通过检测血液样品中的特定生物标志物诊断主动脉夹层

测量装置的制造及其应用技术1.本发明涉及诊断样品中的主动脉夹层的方法。本发明进一步涉及聚集蛋白聚糖或其变体作为用于诊断样品中的主动脉夹层的生物标志物的用途。本发明还涉及用于诊断样品中的主动脉夹层的试剂盒。本发明进一步涉及用于执行诊断主动脉夹层的方法的现场护理装置。背景技术：2.主动脉夹层，例如a型主动脉夹层，是危及生命的状况，当对主动脉的最内层的损害(所谓的内膜撕裂)允许血液在主动脉壁的各层之间流动，从而迫使各层分开时，所述状况出现。目前，诊断占主导地基于医学成像，例如用于确认且评估夹层的计算机断层扫描或超声。在根据内膜撕裂的解剖区域的stanford分类后，主动脉夹层基本上分类成两个主要类型，a型和b型。在stanford a型夹层中，内膜撕裂位于左锁骨下动脉之前，而在stanford b型夹层中，内膜撕裂相应地位于左锁骨下动脉之外。3.致命的主动脉破裂是急性主动脉夹层，尤其是a型夹层中最具破坏性的并发症。因此，如果没有立即的主动脉手术修复，患有a型主动脉夹层的患者中的死亡率为大约1-5%/小时。由于主动脉夹层，特别是a型主动脉夹层的这种高度急性和危及生命的特性，立即诊断和后续的手术治疗是必要的。4.在患者入院时患者的临床症状对于诊断主动脉夹层起主要作用。此类临床症状可以包括胸部和/或背部的急性重度痛。必须执行a型主动脉夹层的重要的鉴别诊断，因为心脏病发作的临床症状可能与主动脉夹层的临床症状相似。目前存在可以用于诊断血液样品中的心脏病发作的多重可靠的生物标志物。然而，对于主动脉夹层，特别是a型主动脉夹层，目前缺少此类生物标志物。因此，在患有急性胸痛的患者中，用于心肌损伤和可能的主动脉夹层的生物标志物应该立即作为基本常规进行评估。这种算法将防止负责的医生给患者服用错误的药物。通常用作急性冠状动脉综合征的治疗的抗凝药物在患有急性主动脉夹层的患者中将是致命的。此外，在排除急性心肌梗塞后，遗漏急性主动脉夹层的诊断的可能性将显著减少。另外，在诊断和确定性治疗之间的时间将相当大地减少。由于合适的生物标志物，潜在疾病过程的早期指示将促使更快速的适当的进一步诊断测试。因此，需要用于主动脉夹层，特别是a型主动脉夹层的合适生物标志物，以及诊断主动脉夹层的方法。5.许多诊所没有在适当的时间执行鉴别诊断测试的能力，因为需要高分辨率的成像数据用于执行主动脉夹层的鉴别诊断。因此，需要特异性的生物标志物，其是患者中的a型主动脉夹层出现的第一种早期指标，使得可以以靶向和及时的方式执行后续的分别医学检查。6.由于非特异性临床症状，主动脉夹层经常根本没有被诊断或诊断得太晚。目前，a型主动脉夹层的诊断基于复杂的、劳动密集型和成本密集型的医学检查，例如涉及造影剂的计算机断层扫描。因此，仅涉及简单快速的技术例如血液样品中的检测的诊断a型主动脉夹层的方法，将是高度期望的。7.cikach等人[1]在患有主动脉夹层的患者的主动脉样品中已检测到聚集蛋白聚糖。us 2005/0124071 a1涉及作为疾病如关节炎和关节疾病的生物标志物的聚集蛋白聚糖。ep 2019318 a1涉及作为用于分析可能患有心血管疾病(例如腹主动脉瘤)的患者的斑块样品的生物标志物的聚集蛋白聚糖。然而，目前缺少用于检测患者的血液样品中的主动脉夹层的生物标志物。[0008]因此，本发明的一个目的是提供使用可在患有a型主动脉夹层的患者的血液中检测到的生物标志物，诊断主动脉夹层，优选a型主动脉夹层的方法。此外，本发明的一个目的是提供以简单、可靠和及时的方式诊断主动脉夹层，优选a型主动脉夹层的方法。技术实现要素：[0009]在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列出，然而，应该理解，它们可以以任何方式和任何数目组合，以产生另外的实施方案。各种描述的实例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应该理解为支持且涵盖将两个或更多个明确描述的实施方案组合，或者将一个或多个明确描述的实施方案与任何数目的公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本技术中所有描述的要素的任何排列和组合都应该被视为由本技术的描述公开。[0010]在第一个方面，本发明涉及诊断样品中的主动脉夹层的方法，其包括下述步骤：a)提供患者的样品，其中所述样品是血液样品、血清样品和/或血浆样品，b)测量聚集蛋白聚糖或其变体的水平，任选地测量除聚集蛋白聚糖外的至少一种进一步的生物标志物的水平，c)将测量的水平与未患有主动脉夹层的健康人的各自的参考值和/或参考样品进行比较。[0011]在一个实施方案中，所述方法进一步包括如果与参考值和/或参考样品相比，所述样品中的聚集蛋白聚糖水平，任选地除聚集蛋白聚糖外的所述进一步的生物标志物的水平是增加的，则确定患者患有主动脉夹层的步骤。[0012]在一个实施方案中，所述主动脉夹层选自a型主动脉夹层和b型主动脉夹层，优选为a型主动脉夹层。[0013]在一个实施方案中，所述样品是人样品。[0014]在一个实施方案中，除聚集蛋白聚糖外的所述生物标志物选自ogn、lpyd、itga11、ano1、brox、c10orf11、cd47、cnn1、comp、fbln2、fbln5、fmod、fndc1、gulp1、hapln1、hapln2、loxl1、ltbp4、mrvi1、myh9、npnt、nptxr、snap23、tagln2、tagln3、thbs2、vcan及其变体，优选选自ogn、lpyd、itga11及其变体。[0015]在一个实施方案中，所述测量通过选自elisa、pcr、qpcr、流式细胞术、质谱法、基于抗体的蛋白质芯片、二维凝胶电泳、蛋白质印迹、蛋白质免疫沉淀、放射免疫测定、配体结合测定和液相层析，优选选自elisa、放射免疫测定和基于抗体的蛋白质芯片的方法来执行。[0016]在一个实施方案中，所述水平指蛋白质和/或核酸的水平。[0017]本发明进一步涉及诊断样品中的主动脉夹层的方法，其包括下述步骤：i)测量患者的样品中的聚集蛋白聚糖或其变体的水平，其中所述样品是血液样品、血清样品和/或血浆样品，任选地测量所述样品中除聚集蛋白聚糖外的至少一种进一步的生物标志物的水平，ii)将测量的水平与未患有主动脉夹层的健康人的各自的参考值和/或参考样品进行比较。[0018]在一个实施方案中，所述方法进一步包括如果与参考值和/或参考样品相比，所述样品中的聚集蛋白聚糖水平，任选地除聚集蛋白聚糖外的所述进一步的生物标志物的水平是增加的，则确定所述患者患有主动脉夹层的步骤。[0019]在一个实施方案中，所述患者的样品是从患者中获得的样品。在一个实施方案中，所述主动脉夹层、所述样品、所述生物标志物、所述测量和所述水平如上文定义的。[0020]在一个进一步方面，本发明涉及聚集蛋白聚糖或其变体作为用于诊断样品中的主动脉夹层的生物标志物的用途，其中所述样品是血液样品、血清样品和/或血浆样品。[0021]在一个实施方案中，所述主动脉夹层选自a型主动脉夹层和b型主动脉夹层，优选为a型主动脉夹层。[0022]在一个实施方案中，所述样品是人样品。[0023]在一个实施方案中，所述用途进一步包含用于诊断样品中的主动脉夹层的除聚集蛋白聚糖外的至少一种生物标志物，除聚集蛋白聚糖外的所述生物标志物优选选自ogn、lpyd、itga11、ano1、brox、c10orf11、cd47、cnn1、comp、fbln2、fbln5、fmod、fndc1、gulp1、hapln1、hapln2、loxl1、ltbp4、mrvi1、myh9、npnt、nptxr、snap23、tagln2、tagln3、thbs2、vcan及其变体，更优选选自ogn、lpyd、itga11及其变体。[0024]在一个实施方案中，所述生物标志物以蛋白质和/或核酸或其片段的形式存在于所述样品中。[0025]在这方面，所述聚集蛋白聚糖、所述变体、所述生物标志物、所述诊断、所述主动脉夹层和所述样品如上文定义的。[0026]在一个进一步方面，本发明涉及用于诊断样品中的主动脉夹层的试剂盒，其包含-用于检测作为生物标志物的聚集蛋白聚糖的试剂或工具，优选抗体或抗原结合肽，-任选的参考工具，优选健康人的参考样品或以限定量的重组聚集蛋白聚糖，-任选的用于检测除聚集蛋白聚糖外的生物标志物的一种或多种试剂或工具，-任选的用于执行如上述任何实施方案中定义的方法的辅助化合物，-任选地包含用于诊断主动脉夹层的说明书，特别是用于将测量的聚集蛋白聚糖水平，任选的测量的至少一种进一步的生物标志物的水平，与未患有主动脉夹层的健康人的参考值和/或参考样品进行比较的说明书，其中所述聚集蛋白聚糖水平，任选的进一步的生物标志物水平的增加指示主动脉夹层。[0027]在这方面，所述聚集蛋白聚糖、所述生物标志物、所述诊断、所述主动脉夹层、所述测量和所述样品如上文定义的。[0028]在一个进一步方面，本发明涉及用于执行如上文任何实施方案中定义的诊断主动脉夹层的方法的现场护理装置，其包括：-用于使选自血液样品、血清样品和/或血浆样品的样品与所述现场护理装置接触的样品入口，-用于测量所述样品中的聚集蛋白聚糖水平，任选地进一步测量所述样品中除聚集蛋白聚糖外的至少一种生物标志物的分析单元，-包括用于检测聚集蛋白聚糖水平的检测器的评估单元，其中所述检测器生成指示聚集蛋白聚糖水平的输出信号。[0029]在这方面，所述方法、所述诊断、所述主动脉夹层、所述样品、所述聚集蛋白聚糖和所述生物标志物如上文定义的。[0030]在一个进一步方面，本发明还涉及治疗主动脉夹层，优选a型主动脉夹层的方法，其包括使用如上文定义的诊断主动脉夹层的方法，诊断所述主动脉夹层，优选所述a型主动脉夹层。[0031]在这方面，所述主动脉夹层和所述诊断方法如上文定义的。[0032]在一个进一步方面，本发明进一步涉及至少一种生物标志物用于制造用于诊断和/或治疗主动脉夹层，优选a型主动脉夹层的药物的用途，其中所述至少一种生物标志物是聚集蛋白聚糖以及任选的选自ogn、lpyd、itga11、ano1、brox、c10orf11、cd47、cnn1、comp、fbln2、fbln5、fmod、fndc1、gulp1、hapln1、hapln2、loxl1、ltbp4、mrvi1、myh9、npnt、nptxr、snap23、tagln2、tagln3、thbs2和vcan的任何生物标志物。[0033]在这方面，所述生物标志物、所述诊断和所述主动脉夹层如上文定义的。[0034]在一个进一步方面，本发明进一步涉及聚集蛋白聚糖，以及任选地另外选自以下的除聚集蛋白聚糖外的任何生物标志物用于诊断主动脉夹层，优选a型主动脉夹层的用途：ogn、lpyd、itga11、ano1、brox、c10orf11、cd47、cnn1、comp、fbln2、fbln5、fmod、fndc1、gulp1、hapln1、hapln2、loxl1、ltbp4、mrvi1、myh9、npnt、nptxr、snap23、tagln2、tagln3、thbs2和vcan。[0035]在这方面，所述生物标志物、所述诊断和所述主动脉夹层如上文定义的。具体实施方式[0036]本发明允许诊断患者的血液样品中的主动脉夹层，特别是a型主动脉夹层。本发明人在本文中公开了聚集蛋白聚糖是用于诊断主动脉夹层，优选a型主动脉夹层的方法中的合适生物标志物。特别地，本发明人检测到，与未患有a型夹层的受试者相比，聚集蛋白聚糖水平在患有a型夹层的患者的血液样品中是增加的。[0037]本发明的方法出乎意料地允许诊断血液样品中的急性a型主动脉夹层。特别地，本发明的方法的一个优点在于提供了生物标志物，例如聚集蛋白聚糖，其可以快速、容易和无创地进行分析。在聚集蛋白聚糖检测为在患者的血浆或血清中是增加的情况下，可以将患者迅速地引导至进一步的医学检查，例如计算机断层扫描，和/或可以执行立即的手术。使用聚集蛋白聚糖作为生物标志物诊断主动脉夹层的方法的一个进一步优点在于，它允许例如通过使用本发明的试剂盒和/或现场护理装置，在急诊室或任何急救地点的容易快速的诊断。本发明的方法提供了主动脉夹层的快速和可靠的诊断，优选快至《 3.5小时，更优选快至《 1小时。[0038]如本文使用的，术语“诊断(diagnosing)”或“诊断(diagnosis)”涉及检查患者的健康状况，优选涉及确定哪种疾病或状况导致个人的症状和/或健康状况。在一个实施方案中，诊断涉及确定个人是否患有主动脉夹层，例如a型主动脉夹层。在一个实施方案中，本发明的诊断包含其中确定患者是否患有心脏病发作、主动脉夹层或两者均无的鉴别诊断。在一个实施方案中，根据本发明的诊断方法包括使用聚集蛋白聚糖和选自以下的任何生物标志物用于确定受试者是否患有主动脉夹层：ogn、lpyd、itga11、ano1、brox、c10orf11、cd47、cnn1、comp、fbln2、fbln5、fmod、fndc1、gulp1、hapln1、hapln2、loxl1、ltbp4、mrvi1、myh9、npnt、nptxr、snap23、tagln2、tagln3、thbs2和vcan，并且任选地进一步包括使用选自肌钙蛋白i、肌钙蛋白t、hs肌钙蛋白和ck-mb的任何生物标志物用于确定受试者是否患有心脏病发作。在一个实施方案中，诊断样品中的主动脉夹层的方法在体外执行；特别地，测量聚集蛋白聚糖或其变体的水平，任选地测量至少一种进一步的生物标志物的水平的步骤(b)在体外执行。在一个实施方案中，诊断主动脉夹层的方法使用从患者中获得的血液样品在体外执行。[0039]在一个实施方案中，如果根据本发明的诊断方法已指示患者患有主动脉夹层，则所述诊断方法进一步包括在执行手术治疗之前，例如通过计算机断层扫描或超声，对所述患者进行成像的后续步骤。[0040]如本文使用的，术语“主动脉夹层”指其中主动脉的内层撕裂的严重医学状况。血液可能通过撕裂涌出，其导致主动脉的内层和中间层分离。由于没有足够的血液流向心脏或主动脉的完全破裂，主动脉夹层可能是致命的。stanford分类描述了两类主动脉夹层，即a型和b型主动脉夹层，取决于是否涉及升主动脉。a型涉及升主动脉和/或主动脉弓，并且在一些情况下涉及降主动脉。b型涉及降主动脉或弓(左锁骨下动脉远端)，而不涉及升主动脉。a型升主动脉夹层一般需要首要的手术治疗，而b型夹层一般进行药物治疗作为初始治疗，并且如果出现任何并发症，则使用手术或干预。[0041]如本文使用的，术语“a型主动脉夹层”指其中撕裂通常在主动脉的上升部分发生的主动脉夹层。a型主动脉夹层也可能影响主动脉根部、主动脉弓和整个主动脉中的任一种。a型夹层可能起因于高血压、遗传性结缔组织无力和/或动脉瘤。患有急性a型主动脉夹层的受试者通常经历严重胸痛的突然发作，其可能扩散到颈部、下巴或背部。可能出现症状例如呼吸短促、意识丧失以及与来自中风的那些相似的症状，例如突然说话困难、视力丧失和虚弱。a型主动脉夹层紧急需要诊断和手术。如果没有治疗，约50%的患有stanford a型夹层的患者在三天内死亡。在一个实施方案中，在a型主动脉夹层中起作用的囊性中层变性导致平滑肌细胞变性，导致替代组织和/或蛋白质例如聚集蛋白聚糖的产生。[0042]如本文使用的，术语“样品”指患者的样品，优选血液样品。在一个实施方案中，所述样品是血液样品、血清样品和/或血浆样品。在一个实施方案中，术语“血液样品”涉及全血样品、血清样品和/或血浆样品。在一个实施方案中，所述患者是人。本发明的一个优点在于根据本发明的诊断方法可以仅使用非常少量的血液，例如10-1000 μl，优选《 500ꢀµl的血液，更优选≤ 100ꢀµl的血液来执行。在一个实施方案中，术语“患者的样品”指从患者中获得的样品，优选血液样品。在一个实施方案中，通过微创和/或无创抽血，优选无创抽血来获得患者的样品。在一个实施方案中，提供患者的样品和/或从患者中获得样品仅仅涉及微创和/或无创技术，优选无创技术。在一个实施方案中，提供患者的样品和/或从患者中获得样品仅仅涉及非危险方法，其仅涉及较小的干预并且对于所述患者没有实质的健康风险。[0043]如本文使用的，术语“测量”指对样品中的参数进行定量，特别是对生物标志物例如聚集蛋白聚糖的水平进行定量。在一个实施方案中，使用任何方法，例如elisa、pcr、qpcr、流式细胞术、质谱法、基于抗体的蛋白质芯片、二维凝胶电泳、蛋白质印迹、蛋白质免疫沉淀、放射免疫测定、配体结合测定和液相层析中的任一种，优选选自elisa、放射免疫测定和基于抗体的蛋白质芯片的任一种，执行测量生物标志物水平。在一个实施方案中，测量聚集蛋白聚糖和任选的一种或多种其它生物标志物。在一个实施方案中，测量聚集蛋白聚糖的水平以及骨甘蛋白聚糖、赖氨酰吡啶啉和整联蛋白α11中的任一种的水平。[0044]如本文使用的，术语“水平”指样品中的生物标志物的蛋白质和/或核酸水平。在一个实施方案中，生物标志物的水平是样品中的生物标志物浓度和/或量的指标。在一个实施方案中，当提及样品中的生物标志物的存在时，术语生物标志物“水平”、“浓度”和“量”可以互换使用。在一个实施方案中，使用elisa测定来测量水平。[0045]如本文使用的，术语“聚集蛋白聚糖”指蛋白聚糖和细胞外基质的组分。聚集蛋白聚糖占主导地存在于透明软骨中。聚集蛋白聚糖(acan)也称为软骨特异性蛋白聚糖核心蛋白(cspcp)或硫酸软骨素蛋白聚糖1，并且是由人中的acan基因编码的蛋白质。由于可变剪接，人形式的聚集蛋白聚糖蛋白可以以多重同种型表达，特别是同种型1 (seq id no.1)、2 (seq id no.2)和3 (seq id no.3)。同种型1、2和3的氨基酸序列分别包含2431 aa、2530 aa和2568 aa。acan基因中的突变可以导致罕见疾病脊椎骨骺发育不良。血管系统内的聚集蛋白聚糖沉积可能导致血管僵硬增加。在一个实施方案中，术语“聚集蛋白聚糖”进一步包含聚集蛋白聚糖的生物活性片段以及其变体。在一个实施方案中，聚集蛋白聚糖用作用于诊断主动脉夹层，优选a型主动脉夹层的生物标志物。[0046]如本文使用的，术语“变体”指生物标志物的任何衍生物，例如片段、同种型、同种型的片段、可变剪接的变体、突变的变体、翻译后修饰的变体或其片段。在一个实施方案中，变体涉及以核酸和/或蛋白质形式的生物标志物的变体。在一个实施方案中，生物标志物的变体是所述生物标志物的生物活性衍生物，例如生物活性片段。在一个实施方案中，聚集蛋白聚糖的变体是聚集蛋白聚糖片段、聚集蛋白聚糖的同种型(seq id. 1-3)或其片段、可变剪接的变体、突变的变体和翻译后修饰的变体中的任一种。在一个实施方案中，除聚集蛋白聚糖外的生物标志物的变体是所述生物标志物的任何片段、同种型、同种型的片段、可变剪接的变体、突变型变体、翻译后修饰的变体。[0047]如本文使用的，术语“生物标志物”指通过其可以鉴定特定病理或生理过程和/或疾病的天然存在的分子、基因、蛋白质和/或特性。在一个实施方案中，生物标志物用于诊断主动脉夹层，优选a型主动脉夹层的存在。在一个实施方案中，用于按照本发明的方法诊断主动脉夹层的生物标志物是选自以下的任何生物标志物：聚集蛋白聚糖(acan)、骨甘蛋白聚糖(ogn)、赖氨酰吡啶啉(lpyd)、整联蛋白亚基α11 (itga11)、anoctamin (ano1)、brox (含有bro1结构域和caax基序(bro1 domain and caax motif containing))、富含亮氨酸的黑素细胞分化相关(leucine rich melanocyte differentiation associated)(lrmda/c10orf11)、cd47分子(cd47)、钙调理蛋白(calponin) 1 (cnn1)、软骨寡聚基质蛋白(comp)、腓骨蛋白(fibulin) 2 (fbln2)、腓骨蛋白5 (fbln5)、纤维调节蛋白(fmod)、含纤连蛋白iii型结构域1 (fndc1)、gulp含ptb结构域域的吞噬衔接因子1(gulp ptb domain containing engulfment adaptor 1)(gulp1)、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1 (hapln1)、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白2 (hapln2)、赖氨酰氧化酶样1 (loxl1)、潜在转化生长因子β结合蛋白4 (ltbp4)、鼠逆转录病毒整合位点1同源物(mrvi1)、肌球蛋白重链9 (myh9)、肾连蛋白(npnt)、神经元正五聚蛋白受体(nptxr)、突触小体相关蛋白23 (snap23)、转胶蛋白(transgelin) 2 (tagln2)、转胶蛋白3 (tagln3)、血小板反应蛋白2 (thbs2)、多功能蛋白聚糖(versican) (vcan)及其变体。在一个实施方案中，根据本发明的诊断方法包括测量生物标志物聚集蛋白聚糖的水平，并且任选地另外测量除聚集蛋白聚糖外的至少一种其它生物标志物的水平。在一个实施方案中，与健康个体的血液样品中的聚集蛋白聚糖水平相比，生物标志物聚集蛋白聚糖的水平在患有a型主动脉夹层的患者的血液样品中是增加的。在一个实施方案中，与健康个体中的水平相比，聚集蛋白聚糖以及选自ogn、lpyd和itga11的至少一种其它生物标志物的水平在患有a型主动脉夹层的患者的血液样品中是增加的。在一个实施方案中，与健康个体的水平和/或患有除a型主动脉夹层外的疾病，例如心血管疾病如心肌梗塞的患者中的水平相比，聚集蛋白聚糖以及选自ogn、hapln1和itga11的至少一种其它生物标志物的水平在患有a型主动脉夹层的患者的血液样品中是增加的。[0048]如本文使用的，术语“骨甘蛋白聚糖”指由ogn基因编码的人蛋白质。ogn基因编码以下蛋白质，其与转化生长因子β结合诱导异位骨形成。骨甘蛋白聚糖蛋白是含有串联富亮氨酸重复(lrr)的小蛋白聚糖。ogn的表达水平已与扩大的心脏，且更具体而言左心室肥大相关联。[0049]如本文使用的，术语“赖氨酰吡啶啉”和“lpyd”涉及通常在胶原中，由两个羟赖氨酸残基和一个赖氨酸残基形成的交联。[0050]如本文使用的，术语“参考”、“参考值”或“参考样品”指的是指示生物标志物水平的正常水平的对照值和/或对照样品。在一个实施方案中，参考值和参考样品分别是在健康个体中检测到的值和从健康个体中获得的样品。在一个实施方案中，参考值和/或参考样品是在健康个体中对于目的生物标志物水平鉴定的预计值的指标。在一个实施方案中，参考值和/或参考样品允许将患者中检测到的生物标志物水平与在健康个体中预计和/或检测到的生物标志物水平进行比较。在一个实施方案中，参考样品用于获得参考值。在一个实施方案中，将患者的聚集蛋白聚糖水平与聚集蛋白聚糖水平的参考值进行比较，并且与所述参考值相比，所述患者中的聚集蛋白聚糖水平增加指示所述患者患有主动脉夹层，特别是a型主动脉夹层。在一个实施方案中，将患者的生物标志物水平与所述生物标志物水平的参考值进行比较，并且所述患者中与所述参考值相比偏离的生物标志物水平，优选增加的生物标志物水平指示所述患者患有主动脉夹层，特别是a型主动脉夹层。在一个实施方案中，参考衍生自未患有主动脉夹层的健康人。在一个实施方案中，术语“参考”和“参考值和/或参考样品”可互换使用。在一个实施方案中，术语“包含”可以涉及“由……组成”。[0051]如本文使用的，术语“患者”涉及患有主动脉夹层、处于获得主动脉夹层的风险中、和/或怀疑患有主动脉夹层的受试者，优选人受试者。如本文使用的，术语“健康人”指未患有主动脉夹层，优选未患有心血管疾病，更优选根本没有患有任何疾病的个人。[0052]如本文使用的，术语“试剂盒”指根据本发明执行诊断样品中的主动脉夹层的方法所必需的一组试剂。在一个实施方案中，本发明的试剂盒是这样的试剂盒，其包含执行本发明的方法，例如使用elisa、放射免疫测定或基于抗体的蛋白质芯片作为测量方法来执行所述方法所必需的所有组分(除血液样品外)。在一个实施方案中，本发明的试剂盒可以与本发明的现场护理装置一起使用，以在本发明的诊断主动脉夹层的方法中分析患者的血液样品。[0053]如本文使用的，术语“用于检测的试剂或工具”指适合于检测生物标志物，例如聚集蛋白聚糖和/或除聚集蛋白聚糖外的生物标志物的任何试剂或工具。在一个实施方案中，所述生物标志物的蛋白质水平使用试剂或工具进行检测，所述试剂或工具是抗体、抗原结合肽如fab片段、scfv片段、双抗体和fab2片段或适体中的任一种。在一个实施方案中，所述生物标志物的核酸水平使用作为探针和引物中的任一种的试剂或工具进行检测。[0054]如本文使用的，术语“现场护理装置”指在患者护理场所处或附近用于医学诊断测试的装置。在一个实施方案中，现场护理装置用于分析患者的血液样品。在一个实施方案中，现场护理装置用于分析血液样品，例如全血样品、血清样品或血浆样品。在一个实施方案中，在用现场护理装置执行的单次测量中分析的血液体积小于1 ml，优选小于500 μl的血液，更优选小于100 μl的血液。在一个实施方案中，用本发明的现场护理装置执行的分析的结果可在分析开始后快至5小时内，优选在3.5小时内，更优选在60分钟内获得。在一个实施方案中，现场护理装置易于操作以及便于携带，并且可以在移动重症监护室内使用。[0055]如本文使用的，术语“样品入口”涉及用于使样品与用于执行诊断主动脉夹层的方法的现场护理(poc)装置接触的入口。在一个实施方案中，样品入口使用毛细力，以使怀疑患有主动脉夹层的患者的样品与poc装置接触。在一个实施方案中，样品入口借助于注射、浸渍、吸收、压力、充气不足、真空和/或毛细力中的任一种接收血液样品。在一个实施方案中，样品入口接收怀疑患有主动脉夹层的患者的血液样品，并将其传输到poc装置的分析单元。[0056]如本文使用的，术语“分析单元”指能够通过测量生物标志物例如聚集蛋白聚糖的水平来分析样品的单元。[0057]如本文使用的，术语“评估单元”指包括检测器的单元，所述检测器能够检测用分析单元执行的生物标志物分析的结果。在一个实施方案中，评估单元检测聚集蛋白聚糖水平，任选地进一步检测除聚集蛋白聚糖外的生物标志物的水平，并且给出所述检测的结果作为输出信号。在一个实施方案中，分析单元和评估单元可以包括在一个单元中和/或是能够执行这两种功能的一个单元。[0058]如本文使用的，术语“检测器”指能够检测用以下中的任一种执行的生物标志物水平的分析结果的模块：elisa、pcr、qpcr、流式细胞术、质谱法、基于抗体的蛋白质芯片、二维凝胶电泳、蛋白质印迹、蛋白质免疫沉淀、放射免疫测定、配体结合测定和液相层析。在一个实施方案中，检测器生成指示生物标志物水平的输出信号。[0059]如本文使用的，术语“输出信号”指的是指示聚集蛋白聚糖水平和/或除聚集蛋白聚糖外的生物标志物水平的分析结果的信号。附图说明[0060]本发明现在通过参考下述附图进行进一步描述。[0061]下文附图描述中提到的所有方法都如实施例中详细描述地进行。[0062]图1显示了不同手术活组织检查中的基因表达。skel：骨骼肌(n=5)，fat：皮下脂肪(n=5)，la：左心房(n=5)，aot：来自a型夹层的主动脉(n=6)，aoc：来自冠状动脉旁路移植术的主动脉(n=6)，v：大隐静脉(n=5)，ima：胸廓内动脉(n=5)。描绘的是生物标志物候选物透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1 (hapln1)、整联蛋白α-11 (itga11)、骨甘蛋白聚糖(ogn)和stemi患者(n=18)中的acan水平。d)动脉瘤患者(n=13)中的acan水平。e)手术对照(mvr) (●，n=9)、无冠状动脉疾病(n-cad)的对照(◆，n=15)和健康人(■，n=12)中的acan水平。虚线指通过roc分析确定的14.3 ng/ml的最佳鉴别水平。错误分组的样品以灰色指示。acan：聚集蛋白聚糖，ataad：急性胸主动脉夹层，mvr：二尖瓣修复，n-cad：无冠状动脉疾病，roc：接受者操作曲线，stemi：st段抬高型心肌梗塞。[0072]在下文中，参考实施例，给出这些实施例以说明而非限制本发明。实施例[0073]实施例1：通过qrt-pcr分析组织活组织检查中的基因表达在手术过程中获得组织样品，并且立即在液氮中速冻。它们保持在-196℃下，直到进一步使用。根据制造商的建议，使用rneasy plus universal试剂盒(qiagen，hilden，德国)来提取rna。在30ꢀµl的最终体积中，使用m-mlv逆转录酶(100 u)、250 ng随机六聚体引物、10 mm dtt、dntp (各0.5 mm)、15 mm mgcl2、375 mm kcl和250 mm tris‑ꢀhcl ph 8.3，由100 ng总rna合成cdna。使用0.3ꢀµm的每种引物，使用下述条件在quant studio 3 (thermofisher，germering，德国)上执行qrt-pcr分析：95℃ 10分钟，95℃ 15秒和60℃ 1分钟的40个循环。actb (β-肌动蛋白)的表达用于标准化各个样品中的表达水平。对于所有组织类型，除了ao a型(n=6)和ao cabg (n=9)之外，分析了5个活组织检查。分析了下述部位的组织样品：•左心房(la)•骨骼肌(skel. muscle)•皮下脂肪组织(fat)•大隐静脉(vein)•胸廓内动脉(ima)•主动脉(a型夹层) (ao a型)•主动脉(冠状动脉旁路移植术，cabg) (ao cabg/aoc)分析了蛋白质组学研究中检测到的生物标志物候选物的基因表达。图1显示了生物标志物候选物骨甘蛋白聚糖(ogn)、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1 (hapln1)、整联蛋白α-11 (itga11)和聚集蛋白聚糖(acan)的rna表达数据。与其它组织类型相比，这四种生物标志物候选物显示了在衍生自患有a型夹层的患者的主动脉组织(ao a型)中增加的表达。β-肌动蛋白用作对照管家基因。goi=目的基因。[0074]蛋白质组学研究中检测到的25种生物标志物候选物除ogn、hapln1、itga11和acan外的生物标志物候选物并未显示主动脉特异性rna表达。[0075]实施例2：血液样品中的生物标志物的评估分析了是否可能在患有a型主动脉夹层的患者的血液样品(例如血浆或血清)中检测四种鉴定的生物标志物候选物，即ogn、lpyd、itga11和acan、或其片段或代谢产物。分析了各种受试者群体的手术前获得的血浆样品。特别地，elisa实验用来自四个患者组和一个对照组的样品执行。[0076]如下根据制造商的说明书，使用酶联免疫吸附测定试剂盒(cloud-clone corporation，katy，tx)，确定血浆样品中的聚集蛋白聚糖浓度。将acan标准品或血浆(各100ꢀµl)移液到每个孔内，并且在37℃下温育1小时。吸出上清液，并且加入100ꢀµl检测试剂a，并且使样品在37℃下温育1小时。样品用300ꢀµl洗涤溶液洗涤3次，加入100ꢀµl检测试剂b，并且使样品在37℃下在黑暗中温育30分钟。样品用300ꢀµl洗涤溶液洗涤3次，并且加入90ꢀµl tmb底物溶液。使样品在37℃下在黑暗中温育10至20分钟。其后，向每个孔中加入50ꢀµl终止溶液，并且在elisa阅读器中确定od 450nm。[0077]关于组3和组4，仅确定了聚集蛋白聚糖。除了使用的样品之外，实验1和实验2遵循相同的实验方案执行。[0078]组1：患有急性a型主动脉夹层的患者借助于计算机断层扫描，对于该组患者诊断了急性a型主动脉夹层。实验1：n=14；实验2：n=15。[0079]组2：患有孤立性二尖瓣关闭不全的患者该组患者患有孤立性二尖瓣关闭不全，而无其它严重疾病。分析了该组的手术前获得的样品。该组充当对照组。实验1：n=10。[0080]组3：患有主动脉的真性动脉瘤的患者该组患者患有主动脉的真性动脉瘤，而无主动脉夹层。该组患者没有主动脉的急性、组织创伤性破裂。分析了该组的手术前获得的样品。该组充当对照组。实验1：n=7。[0081]组4：具有在心房颤动中的心房外科冷冻消融术的患者该组患者(实验2：n=5)患有以心房颤动形式的节律障碍，所述心房颤动通过其中选择性地破坏心房心肌的实质性区域的外科冷冻消融术进行治疗。分析了该组的手术后获得的样品，即在入住重症监护室时获得的样品。该组充当对照组。[0082]组5：健康受试者该对照组由没有心血管疾病的健康受试者组成。实验1：n=7；实验2：n=5。[0083]测量了四种最有希望的生物标志物候选物(即acan、ogn、lpyd和itga11)的血浆水平。图2显示了在组1、组2和组5的血浆中测量的各自生物标志物候选物的血浆水平。使用elisa在组1中特异性地检测到显著增加的acan浓度。ogn和lpyd也显示了在组1中显著增加的浓度。关于itga11并未检测到显著差异。[0084]此外，使用elisa关于acan的血浆水平分析了组3和组4。与组3相比，患有a型主动脉夹层的患者(组1)的样品也显示了增加的acan浓度。在具有外科冷冻消融术的患者的组4中检测到显著增加的血浆浓度，其中在手术中发生了所需的严重心房损伤。特别地，组4 (maze)显示了与ctrl相比增加到约9.9倍、以及与ao a型相比增加到约2.1倍的acan水平(图3)。该组中增加的acan浓度可能与心房损伤、在手术期间的心肺机使用或手术本身的创伤有关。[0085]实施例3：测定间比较使用11个患者的组1样品的acan血浆浓度的重复分析允许实验1和2的直接测定间比较。图4显示了关于acan的血浆浓度增加的类似结果。因此，用于执行实验的elisa试剂盒允许acan浓度的可靠和可重复确定。图5显示了实验1和2的平均值，即与组5相比，组1中的acan血浆浓度的平均增加。[0086]实施例4：材料和方法血液样品和活组织检查收集了ataad患者(n=33)的血液样品。样品在入院后直接抽取，并且在4℃下以2,000 x g离心10分钟。将血浆分成200 μl等分试样，并且在入院后的30分钟内立即贮存于-80℃下直至进一步使用。来自所有其它实验队列的血浆样品由german heart center munich供应。人活组织检查(骨骼肌、脂肪组织、左心房、来自ataad或冠状动脉旁路移植术患者的主动脉组织、大隐静脉和胸廓内动脉)在外科手术过程中获得，直接快速冷冻并贮存于液氮中直至进一步使用。[0087]通过qrt-pcr评价人活组织检查中的基因表达使用ultraturrax miccra d-8 (art moderne labortechnik，müllheim，德国)，将冷冻的活组织检查在900 μl qiazol裂解试剂中匀浆化30秒，并且根据制造商的建议，用rneasy plus universalmini kit (qiagen，hilden，德国)进行处理。在30 μl的最终体积中，用m-mlv逆转录酶(150 u，invitrogen，carlsbad，ca)、随机六聚体引物(375 ng)、dntp (各10 mm)、10 mm dtt和1x第一链缓冲液，在37℃下达50分钟将100 ng总rna逆转录成cdna。酶在70℃下失活15分钟。在quant studio 3 (thermofisher，dreieich，德国)上，使用0.3 μm的每种引物和power sybr green mastermix (thermofisher)，使用下述循环条件执行1 μl cdna的基因特异性扩增：95°ꢀ10分钟以激活taq聚合酶，随后为95℃ 15秒和60℃ 60秒的40个循环。相对基因表达针对作为参考的actb (β-肌动蛋白)表达进行标准化。[0088]通过elisa测量血浆样品中的acan、ogn和itga11根据制造商的说明书，商购可得的elisa试剂盒用于确定血浆样品中的聚集蛋白聚糖(acan) (目录号seb908hu，cloud clone corp.，katy，tx)、骨甘蛋白聚糖(ogn) (目录号lsf22608，lifespan biosciences inc.，seattle，wa)和整联蛋白α11 (itga11) (目录号csbel011863hu，cusabio，houston，tx)的浓度。简言之，使所有组分和样品达到室温，并且加入100 μl未稀释的血浆样品，进行处理并在450 nm处读取板。在每个测定中，包括标准曲线以确定各个样品中的浓度。[0089]统计分析通过曼-惠特尼秩和检验或单因素anova检验来确定基因表达的差异。通过威尔科克森-曼-惠特尼检验、kruskal wallis或单因素anova检验，估计多个组的acan蛋白质浓度方面的差异显著性。在所有情况下，p值《 0.05被视为显著的。适当时，值呈现为平均值±平均值的标准误差(sem)、95%置信区间(ci)和倍数变化。[0090]实施例5：诊断急性a型主动脉夹层的候选基因的选择本发明人先前鉴定了在人心脏的主动脉中的8,699种蛋白质。为了限制可能的生物标志物候选物的数目，本发明人执行了两种方法。首先，本发明人选择了最丰富表达，但不一定局限于主动脉组织的蛋白质。其次，本发明人选择了与所有其它十五个心脏区域相比，在主动脉组织中优先表达的蛋白质。遵循这些预选标准，本发明人限定了23种潜在候选者的列表(图6a)。查看跨越人心脏的16个区域的候选标志物的蛋白质表达，几种候选标志物显示了在主动脉和冠状动脉中的高表达，提示它们作为用于脉管系统的有希望的标志物。图6b中显示了acan蛋白质的浓度，acan蛋白质为对于跨越人心脏的所有16个区域的动脉血管具有高特异性的有希望的候选物。接下来，本发明人确定了与来自冠状动脉旁路术患者的主动脉组织相比，来自ataad患者的主动脉组织中的所有候选物的mrna表达。此外，本发明人测量了左心房组织、静脉血管和动脉血管中的mrna，并且本发明人分析了心外组织如脂肪和骨骼肌中的表达。图1显示了四种候选基因的表达：hapln1 (透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1)、itga11 (整联蛋白α-11)、ogn (骨甘蛋白聚糖)和acan (聚集蛋白聚糖)。在所有情况下，mrna丰度在来自ataad患者的主动脉中是最高的，并且它显著不同于来自冠状动脉旁路移植术患者的主动脉组织(图1)。[0091]实施例6：acan蛋白质浓度在患有急性a型主动脉夹层的患者的血浆中是增强的关于蛋白质和基因表达的数据促使本发明人确定在到达医院后直接获得的ataad患者的血浆样品中的acan、ogn和itga11的蛋白质浓度。为了比较，本发明人分析了健康志愿者和经历微创的孤立二尖瓣修复(mvr)的患者的血浆。事实上，与两个对照组相比，acan水平是显著升高的，具有高3至4倍的浓度(图2)。平均血浆acan水平为50.16±5.43 ng/ml。健康受试者(对照组)和mvr组的平均血浆水平分别为10.33±1.42 ng/ml和11.92±1.77 ng/ml。与分别为17.65±2.58 ng/ml和18.75±2.65 ng/ml的对照和mvr样品相比，ogn水平在ataad样品中也是显著增强的，具有25.34±ꢀ1.46 ng/ml的平均值。然而，在ataad患者和对照组之间的差异小得多(图2)。相比之下，血浆样品中的itga11值在ataad组中是最低的，为5.59±3.79 ng/ml，并且在两个参考组(对照和mvr)中是相似的，为19.31±11.54 ng/μl和22.84±17.88 ng/ml (图2)。因此，acan是诊断ataad的最有希望的候选物。[0092]实施例7：acan血浆水平在患有急性心肌梗塞和动脉瘤的患者中并未增强本发明人进一步解决了升高的acan血浆水平是否对于ataad是特异性的问题。为了进一步证实最初有希望的结果，本发明人增加了ataad患者的数目(n=33)。使用这个扩展的队列，本发明人检测到与平均值为4.45±0.90 ng/ml的来自无症状的慢性升主动主动脉瘤患者的样品相比，ataad患者中的acan血浆水平显著增加到几乎10倍，具有38.59±4.08 ng/ml的平均血浆水平(图7)。本发明人接下来分析了急性st段抬高型心肌梗塞(stemi)患者的acan血浆水平，stemi可能混淆ataad的正确诊断。再次，与显示11.77±1.89 ng/ml的平均值的stemi患者相比，ataad患者的acan蛋白质浓度是明确且显著升高的(图7)。另外，与ataad患者相比，无冠状动脉疾病(n-cad)的患者中的acan蛋白质水平是显著较低的，但与健康对照或stemi患者并无显著不同。n-cad组显示了8.88±1.8 ng/ml的平均值(图7)。健康对照组的平均值为8.05±1.38 ng/ml。因此，与健康对照和具有重要的心脏鉴别诊断(包括mi)的患者相比，ataad患者的循环中的acan蛋白质水平是显著升高的，这支持了acan作为检测ataad的可靠和特异性生物标志物的用途。[0093]实施例8：acan血浆浓度与人口统计参数和ataad严重性的相关本发明人进一步解决了acan释放到循环内是否可能受到基本人口统计参数如性别或年龄的影响的问题。然而，性别和年龄对acan血浆水平均没有显著影响(图8a和b)。女性和男性样品的平均acan血浆水平为36.06±5.74 ng/ml和40.69±5.80 ng/ml。对于年龄相关，ataad样品分成五个年龄组。从年轻到老年组构的五个年龄组的平均acan血浆水平为23.60±6.38 ng/ml、 44.49±7.94 ng/ml、36.63±6.69 ng/ml、41.28±8.37 ng/ml和41.21 ng/ml (图8b)。尽管与其它四个年龄组的平均acan水平相比，第一组(40-49岁)中23.60 ng/ml的相当较低的平均acan水平，但根据p值为0.715的单因素anova检验，所有五个组之间不存在acan血浆水平的统计学显著差异。此外，本发明人考虑了根据de bakey分类的ataad程度是否可以通过血浆中的acan浓度来反映。然而，在de bakey i型和ii型ataad患者之间不存在重大差异(图8c)，平均acan水平为32.79±4.43 ng/ml和36.27±6.51 ng/ml。最后，本发明人确立了acan水平的动力学以及在ataad症状发作与血液样品抽取之间的时间段。acan水平在发作后长达72小时保持明确升高，在任何时间点没有重大差异(图8d)。按递增次序的五个时间点的acan血浆水平为43.2±10.84 ng/ml、34.0±6.67 ng/ml、35.3±9.06 ng/ml、53.2±12.39 ng/ml和47.1±9.03 ng/ml (p=0.709)。[0094]实施例9：acan以高特异性和灵敏度检测急性a型主动脉夹层本发明人接下来评估了ataad患者的血浆样品中的临床mi生物标志物ck-mb和ctnt的水平。对于这两种标志物，在绝大多数样品中，值保持低于限定心肌细胞损伤的确立的临床参考极限(图9a和c)。另外，未观察到acan和ck-mb (图9b)或ctnt (图9d)的血浆水平之间的相关性。心肌酶水平高于确立的临床阈值的所有ataad样品经受主动脉根部的牵涉，伴随冠状动脉口的推测连续变窄或阻塞。因此，ataad患者的外周循环中的acan增加显然完全不依赖于ck-mb和ctnt两者而发生。关于所有ataad患者(n=33)相对于所有对照受试者(n=63)的接受者操作特征(roc)曲线分析的曲线下面积为0.947 (图10a)。基于roc曲线分析，血浆中14.3 ng/ml的acan浓度是最佳鉴别极限，导致97%的灵敏度和81%的特异性。仅一个ataad样品显示了低于此阈值的acan浓度(图10b)。分析患有心脏并发症(stemi或动脉瘤，图10c和d)的患者中的acan水平显示了多于80%的特异性。另外，在不同的实验对照组(图10e)中获得了相似的特异性。因此，数据明确地显示了acan作为血浆样品中的可靠生物标志物以高灵敏度和特异性检测ataad的潜力。[0095]实施例10：讨论ataad患者经常因伴随的共病而住院，所述共病掩盖了ataad的诊断并使其复杂化，需要可靠的生物标志物的高特异性。本发明人已测量了ataad患者的外周血中的acan水平。数据明确地显示了，与健康个体和患有不同心血管疾病的患者的血浆样品相比，acan浓度在ataad患者的血浆中是显著增加的。基于roc曲线分析，ataad患者中的acan水平高于14.3 ng/ml的计算阈值。相比之下，绝大多数mi患者的acan血浆水平保持低于该值。另外，胸升主动脉的动脉瘤改变也并不导致增加的acan血浆水平。因此，该研究可以明确地排除acan作为动脉瘤性胸主动脉疾病的可能筛查标志物。总之，因此可以说第二心血管诊断并不影响血浆中的acan水平用于ataad的特异性诊断。基本人口统计参数(年龄、性别)、疾病程度以及ataad的发作和住院之间的时间并不影响外周acan水平，提示了仅ataad的创伤事件将导致acan释放。当考虑所有实验对照组时，基于roc曲线分析，跨越ataad患者、健康先证者和具有其它心血管诊断(mvr、n-cad)的患者的队列，应用14.3 ng/ml的最佳鉴别极限，产生多于97%的特异性和81%的灵敏度。即使当本发明人集中于临床患者并排除健康人时，本发明人仍以》81%的灵敏度结束。钙调理蛋白和d-二聚体已被提议为ataad中的诊断工具。将上述结果与这两种标志物进行比较，本发明人发现acan区分ataad和mi的优越特异性(≈ 73%)。重要的是，acan水平与ck-mb或ctnt浓度并不相关联。因此，acan与这些标志物的组合可能有益于进一步增加灵敏度。因此，在紧急情况下ataad和mi标志物的组合使用应该促使主治医生运行适当的、更具侵入性和耗时的诊断测试用于最终确认。因此，将防止不必要的治疗延误。钙调理蛋白水平在ataad中增加，但在发作后超过12小时降低。相比之下，在到达医院后，acan水平保持升高，并且在ataad发作后长达72小时内基本上并不改变。当ataad在该时间段之前发生时，这可能尤为关键。将acan的性能与现有的标志物例如d-二聚体和钙调理蛋白进行比较，明确地强调了acan的优越性。[0096]总之，本发明人已将acan血浆水平鉴定为检测ataad存在的可靠生物标志物。这种标志物以非常灵敏的方式可靠地检测到ataad患者。同时，该生物标志物显示了令人满意的特异性，其并未被mi的存在混淆。[0097]参考文献[1] cikach等人，massive aggrecan and versican accumulation in thoracic aortic aneurysm and dissection； jci insight. 2018；3 (5):e97167. https://doi.org/10.1172/jci.insight.97167。[0098]在说明书、权利要求和/或附图中公开的本发明的特征可以分开地和以其任何组合成为用于以其各种形式实现本发明的材料。









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