合成的腺相关病毒反向末端重复及其用作启动子的方法

有机化合物处理,合成应用技术145的位置处的itr2或itr3的d区的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；和/或(v)其中一个或多个切口茎环中的至少一个包含在对应于核苷酸位置4的位置处的g取代、和/或在对应于核苷酸位置122的位置处的c取代(例如，c4g和/或g122c)，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列。8.本发明的第二个方面提供了包含至少一个合成腺相关病毒(aav)反向末端重复(itr)的多核苷酸，其中所述itr包含：(a) aav rep结合元件(rbe)；(b) b环；(c) c环；(d)一个或多个切口茎环；(e) d区；(f) aav末端解离序列；以及(g) aav rbe'元件；其中(a)-(g)来自并非aav1或aav6的任何aav血清型，并且(i)其中rbe'元件包含在对应于核苷酸位置73至75的位置处的非互补环tct序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(ii)其中b环包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置43-61的位置处的itr1或itr6 (即，aav1或aav6的itr)的b环的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iii)其中c环包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置65-83的位置处的itr1或itr6的c环的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iv)其中d区包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置125-145的位置处的itr1或itr6的d区的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；和/或(v)其中一个或多个切口茎环中的至少一个包含在对应于核苷酸位置4的位置处的c取代、和/或在对应于核苷酸位置122的位置处的g取代(例如，g4c和/或c122g)，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列。9.本发明的另外方面涉及包含本发明的多核苷酸的载体、重组aav颗粒和嵌合aav颗粒。10.本发明的另一个方面提供了在细胞中转录异源核苷酸序列的方法，其包括将本发明的多核苷酸引入细胞内。11.本发明的另一个方面提供了将核酸递送至细胞的方法，其包括将本发明的重组aav颗粒引入细胞内。12.本发明的一个另外方面提供了产生重组aav颗粒的方法，其包括在足以使重组aav模板复制和包装的条件下，向允许aav复制的细胞提供：(a)重组aav模板，其包含(i)异源核酸，和(ii)本发明的合成itr；以及(b)包含rep编码序列和cap编码序列的多核苷酸；由此在细胞中产生重组aav颗粒。13.本发明的一个另外方面提供了产生重组aav颗粒的方法，其包括在足以使重组aav模板复制和包装的条件下，向允许aav复制的细胞提供：(a)重组aav模板，其包含(i)异源核酸，和(ii)来自任何aav血清型的野生型itr或本发明的合成itr；以及(b)包含rep编码序列和cap编码序列的多核苷酸，其中所述rep和cap编码序列来自不同的aav血清型；由此在细胞中产生重组aav颗粒。14.本发明的另一个方面提供了向哺乳动物受试者施用核酸的方法，其包括向哺乳动物受试者施用已在足以使aav颗粒载体基因组进入细胞的条件下，与本发明的重组aav颗粒接触的细胞。15.本发明的另一个方面提供了向哺乳动物受试者施用核酸的方法，其包括向哺乳动物受试者施用本发明的重组aav颗粒。16.本发明的一个进一步方面提供了相对于野生型(例如，未修饰的) itr，增强腺相关病毒(aav)反向末端重复(itr)的启动子功能的方法，其中所述itr包含：(a) aav rep结合元件(rbe)；(b) b环；(c) c环；(d)一个或多个切口茎环；(e) d区；(f) aav末端解离序列；以及(g) aav rbe'元件；其中(a)-(g)来自并非aav2或aav3的任何aav血清型，所述方法包括取代下述中的一种或多种：(i)在对应于核苷酸位置73至75的位置处的非互补环ttt序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(ii)与在对应于核苷酸位置43-61的位置处的itr2或itr3 (即，分别为aav2或aav3的itr)的b环的核苷酸序列具有80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iii)与在核苷酸位置65-83处的itr2或itr3的c环的核苷酸序列具有80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iv)与在核苷酸位置125-145处的itr2或itr3的d区的核苷酸序列具有80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；和/或(v)在核苷酸位置4处的g取代和/或在核苷酸位置122处的c取代(例如，c4g和/或g122c)，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列。17.本发明的一个进一步方面提供了相对于野生型(例如，未修饰的) itr，减少腺相关病毒(aav)反向末端重复(itr)的启动子功能的方法，其中所述itr包含：(a) aav rep结合元件(rbe)；(b) b环；(c) c环；(d)一个或多个切口茎环；(e) d区；(f) aav末端解离序列；以及(g) aav rbe'元件；其中(a)-(g)来自并非aav1或aav6的任何aav血清型，所述方法包括取代下述中的一种或多种：(i)在对应于核苷酸位置73至75的位置处的非互补环tct序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(ii)与在核苷酸位置43-61处的itr1或itr6 (即，aav1或aav6的itr)的b环的核苷酸序列具有80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iii)与在核苷酸位置65-83处的itr1或itr6的c环的核苷酸序列具有80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iv)与在核苷酸位置125-145处的itr1或itr6的d区的核苷酸序列具有80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；和/或(v)在核苷酸位置4处的c取代和/或在核苷酸位置122处的g取代(例如，g4c和/或c122g)，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列。18.本发明的这些及其它方面在下文阐述的本发明的描述中更详细地阐述。附图说明19.图1a-1c显示了来自血清型1-4、6和7的aav itr的序列和结构的图解。图1a显示了aav2 itr (“itr2”) (seq id no:1)的图解，其中rep结合元件(rbe)和rbe’为粗体。末端解离切口位点tt二核苷酸为红色。图1b显示了共有itr序列(seq id no:7)的图解。itr序列1-4、6-7之间的核苷酸差异的定位以红色突出显示。红色核苷酸为iupac代码，其中y是c或t，r是a或g，s是g或c，w是a或t，k是g或t，m是a或c，b是g或t或c，v是g或c或a，且n是任何核苷酸。彩色轮廓指示itr中的a (黑色)、b (蓝色)、c (灰色)和d (绿色)区域。图1c显示了itr 1 (seq id no:2)、3 (seq id no:3)、4 (seq id no:4)、6 (seq id no:5)和7 (seq id no:6)的序列和结构的图解。粗体字母指示itr序列之间的非保守核苷酸。20.图2a-2g显示了来自用aav (1-4、6-7)/2ꢀ–ꢀitr-萤光素酶载体感染的细胞系的萤光素酶活性的图。图2a显示了用aav2/2-itr-萤光素酶或aav2/2-cba-萤光素酶以1e5 vg/细胞感染的hek293细胞的图。感染后2天，使细胞裂解并且使用萤光素底物测量萤光素酶活性。所显示的值是原始rlu。图2b-2d显示了用aav1/2-itr-萤光素酶、aav2/2-itr-萤光素酶或aav7/2-itr-萤光素酶以2e5 vg/细胞感染的指示细胞系的图。感染后2天，使细胞裂解并且使用萤光素底物测量萤光素酶活性。使rlu值针对加入萤光素酶测定中的总细胞蛋白(如通过bca测量的)进行标准化，然后使所有值针对itr2进行标准化。每种aavn/2-itr-萤光素酶以一式三份的分批制备，一起滴定，然后一式三份地感染细胞。图2e-2f显示了用aav1/2-itr-萤光素酶、aav2/2-itr-萤光素酶、aav3/2-itr-萤光素酶、aav4/2-itr-萤光素酶或aav6/2-itr-萤光素酶以2e5 vg/细胞感染的指示细胞系的图。感染后2天，使细胞裂解并且使用萤光素底物测量萤光素酶活性。使rlu值针对加入萤光素酶测定中的总细胞蛋白(如通过bca测量的)进行标准化，然后使所有值针对itr2进行标准化。每种aavn/2-itr-萤光素酶以一式三份的分批制备，一起滴定，然后一式三份地感染细胞。p值指示为* 《 0.0001、# 《 0.001和^ 《 0.01。21.图3显示了来自用aav1/1和aav2/1ꢀ–ꢀitr-萤光素酶载体感染的hek293细胞的萤光素酶活性的图。hek293细胞用aav1/1、aav2/1、aav1/2或aav2/2-itr-萤光素酶载体的三个生物学重复以2e5 vg/细胞一式三份进行感染。感染后2天，使细胞裂解并且使用萤光素底物测量萤光素酶活性。使rlu值针对加入萤光素酶测定中的总细胞蛋白(如通过bca测量的)进行标准化，然后使所有值针对每个衣壳组内的itr2值进行标准化(即，aav1/1和aav2/1针对aav2/1进行标准化。aav1/2和aav2/2针对aav2/2进行标准化)。在aav1/1相对于aav1/2之间不存在统计学差异。22.图4a显示了来自促进萤光素酶mrna的itr1-4、6或7 (seq id no:1-6)的转录起始位点(tss)的图解。hek293细胞用aav (1-4、6或7)/2-itr-萤光素酶以2e5 vg/细胞进行感染，并且在感染后3天收获总rna。使用萤光素酶特异性引物使rna逆转录。通过ngs分析最终的cdna产物。黑色箭头指示具有1%或更高的读取序列的tss。rbe'和rbe以粗体指示。trs以红色指出。23.图4b显示了指示itr2 (seq id no:1)中推定的转录因子结合位点的图解。24.图4c显示了鉴定来自促进mrna的itr2 (seq id no:1)或itr7 (seq id no:6)的转录起始位点的示意图。hek293细胞用aav2/2 (上)或aav7/2-itr-萤光素酶(下)进行感染，并且在感染后3天收获总rna。使用萤光素酶特异性引物使rna逆转录。通过下一代测序分析最终的cdna产物。箭头指示tss，箭头上方的数字指示可以追溯到该位点的转录物数目。25.图5a-5b显示了萤光素酶测定的图像。来自用aav (1-4、6)/9-itr-cre重组酶注射的小鼠的萤光素酶活性，4-6周龄的雄性fvb.129s6(b6)-gt(rosa)26sortm1 (luc)kael/j小鼠用100ꢀµl 1e9 vg的aav (1-4、6)/9-itr-cre重组酶进行注射。在aav注射后3周(图5a)和9周(图5b)，向小鼠i.p.给予100 μl萤光素酶底物，并且记录光子。具体实施方式26.本发明现在将参考附图进行描述，其中显示了本发明的代表性实施方案。然而，本发明可以以不同的形式体现，并且不应被解释为限制于本文阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案，使得本公开内容将是彻底和完整的，并且将本发明的范围完全传达给本领域技术人员。27.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。在本文的本发明描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不预期是本发明的限制。本文提到的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献都通过引用以其整体并入本文。28.定义单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”预期还包括复数形式，除非上下文另有明确说明。29.此外，如本文使用的，当指可测量的值例如多核苷酸或多肽序列的长度、剂量、时间、温度等等的量时，术语“约”意欲涵盖指定量±ꢀ20%、±ꢀ10%、±ꢀ5%、±ꢀ1%、±ꢀ0.5%或甚至±ꢀ0.1%的变化。30.还如本文使用的，“和/或”指且涵盖相关列出项中的一个或多个的任何和所有可能的组合，以及当以替代方案(“或”)解释时的组合缺乏。31.除非上下文另有说明，特意地预期本文描述的本发明的各种特征可以以任何组合使用。32.此外，本发明还考虑了在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征组合。33.为了进一步说明，例如，如果说明书指示特定氨基酸可以选自a、g、i、l和/或v，则该措辞还指示氨基酸可以选自这些氨基酸的任何子集，例如a、g、i或l；a、g、i或v；a或g；仅l；等，如同每个此类子组合在本文中明确阐述一样。此外，此类措辞还指示可以放弃指定氨基酸中的一种或多种。例如，在特定实施方案中，氨基酸不是a、g或i；不是a；不是g或v；等，如同每种此类可能的放弃在本文中明确阐述一样。34.如本文使用的，术语“减少”、“降低”、“下降”和类似术语意指至少约5%、10%、15%、20%、25%、35%、50%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、100%或更多的降低。35.如本文使用的，术语“增强”、“增加”、“强化”和类似术语指示至少约10%、20%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更多的增加。36.如本文使用的，术语“多肽”涵盖肽和蛋白质两者，除非另有说明。37.如本文使用的，“多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”是核苷酸碱基的序列，并且可以是rna、dna或dna-rna杂合序列(包括天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸两者)，但在代表性实施方案中，是单链或双链dna序列。38.如本文使用的，“分离的”多核苷酸(例如，“分离的dna”或“分离的rna”)意指与天然存在的生物或病毒的至少一些其它组分(例如通常发现与多核苷酸缔合的细胞或病毒结构组分或者其它多肽或核酸)至少部分分开的多核苷酸。在代表性实施方案中，与原材料相比，“分离的”核苷酸富集至至少约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多倍。39.同样地，“分离的”多肽意指与天然存在的生物或病毒的至少一些其它组分(例如通常发现与多肽缔合的细胞或病毒结构组分或者其它多肽或核酸)至少部分分开的多肽。在代表性实施方案中，与原材料相比，“分离的”多肽富集至至少约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多倍。40.如本文使用的，“分离”或“纯化”(或语法等价物)病毒载体意指病毒载体与原材料中的至少一些其它组分至少部分分开。在代表性实施方案中，与原材料相比，“分离的”或“纯化的”病毒载体富集至至少约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多倍。41.如本文使用的，术语“嵌合体”、“嵌合的”和/或“融合蛋白”指通过有意的人为设计非天然生成的氨基酸序列(例如，多肽)，除了其它组分外，其包含任选地连接到其它氨基酸区段(融合蛋白)的目的蛋白质和/或其修饰变体和/或活性片段(“主链”)的氨基酸序列，其中所述目的蛋白质包含来自不同的野生型参考序列(嵌合体)的修饰(例如，取代例如单一残基和/或氨基酸残基的邻接区域)。设计蛋白质的不同组分可以提供不同和/或组合的功能。设计蛋白质的结构和功能组分可以从不同和/或多种来源材料掺入。设计蛋白质可以外源递送至受试者，其中与相应的内源性蛋白质形成对比，它将是外源的。[0042]“治疗性多肽”是可以减轻、减少、预防、延迟和/或稳定起因于细胞或受试者中的蛋白质缺乏或缺陷的症状的多肽或肽，和/或是以其它方式对受试者赋予益处的多肽。[0043]术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”(及其语法变化)意指受试者的状况的严重性减少、至少部分改善或稳定，和/或实现至少一种临床症状的一些减轻、缓和、降低或稳定，和/或在疾病或病症的进展中存在延迟。[0044]术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”(及其语法变化)指相对于在本发明的方法的不存在下出现的情形，受试者中的疾病、病症和/或临床症状发作的预防和/或延迟，和/或疾病、病症和/或临床症状发作的严重性减少。预防可以是完全的，例如疾病、病症和/或临床症状的完全不存在。预防还可以是部分的，使得受试者中的疾病、病症和/或临床症状的出现和/或发作的严重性小于在本发明的不存在下出现的情形。[0045]如本文使用的，“治疗有效”、“治疗”或“有效”量是足以对受试者提供一些改善或益处的量。可替代地陈述，“治疗有效”、“治疗”或“有效”量是提供受试者中的至少一种临床症状的一些减轻、缓和、降低或稳定的量。本领域技术人员将了解，疗效无需是完全或治愈的，只要对受试者提供一些益处即可。[0046]如本文使用的，“预防有效”量是相对于在本发明的方法的不存在下出现的情形，足以预防和/或延迟受试者中的疾病、病症和/或临床症状的发作，和/或减少和/或延迟受试者中的疾病、病症和/或临床症状发作的严重性的量。本领域技术人员将了解，预防水平无需是完全的，只要对受试者提供一些益处即可。[0047]术语“异源核苷酸序列”、“异源核酸”或“异源核酸分子”在本文中可互换使用，并且指病毒中并非天然存在的序列。一般地，异源核酸包含编码目的多肽或非翻译rna (例如，用于递送至细胞或受试者)的开放读码框。[0048]如本文使用的，术语“病毒载体”、“载体”或“基因递送载体”指病毒(例如，aav)颗粒，其充当核酸递送媒介物并且包含在病毒粒子内包装的载体基因组(例如，病毒dna [vdna])。可替代地，在一些背景下，术语“载体”可以用于指单独的载体基因组/vdna。[0049]如本文使用的，当提及病毒时，术语“载体”、“颗粒”和“病毒粒子”可以互换使用。[0050]本发明的病毒载体可以进一步是双链体aav颗粒，如国际专利公开wo 01/92551 (其公开内容通过引用以其整体并入本文)中所述。因此，在一些实施方案中，可以包装双链(双链体)基因组。[0051]如本文使用的，术语“腺相关病毒”(aav)包括但不限于aav 1型、aav 2型、aav 2.5型、aav3型(包括3a和3b型)、aav4型、aav5型、aav6型、aav7型、aav8型、aav9型、aav10型、aav11型、禽类aav、牛aav、犬aav、马aav、绵羊aav、进化枝faav以及目前已知或以后发现的任何其它aav。参见例如，bernardn.fields等人，virology，第2卷，第69章(第4版，lippincott-ravenpublishers)。已鉴定了许多相对新的aav血清型和进化枝(参见表1)。[0052]各种aav血清型的基因组序列，以及天然末端重复(tr)、rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。此类序列的示例性但非限制性实例可以在文献或公共数据库如genbank®数据库中找到。参见例如genbank®数据库登录号nc_002077.1、nc_001401.2、nc_001729.1、nc_001863.1、nc_001829.1、nc_006152.1、nc_001862.1、af513851.1、af513852.1，其公开内容通过引用并入本文用于教导细小病毒和aav核酸序列和氨基酸序列。还参见例如srivistava等人(1983)j.virology45:555；chiorini等人(1998)j.virology71:6823；chiorini等人(1999)j.virology73:1309；bantel-schaal等人(1999)j.virology73:939；xiao等人(1999)j.virology73:3994；muramatsu等人(1996)virology221:208；shade等人(1986)j.virol.58:921；gao等人(2002)proc.nat.acad.sci.usa99:11854；国际专利公开wo00/28061、wo99/6160和wo98/11244；以及美国专利号6,156,303；其公开内容通过引用并入本文用于教导细小病毒和aav核酸序列和氨基酸序列。[0053]bernardn.fields等人，virology，第2卷，第69和70章(第4版，lippincott-ravenpublishers)中更详细地描述了自主细小病毒和aav的衣壳结构。还参见aav2(xie等人(2002)proc.nat.acad.sci.99:10405-10)、aav4(padron等人(2005)j.virol.79：5047-58)、aav5(walters等人(2004)j.virol.78：3361-71)、以及cpv(xie等人(1996)j.mol.biol.6:497-520和tsao等人(1991)science251：1456-64)的晶体结构的描述。[0054]“raav载体基因组”或“raav基因组”是包含一个或多个异源核酸序列的aav基因组(即，vdna)。raav载体一般仅需要顺式的145碱基的反向末端重复(itr)，以生成病毒。通常，raav载体基因组仅保留一个或多个itr序列，以便使可以由载体有效包装的转基因的大小达到最大。结构蛋白和非结构蛋白编码序列可以反式提供(例如，来自载体例如质粒，或通过将序列稳定地整合到包装细胞内)。在本发明的实施方案中，raav载体基因组包含至少一个itr序列(例如，aavitr序列)，任选两个itr(例如，两个aavitr)，其通常位于载体基因组的5'和3'端处并且侧接异源核酸，但无需与其邻接。itr可以是彼此相同或不同的。[0055]“aav反向末端重复”或“aavitr”可以来自任何aav，包括但不限于血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11或13，蛇aav，禽类aav，牛aav，犬aav，马aav，绵羊aav，山羊aav，虾aav或者目前已知或以后发现的任何其它aav(参见例如表1)。aavitr无需具有天然末端重复序列(例如，天然aavitr序列可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变进行改变)，只要末端重复介导所需的功能，例如复制、病毒包装、持久性和/或原病毒援救等等，并且包含功能所需的结构组分(例如，如图1a-1c中描绘的)。[0056]本发明的病毒载体可以进一步是“靶向”病毒载体(例如，具有定向嗜性)和/或“杂合”aav(即，其中病毒itr和病毒衣壳来自不同的aav)，如国际专利公开wo00/28004和chao等人，(2000)mol.therapy2:619中描述的。[0057]进一步地，病毒衣壳或基因组元件可以含有其它修饰，包括插入、缺失和/或取代。[0058]术语“模板”或“底物”在本文中用于指可以复制以产生aav病毒dna的多核苷酸序列。为了载体生产的目的，模板通常嵌入更大的核苷酸序列或构建体内，所述核苷酸序列或构建体包括但不限于质粒、裸露dna载体、细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)或病毒载体(例如，腺病毒、疱疹病毒、eb病毒、aav、杆状病毒、逆转录病毒载体等等)。可替代地，模板可以稳定地掺入包装细胞的染色体内。[0059]如本文使用的，aavꢀ“rep编码序列”指示编码aav非结构蛋白的核酸序列，所述aav非结构蛋白介导病毒复制和新病毒颗粒的产生。aav复制基因和蛋白质已在例如fields等人virology，第2卷，第69和70章(第4版，lippincott-raven publishers)中进行描述。[0060]“rep编码序列”无需编码所有aav rep蛋白。例如，就aav而言，rep编码序列无需编码所有四种aav rep蛋白(rep78、rep 68、rep52和rep40)，实际上，认为aav5仅表达剪接的rep68和rep40蛋白。在代表性实施方案中，rep编码序列至少编码对于病毒基因组复制和包装成新病毒粒子所需的那些复制蛋白。rep编码序列一般编码至少一种大rep蛋白(即，rep78/68)和一种小rep蛋白(即，rep52/40)。在特定实施方案中，rep编码序列编码aav rep78蛋白和aav rep52和/或rep40蛋白。在其它实施方案中，rep编码序列编码rep68和rep52和/或rep40蛋白。在一个再进一步的实施方案中，rep编码序列编码rep68和rep52蛋白、rep68和rep40蛋白、rep78和rep52蛋白、或rep78和rep40蛋白。[0061]如本文使用的，术语“大rep蛋白”指rep68和/或rep78。本发明的大rep蛋白可以是野生型或合成的。野生型大rep蛋白可以来自任何aav，包括但不限于血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11或13，或者目前已知或以后发现的任何其它aav (参见例如表1)。合成的大rep蛋白可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变进行改变。[0062]本领域技术人员将进一步了解复制蛋白不必由相同的多核苷酸编码。例如，对于aav，p19启动子可能是失活的，并且大rep蛋白由一种多核苷酸表达，而小rep蛋白由不同的多核苷酸表达。然而，通常，从单一构建体表达复制蛋白将是更方便的。在一些系统中，病毒启动子(例如aav p19启动子)可能不被细胞识别，并且因此有必要从分开的表达盒表达大rep蛋白和小rep蛋白。在其它情况下，可能期望分开表达大rep蛋白和小rep蛋白，即在分开的转录和/或翻译控制元件的控制下。例如，可能期望控制大rep蛋白的表达，以便降低大rep蛋白/小rep蛋白的比率。在昆虫细胞的情况下，下调大rep蛋白(例如，rep78/68)的表达以避免对细胞的毒性可能是有利的(参见例如urabe等人，(2002) human gene therapy 13:1935)。[0063]如本文使用的，aavꢀ“cap编码序列”编码形成功能性aav衣壳(即，可以包装dna并感染靶细胞)的结构蛋白。通常，cap编码序列将编码所有的aav衣壳亚基，但可以编码少于所有的衣壳亚基，只要产生功能性衣壳。通常，但不一定，cap编码序列将存在于单一核酸分子上。[0064]aav的衣壳结构在bernard n. fields等人，virology，第2卷，第69和70章(第4版，lippincott-raven publishers)中更详细地描述。[0065]如本文使用的，术语“合成aav itr”指非天然存在的itr，其由于一种或多种缺失、添加、取代或其任何组合，在核苷酸序列上不同于野生型itr，例如aav血清型2 itr (itr2)序列。合成和野生型itr (例如itr2)序列之间的差异可以少至单个核苷酸变化，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、60、70、80、90或100个或更多个核苷酸或其中的任何范围的变化。在一些实施方案中，合成和野生型itr (例如itr2)序列之间的差异可以不多于约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸或其中的任何范围。[0066]本发明提供了包含至少一个aav itr的多核苷酸，其具有期望的特性，并且可以被设计为操纵包含itr的载体的活性以及对该载体的细胞应答。[0067]因此，本发明的一个方面涉及包含至少一个合成腺相关病毒(aav)反向末端重复(itr)的多核苷酸，其中所述itr包含：(a) aav rep结合元件(rbe)；(b) b环；(c) c环；(d)一个或多个切口茎环；(e) d区；(f) aav末端解离序列；以及(g) aav rbe'元件；其中(a)-(g)来自并非aav2或aav3的任何aav血清型，并且(i)其中rbe'元件包含在对应于核苷酸位置73至75的位置处的非互补环ttt序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(ii)其中b环包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置43-61的位置处的itr2或itr3 (即，分别为aav2或aav3的itr)的b环的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iii)其中c环包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置65-83的位置处的itr2或itr3的c环的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iv)其中d区包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置125-145的位置处的itr2或itr3的d区的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；和/或(v)其中一个或多个切口茎环中的至少一个包含在对应于核苷酸位置4的位置处的c或g取代、和/或在对应于核苷酸位置122的位置处的c或g取代(例如，c4g和/或g122c)，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列。[0068] seq id no:1. aav2 itr (itr2) (ncbi参考序列nc_001401.2)ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct例如图1a-1c中描绘的野生型(例如，未修饰的) aav血清型itr包含多重结构特征，包括但不限于a区、rep结合元件(rbe)、rbe'、一个或多个切口茎环、末端解离位点(terminal resolution site，trs)、b环、c环和d区。[0069]itr序列预测为折叠回自身以形成发夹结构，例如包括称为b环和c环的区域(图1a-1b)。itr的a区中的rbe是大rep蛋白(rep78、rep68)的结合位点，其可以在结合rbe后启动基因组复制。这种初始结合帮助解开dna链并形成切口茎，其可由rep在二核苷酸tt末端解离位点(trs)处切割。大rep蛋白还与在c环的尖端处的rbe'区接触(图1a-1b)。[0070]aav itr的rbe序列、末端解离序列和rbe'元件是本领域众所周知的。aav2 itr中的元件显示于图1a中。如本发明的多核苷酸中存在的元件各自可以是如天然存在的aav itr中存在的确切序列，或者可以略微不同(例如，通过不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的添加、缺失和/或取代而不同)，只要元件的功能与当它在天然存在的aav itr中存在时元件的功能并无实质上不同。术语“实质上不同的”在本文中定义为大于50%的功能(例如，转导效率、rep结合、切口)差异。如本文定义的术语rbe、末端解离序列和rbe'元件涵盖全长元件的片段和部分，其提供与当它在天然存在的aav itr中存在时元件的功能并无实质上不同的功能。[0071]在一些实施方案中，本发明的合成itr，例如包含以下的合成itr，可能具有比野生型(例如，未修饰的) aav血清型itr增强的转录功能：(a) aav rbe；(b) b环；(c) c环；(d)一个或多个切口茎环；(e) d区；(f) aav末端解离序列；以及(g) aav rbe'元件；其中(a)-(g)来自并非aav2或aav3的任何aav血清型，并且(i)其中rbe'元件包含在对应于核苷酸位置73至75的位置处的非互补环ttt序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(ii)其中b环包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置43-61的位置处的itr2或itr3 (即，分别为aav2或aav3的itr)的b环的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iii)其中c环包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置65-83的位置处的itr2或itr3的c环的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iv)其中d区包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置125-145的位置处的itr2或itr3的d区的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；和/或(v)其中一个或多个切口茎环中的至少一个包含在对应于核苷酸位置4的位置处的c或g取代、和/或在对应于核苷酸位置122的位置处的c或g取代(例如，c4g和/或g122c)，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列。[0072]本发明的另一个方面提供了包含至少一个合成腺相关病毒(aav)反向末端重复(itr)的多核苷酸，其中所述itr包含：(a) aav rbe；(b) b环；(c) c环；(d)一个或多个切口茎环；(e) d区；(f) aav末端解离序列；以及(g) aav rbe'元件；其中(a)-(g)来自并非aav1或aav6的任何aav血清型，并且(i)其中rbe'元件包含在对应于核苷酸位置73至75的位置处的非互补环tct序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(ii)其中b环包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置43-61的位置处的itr1或itr6 (即，aav1或aav6的itr)的b环的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iii)其中c环包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置65-83的位置处的itr1或itr6的c环的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iv)其中d区包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置125-145的位置处的itr1或itr6的d区的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；和/或(v)其中一个或多个切口茎环中的至少一个包含在对应于核苷酸位置4的位置处的c或g取代、和/或在对应于核苷酸位置122的位置处的c或g取代(例如，g4c和/或c122g)，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列。[0073]在一些实施方案中，所述合成itr，(例如包含以下的合成itr：(a) aav rbe；(b) b环；(c) c环；(d)一个或多个切口茎环；(e) d区；(f) aav末端解离序列；以及(g) aav rbe'元件；其中(a)-(g)来自并非aav1或aav6的任何aav血清型，并且(i)其中rbe'元件包含在对应于核苷酸位置73至75的位置处的非互补环tct序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(ii)其中b环包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置43-61的位置处的itr1或itr6 (即，aav1或aav6的itr)的b环的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iii)其中c环包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置65-83的位置处的itr1或itr6的c环的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iv)其中d区包含核苷酸序列，其与在对应于核苷酸位置125-145的位置处的itr1或itr6的d区的核苷酸序列具有80%序列同一性，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；和/或(v)其中一个或多个切口茎环中的至少一个包含在对应于核苷酸位置4的位置处的c或g取代、和/或在对应于核苷酸位置122的位置处的c或g取代(例如，g4c和/或c122g)，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列)可能具有比野生型(例如，未修饰的) aav血清型itr减少的转录功能。[0074]本发明的合成itr的结构特征(a)-(g)可以来自任何aav血清型，例如但不限于表1的任何aav血清型。在一些实施方案中，本发明的合成itr的(a)-(g)来自相同的aav。在一些实施方案中，本发明的合成itr的(a)-(g)来自不同的aav。本发明的多核苷酸和/或合成itr的产生可以通过引入从另一种aav血清型鉴定(如例如图1a-1c中鉴定)的一些(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等)或所有修饰来进行。并非鉴定为aav itr的特定区域的部分的每一个核苷酸都需要被取代，以产生本发明的合成itr。产生所需功能和/或结构itr性质所必需的取代数目可以通过本领域的普通技术人员，根据本文的教导和根据本领域众所周知的方案容易地确定。此处阐述的核苷酸序列中提供的核苷酸编号基于如本文提供的aav2 (seq id no:1)的itr的未修饰(例如野生型)核苷酸序列。然而，本领域的普通技术人员将容易理解，其它aav血清型itr序列或其它病毒itr序列中的等价核苷酸位置可以容易地鉴定，并且用于本发明的多核苷酸和/或合成itr的产生中，并且可以经由比对进行鉴定，所述比对例如本文在序列节段中公开的以及例如在通过引用并入本文的hewitt等人，2009 j. virol. 83(8):3919-3929中公开的。[0075]在一些实施方案中，本发明的合成itr可以进一步包含另外的非aav顺式元件，例如，启动转录、介导增强子功能、允许在有丝分裂时复制和对称分布、或改变转导基因组的持久性和加工的元件。此类元件是本领域众所周知的，并且包括但不限于启动子、增强子、染色质附着序列、端粒序列、顺式作用微小rna及其组合。在一些实施方案中，本发明的合成itr可以明确地不包含任何另外的非aav顺式元件。例如，在一些实施方案中，本发明的合成itr可以不包含启动子。[0076]在一些实施方案中，本发明的多核苷酸可以进一步包含一个或多个绝缘子序列。如本文使用的，术语“绝缘子序列”指可以抑制和/或以其它方式减弱itr转录活性的序列(例如，itr之外的序列)。绝缘子序列的实例是本领域已知的。[0077]在一些实施方案中，本发明的多核苷酸可以进一步包含异源核苷酸序列(例如，编码序列，例如编码蛋白质或功能性rna)。[0078]已知野生型(例如，未修饰的) aav itr序列包含cpg基序。在一些实施方案中，相对于天然存在的aav itr例如itr2的序列，本发明的合成itr中的一个或多个cpg基序可以被缺失和/或取代。aav itr2含有16个cpg基序。tlr-9与cpg序列基序直接结合并导致细胞先天免疫的激活。亦众所周知的是，cpg基序的甲基化导致转录沉默。itr中的cpg基序的去除可能导致降低的tlr-9识别和/或降低的甲基化，并且从而降低的转基因沉默。[0079]另外，最近的研究已显示了，双链rna (dsrna)可能被dsrna传感器mda5或mavs感知并触发免疫应答，如通过引用以其整体并入本文的shao等人2018 jci insight 3(12):e120474以及faust等人2013 jci 123(7):2994-3001中所述的。尽管不希望受理论约束，但在包含本发明的多核苷酸和/或合成itr的基因治疗的使用期间，itr中的cpg基序的去除/减少可能导致降低的dsrna免疫应答。[0080]在一些实施方案中，至少1个cpg基序，例如至少4个或更多个或者8个或更多个cpg基序，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个cpg基序被缺失和/或取代。如本文使用的，短语“缺失和/或取代”意指cpg基序中的一个或两个核苷酸被缺失、被不同的核苷酸取代、或缺失和取代的任何组合。[0081]本发明还提供了包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸包含本发明的合成itr。病毒载体可以是细小病毒载体，例如aav载体。本发明进一步提供了包含本发明的合成itr的重组细小病毒颗粒(例如重组aav颗粒)。在一些实施方案中，本发明提供了包含来自任何aav血清型的itr或本发明的合成itr的嵌合aav颗粒，其中另外的aav顺式元件(例如rep和/或cap)来自与itr不同的aav血清型。病毒载体和病毒颗粒在下文进一步讨论。[0082]本发明还提供了组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的本发明的病毒载体。[0083]使用方法本发明进一步提供了本发明的多核苷酸、核酸、合成itr、病毒、载体、颗粒和/或组合物的使用方法。[0084]在一个方面，本发明提供了在细胞中转录异源核苷酸序列的方法，其包括将本发明的多核苷酸引入细胞内。[0085]在一些实施方案中，引入细胞内的本发明的多核苷酸可以进一步包含另外的非aav顺式元件，例如，启动转录、介导增强子功能、允许在有丝分裂时复制和对称分布、或改变转导基因组的持久性和加工的元件，例如但不限于启动子、增强子、染色质附着序列、端粒序列、顺式作用微小rna及其组合。在一些实施方案中，引入细胞内的本发明的多核苷酸可以明确地不包含任何另外的非aav顺式元件。在一些实施方案中，引入细胞内的多核苷酸不包含另外的非aav顺式启动子。[0086]进一步提供的是将核酸递送至细胞的方法，其包括将本发明的重组aav颗粒引入细胞内。[0087]本发明的另一个方面提供了产生重组aav颗粒的方法，其包括在足以使重组aav模板复制和包装的条件下，向允许aav复制的细胞提供：(a)重组aav模板，其包含(i)异源核酸，和(ii)本发明的合成itr；以及(b)包含rep编码序列和cap编码序列的多核苷酸；由此在细胞中产生重组aav颗粒。[0088]本发明的另一个方面提供了产生重组aav颗粒的方法，其包括在足以使重组aav模板复制和包装的条件下，向允许aav复制的细胞提供：(a)重组aav模板，其包含(i)异源核酸，和(ii)来自任何aav血清型的野生型itr或本发明的合成itr；以及(b)包含rep编码序列和cap编码序列的多核苷酸，其中所述rep和cap编码序列来自不同的aav血清型；由此在细胞中产生重组aav颗粒。[0089]在一些实施方案中，rep编码序列和cap编码序列不能包装到重组aav颗粒内。[0090]在一些实施方案中，rep编码序列和/或cap编码序列可以由质粒提供。[0091]在一些实施方案中，rep编码序列和/或cap编码序列可以由病毒载体提供。病毒载体可以是本领域已知的任何病毒载体，包括但不限于腺病毒载体、疱疹病毒载体、eb病毒载体和杆状病毒载体。[0092]在一些实施方案中，rep编码序列可以稳定地整合到细胞的基因组内。[0093]在一些实施方案中，cap编码序列可以稳定地整合到细胞的基因组内。[0094]在一些实施方案中，重组aav模板可以由质粒和/或病毒载体提供，或者可以作为原病毒稳定地整合到细胞的基因组内。[0095]进一步提供的是向哺乳动物受试者施用核酸的方法，其包括向哺乳动物受试者施用已在足以使aav颗粒载体基因组进入细胞的条件下，与本发明的重组aav颗粒接触的细胞。靶细胞的非限制性实例包括神经细胞、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰腺细胞、肝细胞、肾细胞、心肌细胞、骨细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞、祖细胞、干细胞、癌细胞和肿瘤细胞。[0096]另外提供的是向哺乳动物受试者施用核酸的方法，其包括向哺乳动物受试者施用本发明的重组aav颗粒。在一些实施方案中，重组aav颗粒可以以约1 x 106 vg/kg至约1 x 1015 vg/kg，例如约1 x 106、1 x 107、1 x 108、1 x 109、1 x 1010、1 x 1011、1 x 1012、1 x 1013、1 x 1014、1 x 1015 vg/kg或者其中的任何值或范围的剂量范围施用于哺乳动物受试者。例如，在一些实施方案中，重组aav颗粒可以以约1 x 106 vg/kg至约5 x 1012 vg/kg、约5 x 1010 vg/kg至约1 x 1015 vg/kg、或约1 x 106 vg/kg、约5 x 108 vg/kg、约5 x 1010 vg/kg、约5 x 1012 vg/kg、或约1 x 1014 vg/kg的剂量范围施用于哺乳动物受试者。[0097]在一些实施方案中，哺乳动物受试者可以是人受试者。[0098]在一些实施方案中，aav颗粒可以通过选自以下的途径进行施用：经口、直肠、经粘膜、经皮、吸入、静脉内、皮下、皮内、颅内、肌内、内皮内、玻璃体内、视网膜下、关节内施用及其任何组合。[0099]在一些实施方案中，aav颗粒可以在选自以下的部位处施用于受试者：肿瘤、脑、骨骼肌、平滑肌、心脏、膈膜、气道上皮、肝、肾、脾、胰腺、皮肤、眼及其任何组合。[0100]在一些实施方案中，与不包含本发明的多核苷酸的aav颗粒相比，哺乳动物受试者可以具有针对aav颗粒减少的免疫应答。[0101]本文进一步提供的是相对于野生型(例如，未修饰的) itr，增强腺相关病毒(aav)反向末端重复(itr)的启动子功能的方法，其中所述itr包含：(a) aav rep结合元件(rbe)；(b) b环；(c) c环；(d)一个或多个切口茎环；(e) d区；(f) aav末端解离序列；以及(g) aav rbe'元件；其中(a)-(g)来自并非aav2或aav3的任何aav血清型，所述方法包括取代下述中的一种或多种：(i)在对应于核苷酸位置73至75的位置处的非互补环ttt序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(ii)与在对应于核苷酸位置43-61的位置处的itr2或itr3 (即，分别为aav2或aav3的itr)的b环的核苷酸序列具有80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iii)与在核苷酸位置65-83处的itr2或itr3的c环的核苷酸序列具有80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iv)与在核苷酸位置125-145处的itr2或itr3的d区的核苷酸序列具有80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；和/或(v)在核苷酸位置4处的g或c取代和/或在核苷酸位置122处的g或c取代(例如，c4g和/或g122c)，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列。[0102]本发明的另一个方面提供了相对于野生型(例如，未修饰的) itr，减少腺相关病毒(aav)反向末端重复(itr)的启动子功能的方法，其中所述itr包含：(a) aav rep结合元件(rbe)；(b) b环；(c) c环；(d)一个或多个切口茎环；(e) d区；(f) aav末端解离序列；以及(g) aav rbe'元件；其中(a)-(g)来自并非aav1或aav6的任何aav血清型，所述方法包括取代下述中的一种或多种：(i)在对应于核苷酸位置73至75的位置处的非互补环tct序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(ii)与在核苷酸位置43-61处的itr1或itr6 (即，aav1或aav6的itr)的b环的核苷酸序列具有80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iii)与在核苷酸位置65-83处的itr1或itr6的c环的核苷酸序列具有80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；(iv)与在核苷酸位置125-145处的itr1或itr6的d区的核苷酸序列具有80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列；和/或(v)在核苷酸位置4处的c取代和/或在核苷酸位置122处的g取代(例如，g4c和/或c122g)，其中所述核苷酸编号基于seq id no:1的核苷酸序列。[0103]在一些实施方案中，在修饰之前的(未修饰的) itr具有高转录活性。[0104]在一些实施方案中，在修饰之前的(未修饰的) itr具有低转录活性。[0105]在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括改变itr内的cpg岛和/或c-g二核苷酸频率(例如，插入一个或多个[例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等或更多个) cpg岛和/或c-g二核苷酸序列，和/或缺失一个或多个[例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等或更多个) cpg岛和/或c-g二核苷酸序列)。尽管不希望受理论约束，但改变cpg和/或c-g二核苷酸频率可以改变合成itr的转录活性。在一些实施方案中，本发明的合成itr具有至少一个或多个gpc和/或c-g二核苷酸序列，并且保留野生型(未修饰的) itr的功能活性。[0106]在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括其中itr双向活性是减弱的并且免疫应答是减轻的。尽管不希望受理论约束，但认为itr双向活性可以增强dsrna识别和免疫应答触发，如通过引用并入本文的shao等人2018 jci insight 3(12):e120474中所述的。[0107]产生病毒载体的方法本发明进一步提供了产生病毒载体的方法。[0108]在一个实施方案中，本发明提供了产生重组aav颗粒的方法，其包括在足以使重组aav模板复制和包装的条件下，向允许aav复制的细胞提供：(a)重组aav模板，其包含(i)异源核苷酸序列，和(ii)本发明的合成itr；(b)包含rep编码序列和cap编码序列的多核苷酸；由此在细胞中产生重组aav颗粒。[0109]足以使重组aav模板复制和包装的条件可以是例如足以使aav模板复制和衣壳化到aav衣壳内的aav序列(例如，aav rep序列和aav cap序列)、以及来自腺病毒和/或疱疹病毒的辅助序列的存在。在特定实施方案中，aav模板包含两个aav itr序列，其定位于异源核酸序列的5'和3'，尽管它们无需与之直接邻接。[0110]在一些实施方案中，重组aav模板包含不被rep解离以制备如国际专利公开wo 01/92551中所述的双链体aav载体的itr。[0111]核酸模板以及aav rep和cap序列在这样的条件下提供，使得在细胞中产生包含在aav衣壳内包装的核酸模板的病毒载体。该方法可以进一步包括从细胞中收集病毒载体的步骤。病毒载体可以从培养基中和/或通过使细胞裂解进行收集。[0112]细胞可以是允许aav病毒复制的细胞。可以采用本领域已知的任何合适的细胞。在特定实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。作为另一个选项，细胞可以是提供从复制缺陷型辅助病毒中缺失的功能的反式互补包装细胞系，例如293细胞或其它e1a反式互补细胞。[0113]aav复制和衣壳序列可以通过本领域已知的任何方法提供。目前的方案通常在单一质粒上表达aav rep/cap基因。aav复制和包装序列无需一起提供，尽管这样做可能是方便的。aav rep和/或cap序列可以由任何病毒载体或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可以由杂合腺病毒或疱疹病毒载体提供(例如，插入缺失的腺病毒载体的e1a或e3区内)。ebv载体还可以用于表达aav cap和rep基因。这种方法的一个优点在于ebv载体是附加型的，但在相继的细胞分裂自始至终将维持高拷贝数(即，作为染色体外元件稳定地整合到细胞内，指定为“基于ebv的核附加体”)。[0114]作为进一步的替代方案，rep/cap序列可以稳定地掺入细胞内。[0115]通常，aav rep/cap序列不由tr侧接，以预防这些序列的援救和/或包装。[0116]可以使用本领域已知的任何方法将核酸模板提供给细胞。例如，模板可以由非病毒(例如，质粒)载体或病毒载体供应。在特定实施方案中，核酸模板由疱疹病毒或腺病毒载体供应(例如，插入缺失的腺病毒的e1a或e3区内)。作为另一个实例，可以使用携带由aav tr侧接的报道基因的杆状病毒载体。如上文关于rep/cap基因所述，ebv载体也可以用于递送模板。[0117]在另一个代表性实施方案中，核酸模板由复制型raav病毒提供。在另外其它实施方案中，包含核酸模板的aav原病毒稳定地整合到细胞的染色体内。[0118]为了增强病毒滴度，可以向细胞提供促进生产性aav感染的辅助病毒功能(例如腺病毒或疱疹病毒)。aav复制所必需的辅助病毒序列是本领域已知的。通常，这些序列由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。可替代地，腺病毒或疱疹病毒序列可以由另一种非病毒载体或病毒载体，例如作为携带促进有效aav产生的所有辅助基因的非感染性腺病毒小质粒提供。[0119]进一步地，辅助病毒功能可以由包装细胞提供，所述包装细胞具有在染色体中嵌入或作为稳定的染色体外元件维持的辅助序列。一般地，辅助病毒序列不能被包装到aav病毒粒子内，例如不由tr侧接。[0120]本领域技术人员将了解，在单一辅助构建体上提供aav复制和衣壳序列以及辅助病毒序列(例如，腺病毒序列)可以是有利的。该辅助构建体可以是非病毒构建体或病毒构建体。作为一个非限制性说明，辅助构建体可以是包含aav rep/cap基因的杂合腺病毒或杂合疱疹病毒。[0121]在一个特定实施方案中，aav rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体供应。该载体可以进一步包含核酸模板。aav rep/cap序列和/或raav模板可以插入腺病毒的缺失区域(例如，e1a或e3区)内。[0122]在一个进一步的实施方案中，aav rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体供应。根据该实施方案，raav模板可以作为质粒模板提供。[0123]在另一个说明性实施方案中，aav rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体供应，并且raav模板作为原病毒整合到细胞内。可替代地，raav模板由ebv载体提供，所述ebv载体作为染色体外元件(例如，作为基于ebv的核附加体)维持在细胞内。[0124]在一个进一步的示例性实施方案中，aav rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助物供应。raav模板可以作为分开的复制型病毒载体提供。例如，raav模板可以由raav颗粒或第二重组腺病毒颗粒提供。[0125]根据前述方法，杂合腺病毒载体通常包含足以使腺病毒复制和包装的腺病毒5'和3'顺式序列(即，腺病毒末端重复和pac序列)。aav rep/cap序列和raav模板(如果存在的话)嵌入腺病毒主链中，并且侧翼为5'和3'顺式序列，使得这些序列可以被包装到腺病毒衣壳内。如上所述，腺病毒辅助序列和aav rep/cap序列一般不由tr侧接，使得这些序列不被包装到aav病毒粒子内。[0126]zhang等人((2001) gene ther. 18:704-12)描述了包含腺病毒以及aav rep和cap基因两者的嵌合辅助物。[0127]疱疹病毒也可以用作aav包装方法中的辅助病毒。编码aav rep蛋白的杂合疱疹病毒可以有利地促进可扩大的aav载体生产方案。例如，通过引用并入本文的pct公开号wo 00/17377已描述了表达aav-2 rep和cap基因的杂合单纯疱疹病毒i型(hsv-1)载体。[0128]作为进一步的替代方案，本发明的病毒载体可以使用递送rep/cap基因和raav模板的杆状病毒载体在昆虫细胞中产生。[0129]不含污染性辅助病毒的aav载体原种可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，aav和辅助病毒可以基于大小容易地区分。aav还可以基于对于肝素底物的亲和力与辅助病毒分开。可以使用缺失的复制缺陷型辅助病毒，使得任何污染性辅助病毒不是有复制能力的。作为进一步的替代方案，可以采用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助物，因为仅需要腺病毒早期基因表达来介导aav病毒的包装。对于晚期基因表达缺陷的腺病毒突变体是本领域已知的(例如，ts100k和ts149腺病毒突变体)。[0130]重组病毒载体本发明的病毒载体可用于在体外、离体和在体内将核酸递送至细胞。特别地，病毒载体可以有利地用于将核酸递送或转移至动物细胞，包括例如哺乳动物细胞。[0131]任何目的异源核酸序列可以在本发明的病毒载体中进行递送。目的核酸包括编码多肽的核酸，所述多肽包括治疗性(例如，用于医学或兽医学用途)和/或免疫原性(例如，用于疫苗)多肽。[0132]治疗性多肽包括但不限于囊性纤维化跨膜调节蛋白(cftr)、肌营养不良蛋白(包括小和微肌营养不良蛋白，参见例如，vincent等人(1993) nature genetics 5:130；美国专利公开号2003017131；pct公开号wo/2008/088895，wang等人proc. natl. acad. sci. usa 97:13714-13719 (2000)；以及gregorevic等人mol. ther. 16:657-64 (2008))、肌肉生长抑制素前肽、卵泡抑素、激活素ii型可溶性受体、igf-1、抗炎多肽例如iκb显性突变体、肌长蛋白(sarcospan)、肌营养相关蛋白(utrophin) (tinsley等人(1996) nature 384:349)、小肌营养相关蛋白(mini-utrophin)、凝血因子(例如，因子viii、因子ix、因子x等)、促红细胞生成素、血管抑素、内皮抑素、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶、超氧化物歧化酶、瘦素、ldl受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、β-珠蛋白、α-珠蛋白、血影蛋白、α1-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、β-葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖胺酶a、支链酮酸脱氢酶、rp65蛋白、细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白细胞介素-2、白细胞介素-4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等等)、肽生长因子、神经营养因子和激素(例如，生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1和2、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、神经营养因子–3和–4、脑源性神经营养因子、骨形态发生蛋白[包括rankl和vegf]、神经胶质衍生的生长因子、转化生长因子–α和–β等等)、溶酶体酸性α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶a、受体(例如，肿瘤坏死生长因子α可溶性受体)、s100a1、小白蛋白(parvalbumin)、腺苷酸环化酶6型、调节钙处理的分子(例如，serca2a，pp1的抑制剂1及其片段[例如，pct公开号wo 2006/029319和wo 2007/100465])、实现g蛋白偶联受体激酶2型敲减的分子例如截短的组成型活性barkct、抗炎因子例如irap、抗肌肉生长抑制素蛋白、天冬氨酸酰酶、单克隆抗体(包括单链单克隆抗体；示例性mab是herceptin®ꢀmab)、神经肽及其片段(例如甘丙肽、神经肽y (参见美国专利号7,071,172)、血管生成抑制剂例如血管抑制素(vasohibin)及其它vegf抑制剂(例如血管抑制素2 [参见pct公开wo jp2006/073052])。其它说明性异源核酸序列编码自杀基因产物(例如，胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素和肿瘤坏死因子)、赋予对癌症疗法中使用的药物抗性的蛋白质、肿瘤抑制基因产物(例如，p53、rb、wt-1)、trail、fas-配体、以及在有此需要的受试者中具有疗效的任何其它多肽。aav载体还可以用于递送单克隆抗体和抗体片段，例如针对肌肉生长抑制素的抗体或抗体片段(参见例如，fang等人nature biotechnology 23:584-590 (2005))。[0133]编码多肽的异源核酸序列包括编码报道多肽(例如酶)的那些序列。报道多肽是本领域已知的，并且包括但不限于绿色荧光蛋白(gfp)、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶基因。[0134]任选地，异源核酸编码分泌多肽(例如，在其天然状态下为分泌多肽或已改造为分泌(例如通过与如本领域已知的分泌信号序列可操作地结合)的多肽)。[0135]可替代地，在本发明的特定实施方案中，异源核酸可以编码反义核酸，核酶(例如，如美国专利号5,877,022中所述的)，实现剪接体介导的反式剪接的rna (参见puttaraju等人(1999) nature biotech. 17:246；美国专利号6,013,487；美国专利号6,083,702)，干扰rna (rnai)包括介导基因沉默的sirna、shrna或mirna (参见sharp等人(2000) science 287:2431)，以及其它非翻译rna，例如“引导”ꢀrna (gorman等人(1998) proc. nat. acad. sci. usa 95:4929；给予yuan等人的美国专利号5,869,248)等等。示例性的非翻译rna包括针对多药抗性(mdr)基因产物的rnai (例如，以治疗和/或预防肿瘤和/或用于施用于心脏以预防由化学疗法所致的损害)，针对肌肉生长抑制素的rnai (例如，用于杜氏肌营养不良)，针对vegf的rnai (例如，以治疗和/或预防肿瘤)，针对受磷蛋白(phospholamban)的rnai (例如，以治疗心血管疾病，参见例如，andino等人j. gene med. 10:132-142 (2008)，以及li等人acta pharmacol sin. 26:51-55 (2005))；受磷蛋白抑制性或显性失活分子例如受磷蛋白s16e (例如，以治疗心血管疾病，参见例如，hoshijima等人nat. med. 8:864-871 (2002))，针对腺苷激酶的rnai (例如，用于癫痫)，以及针对病原性生物和病毒(例如，乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、cmv、单纯疱疹病毒、人乳头状瘤病毒等)的rnai。[0136]进一步地，可以递送指导可变剪接的核酸序列。为了说明，与肌营养不良蛋白外显子51的5'和/或3'剪接位点互补的反义序列(或其它抑制序列)可以与u1或u7小核(sn) rna启动子结合进行递送，以诱导该外显子的跳跃。例如，包含定位于反义/抑制序列5'的u1或u7 snrna启动子的dna序列可以在本发明的修饰衣壳中进行包装且递送。[0137]病毒载体还可以包含异源核酸，其与宿主染色体上的基因座共享同源性且与之重组。例如，这种方法可以用于校正宿主细胞中的遗传缺陷。[0138]本发明还提供了表达免疫原性多肽的病毒载体，例如用于疫苗接种。核酸可以编码本领域已知的任何目的免疫原，包括但不限于来自人免疫缺陷病毒(hiv)、猿猴免疫缺陷病毒(siv)、流感病毒的免疫原，hiv或siv gag蛋白，肿瘤抗原，癌抗原，细菌抗原，病毒抗原等等。[0139]细小病毒作为疫苗载体的用途是本领域已知的(参见例如，miyamura等人，(1994) proc. nat. acad. sci usa 91:8507；授予young等人的美国专利号5,916,563、授予mazzara等人的美国专利号5,905,040、美国专利号5,882,652、授予samulski等人的美国专利号5,863,541)。抗原可以在细小病毒衣壳中呈递。可替代地，抗原可以由引入重组载体基因组内的异源核酸表达。如本文描述的和/或如本领域已知的任何目的免疫原可以由本发明的病毒载体提供。[0140]免疫原性多肽可以是适合于引发免疫应答和/或保护受试者免受感染和/或疾病的任何多肽，所述感染和/或疾病包括但不限于微生物、细菌、原生动物、寄生虫、真菌和/或病毒感染和疾病。例如，免疫原性多肽可以是正粘病毒免疫原(例如流感病毒免疫原，例如流感病毒血凝素(ha)表面蛋白或流感病毒核蛋白、或马流感病毒免疫原)、或慢病毒免疫原(例如，马传染性贫血病毒免疫原、猿猴免疫缺陷病毒(siv)免疫原、或人免疫缺陷病毒(hiv)免疫原，例如hiv或siv包膜gp160蛋白，hiv或siv基质/衣壳蛋白，以及hiv或siv gag、pol和env基因产物)。免疫原性多肽还可以是沙粒病毒免疫原(例如拉沙热病毒免疫原，例如拉沙热病毒核衣壳蛋白和/或拉沙热包膜糖蛋白)、痘病毒免疫原(例如牛痘病毒免疫原，例如牛痘l1或l8基因产物)、黄病毒免疫原(例如黄热病毒免疫原或日本脑炎病毒免疫原)、丝状病毒免疫原(例如埃博拉病毒免疫原或马尔堡病毒免疫原，例如np和gp基因产物)、布尼亚病毒免疫原(例如rvfv、cchf和/或sfs病毒免疫原)、或冠状病毒免疫原(例如传染性人冠状病毒免疫原例如人冠状病毒包膜糖蛋白、或猪传染性胃肠炎病毒免疫原、或禽传染性支气管炎病毒免疫原)。免疫原性多肽可以进一步是脊髓灰质炎免疫原、疱疹病毒免疫原(例如cmv、ebv、hsv免疫原)、腮腺炎病毒免疫原、麻疹病毒免疫原、风疹病毒免疫原、白喉毒素或其它白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎等)免疫原、和/或本领域目前已知或以后鉴定为免疫原的任何其它疫苗免疫原。[0141]可替代地，免疫原性多肽可以是任何肿瘤或癌细胞抗原。任选地，肿瘤或癌抗原在癌细胞的表面上表达。示例性癌症和肿瘤细胞抗原在s.a. rosenberg (immunity 10:281 (1991))中进行描述。其它说明性癌症和肿瘤抗原包括但不限于：brca1基因产物、brca2基因产物、gp100、酪氨酸酶、gage-1/2、bage、rage、lage、ny-eso-1、cdk-4、β-连环蛋白、mum-1、半胱天冬酶-8、kiaa0205、hpve、sart-1、prame、p15、黑色素瘤肿瘤抗原(kawakami等人(1994) proc. natl. acad. sci. usa 91:3515；kawakami等人(1994) j. exp. med.，180:347；kawakami等人(1994) cancer res. 54:3124)、mart-1、gp100 mage-1、mage-2、mage-3、cea、trp-1、trp-2、p-15、酪氨酸酶(brichard等人(1993) j. exp. med. 178:489)；her-2/neu基因产物(美国专利号4,968,603)、ca125、lk26、fb5 (内皮唾液酸蛋白)、tag 72、afp、ca19-9、nse、du-pan-2、ca50、span-1、ca72-4、hcg、stn (唾液酸tn抗原)、c-erbb-2蛋白、psa、l-canag、雌激素受体、乳脂球蛋白、p53肿瘤抑制蛋白(levine，(1993) ann. rev. biochem. 62:623)；粘蛋白抗原(pct公开号wo 90/05142)；端粒酶；核基质蛋白；前列腺酸性磷酸酶；乳头状瘤病毒抗原；和/或目前已知或以后发现与下述癌症相关的抗原：黑色素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌以及目前已知或以后鉴定的任何其它癌症或恶性状况(参见例如，rosenberg，(1996) ann. rev. med. 47:481-91)。[0142]作为进一步的替代方案，异源核酸可以编码在体外、离体或在体内的细胞中期望地产生的任何多肽。例如，病毒载体可以引入培养的细胞内，并且从其中分离所表达的核酸产物。[0143]本领域技术人员将理解，目的异源核酸可以与适当的控制序列可操作地结合。例如，异源核酸可以与表达控制元件可操作地结合，所述表达控制元件例如转录/翻译控制信号、复制起点、多聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(ires)、启动子和/或增强子等等。[0144]进一步地，例如通过选择性地阻断在特定位点处的剪接活性的寡核苷酸、小分子和/或其它化合物的存在或不存在，通过调控不同内含子的选择性剪接(例如，如pct公开号wo 2006/119137中所述的)，可以在转录后水平下实现目的异源核酸的调控表达。[0145]本领域技术人员将了解，取决于所需水平和组织特异性表达，可以使用各种启动子/增强子元件。取决于所需表达模式，启动子/增强子可以是组成型或诱导型的。启动子/增强子可以是天然或外来的，并且可以是天然序列或合成序列。所谓“外来”，其预期转录起始区在转录起始区引入其内的野生型宿主中并未发现。[0146]在特定实施方案中，启动子/增强子元件对于待治疗的靶细胞或受试者可以是天然的。在代表性实施方案中，启动子/增强子元件对于异源核酸序列可以是天然的。一般选择启动子/增强子元件，使得它在目的靶细胞中发挥功能。进一步地，在特定实施方案中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以是组成型或诱导型的。[0147]诱导型表达控制元件通常在其中期望对异源核酸序列的表达提供调控的那些应用中是有利的。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性或优选的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选的(包括心肌、骨骼肌和/或平滑肌特异性或优选的)、神经组织特异性或优选的(包括脑特异性或优选的)、眼特异性或优选的(包括视网膜特异性和角膜特异性的)、肝特异性或优选的、骨髓特异性或优选的、胰腺特异性或优选的、脾特异性或优选的、和/或肺特异性或优选的启动子/增强子元件。其它诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。示例性诱导型启动子/增强子元件包括但不限于tet开/关元件、ru486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。[0148]在其中异源核酸序列在靶细胞中进行转录然后翻译的实施方案中，一般包括特异性起始信号用于所插入的蛋白质编码序列的有效翻译。可能包括atg起始密码子和相邻序列的这些外源翻译控制序列可以具有各种起源(天然和合成的)。[0149]根据本发明的病毒载体提供了用于将异源核酸递送到广泛范围的细胞内的方法，所述细胞包括分裂细胞和非分裂细胞。例如，病毒载体可以用于将目的核酸在体外递送至细胞，例如在体外产生多肽或用于离体基因治疗。病毒载体另外可用于将核酸递送至有此需要的受试者的方法中，例如，以表达免疫原性多肽和/或治疗性多肽和/或功能性rna。以这种方式，多肽和/或功能性rna可以在受试者体内产生。因为受试者具有多肽的缺乏，所以受试者可以需要该多肽。进一步地，因为多肽和/或功能性rna在受试者中的产生可以赋予一些有利效应，所以可以实践该方法。[0150]病毒载体还可以用于在培养的细胞或受试者中产生目的多肽和/或功能性rna (例如，使用受试者作为生物反应器来产生多肽，和/或例如与筛选方法结合观察功能性rna对受试者的作用)。[0151]一般而言，本发明的病毒载体可以用于递送编码多肽和/或功能性rna (例如治疗性多肽，例如治疗性核酸)的异源核酸，以治疗和/或预防任何疾病状态或病症，对于所述疾病状态或病症而言将治疗性多肽和/或功能性rna递送至例如有此需要的受试者是有益的，例如，其中所述受试者患有疾病状态或病症或者处于疾病状态或病症的风险中。在一些实施方案中，疾病状态是cns疾病或病症。在一些实施方案中，受试者患有与疾病或病症相关的疼痛或者处于患有其的风险中。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者在子宫内。[0152]说明性的疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(囊性纤维化跨膜调节蛋白)及其它肺疾病，血友病a (因子viii)，血友病b (因子ix)，地中海贫血(β-珠蛋白)，贫血(促红细胞生成素)及其它血液病症，阿尔茨海默氏病(gdf；脑啡肽酶)，多发性硬化(β-干扰素)，帕金森氏病(神经胶质细胞系衍生的神经营养因子[gdnf])，亨廷顿氏病(rnai以去除重复)，肌萎缩侧索硬化，癫痫(甘丙肽、神经营养因子)及其它神经系统病症，癌症(内皮抑素、血管抑素、trail、fas-配体、细胞因子(包括干扰素)；rnai (包括针对vegf或多药抗性基因产物的rnai)，mir-26a [例如，用于肝细胞癌])，糖尿病(胰岛素)，肌营养不良(包括杜氏(肌营养不良蛋白、小肌营养不良蛋白、胰岛素样生长因子i、肌聚糖[例如，α、β、γ]、针对肌肉生长抑制素的rnai、肌肉生长抑制素前肽、卵泡抑素、激活素ii型可溶性受体、抗炎多肽例如iκb显性突变体、肌长蛋白、肌营养相关蛋白、小肌营养相关蛋白、针对肌营养不良蛋白基因中的剪接连接点以诱导外显子跳跃的反义物或rnai[参见例如，pct公开号wo/2003/095647]、针对u7 snrna以诱导外显子跳跃的反义物[参见例如，pct公开号wo/2006/021724]、以及针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段))和贝克尔(becker)，戈谢病(gaucher disease) (葡糖脑苷脂酶)，胡尔勒病(hurler’s disease)(α-l-艾杜糖醛酸酶)，腺苷脱氨酶缺乏症(腺苷脱氨酶)，糖原贮积病(例如，法布里病(fabry disease)[α-半乳糖苷酶]和庞贝病(pompe disease)[溶酶体酸性α-葡糖苷酶])及其它代谢病症，先天性肺气肿(α1-抗胰蛋白酶)，莱-尼二氏综合征(lesch-nyhan syndrome)(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，尼曼-皮克二氏病(niemann-pick disease) (鞘磷脂酶)，泰萨克斯病(tays sachs disease) (溶酶体己糖胺酶a)，枫糖尿病(maple syrup urine disease)(支链酮酸脱氢酶)，视网膜退行性疾病(以及其它眼和视网膜疾病；例如，用于黄斑变性的pdgf和/或血管抑制素或其它vegf抑制剂或其它血管生成抑制剂，以治疗/预防例如在i型糖尿病中的视网膜病症)，实体器官例如脑(包括帕金森氏病[gdnf]、星形细胞瘤[内皮抑素、血管抑素和/或针对vegf的rnai]、胶质母细胞瘤[内皮抑素、血管抑素和/或针对vegf的rnai])、肝、肾、心脏(包括充血性心力衰竭或外周动脉疾病(pad))的疾病(例如，通过递送蛋白磷酸酶抑制剂i (i-1)及其片段(例如i1c)、serca2a、调控受磷蛋白基因的锌指蛋白、barkct、β2-肾上腺素能受体、β2-肾上腺素能受体激酶(bark)、磷脂酰肌醇-3激酶(pi3激酶)、s100a1、小白蛋白、腺苷酸环化酶6型、实现g蛋白偶联受体激酶2型敲减的分子例如截短的组成型活性barkct；calsarcin，针对受磷蛋白的rnai；受磷蛋白抑制性或显性失活分子如受磷蛋白s16e等)，关节炎(胰岛素样生长因子)，关节病症(胰岛素样生长因子1和/或2)，内膜增生(例如，通过递送enos、inos)，改善心脏移植的存活(超氧化物歧化酶)，aids (可溶性cd4)，肌萎缩(胰岛素样生长因子i)，肾虚(促红细胞生成素)，贫血(促红细胞生成素)，关节炎(抗炎因子，如irap和tnfα可溶性受体)，肝炎(α-干扰素)，ldl受体缺乏症(ldl受体)，高氨血症(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)，克拉伯氏病(krabbe’s disease) (半乳糖脑苷脂酶)，巴滕病(batten's disease)，脊髓小脑性共济失调(包括sca1、sca2和sca3)，苯丙酮尿症(苯丙氨酸羟化酶)，自身免疫疾病，先天性神经退行性病症(例如，单基因神经退行性病症)例如粘多糖贮积症(包括但不限于i型粘多糖贮积症(也称为胡尔勒综合征、胡-沙二氏综合征(hurler-scheie syndrome)或沙伊综合征(scheie syndrome)，idua，α-l-艾杜糖醛酸酶)、ii型粘多糖贮积症(也称为亨特综合征(hunter syndrome)，ids，i2l酶)、iii型粘多糖贮积症(也称为圣菲利波综合征(sanfilippo syndrome)，gns [n-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶]，hgsnat [乙酰肝素-α-氨基葡糖苷n-乙酰转移酶]、naglu [α-n-乙酰氨基葡糖苷酶]和/或sgsh [磺酰胺酶])、iv型粘多糖贮积症(也称为莫基奥综合征(morquio syndrome)、galns [氨基半乳糖(n-乙酰基)-6-硫酸酯酶]和/或glb1 [β-半乳糖苷酶])、v型粘多糖贮积症(也称为沙伊综合征，目前是i型的亚组，也称为idua，α-l-艾杜糖醛酸酶)、vi型粘多糖贮积症(也称为马-拉二氏综合征(maroteaux-lamy syndrome)，arsb，芳基硫酸酯酶b)、vii型粘多糖贮积症(也称为斯莱综合征(sly syndrome)，gusb，β-葡糖醛酸酶)、ix型粘多糖贮积症(也称为natowicz综合征，hyal1，透明质酸酶)和/或脑白质营养不良(包括但不限于成人发病型常染色体显性遗传性脑白质营养不良(adld；lmnb1，核纤层蛋白b1)，aicardi-goutieres综合征(trex1、rnasehsb、rnaseh2c和/或rnaseh2a)，亚历山大病(alexander disease)(frap，神经胶质纤维酸性蛋白)，cadasil (notch3)，卡纳万病(canavan disease)(aspa，天冬氨酸酰酶)，carasil (htra1，丝氨酸蛋白酶htra1)，脑腱黄瘤病("ctx"，cyp27a1，甾醇27-羟化酶)，儿童共济失调和脑髓鞘形成低下(cerebral hypomyelination)(cach)/白质消融性疾病(vanishing white matter disease)(vwmd) (eif2b，真核起始因子2b)，法布里病(gla，α-半乳糖苷酶a)，岩藻糖苷贮积症(fuca1，α-l-岩藻糖苷酶)，gm1神经节苷脂贮积症(glb1，β-半乳糖苷酶)，l-2-羟基戊二酸尿症(l2hdgh，l-2-羟基戊二酸脱氢酶)，克拉伯病(galc，半乳糖脑苷脂酶)，伴有皮层下囊肿的巨脑性白质脑病(“mlc”，mlc1和/或hepacam)，异染性脑白质营养不良(asa，芳基硫酸酯酶a)，多种硫酸酯酶缺乏症(“msd”，sumf1，影响所有硫酸酯酶的硫酸酯酶修饰因子1)，佩-梅二氏病(pelizaeus-merzbacher disease)(也称为“x连锁痉挛性截瘫”，plp1 [x连锁蛋白脂质蛋白1]和/或gja12 [间隙连接蛋白12])，pol iii相关脑白质营养不良(polr3a和/或polr3b)，雷夫叙姆病(refsum disease)(phyh，[植烷酰辅酶a羟化酶]和/或pex7 [phyh输入过氧化物酶体内])，salla病(也称为“游离唾液酸贮积病”，slc17a5，唾液酸转运蛋白)，斯-拉二氏综合征(sjogren-larsson syndrome)(áldh3a2，醛脱氢酶)，x连锁肾上腺脑白质营养不良(“ald”，abcd1，过氧化物酶体atp酶结合盒蛋白)，齐薇格综合征谱系障碍(zellweger syndrome spectrum disorder)(也称为过氧化物酶体生物发生障碍，pex1，pex2，pex3，pex4，pex5，pex10，pex11b，pex12，pex13，pex14，pex16，pex19，pex26)等等。本发明可以进一步在器官移植之后使用，以增加移植的成功率和/或减少器官移植或辅助疗法的负面副作用(例如，通过施用免疫抑制剂或抑制性核酸，以阻断细胞因子产生)。作为另一个实例，例如在癌症患者中的骨折或手术切除之后，骨形态发生蛋白(包括bnp 2、7等，rankl和/或vegf)可以与骨同种异体移植物一起施用。[0153]因此，在一些实施方案中，本发明提供了治疗有此需要的受试者中的疾病的方法，其包括在治疗性核酸藉此在受试者中表达的条件下，通过向受试者施用本发明的病毒载体和/或组合物，将治疗性核酸引入受试者的细胞内。[0154]本发明还可以用于产生诱导多能干细胞(ips)。例如，本发明的病毒载体可以用于将干细胞相关核酸递送到非多能细胞内，例如成体成纤维细胞、皮肤细胞、肝细胞、肾细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞等等。编码与干细胞相关的因子的核酸是本领域已知的。与干细胞和多能性相关的此类因子的非限制性实例包括oct-3/4、sox家族(例如，sox1、sox2、sox3和/或sox15)、klf家族(例如，klf1、klf2、klf4和/或klf5)、myc家族(例如，c-myc、l-myc和/或n-myc)、nanog和/或lin28。[0155]本发明还可以进行实践，以治疗和/或预防代谢病症，例如糖尿病(例如胰岛素)、血友病(例如因子ix或因子viii)、溶酶体贮积症例如粘多糖贮积症(例如斯莱综合征[β-葡糖醛酸酶]、胡尔勒综合征[α-l-艾杜糖醛酸酶]、沙伊综合征[α-l-艾杜糖醛酸酶]、胡-沙二氏综合征[α-l-艾杜糖醛酸酶]、亨特综合征[艾杜糖醛酸硫酸酯酶]、圣菲利波综合征a [乙酰肝素磺酰胺酶]、b [n-乙酰氨基葡糖苷酶]、c [乙酰辅酶a:α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶]、d [n-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶]、莫基奥综合征a [半乳糖-6-硫酸酯硫酸酯酶]、b [β-半乳糖苷酶]、马-拉二氏综合征[n-乙酰氨基半乳糖-4-硫酸酯酶]等)、法布里病(α-半乳糖苷酶)、戈谢病(葡糖脑苷脂酶)、或糖原贮积症(例如庞贝病；溶酶体酸性α-葡糖苷酶)。[0156]基因转移具有用于理解疾病状态且提供用于疾病状态的疗法的实质潜在用途。存在其中缺陷基因是已知的且已得到克隆的许多遗传性疾病。一般而言，上述疾病状态落入两个类别内：通常为酶的缺乏状态，其一般以隐性方式遗传；以及不平衡状态，其可能涉及调节蛋白或结构蛋白，并且通常以显性方式遗传。对于缺乏状态疾病，基因转移可以用于将正常基因带入受累组织内用于替代疗法，以及使用反义突变产生用于疾病的动物模型。对于不平衡疾病状态，基因转移可以用于在模型系统中产生疾病状态，其然后可以用于对抗疾病状态的努力中。因此，根据本发明的病毒载体允许遗传性疾病的治疗和/或预防。[0157]根据本发明的病毒载体还可以用于在体外或在体内将功能性rna提供给细胞。例如，细胞中的功能性rna的表达可以缩减细胞对特定靶蛋白的表达。相应地，可以施用功能性rna，以降低特定蛋白质在有此需要的受试者中的表达。功能性rna还可以在体外施用于细胞，以调控基因表达和/或细胞生理学，例如以优化细胞或组织培养系统或筛选方法。[0158]另外，根据本发明的病毒载体在诊断和筛选方法中有用，由此在细胞培养系统或可替代的转基因动物模型中瞬时或稳定表达目的核酸。[0159]本发明的病毒载体还可以用于各种非治疗目的，包括但不限于在评价基因靶向、清除、转录、翻译等的方案中的用途，如对于本领域技术人员显而易见的。病毒载体还可以用于评估安全性(传播、毒性、免疫原性等)的目的。例如，此类数据由美国食品和药物管理局(united states food and drug administration)视为在临床功效评估前的监管审批过程的部分。[0160]作为一个进一步方面，本发明的病毒载体可以用于在受试者中产生免疫应答。根据该实施方案，包含编码免疫原性多肽的异源核酸序列的病毒载体可以施用于受试者，并且通过受试者产生针对免疫原性多肽的主动免疫应答。免疫原性多肽如上文所述。在一些实施方案中，引发保护性免疫应答。[0161]可替代地，病毒载体可以离体施用于细胞，并且将改变的细胞施用于受试者。将包含异源核酸的病毒载体引入细胞内，并且将细胞施用于受试者，其中可以表达编码免疫原的异源核酸，并且在受试者中诱导针对免疫原的免疫应答。在特定实施方案中，细胞是抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)。[0162]“主动免疫应答”或“主动免疫”的特征在于“在遇到免疫原后宿主组织和细胞的参与”。它涉及淋巴网状组织中的免疫活性细胞的分化和增殖，其导致抗体合成或细胞介导反应性的发展或两者。”ꢀherbert b. herscowitz，immunophysiology：cell function and cellular interactions in antibody formation，in immunology：basic processes 117 (joseph a. bellanti编辑，1985)。换言之，在通过感染或疫苗接种暴露于免疫原后，通过宿主产生主动免疫应答。主动免疫可以与被动免疫相比较，所述被动免疫通过“预先形成的物质(抗体、转移因子、胸腺移植物、白细胞介素-2)从主动免疫的宿主转移到非免疫宿主”来获得。同上。[0163]如本文使用的，“保护性”免疫应答或“保护性”免疫指示免疫应答对受试者赋予一些益处，因为它预防或减少疾病的发生率。可替代地，保护性免疫应答或保护性免疫可以用于治疗和/或预防疾病，特别是癌症或肿瘤(例如，通过预防癌症或肿瘤形成、通过引起癌症或肿瘤的消退、和/或通过预防转移和/或通过预防转移性结节的生长)。保护效应可以是完全或部分的，只要治疗的益处超过其任何缺点。[0164]在特定实施方案中，包含异源核酸的病毒载体或细胞可以以免疫原性有效量施用，如本文所述的。[0165]还可以通过施用表达一种或多种癌细胞抗原(或免疫相似分子)、或产生针对癌细胞的免疫应答的任何其它免疫原的病毒载体，施用本发明的病毒载体用于癌症免疫疗法。为了说明，可以通过施用包含编码癌细胞抗原的异源核酸的病毒载体，在受试者中产生针对癌细胞抗原的免疫应答，例如以治疗患有癌症的患者和/或预防癌症在受试者中的发展。如本文所述的，病毒载体可以在体内或通过使用离体方法施用于受试者。可替代地，癌抗原可以作为病毒衣壳的部分表达，或以其它方式与病毒衣壳相关(例如，如上所述)。[0166]作为另一个替代方案，可以施用本领域已知的任何其它治疗性核酸(例如，rnai)或多肽(例如，细胞因子)，以治疗和/或预防癌症。[0167]如本文使用的，术语“癌症”涵盖形成肿瘤的癌症。同样地，术语“癌性组织”涵盖肿瘤。“癌细胞抗原”涵盖肿瘤抗原。[0168]术语“癌症”具有其在本领域中理解的含义，例如不受控制的组织生长，其具有扩散到身体的远处部位(即，转移)的潜力。示例性癌症包括但不限于黑色素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌以及目前已知或以后鉴定的任何其它癌症或恶性状况。在代表性实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防形成肿瘤的癌症的方法。[0169]例如，术语“肿瘤”在本领域中还理解为在多细胞生物内的未分化细胞的异常团块。肿瘤可以是恶性的或良性的。在代表性实施方案中，本文公开的方法用于预防和治疗恶性肿瘤。[0170]术语“治疗癌症”、“癌症的治疗”和等价术语预期减少或至少部分消除癌症的严重性和/或减缓和/或控制疾病的进展和/或稳定疾病。在特定实施方案中，这些术语指示预防或减少或至少部分消除癌症的转移、和/或预防或减少或至少部分消除转移性结节的生长。[0171]术语“癌症的预防”或“预防癌症”和等价术语预期该方法至少部分消除或减少和/或延迟癌症发作的发生率和/或严重性。换言之，受试者中的癌症发作可以在可能性或概率方面减少和/或延迟。[0172]在特定实施方案中，细胞可以从患有癌症的受试者中取出，并且与根据本发明的表达癌细胞抗原的病毒载体接触。然后将修饰的细胞施用于受试者，由此引发针对癌细胞抗原的免疫应答。这种方法可以有利地用于免疫受损的受试者，其不能在体内产生足够的免疫应答(即，不能产生足够数量的增强抗体)。[0173]本领域已知免疫应答可以通过免疫调节细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素、τ-干扰素、白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-11、白细胞介素12、白细胞介素-13、白细胞介素-14、白细胞介素-18、b细胞生长因子、cd40配体、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、单核细胞趋化蛋白-1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和淋巴毒素)得到增强。相应地，免疫调节细胞因子(优选地，ctl诱导细胞因子)可以与病毒载体结合施用于受试者。[0174]细胞因子可以通过本领域已知的任何方法进行施用。外源细胞因子可以施用于受试者，或可替代地，编码细胞因子的核酸可以使用合适载体递送至受试者，并且在体内产生细胞因子。[0175]受试者、药物制剂和施用模式根据本发明的病毒载体和衣壳在兽医学和医学应用两者中有用。合适的受试者包括禽类和哺乳动物两者。如本文使用的，术语“禽类”包括但不限于鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡、雉鸡、鹦鹉、长尾小鹦鹉等等。如本文使用的，术语“哺乳动物”包括但不限于人、非人灵长类动物、牛族动物、绵羊类、山羊类、马科动物、猫科动物、犬科动物、兔形目动物等。人受试者包括子宫内(例如，胚胎、胎儿)、新生儿、婴儿、青少年、成人和老年受试者。[0176]在代表性实施方案中，受试者“需要”本发明的方法，并且因此在一些实施方案中，可以是“有此需要的受试者”。[0177]在特定实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的本发明的病毒载体和/或衣壳，以及任选的其它医学试剂、药物试剂、稳定剂、缓冲剂、载剂、佐剂、稀释剂等。对于注射，载剂通常为液体。对于其它施用方法，载剂可以是固体或液体。对于吸入施用，载剂将是可吸入的，并且任选地可以是固体或液体微粒形式。[0178]“药学上可接受的”意指无毒或在其它方面不期望的材料，即，该材料可以施用于受试者，而不引起任何不期望的生物效应。[0179]本发明的一个方面是在体外将核酸转移至细胞的方法。根据适合于特定靶细胞的标准转导方法，病毒载体可以以适当的感染复数引入细胞内。取决于靶细胞类型和数目、以及特定的病毒载体，待施用的病毒载体滴度可以改变，并且可以由本领域技术人员无需过度实验进行确定。在代表性实施方案中，将至少约103感染单位，任选地至少约105感染单位引入细胞。[0180]病毒载体引入其内的细胞可以具有任何类型，包括但不限于神经细胞(包括外周神经系统和中枢神经系统的细胞，特别是脑细胞例如神经元和少突胶质细胞)、肺细胞、眼细胞(包括视网膜细胞、视网膜色素上皮和角膜细胞)、上皮细胞(例如，肠道和呼吸道上皮细胞)、肌细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和/或膈肌细胞)、树突状细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、心肌细胞、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞等等。在代表性实施方案中，细胞可以是任何祖细胞。作为一个进一步的实施方案，细胞可以是干细胞(例如，神经干细胞、肝干细胞)。作为再一个进一步的实施方案，细胞可以是癌细胞或肿瘤细胞。此外，如上文指示的，细胞可以来自任何起源的物种。[0181]病毒载体可以在体外引入细胞内，用于将修饰的细胞施用于受试者的目的。在特定实施方案中，细胞已从受试者中取出，将病毒载体引入其中，然后将细胞施用回受试者内。从受试者中取出细胞用于离体操作，随后引入回受试者内的方法是本领域已知的(参见例如，美国专利号5,399,346)。可替代地，重组病毒载体可以引入来自供体受试者的细胞、培养的细胞或来自任何其它合适来源的细胞内，并且将细胞施用于有此需要的受试者(即，“接受者”受试者)。[0182]用于离体核酸递送的合适细胞如上所述。施用于受试者的细胞剂量将根据受试者的年龄、状况和物种，细胞类型，待由细胞表达的核酸，施用模式等等而变。通常，将施用在药学上可接受的载剂中的至少约102至约108个细胞或至少约103至约106个细胞/剂量。在特定实施方案中，用病毒载体转导的细胞以治疗有效量或预防有效量与药物载剂组合施用于受试者。[0183]在一些实施方案中，将病毒载体引入细胞内，并且可以将细胞施用于受试者，以引发针对所递送的多肽(例如，作为转基因或在衣壳中表达)的免疫原性应答。通常，施用与药学上可接受的载剂组合的一定量的表达免疫原性有效量的多肽的细胞。“免疫原性有效量”是所表达多肽的量，其足以在药物制剂所施用的受试者中诱发针对多肽的主动免疫应答。在特定实施方案中，剂量足以产生保护性免疫应答(如上文定义的)。所赋予的保护程度无需是完全的或永久的，只要施用免疫原性多肽的益处超过其任何缺点。[0184]在一些实施方案中，与对照相比，例如当与另一种aav病毒载体(例如，表1中列出的任何aav血清型)接触时，受试者在与本发明的病毒载体接触时可能具有减少的免疫学概况(例如免疫应答，例如抗原交叉反应性)。[0185]本发明的一个进一步方面是将病毒载体和/或病毒衣壳施用于受试者的方法。可以通过本领域已知的任何手段，将根据本发明的病毒载体和/或衣壳施用于有此需要的人受试者或动物。任选地，病毒载体和/或衣壳可以以在药学上可接受的载剂中的治疗有效剂量或预防有效剂量进行递送。[0186]可以进一步施用本发明的病毒载体和/或衣壳，以引发免疫原性应答(例如，作为疫苗)。通常，本发明的免疫原性组合物包含与药学上可接受的载剂组合的免疫原性有效量的病毒载体和/或衣壳。任选地，剂量足以产生保护性免疫应答(如上文定义的)。[0187]待施用于受试者的病毒载体和/或衣壳的剂量取决于施用模式、待治疗和/或预防的疾病或状况、各个受试者的状况、特定的病毒载体或衣壳、待递送的核酸等等，并且可以以常规方式进行确定。用于实现疗效的示例性剂量是至少约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、103、1014、1015转导单位，任选地约108 –ꢀ1013转导单位的滴度。[0188]在特定实施方案中，多于一次施用(例如两次、三次、四次或更多次施用)可以用于实现在各种间隔的时期内的所需基因表达水平，例如每天一次、每周一次、每月一次、每年一次等。[0189]示例性的施用模式包括经口、直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如，经由气溶胶)、颊(例如，舌下)、阴道、鞘内、眼内、经皮、在子宫内(或在卵内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌内[包括对骨骼肌、膈肌和/或心肌的施用]、皮内、胸膜内、大脑内和关节内)、局部(例如，对皮肤和粘膜表面两者，包括气道表面和经皮施用)、淋巴管内等等，以及直接的组织或器官注射(例如，对肝、骨骼肌、心肌、膈肌或脑)。施用还可以是对于肿瘤(例如，在肿瘤或淋巴结中或附近)。在任何给定情况下的最合适途径取决于所治疗和/或预防状况的性质和严重性，以及所使用的特定载体的性质。[0190]根据本发明对骨骼肌的施用包括但不限于对肢体(例如上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背部、颈部、头部(例如舌)、胸部、腹部、骨盆/会阴、和/或手指中的骨骼肌的施用。合适的骨骼肌包括但不限于小指展肌(abductor digiti minimi) (在手中)、小趾展肌(abductor digiti minimi)(在足中)、拇展肌、外展小趾肌、拇短展肌、拇长展肌、短收肌、拇收肌、长收肌、大收肌、拇内收肌、肘肌、前斜角肌、膝关节肌、肱二头肌、股二头肌、肱肌、肱桡肌、颊肌、喙肱肌、皱眉肌、三角肌、降口角肌、降下唇肌、二腹肌、背侧骨间肌(在手中)、背侧骨间肌(在足中)、桡侧腕短伸肌、桡侧腕长伸肌、尺侧腕伸肌、小指伸肌、指伸肌、趾短伸肌、趾长伸肌、短伸肌、长伸肌、食指伸肌、拇短伸肌、拇长伸肌、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、小指短屈肌(在手中)、小趾短屈肌(在足中)、趾短屈肌、趾长屈肌、指深屈肌、指浅屈肌、短屈肌、长屈肌、拇短屈肌、拇长屈肌、额肌、腓肠肌、颏舌骨肌、臀大肌、臀中肌、臀小肌、股薄肌、颈髂肋肌、腰髂肋肌、胸髂肋肌、骼肌、下孖肌、下斜肌、下直肌、冈下肌、棘突间肌、横突间肌、翼外肌、外直肌、背阔肌、提口角肌、提上唇肌、提上唇鼻翼肌、提上睑肌、肩胛提肌、长回旋肌、头最长肌、颈最长肌、胸最长肌、头长肌、颈长肌、蚓状肌(在手中)、蚓状肌(在足中)、咬肌、内翼肌、内直肌、中斜角肌、多裂肌、下颌舌骨肌、头下斜肌、头上斜肌、闭孔外肌、闭孔内肌、枕肌、肩胛舌骨肌、小指对掌肌、拇对掌肌、眼轮匝肌、口轮匝肌、骨间掌侧肌、掌短肌、掌长肌、耻骨肌、胸大肌、胸小肌、腓骨短肌、腓骨长肌、第三腓骨肌、梨状肌、骨间足底肌、跖肌、颈阔肌、腘肌、后斜角肌、旋前方肌、旋前圆肌、腰大肌、股方肌、跖方肌、头前直肌、头外侧直肌、头后大直肌、头后小直肌、股直肌、大菱形肌、小菱形肌、笑肌、缝匠肌、小斜角肌、半膜肌、头半棘肌、颈半棘肌、胸半棘肌、半腱肌、前锯肌、短回旋肌、比目鱼肌、头棘肌、颈棘肌、胸棘肌、头夹肌、颈夹肌、胸锁乳突肌、胸骨舌骨肌、胸骨甲状肌、茎突舌骨肌、锁骨下肌、肩胛下肌、上孖肌、上斜肌、上直肌、旋后肌、冈上肌、颞肌、阔筋膜张肌、大圆肌、小圆肌、胸肌(thoracis)、甲状舌骨肌、胫骨前肌、胫骨后肌、斜方肌、肱三头肌、股中间肌、股外侧肌、股内侧肌、颧大肌和颧小肌、以及如本领域已知的任何其它合适的骨骼肌。[0191]病毒载体和/或衣壳可以通过静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肢体灌注(任选地，腿和/或臂的隔离肢体灌注；参见例如arruda等人(2005) blood 105:3458-3464)、和/或直接肌内注射而递送至骨骼肌。在特定实施方案中，病毒载体和/或衣壳通过肢体灌注，任选的隔离肢体灌注(例如，通过静脉内或关节内施用)施用于受试者(例如，患有肌营养不良例如dmd的受试者)的肢体(臂和/或腿)。在本发明的实施方案中，本发明的病毒载体和/或衣壳可以无需采用“水动力”技术而有利地施用。载体的组织递送(例如至肌肉)经常通过水动力技术(例如以大体积的静脉内/静脉内施用)得到增强，所述水动力技术增加脉管系统中的压力，并且促进载体跨越内皮细胞屏障的能力。在特定实施方案中，本发明的病毒载体和/或衣壳可以在不存在水动力技术例如高体积输注和/或升高的血管内压(例如大于正常收缩压，例如在血管内压方面超过正常收缩压的小于或等于5%、10%、15%、20%、25%增加)的情况下施用。此类方法可以减少或避免与水动力技术相关的副作用，例如水肿、神经损害和/或筋膜室综合征。[0192]对心肌的施用包括对左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜的施用。病毒载体和/或衣壳可以通过静脉内施用、动脉内施用例如主动脉内施用、直接心脏注射(例如进入左心房、右心房、左心室、右心室内)、和/或冠状动脉灌注而递送至心肌。[0193]对膈肌的施用可以通过任何合适的方法(包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用)进行。[0194]对靶组织的递送还可以通过递送包含病毒载体和/或衣壳的储库来实现。在代表性实施方案中，将包含病毒载体和/或衣壳的储库植入骨骼肌、心肌和/或膈肌组织内，或者组织可以与包含病毒载体和/或衣壳的薄膜或其它基质接触。此类可植入基质或基底例如在美国专利号7,201,898中进行描述。[0195]在特定实施方案中，根据本发明的病毒载体和/或病毒衣壳施用于骨骼肌、膈肌和/或心肌(例如，以治疗和/或预防肌营养不良、心脏病[例如pad或充血性心力衰竭])。[0196]在代表性实施方案中，本发明用于治疗和/或预防骨骼肌、心肌和/或膈肌的病症。[0197]在代表性实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防有此需要的受试者中的肌营养不良的方法，该方法包括：向哺乳动物受试者施用治疗有效量或预防有效量的本发明的病毒载体，其中所述病毒载体包含编码下述的异源核酸：肌营养不良蛋白、小肌营养不良蛋白、微肌营养不良蛋白、肌肉生长抑制素前肽、卵泡抑素、激活素ii型可溶性受体、igf-1、抗炎多肽例如iκb显性突变体、肌长蛋白、肌营养相关蛋白、微肌营养不良蛋白、层粘连蛋白α2、α-肌聚糖、β-肌聚糖、γ-肌聚糖、δ-肌聚糖、igf-1、针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段、和/或针对肌肉生长抑制素的rnai。在特定实施方案中，病毒载体可以施用于骨骼肌、膈肌和/或心肌，如本文其它地方描述的。[0198]可替代地，本发明可以进行实践，以将核酸递送至骨骼肌、心肌或膈肌，其用作多肽(例如酶)或功能性rna (例如rnai、微小rna、反义rna)的生产平台，所述多肽或功能性rna通常在血液中循环或用于全身递送至其它组织，以治疗和/或预防病症(例如代谢病症，例如糖尿病[例如胰岛素]、血友病[例如因子ix或因子viii]、粘多糖病症[例如斯莱综合征，胡尔勒综合征，沙伊综合征，胡-沙二氏综合征，亨特综合征，圣菲利波综合征a、b、c、d，莫基奥综合征，马-拉二氏综合征等]，或溶酶体贮积症例如戈谢病[葡糖脑苷脂酶]或法布里病[α-半乳糖苷酶a]，或糖原贮积症例如庞贝病[溶酶体酸性α葡糖苷酶])。用于治疗和/或预防代谢病症的其它合适蛋白质在本文中进行描述。肌肉作为表达目的核酸的平台的用途在美国专利公开号20020192189中进行描述。[0199]因此，作为一个方面，本发明进一步涵盖治疗和/或预防有此需要的受试者中的代谢病症的方法，该方法包括：向受试者的骨骼肌施用治疗有效量或预防有效量的本发明的病毒载体，其中所述病毒载体包含编码多肽的异源核酸，其中所述代谢病症是多肽的缺乏和/或缺陷的结果。说明性的代谢病症和编码多肽的异源核酸在本文中进行描述。任选地，多肽是分泌的(例如，在其天然状态下为分泌多肽或已改造为分泌(例如通过与如本领域已知的分泌信号序列可操作地结合)的多肽)。不受本发明的任何具体理论限制，根据该实施方案，对骨骼肌的施用可以导致多肽分泌到体循环内，并且递送至靶组织。将病毒载体递送至骨骼肌的方法在本文中更详细地进行描述。[0200]本发明还可以进行实践，以产生反义rna、rnai或其它功能性rna (例如核酶)用于全身递送。[0201]本发明还提供了治疗和/或预防有此需要的受试者中的先天性心力衰竭或pad的方法，该方法包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量或预防有效量的本发明的病毒载体，其中所述病毒载体包含编码例如以下的异源核酸：肌浆内质网(sarcoplasmic endoreticulum) ca2+-atp酶(serca2a)、血管生成因子、磷酸酶抑制剂i (i-1)及其片段(例如i1c)、针对受磷蛋白的rnai；受磷蛋白抑制性或显性失活分子例如受磷蛋白s16e、调控受磷蛋白基因的锌指蛋白、β2-肾上腺素能受体、β2-肾上腺素能受体激酶(bark)、pi3激酶、calsarcan、β-肾上腺素能受体激酶抑制剂(βarkct)、蛋白磷酸酶1的抑制剂1及其片段(例如i1c)、s100a1、小白蛋白、腺苷酸环化酶6型、实现g蛋白偶联受体激酶2型敲减的分子例如截短的组成型活性barkct、pim-1、pgc-1α、sod-1、sod-2、ec-sod、激肽释放酶、hif、胸腺肽-β4、mir-1、mir-133、mir-206、mir-208和/或mir-26a。[0202]在一些实施方案中，本发明进一步涵盖治疗和/或预防有此需要的受试者中的先天性神经退行性病症(例如，单基因神经退行性病症)的方法，该方法包括：将治疗有效量或预防有效量的本发明的病毒载体施用于受试者的神经组织(例如神经元细胞)，其中所述病毒载体包含编码多肽的异源核酸，其中所述先天性神经退行性病症是多肽的缺乏和/或缺陷的结果。本文描述了说明性的先天性神经退行性病症和编码多肽的异源核酸。任选地，多肽是分泌的(例如，在其天然状态下为分泌多肽或已改造为分泌(例如通过与如本领域已知的分泌信号序列可操作地结合)的多肽)。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者在子宫内。在一些实施方案中，受试者患有先天性(例如，单基因)神经退行性病症或处于其风险中。在一些实施方案中，受试者患有粘多糖贮积症或脑白质营养不良或处于其风险中。[0203]注射剂可以以常规形式制备为液体溶液或悬浮液、适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或制备为乳状液。可替代地，可以以局部方式而不是全身方式，例如在储库或持续释放制剂中，施用本发明的病毒载体和/或病毒衣壳。进一步地，病毒载体和/或病毒衣壳可以附着至可手术植入的基质进行递送(例如，如美国专利公开号20040013645中描述的)。[0204]本文公开的病毒载体和/或病毒衣壳可以通过任何合适手段施用于受试者的肺，任选地通过施用受试者吸入的包含病毒载体和/或病毒衣壳的可吸入颗粒的气溶胶悬浮液。可吸入颗粒可以是液体或固体。包含病毒载体和/或病毒衣壳的液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适手段产生，例如使用压力驱动的气溶胶雾化器或超声雾化器，如本领域技术人员已知的。参见例如美国专利号4,501,729。同样地可以通过药学领域已知的技术，用任何固体微粒药剂气溶胶发生器来产生包含病毒载体和/或衣壳的固体颗粒的气溶胶。[0205]病毒载体和病毒衣壳可以施用于中枢神经系统(cns)的组织(例如脑、眼)，并且可以有利地导致比在本发明的不存在下观察到的更广泛的病毒载体或衣壳分布。[0206]在特定实施方案中，本发明的递送载体可以施用于治疗cns的疾病，其包括遗传病症、神经退行性病症、精神障碍和肿瘤。说明性的cns疾病包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、卡纳万病、利氏病(leigh’s disease)、雷夫叙姆病、图雷特综合征(tourette syndrome)、原发性侧索硬化、肌萎缩侧索硬化、进行性肌萎缩、皮克氏病(pick's disease)、肌营养不良、多发性硬化、重症肌无力、宾斯万格病、由于脊髓或头部损伤的外伤、泰萨克斯病、莱-尼二氏病、癫痫、脑梗塞、精神障碍(包括情绪障碍(例如抑郁、双相情感障碍、持续性情感障碍、继发性情感障碍))、精神分裂症、药物依赖(例如酗酒及其它物质依赖)、神经症(例如焦虑、强迫症、躯体形式障碍、分离性障碍、悲伤、产后抑郁症)、精神病(例如幻觉和妄想)、痴呆、偏执、注意力缺陷障碍、性心理障碍、睡眠障碍、疼痛障碍、进食障碍或体重病症(例如肥胖、恶病质、神经性厌食症和贪食症)、cns癌症和肿瘤(例如垂体瘤)以及先天性神经退行性病症例如粘多糖贮积症(包括但不限于i型粘多糖贮积症(也称为胡尔勒综合征、胡-沙二氏综合征或沙伊综合征，idua，α-l-艾杜糖醛酸酶)、ii型粘多糖贮积症(也称为亨特综合征，ids，i2l酶)、iii型粘多糖贮积症(也称为圣菲利波综合征，gns [n-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶]，hgsnat [乙酰肝素-α-氨基葡糖苷n-乙酰转移酶]、naglu [α-n-乙酰氨基葡糖苷酶]和/或sgsh [磺酰胺酶])、iv型粘多糖贮积症(也称为莫基奥综合征、galns [氨基半乳糖(n-乙酰基)-6-硫酸酯酶]和/或glb1 [β-半乳糖苷酶])、v型粘多糖贮积症(也称为沙伊综合征，目前是i型的亚组，也称为idua，α-l-艾杜糖醛酸酶)、vi型粘多糖贮积症(也称为马-拉二氏综合征，arsb，芳基硫酸酯酶b)、vii型粘多糖贮积症(也称为斯莱综合征，gusb，β-葡糖醛酸酶)、ix型粘多糖贮积症(也称为natowicz综合征，hyal1，透明质酸酶)和/或脑白质营养不良(包括但不限于成人发病型常染色体显性遗传性脑白质营养不良(adld；lmnb1，核纤层蛋白b1)、aicardi-goutieres综合征(trex1、rnasehsb、rnaseh2c和/或rnaseh2a)、亚历山大病(frap，神经胶质纤维酸性蛋白)、cadasil (notch3)、卡纳万病(aspa，天冬氨酸酰酶)、carasil (htra1，丝氨酸蛋白酶htra1)、脑腱黄瘤病("ctx"，cyp27a1，甾醇27-羟化酶)、儿童共济失调和脑髓鞘形成低下(cach)/白质消融性疾病(vwmd) (eif2b，真核起始因子2b)、法布里病(gla，α-半乳糖苷酶a)、岩藻糖苷贮积症(fuca1，α-l-岩藻糖苷酶)、gm1神经节苷脂贮积症(glb1，β-半乳糖苷酶)，l-2-羟基戊二酸尿症(l2hdgh，l-2-羟基戊二酸脱氢酶)、克拉伯病(galc，半乳糖脑苷脂酶)、伴有皮层下囊肿的巨脑性白质脑病(“mlc”，mlc1和/或hepacam)、异染性脑白质营养不良(asa，芳基硫酸酯酶a)、多种硫酸酯酶缺乏症(“msd”，sumf1，影响所有硫酸酯酶的硫酸酯酶修饰因子1)、佩-梅二氏病(也称为“x连锁痉挛性截瘫”，plp1 [x连锁蛋白脂质蛋白1]和/或gja12 [间隙连接蛋白12])、pol iii相关脑白质营养不良(polr3a和/或polr3b)、雷夫叙姆病(phyh，[植烷酰辅酶a羟化酶]和/或pex7 [phyh输入过氧化物酶体内])、salla病(也称为“游离唾液酸贮积病”，slc17a5，唾液酸转运蛋白)、斯-拉二氏综合征(áldh3a2，醛脱氢酶)、x连锁肾上腺脑白质营养不良(“ald”，abcd1，过氧化物酶体atp酶结合盒蛋白)、齐薇格综合征谱系障碍(也称为过氧化物酶体生物发生障碍，pex1，pex2，pex3，pex4，pex5，pex10，pex11b，pex12，pex13，pex14，pex16，pex19，pex26)等等。[0207]cns病症包括涉及视网膜、后束和视神经的眼病症(例如色素性视网膜炎、糖尿病视网膜病变及其它视网膜退行性疾病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性、青光眼)。[0208]大多数(如果并非全部)眼疾病和病症与以下三类适应症中的一类或多类相关：(1)血管生成、(2)炎症和(3)变性。本发明的递送载体可以用于递送抗血管生成因子；抗炎因子；延缓细胞变性、促进细胞保留或促进细胞生长和上述的组合的因子。[0209]例如，糖尿病视网膜病变的特征在于血管生成。糖尿病视网膜病变可以通过眼内(例如在玻璃体中)或眼周(例如在筋膜下区中)递送一种或多种抗血管生成因子进行治疗。一种或多种神经营养因子还可以眼内(例如玻璃体内)或眼周共递送。[0210]葡萄膜炎涉及炎症。一种或多种抗炎因子可以通过本发明的递送载体的眼内(例如玻璃体或前房)施用进行施用。[0211]相比之下，色素性视网膜炎的特征在于视网膜变性。在代表性实施方案中，色素性视网膜炎可以通过编码一种或多种神经营养因子的递送载体的眼内施用(例如玻璃体施用)进行治疗。[0212]年龄相关性黄斑变性涉及血管生成和视网膜变性两者。该病症可以通过眼内(例如玻璃体)施用编码一种或多种神经营养因子的本发明的递送载体，和/或眼内或眼周(例如在筋膜下区中)施用编码一种或多种抗血管生成因子的本发明的递送载体进行治疗。[0213]青光眼的特征在于增加的眼内压和视网膜神经节细胞的丧失。青光眼的治疗包括使用本发明的递送载体施用一种或多种神经保护剂，其保护细胞免于兴奋性毒性损害。此类试剂包括眼内，任选玻璃体内递送的n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)拮抗剂、细胞因子和神经营养因子。[0214]在其它实施方案中，本发明可以用于治疗癫痫发作，例如以减少癫痫发作的发作、发病率和/或严重性。用于癫痫发作的治疗性治疗的功效可以通过行为(例如摇晃、眼或口的轻拍(ticks))和/或电图手段(大多数癫痫发作具有特征性电图异常)进行评价。因此，本发明还可以用于治疗癫痫，其以随着时间过去的多重癫痫发作为特征。[0215]在一个代表性实施方案中，生长抑素(或其活性片段)使用本发明的递送载体施用于脑，以治疗垂体瘤。根据该实施方案，编码生长抑素(或其活性片段)的递送载体通过显微输注施用到垂体内。同样地，此类治疗可以用于治疗肢端肥大症(来自垂体的异常生长激素分泌)。生长抑素的核酸序列(例如genbank登录号j00306)和氨基酸序列(例如genbank登录号p01166；含有加工的活性肽生长抑素-28和生长抑素-14)是本领域已知的。[0216]在特定实施方案中，载体可以包含如例如美国专利号7,071,172中所述的分泌信号。[0217]在本发明的代表性实施方案中，将病毒载体和/或病毒衣壳施用于cns (例如脑或眼)。病毒载体和/或衣壳可以引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、脑垂体、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体、大脑，包括枕叶、颞叶、顶叶和额叶、皮层、基底神经节、海马和杏仁核(portaamygdala))、边缘系统、新皮层、纹状体、大脑和/或下丘。病毒载体和/或衣壳还可以施用于眼的不同区域，例如视网膜、角膜和/或视神经。[0218]病毒载体和/或衣壳可以递送到脑脊髓液内(例如通过腰椎穿刺术)用于递送载体的更分散施用。在其中血脑屏障已被扰乱(例如脑瘤或脑梗塞)的情形下，病毒载体和/或衣壳可以进一步血管内施用于cns。[0219]病毒载体和/或衣壳可以通过本领域已知的任何途径施用于所需cns区，所述途径包括但不限于鞘内、大脑内、脑室内、静脉内(例如在糖如甘露糖醇的存在下)、鼻内、耳内、眼内(例如玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如筋膜下区)递送，以及肌内递送伴随逆行递送至运动神经元。[0220]在一些实施方案中，本发明的病毒载体或组合物可以经由肠内、肠胃外、鞘内、脑池内、大脑内、脑室内、鼻内、耳内、眼内、眼周、直肠内、肌内、腹膜内、静脉内、经口、舌下、皮下和/或经皮途径进行递送。在一些实施方案中，本发明的病毒载体或组合物可以进行颅内和/或脊柱内递送。[0221]在特定实施方案中，病毒载体和/或衣壳通过直接注射(例如立体定向注射)在液体制剂中施用于所需cns区域或区室。在其它实施方案中，病毒载体和/或衣壳可以通过局部应用提供给所需区域，或通过气溶胶制剂的鼻内施用提供。对眼的施用可以通过液体小滴的局部应用进行。作为进一步的替代方案，病毒载体和/或衣壳可以作为固体缓慢释放制剂进行施用(参见例如美国专利号7,201,898)。[0222]在再另外的实施方案中，病毒载体可以用于逆向转运，以治疗和/或预防涉及运动神经元的疾病和病症(例如肌萎缩侧索硬化(als)；脊髓性肌萎缩(sma)等)。例如，病毒载体可以递送至肌肉组织，它可以从肌肉组织中迁移到神经元内。[0223]本发明已得到描述，并在下述实施例中更详细地加以说明，所述实施例包括在本文中仅用于说明性目的，并不预期是本发明的限制。实施例[0224]实施例1：经典腺相关病毒(aav)血清型2的野生型病毒基因组是大约4,700个核苷酸的单链(ss) dna基因组，并且含有具有重叠读码框的多重基因。基因组的端部的侧翼为145个核苷酸的反向末端重复(itr)序列，其预测为折叠回自身以形成发夹结构(图1a-1b)。cap基因产生衣壳vp蛋白，并且还含有帮助衣壳组装的aap的读码框。aav2 rep基因产生因其近似重量命名的四种蛋白质：rep78、rep68、rep50和rep42。小rep 50和42可以充当动力蛋白，以将新生基因组包装到预先形成的衣壳内。大rep 78和68具有用于基因组复制的核酸内切酶和atp依赖性解旋酶功能。这些大rep可以通过与itr的a区中的rep结合元件(rbe)结合来启动基因组复制。这种初始结合可能帮助解开dna链并形成切口茎，其由rep在二核苷酸tt末端解离位点(trs)处切割。另外，大rep蛋白还与在c环的尖端处的rbe'区接触(图1a-1b)。通过含有复制起点、包装信号以及在感染后对aav基因组赋予持久性的能力，itr在aav的生命周期中发挥基本作用。[0225]对于aav血清型1-4和6-7，itr的预测结构是相似的，但自始至终存在序列差异，特别是rbe中的gagc重复数目、在rbe'处的ttt或tct、在发夹环中的核苷酸、以及在d区中不参与切口茎形成的核苷酸(图1a-1c)。即使具有这些差异，aav2 rep也能够将来自血清型1、3、4和6的基因组复制且交叉包装到众多非aav2衣壳内。[0226]目前，重组aav (raav)载体生产平台依赖aav2 repꢀ–ꢀaav2 itr复制和包装系统。在raav中，aav的内部基因被去除，仅留下itr以侧接治疗盒。因此，在临床环境中，接受基因治疗的患者不仅暴露于衣壳蛋白，而且还暴露于天然病毒aav2 itr序列。这些序列在细胞中的影响在历史上研究不足，但已知的是，aav itr可能与许多宿主蛋白相互作用，并且可能刺激抗病毒和dna损害应答途径(julien等人2018 sci. rep. 8:210；qing等人2001 j. virol. 75:8968-76；satkunanathan等人2017 virology 510:46-54；raj等人2001 nature 412:914-7；hirsch等人2011 plos one 6)。[0227]在这项研究中，各种细胞系用含有来自aav血清型1、2、3、4、6和7的itr序列的aav载体进行感染，并且在体外测量其促进萤光素酶表达的能力。另外，使用萤光素酶特异性cdna的扩增来确定itr 1-4、6或7的转录起始位点(tss)。最后，floxed-萤光素酶小鼠用itr-cre重组酶载体进行注射，以在小鼠模型中评价itr启动子能力，以确定非itr2序列是否也可以在体内引发转基因表达。[0228]质粒构建：来自aav血清型1-4和6-7序列的itr序列从genscript订购，具有侧接该序列用于下游克隆的独特限制性酶位点。以一种itr/质粒订购这些itr，以预防在合成和繁殖过程中潜在的分子间重组。将这些质粒电穿孔到sure电穿孔感受态细胞(agilent，200227)内。使用对itr基因型特异性的限制性酶，就完整itr序列筛选菌落质粒，然后克隆到具有从λ噬菌体dna中随机选择的20核苷酸填充序列以及随后的萤光素酶或cre重组酶的读码框、sv40早期多聚a信号和λ噬菌体dna填充序列的2172个核苷酸的puc19主链内，以使aav载体基因组的总长度分别达到4395或3778个碱基。在质粒构建后，使用illustra templiphi sequence resolver kit (ge life sciences，28903529)，随后使用桑格测序，验证itr序列。在序列确认后，每一个后续质粒制备物都用多重itr特异性限制性酶进行消化，以确保itr序列的存在和稳定性。[0229]细胞系和病毒产物：hek293、hela和huh7细胞维持在37°c下在5% co2中在具有10%小牛血清和1%青霉素-链霉素的达尔贝科改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle's medium)中。使用三重转染方法产生重组aav载体。简言之，用含有itr的萤光素酶或cre重组酶载体质粒，含有aav2 rep和aav1、2或9 cap基因的aav辅助质粒和ad辅助质粒pxx6-80，转染以80%汇合的hek293细胞的15cm板。转染后2天，将细胞收集，裂解并经受cscl梯度超速离心。取出对应于最高病毒浓度的级分，并且在pbs (slide-a-lyzer dialyses cassettes mwco 30,000，thermo fisher，#66003)中透析。使用转基因或填充序列特异性引物和含有相同转基因或填充序列的病毒标准品，通过定量聚合酶链反应(qpcr)一式三份地确定病毒滴度。对于每一个一式三份的实验制备新的病毒分批，并且如果病毒已一起生产且滴定，则它们仅用于同一实验中，将5个病毒分批制备3次，以一式三份地测试aav1-4和6 itr，总共15个病毒分批。[0230]体外感染和萤光素酶测定：为了比较aav2/2-itr-萤光素酶和aav2/2-cba-萤光素酶，将3.2e5 hek293细胞铺平板到12孔板中的每个孔，并且在第二天用1e5 vg/细胞进行感染。感染后2天，使细胞在200ul被动裂解缓冲液(plb)中在室温下裂解20分钟。来自aav2/2-cba-萤光素酶的细胞裂解物在plb中以1:50进行稀释。25ul细胞裂解物在96孔不透明白色测定板中与100ul萤光素(luciferase assay system，promega，e1500)组合，并且用perkin elmer victor3板阅读器测量发光。来自aav2/2-cba-萤光素酶的相对光单位(rlu)值乘以其稀释因子。此处用于指示itr和衣壳血清型的命名法是aavn/n，即aav (itr基因型)/衣壳血清型。为了比较itr-萤光素酶载体，将hek293、hela和huh7细胞个别地铺平板到6孔板内。第二天，细胞用2e5 vg/细胞的aav (n)/2-itr-萤光素酶进行感染，其中n是所指示的itr基因型。两天后，去除培养基，并且将细胞在350ul被动裂解缓冲液中在室温下裂解20分钟。将裂解物转移到1.5ml管中，并且在4℃下以13,000g旋转10分钟。25ul裂解物用于bca (pierce™ꢀbca protein assay kit，23225)测定中，以确定总细胞蛋白质浓度。100ul细胞裂解物在96孔不透明白色测定板中与100ul萤光素(luciferase assay system，promega，e1500)组合，并且用perkin elmer victor3板阅读器测量发光。相对光单位针对添加的总蛋白质进行标准化。[0231]转录起始位点的鉴定：hek293细胞用aav (1-4、6或7)/2-itr-萤光素酶以2e5 vg/细胞进行感染，并且在使用qiagen rneasy试剂盒的rna收获前培养三天。遵循来自5'/3' race第二代试剂盒(roche，3353621001)的制造商说明书，使用定位于萤光素酶编码序列内的引物(5'-gtgacgaacgtgtacatcgac-3'；seq id no:8)，将大约750ng rna逆转录。然后使用qiaquick pcr纯化试剂盒(qiagen，28104)纯化合成的cdna，并且按照制造商的说明书通过末端转移酶添加多聚a尾部。然后使用所供应的正向引物5'-gaccacgcgtatcgatgtcgacttttttttttttttttv-3' (seq id no:9)和萤光素酶编码序列中的嵌套反向引物5'-cttagaaccggtcgaacaccacggtaggct-3' (seq id no:10)，进行pcr。将所得到的pcr产物纯化并用作模板，用于使用试剂盒供应的正向引物5'-gaccacgcgtatcgatgtcgac-3' (seq id no:11)和萤光素酶序列内的另一种嵌套反向引物5'ꢀ‑ttagttggatccggttccatcttccagcgg-3' (seq id no:12)的另外pcr反应。将产物纯化，针对20 ng/ul eb缓冲液进行标准化，并且将25ul送往由genewiz使用下一代测序(ngs)进行的ez扩增子测序。使用star v2.7.0a (dobin等人，2013)，通过unc lineberger bioinformatics core，对所得到的ngs数据进行分析，以将读数与参考基因组比对。bam文件在r中进行处理，以将比对起始位点的频率制成表格。在比对的前10个碱基中具有多重错配(》3)的序列被过滤，因为我们无法推断比对应该在错配之前还是之后开始。还去除了插入物大小大于预计(1000 bp)的读数对。[0232]动物研究：本研究中执行的动物实验用fvb.129s6(b6)-gt(rosa)26sortm1 (luc)kael/j小鼠22 (jackson laboratories库存编号：005125)来进行。如通过unc机构动物护理和使用委员会(unc institutional animal care and use committee) (iacuc，方案号19.023-1)批准的，按照美国国立卫生研究院指南维持小鼠。由于打架，雄性小鼠个别地进行饲养。每只小鼠经由尾静脉用100ul 1e9病毒基因组进行注射。在100ul d-萤光素底物(xenolight d-luciferin，122799，perkin elmer，waltham，ma)的i.p.注射之后，使用ivis kinetic (caliper lifesciences，waltham，ma)，对萤光素酶表达进行成像。使用living image (perkinelmer，waltham，ma)来分析生物发光图像。使用living image软件版本2.20，使用光子值来执行采集。[0233]统计学：所有统计学计算都使用统计软件(graphpad prism 8.2)来执行。数据呈现为具有组平均值的各个点。使用未配对的双尾t检验来评估关于单次比较的数据。当p值小于0.05时，不同组之间的差异被视为统计学显著的。[0234]itr血清型序列具有在体外促进萤光素酶表达的可变能力。为了确定来自各种aav基因型的itr的启动子活性，使用aav itr序列作为启动子来构建萤光素酶报道载体质粒。在载体质粒中，使用多重限制性酶评价itr序列，以确认itr的存在及其基因型身份。最初，将itr2的活性与‘强’ꢀcba启动子进行比较。将aav2-itr-萤光素酶和aav2-cba-萤光素酶包装到aav2衣壳内，并且用于以1e5 vg/细胞感染hek293细胞。感染后两天，测量萤光素酶活性，并且发现与itr2促进的萤光素酶相比，来自cba促进的萤光素酶高超过4个对数(图2a)。这证实了可以使用萤光素酶报道系统成功地测量itr2启动子活性。[0235]在aav2 rep包装系统中的itr7使用尚未在文献中报道。为了测试使用与aav2 rep和aav2衣壳组合的itr7的可行性，将含有itr7的载体与腺病毒辅助物和pxr2一起转染到hek293细胞内。通过qpcr来滴定所得到的病毒。itr7载体具有与同时制备的itr1和itr2载体相似的滴度(表2)。hek293、hela和huh7细胞用aav1/2、aav2/2和aav7/2-itr-萤光素酶以2e5 vg/细胞进行感染。感染后两天测量萤光素酶活性。相对光单位(rlu)针对加入萤光素酶测定中的细胞蛋白质总量(如通过bca测定确定的)进行标准化，然后针对itr2 rlu值进一步进行标准化(图2b-2d)。跨越所有三种细胞系，来自itr1促进的萤光素酶的rlu始终低于itr2 (p 《 0.0001)。在hek293细胞中，与itr2相比，itr1具有29%活性均值(图2b)。这种活性在hela细胞中(为35%)(图2c)，且在huh7细胞中(为32%) (图2d)略微更高。相比之下，itr7展示跨越细胞系不同的启动子活性。在huh7细胞中，与itr2相比，itr7和itr1具有相同的表达水平，分别为33%和31% (图2d)，但itr7在hela细胞中具有以62%的高于itr1的表达(p 《0.0001) (图2c)。在hek293细胞中，itr7促进的萤光素酶活性上升到83%的均值，其中一种病毒制备物具有与其它两种病毒制备物相比减少的活性(图2b)，但这种总体活性仍低于itr2 (p = 0.0029)。[0236]为了确定itr 3、4和6在这些细胞系中是否也展示启动子活性，使用itr-萤光素酶质粒来创建aav (1-4、6)/2-itr-萤光素酶载体，其中aavn/n是aav (itr基因型)/衣壳血清型。所有itr都能够被aav2 rep复制且包装，并且分批滴度在彼此的4倍内。值得注意的是，在这些复制、包装和纯化条件下，来自含有itr2的载体质粒的滴度通常是最高的，而itr6或itr7总是最低的(表2)。[0237]hek293、hela和huh7细胞用aav (1-4、6或7)/2-itr-萤光素酶载体以2e5 vg/细胞进行感染。如上所述测量萤光素酶活性。itr 3、4和6也导致测试的细胞系中的萤光素酶活性，但至不同的程度(图2e-2g)。在所有三种细胞系中，itr2和itr3导致最高的萤光素酶活性。仅在huh7细胞中，在itr2和itr3之间存在显著差异(p = 0.0082)，其中itr3平均起来比itr2多30%活性(图2g)。跨越所有细胞类型，itr1和itr6具有最低的活性，并且彼此并无统计学不同，除了在其中itr1比itr6低10% (p 《0.0001)(具有与29%相比19%的平均值)的hek293细胞中之外(图2e)。与itr2相比，itr4一致地具有62-66%的萤光素酶活性(图2e-2g)，并且在所有三种细胞系中也显著低于itr3 ( p《0.01)。因此，所观察到的来自itr的活性落入三个类别：具有最高相对活性的i类itr：itr2和itr3，具有中等活性水平的ii类：itr4，以及具有最低活性的iii类：itr1和itr6。在测试的所有itr中，仅itr7显示了细胞特异性活性(图2b-2d)。[0238]来自itr序列1-4、6的不同水平的萤光素酶活性暗示itr序列本身是萤光素酶活性的重要决定因素，但可替代地，来自含有itr2的载体的高萤光素酶活性可以是由于衣壳特异性相互作用，因为这种itr与其同源衣壳配对。为了测试包装到其相应衣壳内的itr序列是否影响萤光素酶的产生，将itr1和itr2萤光素酶载体包装到aav1衣壳内，并且用于以2e5 vg/细胞感染hek293细胞。虽然与aav1/2和aav2/2相比，总体活性是减少的，但来自aav1/1-itr-萤光素酶载体的萤光素酶活性仍低于aav2/1载体。当针对aav2进行标准化时，无论使用的衣壳如何，活性都是等价的(图3)。因此，即使当与其同源衣壳配对时，itr1仍是iii类itr。[0239]itr序列含有多重转录起始位点(tss)。测试的所有基因型的itr序列具有高cg含量(64-70%)，并且缺乏传统的tata框共有序列。为了确定萤光素酶转录物是源自单一集中的tss还是多重分散的tss，采用cdna端部的5'快速扩增(race)，以发现原始核苷酸位置。hek293细胞用aav (1-4、6或7)/2-itr-萤光素酶以2e5 vg/细胞进行感染。感染后三天，将总rna分离并使用cdna端部的5'快速扩增(race)试剂盒逆转录。将萤光素酶特异性cdna扩增且通过下一代测序(ngs)分析。对于所有itr，在每个序列内发现了多重tss，并且倾向于在rbe处聚簇，尽管itr1具有比其它itr更广泛的起始位点(图4a)。对于每种itr，3-4个核苷酸代表大多数读数，但这些热点对于每种itr是不同的。这些结果指示了关于itr促进的萤光素酶的转录物可以源自itr内的多重起始位点。[0240]由itr序列1-6驱动的cre重组酶能够在体内激活萤光素酶产生。为了查看体外发现如何转化为体内模型，在floxed萤光素酶报道小鼠品系中测试了itr启动子的能力。fvb.129s6(b6)-gt(rosa)26sortm1 (luc)kael/j小鼠系含有插入rosa26基因座内的萤光素酶开放读码框。萤光素酶表达通过loxp-终止-loxp序列得到阻止，所述loxp-终止-loxp序列可以通过cre重组酶去除。4-6周龄的雄性小鼠经由尾静脉用100ul 1e9 vg的aav (1-4、6)/9-itr-cre重组酶进行注射(n=2)。aav9因其高度转导大多数组织的能力进行选择，因此很可能是鉴定itr启动子之间的组织特异性差异(如果有的话)的最佳选择。作为阳性对照，两只小鼠用aav2/9-cmv-cre载体进行注射。在注射后3、5、7和9周，对小鼠进行成像。到注射后三周，可以在所有小鼠的腹部区域中观察到萤光素酶活性(图5a)。如预计的，已用cmv促进的cre重组酶进行注射的阳性对照小鼠具有表达萤光素酶的更多重组细胞，并且在相同的成像设置下，这些小鼠使相机完全饱和。到注射后4周，无法再检测到来自用aav2/9-itr-cre重组酶注射的小鼠之一的萤光素酶信号。在9周的时间过程期间，萤光素酶信号在剩余小鼠中保持稳定(图5b)。来自用aav2/9-itr-cre重组酶注射的小鼠的表达丧失很可能是由于衣壳抗原反应性cd8+ t细胞，但这并未进行具体调查。[0241]itr血清型序列影响体外启动子活性。itr1-4和6的itr启动子活性是足够一致的，使得它们可以分为三个类别：i、ii和iii，其中i是最高活性。跨越每个细胞系，itr2和itr3 (i类)一致地具有关于萤光素酶活性的最高值，暗示这些序列也具有比测试的其它itr更多的启动子活性，而itr1和itr6 (iii类)具有最低活性(图2a-2g)。考虑到两个序列之间的高度相似性，预计itr1和itr6的相似表达值，所述序列仅因d区中的最后一个核苷酸以及仅在d区之外的4个核苷酸而彼此不同(图1c)。i类和iii类序列之间的序列分析揭示了可以解释不同活性的几个变化点(图1c)。具体地，itr2和itr3含有在rbe'中的ttt序列，而itr1和itr6含有tct。在b环(位置45:59和46:60)和c环(68:80和70:78)中也存在一致的差异，以及在切口茎环的尖端中的位置3和122处存在c至g变化。itr7也类似于itr1序列，但具有不同的启动子活性谱(图2b-2d)。由于itr1和itr7之间仅存在不同的几个核苷酸，因此突变分析可能能够找到涉及itr7促进的萤光素酶在各种细胞类型中的差异表达的特定序列。在itr7中的位置110:15处的t:a对是在itr3、4和6处可见的相同对(图1c)，因此它不太可能涉及我们跨越测试的细胞类型观察到的不同水平的萤光素酶活性。如同itr2、3和4，itr7也具有在位置3处的切口位点附近的g以及在位置122处的c，因此这些核苷酸可能影响启动子强度。可以影响itr中的萤光素酶表达的另一个目的可变区域是d区的最后11个核苷酸，其中仅ctag基序是保守的，但不同类别的itr之间不存在可容易辨别的模式。该区域仍可能是目的区域，因为几种宿主蛋白已显示与itr2的d区相互作用。哪些序列对转基因生产具有作用的问题可以用位置特异性itr突变体来解决，但鉴于复杂的dna二级结构可能在转录中发挥不同的作用，这个问题可能难以完全解决。[0242]在此处使用的条件下，即使当包装到aav1衣壳内时，itr1仍是iii类。这反驳itr衣壳相互作用对启动子活性具有强烈影响。在这项研究中，使用aav2 rep，因此可能仍然是这样的是，这些itr序列具有同源rep可以影响raav复制、包装和转导单位的各个方面。[0243]itr促进的萤光素酶转录物的起始位点。先前的工作将itr2的a区鉴定为对于itr2促进的gfp转基因表达是重要的(haberman等人2000 j. virol. 74:8732-8739)。此处，还发现了a区是转录活性的热点，但通过使用ngs，有可能鉴定在itr序列各处的多重起始和转录因子结合位点，其主要集中于包括rbe的40碱基对的区域内(图4a-4c)。在限定的itr序列内缺乏传统的tata框，但富含胞嘧啶和鸟嘌呤，这些序列与脊椎动物基因组中发现的转录活性的cpg岛(cgi)具有惊人的相似性。目前了解cgi是脊椎动物基因组中最常见的启动子类型，出现在60-70%的注释基因中。cgi通常定义为c+g比率大于50%且观察/预期cpg二核苷酸为60%或更高的序列。aav itr序列在c+g含量和cpg频率两个方面均符合这个定义(表3)。cgi经常是复制起点，并且一般与分散在50-100碱基对的区域内的多重tss相关。这与具有单一的集中tss的启动子形成对比，所述集中tss更通常与特异性地定位的核心启动子元件相关，所述元件包括tata框、inr、tct和xcpe基序。来自该研究的数据支持以下假设：来自所检查的aav基因型的itr序列在转基因促进的背景下充当cgi类型启动子。也就是说，这个数据的另一种解释可以是这些tss实际上起因于不同和可变的附加型序列。由于起因于感染后两个itr端部的重组的所得到的序列是可变的，因此每种附加体可能具有不同的起始位点。[0244]itr1-4、6能够在小鼠模型中促进cre重组酶。体内数据证实了itr1-4、6能够促进足够高水平的cre重组酶，以诱导重组和萤光素酶的产生。在该小鼠品系中，所有itr序列1-4、6都是活跃启动子，并且这可能对于基因治疗应用具有重要意义。这些小鼠用1e11 vg进行注射，1e11 vg是5e12 vg/kg的大致等价物，并且因此是临床相关剂量。在强遍在启动子的背景下，这些itr序列很可能对总体转基因生产没有作用，但存在其中更靶向或敏感的应用可以受影响的情形，例如当使用aav递送的cre重组酶或crispr时。[0245]更重要的是，itr2启动子的双向活性可能正在诱导dsrna应答途径。先前的研究发现了，在感染后8天，aav转导刺激了mda5——dsrna应答蛋白，其识别超过2000个核苷酸长的dsrna产物(shao等人2018 jci insight 3(12):e120474)。提议当处于附加体确认时，itr的启动子活性可能驱动负链rna的产生，所述负链rna可以与正链rna结合并在转导的细胞中累积。在这种情形下，具有较低活性的启动子将是期望的，以帮助减弱先天免疫应答的这个臂。消除itr中的所有cpg岛将需要改变具有5个cpg的rbe序列，使得rep无法再有效地结合它。其它策略，例如添加侧接itr的绝缘序列以预防转录通读，可能是有成效的。[0246]此处呈现的数据显示了，来自aav血清型1-4、6和7的itr序列具有固有的启动子活性，并且这种启动子活性在itr中并非处于相等强度下。具体而言，当与itr 1、4和6相比时，itr2和itr3序列跨越多重细胞类型导致更高的萤光素酶表达。itr7是在萤光素酶表达中展示细胞特异性差异的唯一itr。tss映射到每种itr序列内的多重位置，其中大部分源自含有rbe的40碱基对的区域。在体内，测试的所有itr都具有以足够高的水平促进cre重组酶的能力，以到注射后3周时诱导cre介导的重组。当需要敏感或细胞特异性疗法时，这些数据可能帮助告知载体设计策略。因此，本研究首次显示了，关于aav1-4、6和7的itr序列具有在体外促进转基因表达的不同能力，并且这些序列含有多重tss。另外，敏感的报道小鼠品系用于证实在临床相关剂量下，itr1-4和6具有在体内促进足够的cre重组酶蛋白质的能力，以在细胞水平下具有生物学效应。[0247]前述内容是对本发明的说明，并且不应被解释为对其的限制。[0248]表1. aav基因组表2：以vg/ul计的来自使用pxx6-80和pxr2辅助质粒的载体制备物的滴度表3：aav5'itr序列中的c+g含量和cpg的观察/预期比aav血清型c+g含量观察/预期cpg比aav168.5%83.4%aav270.3%94.8%aav364.3%94.7%aav464.49%66.4%aav667.1%86.9%aav768.3%88.8%将c+g含量计算为(c+g)/n，其中c是胞嘧啶数目，g是鸟嘌呤数目，且n是所示aav血清型的5'itr序列中的核苷酸数目。使用gardiner-garden等人1987的公式计算观察/预期cpg比：((cpg)/(c*g))*n，其中cpg是观察到的cpg数目，c是胞嘧啶数目，g是鸟嘌呤数目，且n是序列中的核苷酸数目。[0249]序列 seqidno:1.aav2itr(itr2)；(ncbi参考序列nc_001401.2)ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct seqidno:2.aav1itr(itr1)；ncbi参考序列：nc_002077.1。另外，genbank：af063497.1ttgcccactccctctctgcgcgctcgctcgctcggtggggcctgcggaccaaaggtccgcagacggcagagctctgctctgccggccccaccgagcgagcgagcgcgcagagagggagtgggcaactccatcactaggggtaatc seqidno:3.aav3bitr(itr3)；genbank：af028705.1tggccactccctctatgcgcactcgctcgctcggtggggcctggcgaccaaaggtcgccagacggacgtgctttgcacgtccggccccaccgagcgagcgagtgcgcatagagggagtggccaactccatcactagaggtatgg seqidno:4.aav4itr(itr4)；ncbi参考序列：nc_001829.1。另外，genbank：u89790.1ttggccactccctctatgcgcgctcgctcactcactcggccctggagaccaaaggtctccagactgccggcctctggccggcagggccgagtgagtgagcgagcgcgcatagagggagtggccaactccatcatctaggtttgcc seqidno:5；aav6itr(itr6)；genbank：af028704.1ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct seqidno:6.aav7itr(itr7)；genbank：mp471038.1ttggccactccctctatgcgcgctcgctcgctcggtggggcctgcggaccaaaggtccgcagacggcagagctctgctctgccggccccaccgagcgagcgagcgcgcatagagggagtggccaactccatcactaggggtacc seq id no:7. 共有itrttgsccactccctctmtgcgcrctcgctcrctcrstsgsgcckgsvgaccaaaggtcbscmgacksmmgdgstytschckksmggcscsasygagygagcgagygcgcakagagggagtggscaactccatcayywrrgktwn seq id no：1-6的序列比对。









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