同基线所需表达水平，以支持以对应的野生型特异性生长速率生长。在整合dna的靶向整合后，将整合体细胞铺在补充有许可条件(诱导物的温度或浓度：＞0.9％l-阿拉伯糖、＞0.8％木糖、＞1％iptg、＞2％半乳糖)的板上。随后在标准生长曲线测定中测试细胞对诱导物条件的合成成瘾，并且合适的必需基因可被鉴定为诱导物依赖性生长速率可被鉴定的基因。在不存在诱导条件的情况下，可以观察到诱导物依赖性生长，生长速率降低＞5％。合适的必需基因的特征在于，在与生产相关的培养基中，在最佳诱导物条件下，赋予指数期特定生长速率的降低小于《5％。[0081]鉴定必需基因的方法在“基因必需性-方法和方案”2015年1月[doi 10.1007/978-1-4939-2398-4]中详细描述，这使得技术人员能够确定基因在特定生长条件下对于微生物细胞生长是否是必需的；包括用于绘制和鉴定以下各项的必需基因的方法：空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)；血链球菌(streptococcus sanguinis)；牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)；大肠杆菌；钩端螺旋体病(leptospirosis)；结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)；铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)；和白色念珠菌(candida albicans)；主要通过筛选转座子标记的文库。另外，其中描述的各种“计算工具”使得技术人员能够直接预测和鉴定微生物基因组中编码必需蛋白质的基因，这得益于全基因组微生物序列的广泛可得性；和许多已知必需基因的结构特征。因此，向技术人员提供了必需基因的两个数据库；以及各种可自由访问的在线工具和算法，用于在没有过度负荷的情况下成功且可重复地鉴定微生物细胞基因组中的大量必需基因。应进一步注意的是，酿酒酵母中82％的必需基因编码与另一种生物中的蛋白质相似的必需蛋白质[giaever g等人,2002]；证明大多数必需基因，无论是已知的还是在一种微生物(例如酵母)中鉴定的，将在其他微生物中具有对应的基因，并且因此可以通过简单的blast搜索在选择的微生物中进行鉴定。[0082]ii.iii负荷感应启动子[0083]如上所述，本发明的微生物生产细胞包含可操作地连接到编码细胞生长和/或存活所需蛋白质的必需基因的负荷感应启动子。负荷感应启动子是在微生物生产细胞中被诱导的启动子，所述细胞由于其产物的生产或过量生产而经受负荷和/或适合度代价。通常，当微生物细胞的产物生产导致细胞生长速率降低(这又归因于生产的适合度代价)时，将发生负荷感应启动子的诱导。重要的是，根据本发明，负荷感应启动子是由产物生产导致的生产细胞中的“负荷状态”诱导的，而不是由产物本身诱导的。由于使用负荷感应启动子和必需基因来提高微生物生产细胞的生产率在很大程度上不依赖于其被工程化制造的产物，因此由本发明赋予的负荷成瘾支持广泛的微生物生产细胞应用。[0084]由于必需基因可操作地连接到负荷感应启动子，因此其在负荷感应启动子被诱导时的转录和表达水平仅增加到高于基础水平。合适的负荷感应启动子是这样一种启动子，当未被诱导时，其允许可操作地连接的必需基因的基础水平表达，所述表达显著限制或阻止细胞生长和/或存活。因此，与必需基因可操作地连接到其天然启动子的细胞相比，包含处于未诱导状态的负荷感应启动子的细胞将明显较慢地生长(实施例1，图2)。相比之下，与不生产产物的细胞相比，当细胞合成期望产物时，包含与必需基因相连的负荷感应启动子的微生物生产细胞表现出显著增加的生长速率(实施例1，图3)。此外，尽管存在生产产物的固有负荷，但本发明的微生物生产细胞可以令人惊讶地实现与亲代微生物细胞的生长速率没有区别的初始生长速率，所述亲代微生物细胞缺乏编码产物或产物生物合成的代谢途径的一种或多种基因并且微生物生产细胞从其衍生(实施例1，图4)。因此，在生产条件下，本发明的微生物生产细胞将比停止合成产物的生产细胞的逃逸变体具有选择优势，从而降低逃逸率。[0085]在一个实施方式中，负荷感应启动子就微生物生产细胞而言可以是天然启动子，或经修饰的天然启动子，同时就必需基因而言是异源的。[0086]在一个实施方式中，启动子含有天然tf/σ因子结合位点。合适的负荷感应启动子是大肠杆菌σ32调节子的启动子，因为它们通常响应于蛋白质的过量表达及其细胞内聚集而被上调。大肠杆菌σ32启动子的非详尽列表包括在本文的表2中，而另外的合适的启动子由nonaka等人,2006鉴定。[0087]在一个实施方式中，负荷感应启动子是σ因子调节的启动子。在优选的实施方式中，负荷感应启动子经由σ32调节子激活，并且可以选自大肠杆菌基因htpg、ibpa、clpb、yccv、grpe、ycjx、ldha、mutm、ybbn、prlc、groes、fxsa和htpx的启动子。对于芽孢杆菌，此类合适的负荷感应启动子可以选自例如hrca调节的启动子，包括groes的启动子。[0088]在一个实施方式中，负荷感应启动子是mutm基因的启动子。mutm编码一种功能上保守的dna糖基化酶，其负责启动一种最常见的氧化应激诱导的dna损伤的修复，即鸟嘌呤氧化成7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤(8-oxog)(jain等人,2007)。[0089]负荷感应启动子还包括与细胞碳营养状态和生长期相关的启动子。因此，在一个实施方式中，负荷感应启动子是毒素基因cspd的启动子，其被降低的生长速率和碳饥饿激活(uppal等人,2014；yamanaka和inouye,1997)，并因此预测在由于代谢产物的产生而经受负荷或适合度代价的细胞中差异上调。[0090]在一个实施方式中，负荷感应启动子是核糖体rna启动子，特别是rrnb和rrne基因的启动子，其响应于营养供给，被fis蛋白诱导，并被ppgpp警报素抑制。rrn启动子活性在具有高蛋白质产量的细胞中被诱导，如在其早期指数生长期所见(nonaka等人,2006)。[0091]在一个实施方式中，负荷感应启动子是响应于与代谢负荷和微生物异源生产相关的氧化应激的启动子(dragosits和mattanovich,2013)。氧化应激反应启动子包括由oxyr调节的启动子，其激活与改善和保护细胞对氧化损伤的反应相关的几个基因；和属于rpos(σs)的基因的启动子，其在蛋白质的过表达过程中，主要是在稳定生长期被上调。[0092][0093][0094][0095][0096]*编号对应于分配给在本技术的实施例部分中测试的不同菌株的编号。[0097]**biocyc/ecocyc数据库集合是途径/基因组数据库的大型在线集合-由https://biocyc.org/访问[0098]不同负荷感应启动子(例如在表2中)诱导/激活时的基础表达水平和特异性反应曲线是不同的，当选择与特定微生物生产细胞及其产物具有最佳匹配(就强度而言)的负荷感应启动子时，可以利用这一点。[0099]在生产过程中由微生物生产细胞中的负荷和/或适合度代价诱导的合适的负荷感应启动子可以选自技术人员已知的公共数据库，例如用于大肠杆菌启动子的https://ecocyc.org；用于枯草芽孢杆菌启动子(也适用于地衣芽孢杆菌启动子)，它们各自的原核同源物的https://bsubcyc.org；用于酿酒酵母启动子及其真菌同源物的https://www.yeastgenome.org。[0100]还可以在测试测定中验证合适的负荷感应启动子，其中候选负荷感应启动子可操作地连接到编码荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白)的基因，并整合到经基因工程化以合成产物的微生物生产细胞中，并整合到对应的非生产细胞(对照)中，所述细胞在生产培养基中在50-150代细胞的连续稀释培养实验后被分离。与非生产细胞(对照)相比，负荷感应启动子在生产细胞中诱导的可检测的荧光蛋白表达为至少5％、7.5％、10％、15％、25％、60％、150％、300％。[0101]ii.iv将负荷感应启动子与微生物生产细胞匹配[0102]响应于生产产物的负荷或适合度代价，微生物生产细胞表现出以表达某些基因为特征的转录状态，在生产发酵期间，所述基因的表达在对应的非生产性亲代细胞或衍生自微生物生产细胞的非生产性逃逸细胞中不被诱导。负荷或适合度代价的生理性质将取决于由给定微生物生产细胞合成的产物，并将反映在其表达被诱导的基因类型中。在生产给定产物的细胞中诱导的基因启动子的身份可以通过本领域熟知的技术(例如转录组学，参见实施例7)来确定。由于许多经诱导的基因启动子将与表2中列出的那些启动子相关或对应，因此这些为给定微生物生产细胞寻找匹配的负荷感应启动子提供了起点。通过鉴定在感兴趣的生产菌株中被发现特异性上调的基因的5至15个启动子，可以扩展启动子的选择。如本文实施例中所示，用于以产物特异性方式将可操作地连接到必需基因的负荷感应启动子与微生物生产细胞相匹配的方法在实验上是快速的，并且可以在简单的实验室设置中进行。[0103]ii.v翻译控制元件[0104]通过必需基因表达调节本发明的微生物生产细胞的生长，要求负荷感应启动子的反应阈值和曲线与必需基因的表达水平平衡；使得基础水平的必需基因表达支持有限的生长或不支持生长，而在高产细胞中，经诱导的负荷感应启动子驱动足够的必需基因表达以支持显著增加的生长速率，优选地，当在指数生长期测量时，生长速率类似于缺乏本发明的负荷感应启动子的生产性细胞的生长速率或≤低5％。[0105]用于平衡负荷感应启动子对必需基因表达水平的负荷反应的一种合适方法是修饰必需基因的翻译强度。在细菌中，翻译强度由起始密码子直接上游的shine-dalgarno/核糖体结合位点(rbs)序列定义，而在真核细胞中，翻译起始区/kozak元件可以用于修饰翻译强度。大肠杆菌中赋予宽范围翻译强度的rbs在表3中提供，而进一步的示例可以在文献(例如bonde等人,2016)中找到。本领域技术人员可以通过为每个负荷感应启动子构建核糖体结合位点的四个变体(rugbjerg等人,2018,pnas[美国国家科学院院刊])，并测试哪个变体能够使所选择必需基因有效调节细胞的生长速率，来平衡经调节的必需基因的翻译强度。用于地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的示例性rbs在表3.1中提供。[0106][0107][0108][0109]ii.vi工程化负荷感应启动子和翻译控制元件[0110]选择的天然负荷感应启动子通常被原核生物中天然调节的orf的-1至-300bp区域(上游)和真核生物中的-1至-500bp区域包含。必须包含的核心启动子及其调控位点(例如转录因子结合位点)的序列边界是普通常识，如对于σ32(nonaka等人,2006)。翻译控制元件/rbs可被添加至启动子的下游，以避免所选择启动子序列的调节特性的改变。[0111]ii.vii提高生产水平[0112]除了与非生产性细胞相比具有增加的初始生长速率之外，本发明的微生物生产细胞的一个令人惊讶的优势是与缺乏工程化负荷成瘾的微生物生产细胞相比，经过多次细胞分裂，所述细胞在大规模发酵期间仍保持显著提高的生产率(在实施例2中模拟；图6)。无论合成的产物类型(如实施例2-5中由微生物生产细胞合成的产物范围所示)如何，都获得了由本发明的微生物生产细胞中负荷成瘾赋予的令人惊讶的优势。[0113]根据一个实施方式，本发明的微生物生产细胞的特征在于，在从单个细胞进行至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、100、150、250或400代次细胞分裂后，与相同代次细胞分裂后的非负荷成瘾生产细胞相比，产物收率提高。将产物收率测量为每单位底物生产的产物的摩尔数或克数。[0114]在一个实施方式中，在从单个细胞进行至少50代次细胞分裂后，与相同代次细胞分裂后的参考非负荷成瘾生产细胞相比，生产水平增加了至少10％、25％、50％或80％。[0115]微生物细胞工厂工程化中的普遍实践旨在最小化已知由于异源途径的维持和表达而产生的负荷。本发明提供了一种提高细胞工厂收率的反直觉解决方案，因为它使微生物细胞生长和存活依赖于生产其产物的细胞，同时经受恒定的负荷或适合度代价。虽然不希望被理论束缚，但推测在本发明的微生物生产细胞及其后代上施加的选择压力(其中仅处于负荷状态的生产性细胞可以生长/存活)可以用于在初始等基因细胞的起始群体中的长期培养期间逐步选择高负荷细胞亚群。[0116]iii.用于制备和鉴定负荷成瘾微生物生产菌株的细胞的方法[0117]在进行本发明的优选方法中，通过以下步骤制备和鉴定负荷成瘾微生物生产菌株。为了获得负荷感应启动子和必需基因之间的最佳工作关系，制备和测试具有不同rbs的不同候选负荷感应启动子以调节所选择必需基因可能是相关的。[0118]iii.i特定生产菌株中一种或多种负荷感应启动子候选物的鉴定[0119]可以测试表2中列出的候选负荷感应启动子。可替代地，可以鉴定在感兴趣的特定生产菌株中检测到的独特的正分化基因转录物；它们各自的启动子提供了候选负荷感应启动子的来源。优选地，通过将微生物生产菌株(在生产过程中)的转录物图谱与来源于对应生产菌株的经分离的一种或多种基因或非基因逃逸突变变体进行比较来鉴定此类分化基因转录物，其中这种逃逸突变变体的特征在于至多低50％更低的生产速率。正分化基因转录物可以通过使用转录组学来鉴定；例如通过与非/低生产逃逸突变变体相比，对从一种或多种生产性微生物生产细胞中提取的经转录rna进行rna测序。经鉴定的启动子可以与微生物生产细胞中的给定必需基因组合进行测试。[0120]用于鉴定一种或多种负荷感应启动子的方法在实施例7中示出；然后将所述一种或多种启动子可操作地连接到用于测试的所选微生物生产细胞中的必需基因。[0121]iii.ii在生长调节过程中引入负荷感应启动子[0122]通过将选自一般候选负荷感应启动子列表(表2)或选自经鉴定的一种或多种特定负荷感应启动子(参见iiii)的一种或多种启动子可操作地连接到微生物生产细胞中的必需基因来测试所述启动子。必需基因的不同翻译强度可以通过提供同源必需基因的替代rbs序列来同时测试；以及测试不同的必需基因(如第iiii节所述)。就微生物生产细胞而言，必需基因可以是天然的或异源的。[0123]当必需基因是天然基因时，其同源天然启动子可被例如突变或缺失事件破坏(即变得无功能)，并且然后通过靶向引入将负荷感应启动子(其相对于必需基因是异源的)可操作地连接到天然必需基因。在另一个实施方式中，天然必需基因启动子通过靶向引入被负荷感应启动子替代。[0124]在微生物中靶向引入基因序列的合适的方法包括细菌中的重组工程，例如大肠杆菌中的lambda red重组工程；而同源重组可以用于酵母和丝状真菌。这两个概念都可以任选地与crispr组合使用，以提高基因替换效率。[0125]iii.iii经平衡的负荷感应和生长调节的筛选[0126]然后筛选包含可操作地连接到必需基因的插入的负荷感应启动子的微生物生产细胞克隆，以鉴定负荷感应启动子以生长控制方式调节必需基因的克隆。例如，在控制产物生产的条件下(例如使用生产基因可诱导的微生物生产菌株)，将许多此类克隆(例如8-96个克隆)的生长与对应的非负荷成瘾微生物生产菌株的细胞进行比较。[0127]当在两种菌株的产物产量低/不存在的条件下测量细胞生长时；合适的负荷成瘾生产克隆是表现出比非负荷成瘾生产菌株显著且优选至少5％更低生长速率的克隆(实施例1，图2)。[0128]iii.iv未受干扰的中枢和生产代谢的验证[0129]必需基因的转录调节或表达的变化可能导致生产基因和中枢碳或氮代谢的不必要的间接干扰，从而损害产物形成，并反过来降低负荷成瘾微生物生产细胞的负荷。为了排除此类克隆，在两种菌株都合成产物的条件下测量细胞生长；其中合适的负荷成瘾生产克隆是表现出生长速率等于或低于非负荷成瘾生产菌株的克隆(如实施例2，图7所示)。[0130]iii.v筛选生长速率稳定性[0131]通过培养至少20代次细胞分裂，例如通过连续传代和测量生长速率，或通过从放大生产过程的不同步骤中取样，来测试满足上述标准的克隆在模拟生产的条件下的生长速率稳定性。随着时间的推移，合适的负荷成瘾微生物生产细胞保持低于非负荷成瘾生产菌株的生长速率(例如实施例2，图7)。[0132]iv.使用负荷成瘾微生物生产菌株的细胞生产期望产物的方法[0133]本发明的第二方面涉及一种生产期望产物的方法，其包括以下步骤：[0134]a.提供经基因工程化以合成产物的微生物生产细胞，其中所述细胞进一步包含可操作地连接到负荷感应启动子的必需基因，并且其中所述启动子相对于所述必需基因是异源的，[0135]b.将经基因修饰的微生物细胞引入包含用于生产所述产物的底物的培养基中，[0136]c.回收由所述培养物合成的所述产物，[0137]其中产物的合成赋予所述细胞负荷和/或适合度代价，并且其中当所述负荷感应启动子被所述负荷和/或适合度代价诱导时，所述必需基因的表达相对于所述必需基因的基础水平表达被上调；并且其中在所述负荷成瘾生产菌株或其后代细胞中缺乏所述产物合成降低了所述细胞的生长速率。[0138]iv.负荷成瘾微生物生产菌株的细胞用于生产期望产物的用途[0139]本发明的第三方面涉及本发明的负荷成瘾微生物生产细胞用于生产期望产物的用途，其中在所述负荷成瘾生产菌株或其后代细胞中缺乏产物合成降低了所述菌株的生长速率。[0140]实施例[0141]实施例1：工程化生产重组人生长激素的负荷成瘾大肠杆菌菌株[0142]1.1细胞工厂对异源生产基因的维持和表达对其细胞构成不自然的负荷[0143]将亲代大肠杆菌bl21(de3)细胞的生长速率与用质粒peg34转化的工程化衍生物进行比较，所述质粒peg34包含编码与绿色荧光蛋白(gfp)融合的重组人生长激素(hgh)的基因。[0144]1.1.1材料和方法[0145]将宿主菌株大肠杆菌bl21(de3)(耶鲁大学大肠杆菌遗传保藏中心)的细胞制成电感受态，并通过标准电穿孔方法(1800v，25μf，200欧姆，1mm比色皿宽度)用质粒peg34转化，并且铺在含有氯霉素的lb琼脂板上。[0146][0147][0148]*编码氯霉素抗性蛋白[seq id no:104]的camr基因[seq id no:103]在peg34[seq id no:101]中，位于互补链上的核苷酸位置3768-4427处；在peg0[seq id no:105]中，位于互补链上的核苷酸位置2339-2995处；在pendu5cam[seq id no:106]中，位于互补链上的核苷酸位置1617-2276处；并且在pmevt[seq id no:108]中，位于互补链上的核苷酸位置6585-7244处。[0149]在含有500μm iptg和30mg/l氯霉素的200μl 2xyt培养基(16g/l胰蛋白胨、5g/l nacl、10g/l酵母提取物)上的96孔微量滴定板中，在37℃下培养单个菌落转化体的预培养物，同时在elx808板读数器(伯腾公司(biotek))中快速水平摇动，每10分钟读取od630。使用第一次读取的od630值背景减去od630值。[0150]1.1.2结果[0151]包含hgh-gfp表达质粒peg34的大肠杆菌细胞比衍生它的亲代大肠杆菌宿主的细胞生长更慢(图1)；说明了由于将细胞资源分配给合成构建体的维持和表达而给细胞带来的负荷或负载。[0152]1.2工程化负荷成瘾细胞工厂[0153]亲代大肠杆菌宿主的负荷成瘾菌株被基因工程化，以整合基因线路，所述基因线路被设计为在细胞工厂中赋予生产性细胞选择性适合度优势。具体地，在大肠杆菌bl21(de3)染色体中，负荷感应启动子(pmutm、pyccv或pycjx)取代了必需基因操纵子folp-glmm的天然启动子。基因线路进一步包括启动子和必需基因之间的rbs，其中测试了四种不同的rbs(表3)来调节必需基因的表达水平。将包含基因线路的菌株的生长速率与亲代宿主菌株大肠杆菌bl21(de3)进行比较。[0154]1.2.1材料和方法[0155]负荷感应启动子：启动子pmutm、pyccv或pycjx通过使用表5中指定的引物和来源于裂解的大肠杆菌bl21(de3)细胞的基因组dna作为模板，pcr扩增紧接相应基因上游的0.3kb区域(参见表3)而产生。pcr混合物：10μl mq水、2μl正向引物(10μm)、2μl反向引物(10μm)、1μl dna模板、15μl phusion u mastermix(赛默科技(thermo scientific))。pcr反应方案：95℃持续180秒(1x)；95℃持续20秒，68-58℃(接地)持续30秒，72℃持续60秒(35x)；72℃持续300秒(1x)；15℃离开。[0156][0157][0158]*rbs互补编码序列以粗体显示；其中n是a、g、t或c。rbs编码在所示寡核苷酸序列的相反链上。[0159]使用user克隆来产生整合序列，所述整合序列包含与线性1.5kb dna片段融合的经扩增启动子区域，所述dna片段含有用于选择正确重组工程产物的kanr基因和与folp基因直接上游221bp相同的221bp靶向序列。通过将经扩增启动子区域和kanr-folp片段以等摩尔量混合，并添加1μl 10x t4连接缓冲液(赛默科技)和0.75μl user酶(新英格兰生物实验室(new england biolabs))，以总的10μl反应体积使其融合。将user反应置于37℃下30分钟。然后将反应物在室温下放置15分钟，随后添加0.75μl t4 dna连接酶(赛默科技)并在室温下孵育30分钟。包含启动子、kanr抗性基因和folp靶向序列的这种整合序列的示例可以在序列表seq id no.140(s9_pmutm_folp)中找到。然后使用引物“rev”(根据表5中的特异性启动子)和p493(表5)，使用以下pcr反应方案将连接的产物扩增至大约250ng/μl：98℃持续180秒(1x)；85℃持续20秒，72-68℃(接地)持续30秒，72℃持续60秒(35x)；72℃持续5分钟(1x)；15℃离开。引物突出端提供了50bp folp相同的靶向序列，以指导重组工程进入folp基因座。[0160]负荷成瘾启动子的染色体整合：如下将启动子整合到大肠杆菌bl21(de3)细胞基因组中folp基因的上游：用600μl用psim5-tet预转化的bl21(de3)过夜培养物接种100ml含有四环素的2xyt培养基(koskiniemi等人,2011)。将细胞在30℃下培养，并当达到od600＝0.20时，将培养物转移到42℃的振荡浴中15分钟，以允许位于psim5-tet上的重组工程酶的表达。然后将培养物转移到2x冷的50ml离心管中；以4000g离心10分钟；弃去上清液；并用20ml冰冷的10％甘油洗涤残留的细胞沉淀。然后将部分重悬浮的细胞以4000g离心6分钟；弃去上清液；并用20ml冰冷的10％甘油洗涤细胞沉淀。将部分重悬浮的细胞以4000g离心6分钟；将每个细胞沉淀小心地重悬浮在495μl冰冷的10％甘油中，并合并。将90μl重悬浮的细胞添加到电穿孔比色皿中，每个比色皿含有1μl(＞250ng)负荷感应启动子整合序列中的一种。用以下设置对细胞进行电穿孔：1800v，25μf，200欧姆，1mm比色皿宽度。在电穿孔后立即向比色皿中添加900ml 2xyt培养基，并在1.5ml eppendorf管中于37℃下使细胞恢复1.5小时。将电穿孔的细胞在室温下孵育过夜，以便有时间进行重组；并且随后铺在含有50mg/l卡那霉素的lb琼脂板上，并在37℃下培养过夜，以确保psim5-tet固化。使用引物p525和p526验证了对必需基因座的正确靶向。一般来说，挑取单个kanr菌落，其大小平均或小于菌落群体。[0161]使用taq dna聚合酶和靶向folp启动子区域的引物，通过菌落pcr来验证kanr选择的菌落的基因组中的负荷成瘾启动子整合。另外，通过sanger测序确定所选择菌落中rbs的身份。[0162]随后，通过在37℃下在水平摇动下在补充有500μm iptg的200μl 2xyt中培养，将包含基因线路的菌株的生长速率与亲代宿主菌株大肠杆菌bl21(de3)进行比较。[0163]1.2.2结果[0164]与它们从其衍生的亲代大肠杆菌宿主相比，所选择的负荷成瘾大肠杆菌菌株的生长速率在不同程度上较慢(图2；示出负荷成瘾菌株s5.0#3、s7.0#8和s9.0#8的生长，其中必需基因folp-glmm分别由负荷感应启动子pyccv、pycjx和pmutm控制)。由于细胞生长依赖于必需folp-glmm基因的表达水平，因此可以得出结论，在非生产性、负荷成瘾菌株中，由相应负荷感应启动子驱动的必需基因表达的水平不足以支持以野生型亲代菌株的水平生长。[0165]在这些负荷成瘾菌株中观察到的生长速率的降低提供了可以施加在非生产细胞上的惩罚的量度，所述非生产细胞在包含负荷成瘾基因线路的细胞工厂群体的培养期间自发进化。惩罚的程度由负荷感应启动子的选择和所选rbs的强度决定。惩罚越大-则培养过程中自发产生的任何低或非生产变体(例如由生产基因的突变产生)的“负选择”窗口越宽。[0166]1.3生产增加了负荷成瘾细胞工厂的生长速率[0167]将负荷成瘾大肠杆菌菌株(其对不生产赋予生长惩罚(图2))用作宿主菌株，用于证明具有生产能力的负荷成瘾细胞的选择性适合度优势。[0168]1.3.1材料和方法[0169]将产生的负荷成瘾大肠杆菌菌株(s9.0#8；s5.0#3；和s7.0#8)的生长最慢的克隆分别用peg34或peg0(表4)通过标准电穿孔方法(1800v，25μf，200欧姆，1mm比色皿宽度)制成电感受态并转化，并且铺在含有氯霉素和卡那霉素的lb琼脂板上。将单个菌落转化体在含有氯霉素的2xyt培养基上培养过夜，然后用于接种包含200μl 2xyt培养基(500μm iptg，氯霉素)的96孔微量滴定板，并在37℃下培养，同时在elx808板读数器(伯腾公司)中快速水平摇动，每10分钟读取od630。使用第一次读取的od630值背景减去od630值。[0170]将大肠杆菌菌株各自用质粒peg34或peg0(表4)转化，并且当诱导细胞合成重组蛋白(与gfp融合的hgh)时，测量它们的生长速率特性。[0171]1.3.2结果[0172]当与亲代大肠杆菌bl21(de3)菌株相比时，包含控制folp-glmm必需基因表达的负荷感应启动子pmutm的负荷成瘾菌株大肠杆菌菌株s9.0#8，表现出经测试菌株中最慢的生长(图2)。相比于用空质粒beg0转化的大肠杆菌菌株s9.0#8的细胞，在用peg34质粒转化并诱导表达重组蛋白hgh-gfp的大肠杆菌菌株s9.0#8的细胞中，指数生长速率的这种降低被逆转(图3)。这表明大肠杆菌菌株s9.0#8中的负荷感应启动子pmutm是由重组蛋白hgh-gfp的合成引起的对细胞的负荷或负载诱导的。这反过来导致folp-glmm基因的上调表达和增强的指数生长。[0173]hgh-gfp在每个负荷成瘾菌株(含有peg34质粒的大肠杆菌菌株s5.0#3、s7.0#8和s9.0#8)中的合成，不仅导致指数生长速率下降的逆转；而且另外地，这些菌株的生长速率与亲代大肠杆菌bl21(de3)的生长无法区分(图4)。[0174]总之，此实施例说明了负荷成瘾基因线路可以用于赋予细胞工厂中其蛋白质或代谢物合成足够高以构成负荷或负载的那些细胞选择性适合度优势；并且这种负荷或负载可通过可操作地连接到细胞中必需基因的负荷感应启动子来检测。相比之下，在负荷成瘾细胞工厂的培养过程中自发出现的非生产性变异细胞(例如由生产基因突变产生)将经受负选择压力，因为它们的生长将被减缓至由必需基因的基础表达所支持的速率。降低的生长速率本身足以减缓细胞工厂中此类变异细胞频率的增加，从而延缓细胞工厂生产率随时间推移的下降。[0175]实施例2：生产人生长激素的负荷成瘾大肠杆菌菌株显示出增强的长期生产稳定性[0176]负荷感应启动子显示为可以感应并被细胞中负荷诱导状态激活的启动子，所述负荷诱导状态由重组蛋白hgh-gfp的细胞合成产生。一旦被激活，则负荷感应启动子显示出将必需基因folp-glmm的表达提高到足以赋予细胞在与非生产性细胞相比时的选择性生长优势的水平。为了最大化响应于其同源负荷感应启动子的必需基因表达的动态范围，将负荷感应启动子与赋予不同翻译强度的变体rbs编码序列(表3)随机组合。[0177]如以下在模拟大规模生产条件下培养的工程化生产菌株所示，具有适合用于负荷成瘾基因线路的负荷感应特性的启动子显示包括热休克启动子、dna损伤启动子、氧化应激反应启动子和rrna启动子。[0178]首先，为每种负荷感应启动子选择许多含有随机变异rbs编码序列的克隆，并在许多细胞分裂中跟踪它们的hgh-gfp合成，以便证明它们随时间推移提高/保持重组hgh-gfp合成的相对能力。[0179]2.1材料和方法[0180]负荷感应启动子：使用表6中指定的引物，如实施例1.2.1所述通过pcr和user克隆产生启动子pyccv、pycjx、pibpa、pgrpe、pldha和pybbn及其各自的整合序列；同时使用引物“rev”(根据表6中的特异性启动子)和p493(表5)扩增连接的产物。[0181][0182][0183]*rbs互补编码序列以粗体显示；其中n是a、g、t或c。rbs编码在所示寡核苷酸序列的相反链上。[0184]负荷成瘾启动子的染色体整合：如下将每个启动子整合到大肠杆菌菌株beg34(对应于含有质粒peg34的大肠杆菌bl21(de3))基因组中folp基因的上游。如实施例1.2.1所述，制备用重组工程质粒psim5-tet预转化的大肠杆菌菌株beg34的细胞，并用每种启动子整合序列通过电穿孔进行转化。在重组工程和psim5-tet固化的所述步骤后，从每个板中挑取八个菌落，对应于具有相同启动子整合但具有随机变异rbs序列的八个克隆(参见表6)。然后将每个克隆转移到含有补充有用于维持质粒peg34的氯霉素的200μl 2xyt的96孔板的一个孔中。如实施例1.2.1所述，将2μl每个培养的克隆用于经由菌落pcr验证启动子整合；在冷冻96孔板之前。[0185]短期hgh-gfp生产筛选测定：将冷冻的96孔板解冻，并使用针式复制器将细胞转移到含有补充有氯霉素的200μl 2xyt的新96孔板中。用breathe-easy密封膜(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))密封此板，并将其置于synergyh1板读数器(伯腾公司)中，在37℃和754rpm下线性摇动20小时过夜；并且在20小时内每10分钟测量每个孔的od(600nm)和gfp荧光(ex/em 485nm/528nm)。然后在室温下将板置于常规的桌面板振荡器中4小时，随后将来自每个孔的2μl培养物转移到新的96孔板，所述板含有补充有氯霉素和0.5mm iptg的200μl 2xyt。将新的96孔板同样用breathe-easy密封膜(西格玛奥德里奇公司)密封，并将其置于synergyh1板读数器中，在37℃和754rpm下线性摇动20小时过夜；并且在20小时内每10分钟在600nm和ex/em 485nm/528nm下测量每个孔的od和gfp荧光。第二天，将2μl培养物转移到新的96孔板中，所述板含有补充有氯霉素和0.5mm iptg的200μl 2xyt，并且每天重复所述过程持续总共6天。[0186]长期hgh-gfp生产测定(图6)：将来自每个负荷成瘾hgh-gfp生产菌株的单个所选择菌落用于接种15ml greiner培养管，所述管含有补充有氯霉素和0.5mm iptg的4ml 2xyt。将培养物在250rpm的摇床上于37℃下生长23小时。然后在相同条件下，将2μl每种培养物以2000倍稀释(对应于大约11代次细胞分裂)接种到新的greiner培养管中，其中对总共12个种子重复这些方法步骤。每次传代后，取200ul培养物样品，以通过在synergyh1板读数器(伯腾公司)中测量od600和gfp荧光(ex/em 485nm/528nm)来确定hgh-gfp合成。[0187]长期hgh-gfp生产测定(图8)：将来自每个负荷成瘾hgh-gfp生产菌株的单个所选择菌落用于接种24深孔板，所述板携带补充有氯霉素和0.5mm iptg的1.8ml 2xyt。将培养物在200rpm的摇床上于30℃下生长23小时。然后在相同条件下，将2μl每种培养物以1000倍稀释(对应于大约10代次细胞分裂)接种到新的深孔板中，其中对总共9个种子重复这些方法步骤。每次传代后，取200ul培养物样品，以通过在synergyh1板读数器(伯腾公司)中测量od600和gfp荧光(ex/em 485nm/528nm)来确定hgh-gfp合成。[0188]所选菌株的生长速率测量：将所选择的高hgh生产菌株s3.6#2、s6.6#6、s7.6#8和s10.6#7在含有氯霉素和卡那霉素的lb琼脂板上划线。将beg34和beg0菌株在含有氯霉素的lb琼脂板上划线。将来自每个板的7个菌落用于接种含有补充有氯霉素的200μl 2xyt的96孔板；将其用breathe-easy密封膜(西格玛奥德里奇公司)密封。在37℃和754rpm线性摇动下，在synergyh1板读数器(伯腾公司)中过夜测量它们的生长。将来自每个孔的2μl样品转移到新的96孔板中的孔中，所述板含有补充有氯霉素和0.5mm iptg的200μl 2xyt。用透气膜密封96孔板，并将其在37℃和754rpm线性摇动下培养20小时，并且使用synergy h1板读数器每10分钟测量生长(od600nm)。[0189]菌株目录：[0190]beg34＝携带peg34的大肠杆菌bl21(de3)；[0191]beg0＝携带空质粒peg0的大肠杆菌bl21(de3)[0192]sx.z#y＝携带peg34的大肠杆菌bl21(de3)，将wt folp启动子替换为负荷成瘾启动子x，其中x是指表2中的启动子id。#后面的数字y表示由简并引物引入的四个rbs变体库中选择的克隆(表7)。z分别是指hgh-gfp(0或6)、甲羟戊酸(1)、溶葡萄球菌酶(4)的生产基因。[0193][0194]2.2结果[0195]2.2.1短期hgh-gfp生产率筛选：如下，在模拟的大规模生产条件下测试四种hgh-gfp生产菌株的生产率，所述菌株包含选自一组热休克启动子(pibpa、pgrpe、pycjx和pybbn)的负荷感应启动子，并具有四种rbs编码序列变体中的一种。菌株每天通过100倍的反向稀释连续传代6天，相当于每个种子大约6代。到第6天(种子6)，在种子1和种子6期间，与非负荷成瘾生产菌株beg34相比，几个菌株显示出升高的hgh-gfp合成。相对于菌株beg34具有高短期hgh-gfp生产率的菌株是s3.6#2(pibpa)、s6.6#6(pgrpe)、s7.6#8(pycjx)和s10.6#7(pybbn)-参见图5。[0196]2.2.2增强的长期hgh-gfp生产率：通过连续转移，在模拟的大规模发酵下监测负荷成瘾菌株s3.6#2、s6.6#6、s7.6#8、s10.6#7和非负荷成瘾菌株beg34和非生产菌株beg0的hgh-gfp生产率。在种子2之后，负荷成瘾菌株s3.6#2、s6.6#6、s7.6#8、s10.6#7和非负荷成瘾对照菌株beg34在hgh-gfp合成方面表现同样良好(图6)。然而，在另外的大约20次传代(种子4)后，对照菌株beg34的hgh-gfp生产率显著下降；并且到种子6时，所述菌株基本上停止了生产。令人惊讶的是，负荷成瘾菌株s7.6#8(具有控制folp-glmm的pycjx)仍保持约50％种子2水平的生产率。另外，与非负荷成瘾菌株beg34相比，负荷成瘾菌株s3.6#2(具有控制folp-glmm的pibpa)、s10.6#7(具有控制folp-glmm的pybbn)和s6.6#6(具有控制folp-glmm的pgrpe)也显示出显著更好的长期生产率。[0197]2.2.3负荷成瘾菌株的生长速率：生产hgh-gfp的负荷成瘾菌株s3.6#2、s6.6#6、s7.6#8和s10.6#7生长速率不高于非负荷成瘾hgh-gfp生产菌株beg34；并且因此，随着时间的推移，它们的hgh-gfp生产水平的提高并不简单地源于初始生产水平的降低，以及因此固有的较低负荷(图7)。[0198]2.2.4负荷成瘾基因线路对所选择必需基因的依赖性：将包含控制必需基因folp-glmm的热休克启动子pfxsa的生产hgh-gfp的负荷成瘾菌株(s13.6#2(fxsa))与包含消除folp表达的移码folp的突变衍生物菌株s13.6#2evo(fxsa)(其生长仅依赖于glmm表达)进行比较。尽管folp表达的缺失导致在复杂的2xyt培养基中的生长速率降低(数据未示出)，但当与非负荷成瘾hgh-gfp生产菌株beg34相比时，单独的必需基因glmm被证明足以在负荷成瘾菌株s13.6#2evo(fxsa)中以与菌株s7.6#8(pycjx)可比水平赋予增强的长期hgh-gfp生产稳定性(图8)。[0199]2.2.5核糖体rna启动子在负荷成瘾基因线路中的用途：除了热休克启动子之外，核糖体rna启动子如prrnb和prrne显示出能够感应细胞中的负荷成瘾状态，并作为响应，控制必需基因表达，如提高hgh-gfp生产菌株的长期生产率。如图9中所见，在对应于约110代次细胞分裂的模拟的大规模生产中，当与非负荷成瘾hgh-gfp生产大肠杆菌菌株beg34相比时，菌株s15.6.7(prrnb)和s16.6.6(prrne)中hgh-gfp生产的长期稳定性显著提高。[0200]2.2.6氧化应激感应启动子在负荷成瘾基因线路中的用途：氧化应激感应启动子如ppoxb显示出能够感应细胞中的负荷成瘾状态，并作为响应，控制必需基因表达，如提高hgh-gfp生产菌株的长期生产率。如图10中所见，在对应于大约90代的7个连续传代的模拟的大规模生产和最终种子的时间延长培养下，当与非负荷成瘾hgh-gfp生产大肠杆菌菌株beg34相比时，菌株s29.6#3(ppoxb)中hgh-gfp生产的生产水平和长期稳定性二者都显著增加。如图10中所见，使用基于ppoxb的负荷成瘾基因线路的生产令人惊讶地导致随时间推移而提高的产量，这表明群体中非基因高性能变体的富集。[0201]总之，本实施例说明，通过将必需基因folp-glmm的转录偶联到大肠杆菌热休克、氧化应激和dna损伤响应启动子以及rrna启动子中的任一个，负荷成瘾增强了被工程化以合成与gfp融合的人生长激素的大肠杆菌菌株的长期稳定性和产量。[0202]实施例3：生产溶葡萄球菌酶的负荷成瘾大肠杆菌菌株显示出增强的长期生产稳定性[0203]溶葡萄球菌酶是27kda肽链内切酶，其切割金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)细胞壁肽聚糖中的交联五甘氨酸桥，从而导致细胞裂解。此抗菌剂可以在大肠杆菌中重组合成。如由以下在模拟的大规模生产条件下生产溶葡萄球菌酶的负荷成瘾大肠杆菌菌株所说明，包含具有负荷感应特性的启动子的负荷成瘾基因线路被证明增强了被工程化以合成溶葡萄球菌酶的此类大肠杆菌菌株的生产稳定性。负荷成瘾生产菌株的生产率进一步被证明通过选择其中负荷感应启动子与赋予同源必需基因最佳翻译强度的rbs序列(表6)组合的菌株而得到优化。这些优势由负荷成瘾菌株s6.4#5(pgrpe)举例说明，如下所述，所述菌株被证明对产量损失更具弹性，因为对由溶葡萄球菌酶表达导致的负荷或适合度代价成瘾。[0204]3.1材料和方法[0205]负荷感应启动子：使用表6中指定的pgrpe特异性引物，通过由pcr扩增pgrpe启动子，如实施例1.2.1所述产生包含启动子pgrpe的启动子整合序列。[0206]负荷成瘾启动子的染色体整合：如下将grpe启动子整合到大肠杆菌菌株bendu5cam(对应于含有生产溶葡萄球菌酶的质粒pendu5cam的大肠杆菌bl21(de3))基因组中folp-glmm基因的上游。如实施例1.2.1所述，制备用重组工程质粒psim5-tet预转化的大肠杆菌菌株bendu5cam的细胞，并用pgrpe启动子整合序列通过电穿孔进行转化。在重组工程和psim5-tet固化的所述步骤后，挑取5个菌落，对应于具有相同启动子整合但具有随机变异rbs序列的克隆(参见表6)。然后将每个克隆转移到含有补充有用于维持质粒pendu5cam的氯霉素的4ml 2xyt的15ml greiner培养管中，并进行培养。如实施例1.2.1所述，将2μl每个培养的克隆用于验证启动子整合；在冷冻之前。[0207]溶葡萄球菌酶生产筛选：使用筛选测定鉴定具有最高溶葡萄球菌酶生产率的大肠杆菌菌株s6.4#5(pgrpe)，其中与非负荷成瘾生产菌株bendu5cam相比，将rbs和pgrpe的三种其他潜在组合在为96孔形式的补充有氯霉素的2xyt中培养1000倍稀释度的六个连续传代(对应于60代)。将菌株在37℃下在15ml培养管中于含有30mg/l氯霉素的3ml 2xyt培养基中生长21小时。将150μl培养物与50μl 50％甘油混合，并储存在-80℃下的96孔板中。另外，将30μl培养物转移到补充有氯霉素的3ml新鲜2xyt培养基中，并在相同条件下再生长21小时；并且重复总共5次转移，其中每次转移都将过夜培养物冷冻保存。[0208]溶葡萄球菌酶表达和检测测定：将含有来自5次转移的所有冷冻保存物的96孔板在冰上解冻。将来自每个孔的20μl转移到含有补充有氯霉素的180μl2xyt的96孔板中，并在37℃下在板读数器中培养生长，直到大多数孔达到od630＝0.35；并且然后向每个孔中添加补充了30mg/l氯霉素和20mm iptg的10μl 2xyt至最终浓度为1mm iptg，足以诱导溶葡萄球菌酶基因表达。将诱导的培养物在37℃下生长4小时，然后将板以4000rpm离心10分钟。将100μl上清液转移到含有100μl过夜金黄色葡萄球菌培养物的新96孔板中。每10分钟，在37℃下，在板读数器上以od630监测每个孔中的金黄色葡萄球菌裂解持续2小时。通过将金黄色葡萄球菌od的变化除以发生变化的60分钟时间范围来量化金黄色葡萄球菌裂解速率。以下可以看到这个等式：[0209][0210]通过将测得的速率归一化为相应生产大肠杆菌培养物的最终od630测量值来确定特异性溶葡萄球菌酶合成速率。[0211]3.2结果[0212]在通过连续传代实现的模拟的大规模生产条件下，培养具有pgrpe启动子和控制必需基因folp-glmm表达的四种rbs编码序列变体中的一种的负荷成瘾溶葡萄球菌酶生产菌株。如图11中所看见，与在非负荷成瘾溶葡萄球菌酶生产bendu5cam菌株中看到的产量急剧下降相比，菌株s6.4#5(pgrpe)保持了显著更高水平的溶葡萄球菌酶产量。因为s6.4#5(pgrpe)和bendu5cam菌株在种子0时的初始溶葡萄球菌酶生产速率相同；因此s6.4#5(pgrpe)的生产速率下降较小，并不是因为溶葡萄球菌酶生产的固有初始负荷较低。[0213]总之：通过将必需基因folp-glmm转录偶联到大肠杆菌热休克启动子pgrpe，证明负荷成瘾增强了被工程化以合成经分泌的溶葡萄球菌酶的大肠杆菌的长期稳定性和产量。[0214]实施例4：生产甲羟戊酸的负荷成瘾大肠杆菌菌株显示出增强的长期生产稳定性[0215]通过引入表达异源三步酶促途径的质粒pmevt来工程化大肠杆菌bl21(de3)细胞以合成甲羟戊酸(martin等人,2003)，所述异源三步酶促途径经由乙酰辅酶a库将葡萄糖转化为甲羟戊酸。包含具有负荷感应特性并控制必需基因转录的启动子的负荷成瘾基因线路被证明在模拟的大规模生产条件下增强了此类甲羟戊酸生产大肠杆菌菌株的生产稳定性。负荷成瘾生产菌株的生产率被证明通过选择其中负荷感应启动子与赋予同源必需基因最佳翻译强度的rbs编码序列(表5)组合的菌株而得到进一步优化。具体地，包含控制folp-glmm转录的负荷成瘾启动子pcspd(一种氧化应激和葡萄糖饥饿感应启动子)或pmutm(热休克/dna损伤感应启动子)的甲羟戊酸生产菌株二者都被证明比非负荷成瘾菌株对产量损失更具弹性，因为它们对由甲羟戊酸生产产生的转录信号成瘾。[0216]4.1材料和方法[0217]负荷感应启动子：使用表8中指定的pmutm和pcspd特异性引物，通过由pcr扩增pmutm和pcspd启动子，如实施例1.2.1所述产生包含启动子pmutm和pcspd的启动子整合序列。[0218][0219]*rbs互补编码序列以粗体显示；其中n是a、g、t或c。rbs编码在所示寡核苷酸序列的相反链上。[0220]负荷成瘾启动子的染色体整合：如下将pmutm和pcspd分别整合到含有溶葡萄球菌酶生产质粒pmevt的大肠杆菌菌株bl21(de3)pmevt的细胞基因组中folp-glmm基因的上游。如实施例1.2.1所述，制备用重组工程质粒psim5-tet预转化的大肠杆菌菌株bl21(de3)pmevt的细胞，并用每种启动子整合序列通过电穿孔进行转化。在重组工程和psim5-tet固化的所述步骤后，挑取5个菌落，对应于具有相同启动子整合但具有随机变异rbs序列的克隆(参见表8)。然后将每个克隆转移到含有补充有用于维持质粒pmevt的氯霉素的200μl 2xyt的96孔板的一个孔中，并进行培养。如实施例1.2.1所述，将2μl每个培养的克隆用于验证启动子整合；在冷冻96孔板之前。[0221]甲羟戊酸生产筛选：如下使用筛选测定鉴定具有最高甲羟戊酸生产率的大肠杆菌菌株s19.1.1(pcspd)和s9.1.4(pmutm)，其中与非负荷成瘾生产大肠杆菌菌株bl21(de3)pmevt平行，将包含rbs和启动子的四种其他潜在组合的菌株在96孔板中培养1000倍稀释度的六个连续传代(对应于60代)。使菌株在用透气密封件密封的微量滴定板中含30mg/l氯霉素和0.5mm iptg的200μl 2xyt培养基中，于37℃下在水平摇动下生长21小时。将150μl培养物与50μl 50％甘油混合，并储存在-80℃下的96孔板中。另外，将2μl 10倍稀释的培养物转移到补充有氯霉素和0.5mm iptg的200μl新鲜2xyt培养基中，并在相同条件下再生长21小时。总共进行了5次与上述相同的转移，并且每次转移都将过夜培养物冷冻保存。[0222]甲羟戊酸合成和检测测定：将含有来自第二、第五和第六次转移的冷冻保存物的96孔板在冰上解冻，并且用于接种含有0.5mm iptg和30mg/l氯霉素的10ml 2xyt，并在37℃下在水平摇动(250rpm)下培养54小时。用23μl 20％硫酸处理来自每个培养物的300μl等分试样；剧烈摇动，然后以13000×g旋转2分钟。将上清液(培养基)样品注射到ultimate 3000高效液相色谱仪中，在50℃下，在aminex hpx-87h离子排斥柱(300mm×7.8mm，bio-rad实验室)上运行5mm硫酸流动相(0.6ml/分钟)。将折光率检测器用于检测。甲羟戊酸的标准曲线是用溶于在相同条件下孵育的非生产大肠杆菌菌株的2xyt培养基上清液中的甲羟戊酸内酯(西格玛奥德里奇公司)生成的。[0223]4.2结果[0224]在通过连续传代实现的模拟的大规模生产条件下，培养具有pcspd或pmutm启动子和控制必需基因folp-glmm表达的四种rbs编码序列变体中的一种的负荷成瘾甲羟戊酸生产菌株。如图12中所见，与在非负荷成瘾甲羟戊酸生产菌株bl21(de3)pmevt中看到的产量急剧下降相比，所选择的负荷成瘾菌株s19.1.1(pcspd)和s9.1.4(pmutm)二者都保持了显著更高水平的甲羟戊酸产量。因为每个负荷成瘾菌株和对照bl21(de3)pmevt菌株在种子0时的初始甲羟戊酸生产速率相同；菌株s19.1.1(pcspd)和s9.1.4(pmutm)的生产速率下降较小并不是因为甲羟戊酸生产的固有初始负荷较低。[0225]总之：通过将必需基因folp-glmm转录偶联到大肠杆菌氧化应激和葡萄糖饥饿感应启动子pcspd和热休克/dna损伤感应启动子pmutm，证明负荷成瘾增强了被工程化以合成甲羟戊酸的大肠杆菌的长期稳定性和产量。[0226]实施例5：评估启动子作为负荷感应器以使酵母细胞对工程化重组蛋白生产的负荷成瘾[0227]能够感应由蛋白质或生物合成途径的重组表达引起的对细胞的负荷或负载，然后诱导必需基因表达的启动子，可以用于创建适合在酵母中使用的负荷成瘾基因线路。一种用于评估候选启动子的方法在经基因工程化以合成任选地与绿色荧光蛋白(gfp)翻译融合的重组人血清白蛋白(hsa)或胰岛素前体(ip)的酵母细胞中进行了说明。[0228]为了使生长响应于候选负荷感应启动子的活性，使用标准可选择标记物，使用转化到酵母细胞中的线性dna构建体的同源重组，用候选启动子基因替代酿酒酵母中必需基因的天然启动子。举例来说，候选启动子可以选自核糖体rna基因的上调启动子，如由rna聚合酶i转录的启动子(laferté等人,2006)、dna损伤感应启动子(例如pogg1)，和由hac1转录因子上调的未折叠蛋白反应启动子(kimata等人,2006)。为了确保负荷感应启动子一旦被激活，则与非感应启动子相比，赋予细胞选择性生长优势，这可能有必要微调必需基因的表达水平。可以通过改变与负荷感应启动子一起引入的翻译起始区来工程化一系列翻译强度。[0229]选择具有候选负荷感应启动子的潜在不同组合的克隆，并评估在30-100代次细胞分裂中维持的蛋白质生产。[0230]5.1材料和方法[0231]生长培养基：ypd培养基包含1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖。sc培养基包含6.7g/l酵母氮源，不含氨基酸，含硫酸铵，但缺乏尿嘧啶。[0232]启动子构建体的染色体整合和验证：用于染色体整合的构建体将含有天然调节基因上游的300-600bp。使用酿酒酵母的标准电穿孔程序，通过转化和同源重组进行启动子构建体的染色体整合。使用菌落pcr验证启动子的正确染色体整合。[0233]长期培养和生产：将来自每个菌株的单菌落转移到24深孔板中，并在诱导重组蛋白产生的条件下，以250rpm和30℃在1.8ml ypd培养基中培养。在培养48小时后，通过1000倍反向稀释，在相同条件下将细胞传代至新的深孔板。使用重组蛋白特异性测定(例如gfp检测)分析样品的生产，并通过od600监测细胞密度。[0234]所选择菌株的生长速率测量：将单个菌株的生长速率与非负荷成瘾生产菌株进行比较。用透气膜密封96孔板，并在37℃和754rpm线性摇动下，在synergy h1板读数器中测量生长20小时。每10分钟测量od600。[0235]5.2结果[0236]5.2.1 hac1上调启动子[0237]在生产人胰岛素前体或人血清白蛋白的重组蛋白生产酵母菌株中，当在天然生长调节基因(例如编码嘧啶生物合成所必需的乳清酸核苷5'-磷酸脱羧酶的条件性必需基因ura3)前面引入时，包含未折叠蛋白反应(upr)元件的hac1上调启动子(例如kar2(seq id no.:91)、pdi1(seq id no.:92)、ssa1(seq id no.:93)或fpr2(seq id no.:94))被证明可用于调节生长，任选地与gfp偶联。经由对应于60-80代次细胞分裂的连续传代，在模拟的长期生产下跟踪生产的稳定性。在包含控制生长调节基因(ura3)转录的hac1上调启动子的酵母菌株中，预期生产比对应的亲代重组蛋白生产酵母菌株更稳定。[0238]5.3.2 rna聚合酶i上调启动子[0239]rna聚合酶i在酵母中转录核糖体rna基因。rna聚合酶i上调启动子，如基因：rpl3(seq id no.:95)、rpl6a(seq id no.:96)和rpl28(seq id no.:97)的启动子可用于调节酵母必需基因的生长。在生产人胰岛素前体或人血清白蛋白的重组蛋白过量生产菌株中，此类上调启动子在天然生长调节基因(例如条件性必需基因ura3)前面被引入，可能与gfp偶联。经由对应于60-80代次细胞分裂的连续传代，通过实验模拟的长期生产跟踪生产的稳定性。在包含控制条件性必需基因ura3转录的rna聚合酶i上调启动子的酵母菌株中，生产将比对应的亲代重组蛋白生产酵母菌株更稳定。[0240]5.3.3 dna损伤响应启动子[0241]由异源表达导致的酵母中的dna损伤反应广泛地诱导dna修复系统的转录，包括ogg1(seq id no.:98)、rad51(seq id no.:99)和rad54(seq id no.:100)。编码ogg1、rad51或rad54的基因的启动子，当可操作地连接到必需基因时，可用于调节本发明的酵母生产细胞的生长。在生产人胰岛素前体或人血清白蛋白的酵母蛋白生产菌株的细胞中，此类启动子在天然必需基因(例如编码ura3的生长调节基因)前面被引入，任选地与gfp融合。[0242]经由对应于60-80代次细胞分裂的连续传代，在模拟的长期生产下跟踪生产的稳定性。在具有prad51和/或prad54上调必需基因的菌株中，生产将更加稳定。[0243]总之：通过将必需基因转录偶联到选自重组蛋白生产负荷期间激活的启动子或与核糖体rna启动子相关的负荷感应启动子，负荷成瘾增强了被工程化以合成人血清白蛋白生产或胰岛素前体的出芽酵母细胞的长期稳定性和生产(表2)。[0244]实施例6生产人血清白蛋白的负荷成瘾酵母菌株的示例显示出增强的长期生产稳定性[0245]用于酵母菌株的负荷成瘾系统包括来源于编码以下各项的基因的启动子：1)蛋白异构酶pdi1，其编码属于酵母(如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母)的未折叠蛋白反应的伴侣蛋白，并且其丰度响应于重组蛋白的过量表达而经常上调；2)由rpl6a和rpl3基因编码的核糖体亚单位，以及3)编码肽基-脯氨酰基顺反异构酶的fpr2，已知所述异构酶在dna复制应激时被激活。将基于这些启动子的负荷成瘾系统引入被工程化以表达和分泌人血清白蛋白的毕赤酵母菌株中，以便确定它们对长期人血清白蛋白(hsa)生产稳定性的影响。[0246]6.1材料和方法：[0247]毕赤酵母(甲基营养型毕赤酵母(komagataella phaffii))菌株egs31是cbs7435菌株(nrrl-y11430或atcc 76273)的衍生物，其通过在aox1启动子控制下的hsa编码alb1基因的基因组整合的cdna版本被工程化以分泌hsa。[0248]菌株构建：egs31菌株的负荷成瘾版本是通过基因整合构建体产生的，所述构建体包含可操作地连接到以下负荷响应启动子中的一种的kanmx条件性可选择g418抗性基因：pdi1、pfpr2、prpl3和prpl6a。通过用侧接＞750bp同源臂的线性整合dna(分别为序列n1-n3)转化egs31细胞，将这些负荷成瘾构建体整合到巴斯德毕赤酵母菌株的ku70基因组基因座中。使用标准电穿孔程序对用乙酸锂和二硫苏糖醇预处理的指数生长细胞进行转化(wu和letchworth,2004)。[0249]表：引入巴斯德毕赤酵母中的重组基因和负荷成瘾构建体[0250][0251]生长培养基：如下制备bmgy和bmmy液体培养基(1l)：将10g酵母提取物和20g蛋白胨添加到700ml h2o中；用磁力搅拌器混合，然后高压灭菌。在冷却至室温后；将以下物质添加到溶液中：100ml 1m磷酸钾缓冲液(ph 6.0)；100ml 13.4％(w/v)酵母氮源，含硫酸铵，不含氨基酸；2ml 0.02％(w/v)生物素，并且在bmgy的情况下，添加100ml 10％(v/v)甘油；并且在bmmy的情况下，添加100ml 5％(v/v)甲醇。[0252]培养：将egs31和负荷成瘾egs31菌株在ypd(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％d-葡萄糖)琼脂板上划线，并在30℃下孵育过夜。挑取单个菌落并在2ml bmgy中预培养，其中对负荷成瘾菌株的培养物补充50ug/ml g418，并在30℃下以300rpm水平摇动过夜进行培养。使用1ul预培养物将表达培养物接种到具有通气盖的96孔深孔板中含有不同浓度(0μg/ml、750μg/ml)g418的500μl bmmy培养基中，以产生“种子1”。[0253]将培养物在30℃下孵育72小时(300rpm水平摇动)。为了产生下一个种子，另外四次，将生长的培养物连续传代(500倍稀释)至新的具有通气盖的96孔深孔板中含有不同浓度(0μg/ml、750μg/ml)g418的500μl bmmy培养基。在每次连续传代中，将来自生长培养物的甘油菌(20％甘油)储存在-80℃下。[0254]为了定量分泌的hsa的生产，使来自甘油菌的定量培养物在具有通气盖的96孔深孔板中含有不同浓度(0μg/ml和750μg/ml)g418的500μl bmmy培养基中重新生长72小时。[0255]将培养物以3000g离心15分钟，并按照制造商的说明使用hsa特异性elisa试剂盒(abcam目录号：ab179887：人白蛋白simplestep试剂盒)对50μl上清液中的浓度进行定量。[0256]6.2结果[0257]当菌株的负荷成瘾系统被添加g418激活时，具有基因组整合的负荷成瘾启动子pdi1(可操作地连接到可选择的kanmx基因)的菌株展现出更高的经分泌的hsa产量(图13)。此外，在大约30次细胞分裂后，对于每种其他经测试的负荷成瘾启动子，随着更高的选择(750μg/ml g418)观察到hsa产量提高(图14a-种子1)。当进一步培养约另外10次细胞分裂时(图14b-种子2)，与非负荷成瘾对照和未激活负荷成瘾的菌株(0μg/ml g418)相比，当负荷成瘾被激活时(150-750μg/ml g418)，所述菌株显示出has生产水平的提高。[0258]总之，在激活其各自的负荷成瘾系统的条件下，培养包含本发明的示例性负荷成瘾系统的酵母细胞被认为在经培养群体中富集了高产酵母变体。虽然在相对短的培养时间(30次细胞分裂)后可以检测到hsa产量的增加，但当传统培养物通常表现出生产率的显著下降时，高产酵母变体的富集在更长的培养期内得到维持和进一步增强。[0259]实施例7合适的负荷感应启动子候选物的鉴定[0260]不同的工程化生产基因和途径引发指示生产过程的不同转录反应。为了鉴定用作负荷感应器的合适的候选启动子，进行了以下实验。[0261]方法：典型的基因逃逸细胞是从在预期的发酵培养基中与感兴趣的基因工程化微生物生产细胞的长期培养中分离的。合适的基因逃逸细胞的特征在于具有比原始基因工程化生产细胞高至少5％的指数期生长速率和低至少30％的生产速率或产物收率。[0262]在预期的发酵条件、按比例缩小的条件或模拟预期发酵条件的摇瓶条件下培养生产细胞和对应的逃逸细胞。在对应于生产细胞中最高生产率的时间点，取样进行rna测序。使用purelink rnamini试剂盒(赛默飞世尔公司)纯化总rna，并按照试剂盒制造商的说明使用truseq stranded mrna试剂盒(依诺米那公司(illumina))制备总rna。将读数作图并electroporation of pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol.biotechniques 36,152-154[0276]yoon,s.h.,han,m.j.,lee,s.y.,jeong,k.j.,和yoo,j.s.(2003).combined transcriptome and proteome analysis of escherichia coli during high cell density culture.biotechnol.bioeng.81,753-767.doi:10.1002/bit.10626.[0277]uppal,s.,shetty,d.m.,&jawali,n.(2014).cyclic amp receptor protein regulates cspd,a bacterial toxin gene,in escherichia coli.journal of bacteriology,196(8),1569-1577.https://doi.org/10.1128/jb.01476-13[0278]yamanaka,k.,&inouye,m.(1997).growth-phase-dependent expression of cspd,encoding a member of the cspafamily in escherichia coli.journal of bacteriology,179(16),5126-5130.https://doi.org/10.1128/jb.179.16.5126-5130.1997。









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