同时检测中蜂蜜与意蜂蜜蜂种来源的胶体金试纸条的制备和应用

测量装置的制造及其应用技术1.本发明属于蜂产品检测领域，涉及一种同时检测中蜂蜜与意蜂蜜蜂种来源的胶体金 试纸条及制备和应用。技术背景2.中蜂又称土蜂，是中国的本土蜜蜂品种。中蜂蜜作为中国特有的蜂蜜品种，深受国 人喜爱，但其产量较低，在国内市场上，中蜂蜂蜜的零售价格一般在160-400元/kg，是国产 意蜂蜜价格的五到十倍。受利益驱使，市场上用意蜂蜜冒充或掺入中蜂蜜中的现象时有发生， 使中蜂蜜的消费者和从业人员蒙受损失。3.蜂蜜含有约1％的蛋白，通过高效液相色谱串联质谱(hplc-ms/ms)分析明确，蜂 蜜蛋白主要为蜜蜂分泌的王浆主蛋白mrjps，其中以mrjp1-3含量最高，是蜂蜜中固有的、 稳定存在的成分，不会被其他掺入蜂蜜中的外源物质所取代。根据其免疫特性，用mrjps作 为蜂蜜蜂种来源检测的内源性标记物是可行的思路。中蜂与意蜂的mrjps具有蜂种差异性， 这为制备两者的特异性抗体提供了可能。通过对中蜂和意蜂mrjp1-3的同源性分析可知，两 者mrjp1的同源性为91.22％，mrjp2的同源性为83.76％，mrjp3的同源性为77.83％，中 蜂和意蜂的mrjp1同源性太高，mrjp3又具有高度多态性，因此优先选择mrjp2作为抗体 制备的目标抗原。技术实现要素：4.本发明的目的是提供一种同时检测中蜂蜜与意蜂蜜蜂种来源的胶体金试纸条，可以 在一张试纸条上同时显示中蜂蜜与意蜂蜜的蜂种来源信息。所述试纸条含有特异性意蜂 mrjp2单克隆抗体和特异性中蜂mrjp2单克隆抗体，特异性意蜂mrjp2单克隆抗体由35e2 细胞株分泌获得，35e2细胞株的保藏编号：cctcc no:c2022208，分类命名：杂交瘤细胞 株35e2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日： 2022年7月6日；特异性中蜂mrjp2单克隆抗体由30g10细胞株分泌获得，30g10细胞株 的保藏编号：cctcc no:c2022209,分类命名：杂交瘤细胞株30g10，保藏单位：中国典型 培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日：2022年7月6日。5.所述试纸条主要由吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫组成，所述硝酸纤维素 膜上设有t1意蜂蜜检测线、t2中蜂蜜检测线和c质控线，c线、t1线和t2线各相距5mm， 所述吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、依次粘贴在塑料衬板上，装入塑料外壳。6.本发明的另一个目的是提供所述试纸条的制备方法，通过以下技术方案实现：7.1.抗原分离纯化(1)用14kda的透析袋对中蜂和意蜂的蜂王浆进行透析纯化，透析后的蜂王浆溶液 10000g离心30min，上清过0.22μm滤膜，滤液即为蜂王浆主蛋白(mrjps)粗提液；(2)用柱层析的方法进行抗原蛋白的纯化，玻璃层析柱型号选择qsepharosef.f.(20ml)， 并用电泳鉴定各个洗脱组分，选取中蜂mrjp2和意蜂mrjp2做为后续免疫的抗原。8.2.小鼠免疫用纯化过的中蜂mrjp2和意蜂mrjp2作为免疫用抗原，免疫动物选用8周龄的雌性 balb/c鼠，取第三次免疫后7天的血清，用间接elisa方法测其血清抗体水平，如果达到 融合标准(血清稀释10000倍，od450＞1)，选取滴度高的小鼠于融合前3天加强免疫一次。9.3.小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合按照单克隆制备流程进行操作，根据针对意蜂蜜的特异性，得到八株意蜂mrjp2融合细 胞，其中的33c6、24d6两株经亚克隆后转为阴性，从剩余六株意蜂mrjp2的融合细胞3b2、 31e2、27d12、1c1、35c4、35e2中各挑选一个细胞状态较好的克隆孔进行二次亚克隆。10.根据针对中蜂蜜的特异性，得到六株意蜂mrjp2融合细胞，其中9b1的elisa双抗 体夹心法没有阳性，22f12转阴，从剩余四株中蜂mrjp2的融合细胞13a5、30g10、25d10、 11e7中各挑选一个细胞状态较好的克隆孔进行二次亚克隆。11.elisa双抗体夹心检测结果显示，意蜂mrjp2筛选克隆细胞均有夹心效果，将稳定 株进行保种，接种小鼠制备腹水，中蜂mrjp2细胞株抗体效价为25d10、30g10》11e7》13a5， 抗原浓度高时(1ug/ml)，中蜂mrjp2细胞株与意蜂mrjp2有交叉反应。对中蜂mrjp2稳定 细胞株进行扩大培养冻存保种，接种小鼠制备腹水。12.4.兔抗中、意蜂蛋白多抗血清的制备选择体重2kg左右的新西兰兔，用纯化的中蜂mrjp2和意蜂mrjp2蛋白作为免疫用抗 原，共进行3次免疫，每次免疫剂量为1mg/只，三免7天后耳缘静脉采血，elisa检测血 清抗体水平，当效价达到要求后，心脏取血，分离血清，通过抗原亲和柱纯化、透析，得到 能同时识别中蜂mrjp2和意蜂mrjp2的多克隆抗体，以此多克隆抗体作为胶体金试纸条的 包被抗体。13.5.中、意蜂蜂蜜单克隆抗体的配对与标记特异性意蜂mrjp2单克隆抗体选择35e2细胞株(保藏编号：cctcc no:c2022208)， 35e2细胞株分泌的单克隆抗体特异性强，与中蜂mrjp2无交叉反应。中蜂mrjp2单克隆抗 体选择30g10细胞株(保藏编号：cctcc no:c2022209)，30g10细胞株分泌的单克隆抗体 与意蜂mrjp2有交叉反应。14.6.胶体金试纸条制备(1)胶体金溶液的制备：取氯金酸水溶液制备成含有粒径为20nm左右的胶体金颗粒的 胶体金溶液；(2)胶体金标记抗体：取能同时识别中蜂mrjp2和意蜂mrjp2的多克隆抗体，加入到 胶体金溶液中，制备成免疫胶体金，标金抗体的最佳ph为8.5；将免疫胶体金附着在无纺布 上为金标垫；(3)在硝酸纤维素膜上包被c线和t1线和t2线，其中c线为质控线，包被商用羊抗 鼠lgg，t1线为意蜂蜜检测线，t2线为中蜂蜜检测线，t1线和t2线包被能同时识别中蜂 mrjp2和意蜂mrjp2的兔多克隆抗体。t1线的检测抗体为特异性意蜂mrjp2单克隆抗体， t2线的检测抗体为中蜂mrjp2单克隆抗体。用划膜机点在硝酸纤维素膜上即得c线、t1线 和t2线，使c线、t1线和t2线各相距5mm；室温晾干，得到包被后的硝酸纤维素膜；(4)胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装：将吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品 垫从上到下依次粘贴在聚氯乙烯(pvc)底板上，切割成2-3mm宽的条状，装入塑料外壳， 即得快速检测试纸条；4℃避光干燥保存。15.本发明的目的是提供所述胶体金试纸条在中蜂蜜与意蜂蜜蜂种检测中的应用，所述 应用包括中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜蜂种来源真实性的检测和意蜂蜂蜜掺假中蜂蜂蜜的检测16.本发明的应用通过以下步骤实现：①取出试纸条，恢复至室温；②蜂蜜样品检测液的准备：将蜂蜜样品用纯水以质量比1：10稀释，混匀；③试纸条平放，将稀释好的蜂蜜样品2滴，加到样品垫上，5-10分钟读取结果；④结果判断：c线显示为红色线条时，结果有效。当t1和t2线显色时，结果为意蜂 蜜或掺有意蜂蜜，即待测样品中含有意蜂mrjp2；当t1线不显色，t2线显色时，结果为中 蜂蜜，待测样品中只含有中蜂mrjp2，而不含意蜂mrjp2；t1和t2线都不显色，结果为糖 浆，即样品既不含有中蜂mrjp2又不含有意蜂mrjp2。c线不显色时，结果无效。17.本发明公布的胶体金试纸条适用于中蜂蜜与意蜂蜜蜂种来源真实性的快速准确检测， 可以在一条试纸上同时检测中蜂蜜和意蜂蜜的蜂种来源真实性，适合中蜂蜜中混入一定比例 意蜂蜜的高效、便捷检测，也可用于不含蜜蜂王浆主蛋白的纯糖浆类型的假蜂蜜的鉴别。18.胶体金免疫层析试纸条技术是一种新型的胶体金标记免疫层析技术，具有可视化、 特异性强、快速便捷等特点，可用于间接定性或半定量的检测，对检测人员要求较低，非常 适合于中蜂蜜的现场快速检测。为了满足蜂产品行业和消费者和对中蜂蜜快速简便检测的需 求，本发明提供了一种快速检测中蜂蜜与意蜂蜜蜂种来源真实性的胶体金试纸条及其制备方 法和应用。通过单克隆抗体制备技术制备得到意蜂mrjp2单克隆抗体和中蜂mrjp2单克隆 抗体，意蜂mrjp2单克隆抗体只能特异性识别意蜂mrjp2蛋白，不会识别中蜂mrjp2蛋白。 意蜂mrjp2单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强等优点，且与其他王浆主蛋白家族相关蛋白 均无交叉反应。19.本发明的有益效果：本发明的中蜂蜜与意蜂蜜蜂种来源真实性的胶体金试纸条具有 操作便捷、检测时间短等优势，适用于中蜂蜜蜂种真实性鉴别，可以准确迅速检测出中蜂蜜 里20％比例以上的意蜂蜜掺入，也可以用于对纯糖浆蜂蜜进行鉴别。附图说明20.图1为试纸条示意图。21.图2为纯化后的天然意蜂mrjp2蛋白、中蜂mrjp2蛋白的sds-page图。22.图3为两株意蜂mrjp2单克隆抗体特异性鉴定。23.图4为中蜂蜜与意蜂蜜蜂种来源真实性胶体金试纸的实际检测效果。具体实施方式24.以下结合附图对本发明做进一步的阐述，下述实施例用于说明本发明，但不用来限 制本发明的范围。若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域常规技术手段，所用试 剂均为分析纯。25.实施例1：一种同时检测中蜂蜜与意蜂蜜蜂种来源的胶体金试纸条本实施例提供一种试纸条，主要由吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫组成，所述 硝酸纤维素膜上设有t1意蜂蜜检测线、t2中蜂蜜检测线和c质控线，c线、t1线和t2线 各相距5mm，所述吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、依次粘贴在塑料衬板上，装入 塑料外壳，试纸条示例见图1。所述试纸条含有特异性意蜂mrjp2单克隆抗体和特异性中蜂 mrjp2单克隆抗体，特异性意蜂mrjp2单克隆抗体由35e2细胞株分泌获得，35e2细胞株 的保藏编号：cctcc no:c2022208，特异性中蜂mrjp2单克隆抗体由30g10细胞株分泌获 得，30g10细胞株的保藏编号：cctcc no:c2022209。35e2细胞株和30g10细胞株被中国 典型培养物保藏中心保藏，保藏日：2022年7月6日。26.实施例2：天然中蜂mrjp2和意蜂mrjp2抗原的分离纯化通过对中蜂和意蜂mrjp1-3的同源性分析可知，两者mrjp1的同源性为91.22％，mrjp2 的同源性为83.76％，mrjp3的同源性为77.83％，中蜂和意蜂的mrjp1同源性太高，mrjp3 又具有高度多态性，因此优先选择mrjp2作为抗体制备的目标抗原，mrjp2抗原的获取直 接从蜂王浆中分离纯化。27.1.样品处理1)称取新鲜蜂王浆3g，溶于30ml纯水，用磁力搅拌器4℃温和搅拌3h。溶液置于50ml 离心管中，10000g离心30min，取上清装入14kda透析袋；2)透析袋置于3000ml纯水中，4℃透析24h，8h换水一次；3)透析后的蜂王浆溶液10000g离心30min，上清过0.22μm滤膜，滤液即为蜂王浆主 蛋白粗提液。28.2.抗原纯化用柱层析的方法进行抗原蛋白的纯化，具体操作如下：29.1)层析柱及洗脱液选择玻璃层析柱(20ml)qsepharosef.f.洗脱液a：0.01mol/l pb缓冲液，ph＝7.6洗脱液b：0.01mol/l pb缓冲液，ph＝7.6，含5个浓度梯度的nacl，分别为0.05mol/l， 0.1mol/l，0.2mol/l，0.3mol/l，0.4mol/l，各配2倍柱体积)。30.2)装柱取层析柱一根，装入约10ml洗脱液a，同时，将悬浮于适量洗脱液a中的qsepharosef.f. 一边搅动一边倒入层析柱中，让其自然沉降到全部加入为止。用5倍柱体积洗脱液a，以1.0 ml/min的流速平衡柱子。31.3)上样上述平衡过程完毕后，待液面离树脂沉降面约1cm后，用滴管将20ml样品沿管壁小心 加入，收集流出液。32.4)洗脱分别用洗脱液a及洗脱液b中5个梯度分别洗脱2个柱体积，分别收集。33.5)对洗脱下来的各组分进行sds-page电泳分析，胶条经考马斯亮蓝染色脱色后 得到各组分的清晰条带(图2)。根据分子量判断中蜂mrjp2和意蜂mrjp2，电泳显示：0.4m 浓度nacl洗脱下来的蛋白纯度大于90％，可用于动物免疫。34.实施例3：意蜂mrjp2和中蜂mrjp2单克隆抗体制备35.1.小鼠免疫用纯化过的中蜂mrjp2和意蜂mrjp2作为免疫用抗原，免疫动物选用8周龄的雌性 balb/c鼠，详细免疫程序见表1。取第三次免疫后7d的血清，用间接elisa方法测其血清 抗体水平，如果达到融合标准(血清稀释10000倍，od450＞1)，选取滴度高的小鼠于融合 前3d加强免疫一次。36.表1免疫程序表1免疫程序对免疫后小鼠血清效价进行检测，结果见表2、表3、表4、表5。37.表2意蜂mrjp2三次免疫后小鼠血清效价检测od450读数ꢀꢀ左前右前左后右后无空白鼠血1/10001.86942.04712.04582.09672.10180.08981/30001.40141.81811.82961.85191.93060.06671/90000.90141.53011.53781.41951.54940.06061/270000.46561.0650.93620.87180.940.04361/810000.2930.66010.56060.48160.57490.12911/2430000.10390.2670.21650.1920.22150.04581/7920000.0880.14610.13020.11490.12820.0663抗稀0.06350.0580.05620.05840.05460.057238.表3意蜂mrjp2三次免疫后小鼠血清交叉检测od450读数ꢀꢀ左前右前左后右后无空白鼠血1/10001.86281.96212.07471.98631.70030.07941/30001.70141.72581.84921.62821.37830.06991/90001.38341.30991.42611.07690.83130.05871/270000.83260.790.89910.58190.39550.06051/810000.53260.43610.52690.34350.25820.11881/2430000.22040.16540.19940.11950.09410.03681/7920000.12160.09420.12290.09410.08340.0618抗稀0.0610.05550.06980.06040.0720.0575结果显示，经意蜂mrjp2三次免疫后5只小鼠血清效价相近，均可达到1:792000，满足 后续细胞融合要求。39.表4中蜂mrjp2三次免疫后小鼠血清效价检测od450读数ꢀꢀ左前右前左后右后无空白鼠血1/10002.14641.8742.11832.06222.07440.08181/30001.97181.83281.99471.87421.9180.06731/90001.76211.82771.95151.73521.75890.05331/270001.37041.58161.71321.42381.38880.04491/810000.87661.15621.34351.02730.98340.11451/2430000.37020.56330.74320.4920.49520.03911/7920000.17310.27510.37570.24180.24880.0609抗稀0.06470.06680.06070.05320.0540.055940.表5中蜂mrjp2三次免疫后小鼠血清交叉检测od450读数表5中蜂mrjp2三次免疫后小鼠血清交叉检测od450读数结果显示，经中蜂mrjp2三次免疫后5只小鼠血清效价相近，均可达到1:792000，满足 后续细胞融合要求。41.2.小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合42.2.1饲养细胞的制备融合前12-24h取6-8周龄ba1b/c小鼠，眼眶放血，并收集小鼠阴性血清，备用。颈椎脱 臼处死后，浸泡于75％浓度的酒精溶液5min。分离腹壁与腹膜，经腹膜向小鼠腹腔注射适量 无血清的1640培养液按摩或叩打腹壁2min，形成细胞悬液。抽取出悬液，立即移入预冷的 15ml离心管，冰浴防止巨噬细胞贴壁，1500g离心5min，弃上清。细胞计数后(细胞总数 应达到4×106个细胞)用hat培养基混悬，调整细胞浓度至1-5×105/ml。用吸管冲洗混匀 后加液于96孔板，100μl/孔，置于37℃、5％co2培养箱中培养。43.2.2骨髓瘤细胞制备在融合前两周复苏骨髓瘤细胞，每隔2-3天传代培养，待细胞生长旺盛，形态良好时(大 小均一、圆浑、透亮)方可用于融合。在细胞融合前一天，用新鲜培养基调整细胞浓度至2ꢀ×105/ml，次日一般既为对数生长期细胞，此时融合成功率较高。收集骨髓瘤细胞于50ml 离心管中，1200g离心10min，弃上清，再将压积细胞重悬于基础培养基中，相同条件再次 离心，弃上清。用适量基础培养基重新悬浮(细胞密度达到1-2×106个细胞/ml，每大格50-100)。44.细胞计数：用微吸管吸取细胞悬液一滴加于血球计数板盖玻片旁，细胞悬液扩散进 入计数室，10倍物镜下统计四角大方格中的细胞数。吸取1-2×107个细胞备用。45.2.3小鼠脾细胞制备取加强免疫后的小鼠，眼眶采血，分离血清，作为阳性对照，备用。将小鼠浸泡于75％酒 精中5min，打开小鼠腹腔，取出脾脏，剥离筋膜，在200目筛网上研磨小鼠脾脏，用10ml 3％fbs1640冲洗筛网，收集脾细胞悬液。1200g离心10min，脾细胞沉淀用10ml 3％fbs1640 重悬，混匀后细胞计数，备用。46.2.4细胞融合按5:1比例混匀免疫脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞，1200g离心6min，弃上清(尽量吸 干)，以免影响peg的浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略为松动，在1min内逐滴加 入peg，边加边轻轻混合均匀。37℃水浴1min，5min内加入终止液10ml(先慢后快，静 置)，沿管壁滑入，轻轻搅匀，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开，静置5min。 1200g离心5min，弃上清，然后用25ml hat培养基悬浮，将含融合细胞的hat培养基接 种于96孔培养板(有150μl饲养层细胞)，置细胞培养箱内培养。47.2.5阳性杂交瘤细胞的筛选记录克隆孔出现的时间及数量，融合7d后换用ht的1640选择培养液。当培养孔中的 杂交瘤群落扩增到孔面积的1/4-1/2时，用间接elisa法特异性抗体检测。对筛选出的od 450 nm值高的阳性克隆孔进行亚克隆。48.2.6阳性杂交瘤细胞的亚克隆进行有限稀释法亚克隆的前一天，按2.1的方法制备饲养细胞。吹打阳性孔内的细胞， 移至1mlht选择培养基混匀，计数。取150-200个细胞于10mlht选择培养基，每孔100μ l，加入到铺好的饲养细胞培养板内，观察记录杂交瘤细胞的生长状况。阳性孔内余下的细胞， 转移至24孔板扩大培养，及时冻存。当培养孔中的杂交瘤群落扩增到孔面积的1/4-1/2时， 用间接elisa法检测。对筛选出的od450 nm值高的阳性克隆孔继续进行克隆。一般至少进 行3-5次克隆化培养工作，待最后一次所选10-20个单克隆株检定为全部阳性克隆株即100％ 阳性孔率为止。49.表6意蜂mrjp2第一次亚克隆后杂交瘤上清elisa夹心法检测od450读数结果显示，可从3b2、31e2、27d12、1c1、35c4、35e2中各挑选一个细胞状态较好的 克隆孔进行二次亚克隆。50.表7中蜂mrjp2第一次亚克隆后杂交瘤上清elisa夹心法复检od450读数结果显示，9b1夹心法没有阳性，22f12转阴。所以从13a5、30g10、25d10、11e7中 各挑选一个细胞状态较好的克隆孔进行二次亚克隆。51.根据意蜂mrjp2第二次亚克隆后杂交瘤上清elisa交叉检测od450读数，间接法 检测结果：31e2、35e2》35c4、27d12》3b2、1c1。夹心法检测结果显示意蜂mrjp2筛选克 隆细胞均有夹心效果，将稳定株进行保种，接种小鼠制备腹水。52.根据中蜂mrjp2第二次亚克隆后杂交瘤上清elisa交叉检测od450读数间接法检 测结果：25d10、30g10》11e7》13a5。夹心法检测结果：25d10、30g10》11e7》13a5，抗原 浓度高时(1ug/ml)，与意蜂mrjp2蛋白有轻微交叉反应。综合间接法和夹心法检测结果，mr2 稳定细胞株进行扩大培养冻存保种,接种小鼠制备腹水。53.2.7单克隆抗体的鉴定54.特异性鉴定(间接elisa法)1)包被意蜂蛋白：coating buffer稀释意蜂蛋白至2μg/ml，100μl/孔。4℃过夜；2)同样的方法包被中蜂蛋白；3)5％脱脂奶粉封闭，200μl/孔。37℃孵育2h；4)pbst洗涤5次；5)取阳性单克隆培养上清分别加入意蜂蛋白包被孔和中蜂蛋白包被孔，100μl/孔。37℃ 孵育1h；6)pbst洗涤5次；7)1％脱脂奶粉-pbst稀释羊抗鼠二抗(1：10000)，100μl/孔；8)pbst洗涤5次；9)tmb系统显色，37℃孵育15min；10)2m h2so4终止反应；11)测定od 450nm值。55.对2株能够稳定分泌抗意蜂蛋白的杂交瘤细胞株(编号为:35e2、35c4)，进行特异 性检测，意蜂蜂蜜特异性单克隆抗体35e2和35c4的特异性良好(图3)，满足后续胶体金试 纸条的开发。56.2.8小鼠腹水制备提前一周向小鼠体内注射0.3ml专用佐剂，复苏杂交瘤细胞株至对数生长期，用量为1ꢀ×106个细胞/只小鼠。一般在注入杂交瘤细胞后7-8d小鼠腹部开始膨胀，14d收取腹水。离 心去除杂质，收集上清，-80℃冻存。57.2.9腹水纯化(抗体纯化)腹水从-80℃冰箱取出，快速融化复温，用0.45μm滤膜过滤。取5ml腹水，12000g 室温离心10min，然后将上清液转移到新的50ml离心管。用pbs稀释4倍，0.22μm滤膜 过滤，proteing亲和柱纯化。5倍柱体积pbs洗涤，然后3倍柱体积0.1m ph 2.7gly-hcl 溶液洗脱，收集并中和洗脱液，洗脱液于pbs中透析过夜。10000g离心10min，收集上清 液，0.22μm滤膜过滤除菌，nanodrop 2000测定蛋白含量，分装，置-80℃备用。用sds-page 方法鉴定纯度，用间接elisa方法检测抗体滴度。58.表8意蜂蜜35e2、35c4小鼠腹水elisa检测od450读数35c4小鼠腹水elisa检测od450读数结果显示，腹水35e2、35c4在间接法中与抗原反应良好；单抗-多抗夹心法检测中夹心 效果较差，只有在抗原浓度较高时有夹心效果59.表9中蜂蜜13a5、30g10小鼠腹水elisa检测od450读数ꢀꢀ13a530g101/10001.42571.33611/30001.38651.27751/90001.34281.25031/270001.32531.13421/810001.31081.01311/2430001.25830.82891/792001.25740.6767稀释液0.06140.0547结果显示，腹水13a5、30g10在间接法中与抗原反应良好；单抗-多抗夹心法检测中30g10 夹心效果较好，灵敏度更高，13a5无夹心效果；使用羊抗鼠(g-m)、驴抗鼠(d-m)不同 捕获二抗结果趋势一致60.2.10单克隆抗体亚型鉴定使用小鼠单抗鉴定试剂盒鉴定，取35e2、35c4、30g10三株杂交瘤细胞的上清液分别与 抗igg i、igg2a、igg2b、igg3、iga、igm抗体反应，od 450nm》0.8，判为阳性反应。结 果显示获得的3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均为igg1类。61.实施例4：检测中蜂蜜与意蜂蜜蜂种来源真实性的胶体金试纸条的开发62.1.胶体金标记兔抗中、意蜂多克隆抗体最佳ph值的确定取20nm颗粒大小的胶体金溶液，将待标记的多克隆抗体4℃条件下12000g离心20min， 取上清，过0.45μm滤膜，用nanodrop 2000测定抗体浓度，再用pbs调整抗体浓度至1mg/ml 备用。63.取2列酶标板(8孔)，先加入0.5ml胶体金溶液，然后取50μl多克隆抗体(1mg/ml) 分别加入用0.2mol/l k2co3调至不同ph值的胶体金溶液中，涡旋振荡混匀，瞬时离心后 静置10min，每管(除对照管外)分别加50μl 10％nacl，混匀后静置2h，各孔加样信息见 表10。64.表10胶体金标记抗体最佳ph值的测定表10胶体金标记抗体最佳ph值的测定65.酶标仪测定od 530nm值：取各管胶体金悬液200μl，测定od 530nm值，绘制曲 线。结果判定：当od 530nm值最大时的ph即最适ph值。此时管内胶体金溶液颜色与原液 相比无任何变化且不出现聚沉。确定标金抗体的最佳ph为8.5。66.2.胶体金标记兔抗中、意蜂多克隆抗体最适浓度的确定取2列酶标板，各加入0.5ml胶体金溶液，调整至上一步己确定的最佳标记ph值，各 管加入不同稀释倍数的多克隆抗体(1mg/ml)50μl，涡旋振荡混匀，静置10min。每管(除 对照管外)分别加入50μl 10％nacl，混匀，静置2h。结果判定:当od 530nm值最大时的 抗体浓度即最适浓度。此时管内胶体金溶液颜色与原液相比无任何变化且不出现聚沉。最终 确定，包被的多克隆抗体浓度及喷金量为8μl/cm。67.3.检测线、质控线包被浓度及金标喷量的确定将纯化后的单克隆抗体在0.1mg/ml-1.5mg/ml的范围内调整t线包被浓度，在 0.1-1mg/ml浓度范围内调整c线包被浓度，在4-10μl/cm的用量范围内调整金标喷量，当阳性 样品c线和t线出现显色适中且均匀的条带，阴性样品c线显线、t线不显线时的条件作为最 终的包被浓度和金标喷量。68.4.胶体金试纸条研制4.1标金垫制备：按表11进行标金垫参数的探索。69.表11标金垫参数670.4.2喷膜经过探索，确定喷膜各参数，喷膜参数见表12。71.表12胶体金试纸条喷膜参数 位置名称初始(mg/ml)终浓度(mg/ml)cprotein a30.5t230g100.50.25t135e21.50.7572.4.3工艺测试设置不同参数组合，探索该试纸条的最佳工艺。73.表1374.表1475.工艺a120和工艺a122较好，最终选择工艺a122。当中蜂蜜中意蜂蜜掺入比例 为20％时，意蜂蜜检测线(t1线)依然会显色，说明该试纸条具有较高的检测灵敏度。将样 品垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水垫一次粘贴到聚氯乙烯(pvc)底板上，切割成2-3mm 宽的条状，装入塑料外壳，即得快速检测试纸条；4℃避光干燥保存。76.4.4检测用试纸条对中蜂蜜、意蜂蜜和掺入不同比例意蜂蜜的中蜂蜜样品进行检测，均在5-10min 内得到正确结果，具体结果见图4：纯中蜂蜜时t1线不显色，c线和t2线显色。纯意蜂蜜 时c线、t1线和t2线均显色。中蜂蜜中掺入意蜂蜜时c线、t1线和t2线均显色，该试纸 条能检测出意蜂蜜20％比例的掺入，是中蜂蜜快速鉴别的可靠工具。77.实施例5：快速检测试纸条的应用中蜂蜜与意蜂蜜蜂种来源真实性的胶体金试纸条的应用，包括以下步骤：78.1.取出试纸条，恢复至室温；2.蜂蜜样品检测液的准备：将蜂蜜样品用纯水以质量比1：10稀释，混匀；3.试纸条平放，将稀释好的蜂蜜样品2滴，加入样本垫，5-10分钟读取结果；4.结果判断：c线显示为红色线条时，结果有效。当t1和t2线显色时，结果为意蜂蜜 或掺有意蜂蜜，即待测样品中含有意蜂mrjp2蛋白；当t1线不显色，t2线显色时，结果为 中蜂蜜，待测样品中只含有中蜂mrjp2，而不含意蜂mrjp2；t1和t2线都不显色，结果为 糖浆，即样品既不含有中蜂mrjp2又不含有意蜂mrjp2。c线不显色时，结果无效。79.虽然上述实施例已对本发明作出了详尽的描述，但本发明的保护范围并不局限于此， 还可对本发明的方案作出其不偏离中心的修改，它们都属于本发明的保护范围。









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