抗GITR抗体及其用途的制作方法

有机化合物处理,合成应用技术抗gitr抗体及其用途技术领域1.本公开涉及特异性结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)的抗体及其抗原结合片段及其使用方法。2.序列表3.序列表的正式副本以ascii格式的序列表与说明书同时通过efs-web以电子方式提交，文件名为10671wo01_sequence_listing_st25.txt，创建日期为2021年3月5日，大小为约60千字节。包含在该ascii格式文档中的序列表是说明书的一部分，并通过引用整体并入本文。背景技术：4.糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)是肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)的成员。gitr表达在调节性t细胞上为组成性高表达，在初始t细胞、nk细胞和粒细胞上为低/中等表达，并且在激活时可诱导。gitr与其配体gitrl相互作用，gitrl主要在抗原呈递细胞上表达。gitr受体激活既可以增强效应t细胞的增殖和功能，也可以减弱调节性t细胞诱导的阻抑。因此，对gitr活性的调节可以作为癌症免疫疗法和免疫病症的基础。因此，需要调节gitr活性的药剂，例如，抗体。技术实现要素：5.本公开提供了结合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)的抗体及其抗原结合片段。本文提供的抗体尤其可用于靶向表达gitr的免疫细胞，例如效应t细胞、调节性t细胞和自然杀伤(nk)细胞。抗体特别有用，因为抗体的体内截短被最小化。6.本文提供的抗体可以是全长的(例如，igg1或igg4抗体)或可以仅包含抗原结合部分(例如，fab、f(ab')2或scfv片段)，并且可以被修饰以影响功能，例如消除残留的效应子功能(reddy等人,2000,j.immunol.164:1925-1933)。7.本文提供的示例性抗gitr抗体列于本文的表7、表8和表9中。表7列出了示例性抗gitr抗体的重链可变区(hcvr)、轻链可变区(lcvr)、重链互补决定区(hcdr1、hcdr2和hcdr3)和轻链互补决定区(lcdr1、lcdr2和lcdr3)的氨基酸序列标识符。表8列出了示例性抗gitr抗体的hcvr、lcvr、hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的核酸序列标识符。表9提供了示例性抗gitr抗体的全长重链和轻链序列的序列标识符。8.本公开提供了特异性结合gitr的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含在选自由seq id no:22、28、34和40组成的组的重链可变区(hcvr)氨基酸序列内的三个重链互补决定区(hcdr1、hcdr2和hcdr3)；和在seq id no:10的轻链可变区(lcvr)氨基酸序列内的三个轻链互补决定区(lcdr1、lcdr2和lcdr3)。9.本公开提供了特异性结合gitr的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自由seq id no:22、28、34和40组成的组的hcvr氨基酸序列；和seq id no:10的lcvr氨基酸序列。10.本公开提供了特异性结合gitr的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含选自由seq id no:26、32、38和44组成的组的重链氨基酸序列；和seq id no:20的轻链氨基酸序列。11.本公开提供了特异性结合gitr的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含在经n101d、n101e、n101s或n101t突变进行修饰的seq id no:2的hcvr氨基酸序列内的三个重链cdr；和在seq id no:10的lcvr氨基酸序列内的三个轻链cdr。12.本公开提供了特异性结合gitr的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含在经n101a、n101f、n101g、n101h、n101i、n101k、n101l、n101m、n101p、n101q、n101r、n101v、n101w或n101y突变进行修饰的seq id no:2的hcvr氨基酸序列内的三个重链cdr；和在seq id no:10的lcvr氨基酸序列内的三个轻链cdr。13.本公开提供了特异性结合gitr的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含在经s103a、s103d、s103e、s103f、s103g、s103h、s103i、s103k、s103l、s103m、s103n、s103p、s103q、s103r、s103t、s103v、s103w或s103y突变进行修饰的seq id no:2的hcvr氨基酸序列内的三个重链cdr；和在seq id no:10的lcvr氨基酸序列内的三个轻链cdr。14.明确排除了本文表1中提供并在美国2017/0355774a1中公开的抗体，其中该抗体在hcvr中缺乏n101或s103修饰或突变。15.本公开提供了特异性结合gitr的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含hcvr和lcvr，其中hcvr包含选自表7中列出的hcdr3氨基酸序列中的任一者的hcdr3氨基酸序列。hcvr还可包含选自表7中列出的hcvr氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。lcvr可包含表7中列出的lcvr氨基酸序列，或与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的它们的基本上相似的序列。16.本公开还提供了特异性结合gitr的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含hcvr和lcvr氨基酸序列对(hcvr/lcvr)，所述hcvr和lcvr氨基酸序列对包含与表7中列出的lcvr氨基酸序列配对的表7中列出的hcvr氨基酸序列。根据某些实施方案，本公开提供了包含表7中列出的所述示例性抗gitr抗体中的任一者内所含的hcvr/lcvr氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述hcvr/lcvr氨基酸序列对选自由以下项组成的组：seq id no:22/10、28/10、34/10和40/10。17.本公开还提供了特异性结合gitr的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含选自表7中列出的hcdr3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列的重链cdr3(hcdr3)。18.本公开还提供了特异性结合gitr的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含hcdr3和lcdr3氨基酸序列对(hcdr3/lcdr3)，所述hcdr3和lcdr3氨基酸序列对包含与表7中提供的lcdr3氨基酸序列配对的表7中列出的hcdr3氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，本公开提供了包含表7中列出的所述示例性抗gitr抗体中的任一者内所含的hcdr3/lcdr3氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述hcdr3/lcdr3氨基酸序列对选自由以下项组成的组：seq id no:24/16、30/16、36/16和42/16。19.本公开还提供了特异性结合gitr的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表7中列出的示例性抗gitr抗体中的任一者中所含有的一组六个cdr(即，hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3)。在某些实施方案中，所述hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组选自由以下项组成的组：seq id no:4-6-24-12-14-16、4-6-30-12-14-16、4-6-36-12-14-16和4-6-42-12-14-16。20.在一个相关实施方案中，本公开提供了特异性结合gitr的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表7中列出的示例性抗gitr抗体中的任一者所定义的hcvr/lcvr氨基酸序列对中所含有的一组六个cdr(即，hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3)。例如，本公开包括特异性结合gitr的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含在选自由seq id no:24/16、30/16、36/16和42/16组成的组的hcvr/lcvr氨基酸序列对中所含有的hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组。21.本公开还提供了编码抗gitr抗体或其部分的核酸分子。例如，本公开提供了编码表7中列出的hcvr氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表8中列出的hcvr核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。22.本公开还提供编码表7中列出的lcvr氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含表8中列出的lcvr核酸序列的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列。23.本公开还提供编码表7中列出的hcdr3氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表8中列出的hcdr3核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与所述多核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本上相似的序列。24.本公开还提供了编码hcvr的核酸分子，其中所述hcvr包含一组三个cdr(即，hcdr1-hcdr2-hcdr3)，其中所述hcdr1-hcdr2-hcdr3氨基酸序列组如表7中列出的示例性抗gitr抗体中的任一者所定义。25.本公开还提供了编码hcvr和lcvr二者的核酸分子，其中所述hcvr包含表7中列出的hcvr氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列，并且其中所述lcvr包含表7中列出的lcvr氨基酸序列中的任一个的氨基酸序列。在某些实施例中，所述核酸分子包含选自表8中列出的hcvr核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列，以及选自表8中列出的lcvr核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列。在根据本文提供的该方面的某些实施方案中，所述核酸分子编码hcvr和lcvr，其中所述hcvr和lcvr二者均衍生自表7中列出的相同的抗gitr抗体。26.本公开还提供了能够表达包含抗gitr抗体的重链可变区或轻链可变区的多肽的重组表达载体。例如，本公开包括重组表达载体，所述重组表达载体包含上述核酸分子中的任一个，即编码表7中所示的hcvr、lcvr和/或cdr序列中的任一个的核酸分子。在本公开的范围内还包括宿主细胞，例如，真核宿主细胞，诸如哺乳动物宿主细胞，其中已经引入了此类载体。示例性的真核宿主细胞包括酵母和哺乳动物细胞，例如脊椎动物细胞，诸如小鼠、大鼠、猴或人细胞系，例如hkb11细胞、per.c6细胞、hek细胞或cho细胞。本文还提供了通过在允许抗体或抗体片段产生的条件下培养宿主细胞，并且回收如此产生的抗体和抗体片段，来产生抗体或其部分的方法。27.本公开包括具有经修饰的糖基化模式的抗gitr抗体。在一些实施例中，去除不合需要的糖基化位点的修饰可能是有用的，或缺乏岩藻糖部分的抗体存在于寡糖链上，例如，以增加抗体依赖性细胞的细胞毒性(adcc)功能(参见shield等人(2002)jbc 277:26733)。在其他应用中，可以进行半乳糖基化的修饰以改变补体依赖性的细胞毒性(cdc)。28.在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含特异性结合gitr的重组人抗体或其片段以及药学上可接受的载剂。在一个相关方面，本公开的特征在于一种组合物，所述组合物是抗gitr抗体和第二治疗剂的组合。在一个实施方案中，第二治疗剂是有利地与抗gitr抗体组合的任何药剂。本公开还提供了抗体-药物缀合物(adc)，该缀合物包含与细胞毒性剂缀合的抗gitr抗体。本文别处公开了涉及本公开的抗gitr抗体的示例性组合疗法、联合制剂和adc。29.在再一个方面，本公开提供了包含特异性结合gitr的重组人抗体或其片段的药物组合物，用于制造用于杀伤肿瘤细胞或用于抑制或减弱肿瘤细胞生长或以其他方式治疗患有癌症的患者的药物。在一些方面，药物组合物在治疗上与第二治疗剂组合。在一些方面，第二治疗剂是pd-1抑制剂。在一些方面，pd-1抑制剂是西米普利单抗(cemiplimab)。30.在再一方面，本公开提供了使用本文提供的抗gitr抗体或抗体的抗原结合部分来杀伤肿瘤细胞或抑制或减弱肿瘤细胞生长或以其他方式治疗患有癌症的患者的治疗方法。根据本文提供的该方面的治疗方法包括将治疗有效量的药物组合物施用于有此需要的受试者，所述药物组合物包含本文提供的抗体或抗体的抗原结合片段。所治疗的病症是通过靶向gitr和/或通过增加t细胞增殖或功能和/或抑制调节性t细胞诱导的阻抑活性而改善、缓解、抑制或预防的任何疾病或病况。在一些方面，所述方法还包括向有此需要的患者或受试者施用第二治疗剂。在一些方面，第二治疗剂是pd-1抑制剂。在一些方面，pd-1抑制剂是西米普利单抗。31.在再一个方面，本公开提供了特异性结合gitr的重组人抗体或其片段，或包含所述抗体或其片段的药物组合物，用于制造用于杀伤肿瘤细胞或用于抑制或减弱肿瘤细胞生长或以其他方式治疗患有癌症的患者的药物的用途。32.在再一个方面，本公开提供了使用抗gitr抗体或抗gitr抗体的抗原结合部分和抗pd1抗体或抗pd1抗体的抗原结合部分的组合来杀伤肿瘤细胞或抑制或减弱肿瘤细胞生长或以其他方式治疗患有癌症的患者的治疗方法。在一些方面，抗pd1抗体是西米普利单抗。根据本文提供的该方面的治疗方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗gitr和抗pd1抗体或抗原结合片段组合物的组合。所治疗的病症是通过靶向gitr和pd1两者而得到改善、缓解、抑制或预防的任何疾病或病况。33.在再一方面，本公开提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用(i)抗gitr抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含seq id no:4的氨基酸序列的hcdr1，包含seq id no:6的氨基酸序列的hcdr2，包含seq id no:24的氨基酸序列的hcdr3，包含seq id no:12的氨基酸序列的lcdr1，包含seq id no:14的氨基酸序列的lcdr2，和包含seq id no:16的氨基酸序列的lcdr3；和(ii)西米普利单抗。在一些方面，所述癌症选自由以下项组成的组：鳞状细胞皮肤癌、皮肤鳞状细胞癌(cscc)、骨髓瘤、肺癌、黑素瘤、头颈部鳞状细胞癌(scchn)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、宫颈癌例如宫颈鳞状细胞癌(宫颈scc)、乳腺癌和肾细胞癌(rcc)、腺癌、结直肠癌(crc)、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤、恶性胶质瘤、骨肉瘤、结直肠癌、胃癌(例如，具有met扩增的胃癌)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、睾丸癌、食道癌、子宫癌、子宫内膜癌、肝癌、免疫检查点阻滞(icb)初始癌和icb经历癌。34.在再一方面，本公开提供了使用抗gitr抗体或其抗原结合片段制造用于治疗有此需要的受试者的癌症的方法的药物的用途，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含seq id no:4的氨基酸序列的hcdr1，包含seq id no:6的氨基酸序列的hcdr2，包含seq id no:24的氨基酸序列的hcdr3，包含seq id no:12的氨基酸序列的lcdr1，包含seq id no:14的氨基酸序列的lcdr2，和包含seq id no:16的氨基酸序列的lcdr3。所述方法包括向受试者施用抗gitr抗体或其抗原结合片段和西米普利单抗。在一些方面，所述癌症选自由以下项组成的组：鳞状细胞皮肤癌、皮肤鳞状细胞癌(cscc)、骨髓瘤、肺癌、黑素瘤、头颈部鳞状细胞癌(scchn)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、宫颈癌例如宫颈鳞状细胞癌(宫颈scc)、乳腺癌和肾细胞癌(rcc)、腺癌、结直肠癌(crc)、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤、恶性胶质瘤、骨肉瘤、结直肠癌、胃癌(例如，具有met扩增的胃癌)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、睾丸癌、食道癌、子宫癌、子宫内膜癌、肝癌、免疫检查点阻滞(icb)初始癌和icb经历癌。35.在再一个实施方案中，本公开提供了用于治疗有此需要的受试者的癌症的方法中的抗gitr抗体或其抗原结合片段，所述方法包括向有此需要的受试者施用(i)抗gitr抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含seq id no:4的氨基酸序列的hcdr1，包含seq id no:6的氨基酸序列的hcdr2，包含seq id no:24的氨基酸序列的hcdr3，包含seq id no:12的氨基酸序列的lcdr1，包含seq id no:14的氨基酸序列的lcdr2，和包含seq id no:16的氨基酸序列的lcdr3；和(ii)西米普利单抗。在一些方面，所述癌症选自由以下项组成的组：鳞状细胞皮肤癌、皮肤鳞状细胞癌(cscc)、骨髓瘤、肺癌、黑素瘤、头颈部鳞状细胞癌(scchn)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、宫颈癌例如宫颈鳞状细胞癌(宫颈scc)、乳腺癌和肾细胞癌(rcc)、腺癌、结直肠癌(crc)、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤、恶性胶质瘤、骨肉瘤、结直肠癌、胃癌(例如，具有met扩增的胃癌)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、睾丸癌、食道癌、子宫癌、子宫内膜癌、肝癌、免疫检查点阻滞(icb)初始癌和icb经历癌。36.通过参阅接下来的详细说明，其他实施方案将变得显而易见。附图说明37.图1描绘了在猴血清或pbs中孵育时在compab1中观察到的截短增加。在猴血清中的估计截短率为大约1.5％/天且在pbs中的估计截短率为大约0.5％/天。38.图2描绘了当在小鼠中以10mg/kg给药时在compab1中观察到的截短增加。在下拉(亲和纯化)之前，将compab1掺入小鼠血清和pbs中作为第0天对照。39.图3描绘了在igg消耗的人血清中孵育后在compab1抗体中的截短增加，而在变体mab1或mab2中没有观察到截短增加。compab1抗体在c端表现出1.9％/天的截短率而在n端表现出0.7％/天的截短率。40.图4描绘了在小鼠血清中体外孵育后在compab1(也称为compab1)抗体中观察到的截短增加，而在变体mab1或mab2中没有观察到截短增加。在小鼠血清中，compab1抗体的估计截短率为至少1.7％/天。41.图5a、图5b和图5c描绘了在jurkat/hcd20细胞(图5a)、jurkat/hcd20/hgitr细胞(图5b)和jurkat/hcd20/mfgitr细胞(图5c)上，在一定浓度范围(18pm至300nm)的mab1和igg1同种型对照的细胞表面结合。使用alexa647标记的抗人igg通过流式细胞术检测结合。将荧光强度作为几何mfi绘图。h，人；mf，食蟹猕猴(macaca fascicularis)(食蟹猴)。42.图6描绘了抗体与激活的(cd25+)人原代t细胞的结合。在体外用抗cd2/抗cd3/抗cd28包被的珠粒刺激来自4个单独供体的原代人t细胞。使用流式细胞术检测在cd25+和cd25-人原代cd4+和cd8+t细胞上，在一定浓度范围(8pm至200nm)的af647缀合的mab1和af647缀合的igg1同种型对照的细胞表面结合。将荧光强度作为几何mfi绘图。hu，人43.图7描绘了抗体与cd69+食蟹猴原代t细胞的结合。在体外用抗cd2/抗cd3/抗cd28包被的珠粒刺激来自4个单独供体的原代食蟹猴t细胞。使用流式细胞术检测在cd69+和cd69-食蟹猴原代cd4+和cd8+t细胞上，在一定浓度范围(8pm至200nm)的af647缀合的mab1和af647缀合的igg1同种型对照的细胞表面结合。将荧光强度作为几何mfi绘图。mf，食蟹猕猴(食蟹猴)44.图8a、图8b、图8c和图8d描绘了jurkat/nfat-luc/hfcγr3a和jurkat/nfat-luc/mffcγr3a效应细胞中fc介导的nfat活性。将jurkat/nfat-luc/hfcγr3a和jurkat/nfat-luc/mffcγr3a与916fm至60nm的mab1或igg1同种型对照或45.8fm至3nm的抗cd20 igg1(包括无抗体对照)以及jurkat/hcd20细胞(图8a、图8c)或jurkat/hcd20/hgitr细胞(图8b)或jurkat/hcd20/mfgitr细胞(图8d)一起孵育(效应细胞与靶细胞的比例为1:2)。jurkat/nfat-luc/hfcγr3a和jurkat/nfat-luc/mffcγr3a细胞中的信号传导作为荧光素酶活性进行检测，并通过发光信号的定量来测量，以相对光单位(rlu)报告。数据来自在一式两份孔中进行的测定并且作为平均值±sd绘图。45.图9a、图9b、图9c、图9d、图9e和图9f描绘了adcc针对经工程改造为表达人或食蟹猴gitr的jurkat t细胞的抗体介导。jurkat/hcd20(图9a、图9d)、jurkat/hcd20/hgitr(图9b、图9e)或jurkat/hcd20/mfgitr(图9c、图9f)靶细胞与人nk细胞(效应细胞与靶细胞的比率为5:1)和浓度范围为9.5fm至10nm的mab1、igg1同种型对照和抗cd20 igg1一起孵育3.5小时。使用可商购获得的cytotox-glo测定法来确定细胞毒性，该测定法是使用发光读出来测量细胞群体中死细胞的相对数目的一种发光细胞毒性测定法。每张图中的虚线表示在不存在抗体的情况下添加nk细胞后观察到的非特异性细胞毒性水平。来自在一式三份孔中进行的测定的数据作为平均值±sd绘图。46.图10a、图10b、图10c和图10d描绘了针对人原代t细胞的adcc的抗体介导。从pbmc(3个供体)中分离出人原代treg(图10a、图10c)和cd8+t细胞(图10b、图10d)(靶细胞)，在培养中刺激和扩增，并与从全血(2个供体)中分离出的人原代nk细胞(效应细胞)一起孵育(效应细胞与靶细胞的比率为5:1)。将浓度范围为169fm至10nm的mab1、igg1同种型对照或抗cd3igg1与效应细胞和靶细胞一起孵育3.5小时。使用可商购获得的cytotox-glo测定法来确定细胞毒性，该测定法是测量细胞群体中死细胞的相对数目的一种发光细胞毒性测定法。每张图中的虚线表示在不存在抗体的情况下添加nk细胞后观察到的非特异性细胞毒性水平。来自在一式三份孔中进行的测定的数据作为平均值±sd绘图。47.图11a、图11b和图11c描绘了经工程改造为表达人或食蟹猴gitr的jurkat t细胞的adcp的抗体介导。用celltrace cfse染料标记的jurkat/hcd20(图11a)、jurkat/hcd20/hgitr(图11b)或jurkat/hcd20/mfgitr(图11c)靶细胞与用celltrace远红染料标记的人原代单核细胞来源的吞噬细胞和浓度范围为381fm至100nm的mab1、igg1同种型对照或抗cd20 igg1(包括无抗体对照)一起孵育1至2小时。通过在opera phoenix高含量筛选系统上荧光成像来分析吞噬作用并以远红标记的细胞群体(用远红染料标记的吞噬细胞，在647nm发射通道中检测到)内的绿色荧光强度(用cfse标记的靶细胞，在488nm发射通道中检测到)进行测量，以相对荧光单位(rfu)报告。来自在一式两份孔中进行的测定的数据作为平均值±sd绘图。48.图12a、图12b、图12c、图12d、图12e和图12f描绘了抗gitr抗体对抗cd3介导的原代cd4+t细胞增殖的影响。在存在固定浓度(2nm)的刺激性抗cd3和hek293/fcγr2b辅助细胞的情况下，将富集的人原代t细胞(6个供体)与连续稀释的mab1或igg1同种型对照在一定浓度范围(32fm至133nm)下一起孵育，包括无抗体对照。数据来自在一式三份孔中进行的测定并且作为平均值±sd绘图。通过检测氚衰变(来自并入分裂细胞中的氚化胸苷)来测量t细胞增殖并报告为cpm。每张图中的虚线表示在不存在滴定抗体的情况下添加刺激性抗cd3后观察到的增殖水平。49.图13描绘了抗gitr抗体对人gitr与人gitr-l结合的影响。通过elisa评价了在一定浓度范围(3.4pm至200nm)的人gitr蛋白hgitr.mmh与固定化的人gitr-l的结合，并确定了结合的ec50值。基于针对与hgitr-l的结合计算的ec50值，将固定浓度的重组hgitr.mmh(1.5nm)与在一定浓度范围(51pm至3μm)的mab1或igg1同种型对照一起预先孵育并添加到含有固定化的人gitr-l的孔中，以确定抗体阻断hgitr.mmh与固定化的人gitr-l结合的能力。用hrp缀合的cmyc抗体，使用tmb底物来检测hgitr.mmh的结合，并且通过分光光度法来测量od450。50.图14展示了抗gitr抗体对adc的影响。将jurkat/hcd20、jurkat/hcd20/hgitr或jurkat/hcd20/mfgitr靶细胞在有或无5％nhs的情况下与浓度范围为477fm至500nm的mab1、igg1同种型对照和抗cd20igg1(包括设为119fm的无抗体对照)一起孵育3.5小时。使用可商购获得的cytotox-glo测定法来确定细胞毒性，该测定法是测量细胞群体中死细胞的相对数目的一种发光细胞毒性测定法。每张图中的虚线表示在不存在抗体的情况下添加5％nhs后观察到的非特异性细胞毒性水平。来自在一式三份孔中进行的测定的数据作为平均值±sd绘图。51.图15a和图15b展示了当与可溶性gitr一起孵育时，抗gitr抗体不能形成能够结合c1q的免疫复合物。将30nm的gitr mab1或igg1同种型对照与重组人gitr胞外域蛋白单体hgitr.mmh(图15a)或二聚体hgitr.mfc(图15b)以1:1的摩尔比一起孵育。还评价了仅含有抗体hgitr.mmh或hgitr.mfc的对照孔。在分析之前，将所有样品稀释50倍到试剂盒检测溶液中。并行分析高(38μg eq/ml)和低(15μg eq/ml)hagg阳性对照并且观察到每个对照样品的c1q结合分别在11至26μg eq/ml和小于4μgeq/ml的预期范围内。虚线表示4μg eq/ml。来自以一式三份测试的样品的数据作为平均值±sd绘图。52.图16a和图16b描绘了在人pd-l1的存在下，来自供体555105(图16a)和供体555130(图16b)的经抗cd3刺激的原代cd3+t细胞的增强的il-2释放。在固定浓度(20nm)的西米普利单抗或一定浓度范围(76fm至200nm)的igg4p同种型对照的存在下，在rbl-2h3/αcd3 or rbl-2h3/αcd3/hpd-l1的存在下，在1:2的抗原呈递细胞与t细胞比率下，将富集的人原代t细胞与连续稀释的mab1或igg1同种型对照一起孵育。数据来自在一式三份孔中进行的测定并且作为平均值±sd绘图。根据制造商的方案，使用来自perkinelmer的人il-2试剂盒测量il-2释放量。53.图17描绘了在用mc38小鼠结肠肿瘤细胞皮下攻击的gitr/gitr-l人源化小鼠中，抗gitr抗体对肿瘤内t调节性细胞的消耗和增加的cd8+t细胞/t调节性细胞比率。54.图18展示在gitr/gitr-l-pd-1人源化小鼠中，与单独的西米普利单抗相比，1mg/kg西米普利单抗与10mg/kg mab1的组合引起mc38肿瘤生长的更大降低。55.图19a、图19b、图19c、图19d和图19e展示了在用1mg/kg西米普利单抗与0.1mg/kg(图19e)、1.0mg/kg(图19d)和10mg/kg mab1(图19c)的组合治疗的小鼠中，相对于单独的西米普利单抗(图19b)，mc38肿瘤清除的频率更高。用同种型对照的治疗如图19a所示。56.图20描绘了与单独的西米普利单抗相比，用1mg/kg西米普利单抗与10mg/kg mab1的组合治疗的携带mc38肿瘤的小鼠中的存活率更高。具体实施方式57.通过靶向肿瘤内免疫细胞来调节肿瘤微环境是用于癌症治疗的治疗方法。具体地，靶向肿瘤内t细胞的细胞表面上表达的共刺激和共抑制免疫检查点受体可以通过增强针对肿瘤细胞的细胞毒性和下调局部免疫阻抑来加强内源性抗肿瘤应答。58.肿瘤坏死因子受体超家族成员18(tnfrsf18)，也称为糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(gitr)，是在调节性t细胞(treg)和非treg(称为常规t细胞)以及免疫系统的其他细胞上表达共刺激受体。gitr在静止t细胞上以低水平表达并且在t细胞激活后上调，在激活的treg上的表达高于激活的常规t细胞(shimizu等人，nature immunology,23(2):135-142,2002)(krausz等人，the scientific world journal,7:533-66,2007)(knee等人，european journal of cancer,67:1-10,2016)。gitr在激活的treg上的差异表达谱使其成为有吸引力的靶标以优先消耗激活的肿瘤内treg以促进抗肿瘤免疫。59.mab1和mab2是优先消耗激活的treg的人igg1 gitr激动剂抗体。gitr激动剂抗体可以通过以fcγr依赖性方式(例如，抗体依赖性细胞毒性/吞噬作用[adcc/adcp])优先消耗肿瘤内treg来诱导抗肿瘤免疫，这与gitr细胞表面表达相关。这些gitr抗体可以与程序性细胞死亡-1(pd-1)检查点阻滞协同作用，在临床前模型中产生长期抗肿瘤应答。在一些方面，抗gitr抗体与pd-1抑制剂，例如西米普利单抗组合。虽然不希望局限于理论，但是pd-1抑制剂可以恢复抗gitr抗体增强抗cd3刺激的t细胞激活的能力。在一些方面，与单独的pd-1抑制剂相比，在治疗上将本文公开的抗gitr抗体与pd-1抑制剂组合引起肿瘤生长的更大降低。在一些方面，相对于单独的pd-1抑制剂，在治疗上将本文公开的抗gitr抗体与pd-1抑制剂组合引起更高的肿瘤清除频率。在一些方面，与单独的pd-1抑制剂相比，在治疗上将本文公开的抗gitr抗体与pd-1抑制剂组合引起荷瘤受试者的更高存活率。[0060]在描述本公开之前，应当理解，本公开不限于所述的特定方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不旨在进行限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限定。[0061]除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指所述值可以从列举的值变动不大于1％。举例来说，如本文所用，表述“约100”包括99和101以及它们之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。[0062]尽管与本文中描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用于本公开的实践或检验，但现在描述优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物全文以引用的方式并入本文中。[0063]糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体[0064]如本文所用，表述糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体、“gitr”等是指人糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体，其包含如seq id no:49(ncbi登录号#np_004186.1)所示的氨基酸序列。表述“gitr”包括单体gitr分子和多聚体gitr分子二者。如本文所用，表述“单体人gitr”意指不含有或不具有任何多聚化结构域并且在正常条件下作为单个gitr分子(不与另一个gitr分子直接物理连接)存在的gitr蛋白或其部分。示例性单体gitr分子是本文称为包含seq id no:45的氨基酸序列的“hgitr.mmh”(参见例如本文的实施例3)的分子。本文中使用的表述“二聚体人gitr”是指包含两个gitr分子的构建体，所述gitr分子通过接头、共价键、非共价键或通过多聚化结构域如抗体fc结构域彼此连接。示例性的二聚gitr分子包括本文称为“hgitr.mfc”和“hgitr.hfc”的那些分子，二者分别包含seq id no:46和seq id no:47的氨基酸序列。[0065]本文对蛋白、多肽和蛋白片段的所有提及意图表示各种蛋白、多肽或蛋白片段的人类形式，除非明确指出其来自非人物种。因此，除非指出是来自非人物种，例如，“小鼠gitr”、“猴gitr”等，否则表述“gitr”意指人gitr。[0066]如本文所有，表述“细胞表面表达的gitr”意指在体外或体内细胞表面上表达使得gitr蛋白的至少一部分暴露于细胞膜的细胞外侧并且可接近抗体的抗原结合部分的一种或多种gitr蛋白或其细胞外结构域。“细胞表面表达的gitr”可以包括在通常表达gitr蛋白的细胞表面上表达的gitr蛋白或由这种gitr蛋白组成。可替代地，“细胞表面表达的gitr”可以包含在细胞的表面上表达的gitr蛋白或由其组成，所述细胞通常在其表面上不表达人gitr，但是已经人工工程改造成在其表面上表达gitr。[0067]抗体和抗体的抗原结合片段[0068]如本文所用，术语“抗体”意指包含与特定抗原(例如，gitr)特异性结合或相互作用的至少一个互补决定区(cdr)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括包含四条多肽链(即通过二硫键相互连接的两条重(h)链和两条轻(l)链)的免疫球蛋白分子，以及它们的多聚体(例如，igm)。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为hcvr或vh)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：ch1、ch2和ch3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为lcvr或vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(cl1)。vh区和vl区可以进一步再划分为高变区，称为互补性决定区(cdr)，其间插有更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl由从氨基末端到羧基末端按照以下次序排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在本文提供的不同实施方案中，抗gitr抗体(或其抗原结合部分)的fr可以与人种系序列相同，或者可以是经天然或人工修饰的。可以基于两个或更多个cdr的并排分析来定义氨基酸共有序列。[0069]在本文提供的某些实施方案中，本文提供的抗gitr抗体是人抗体。如本文所用，术语“人抗体”意图包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本文提供的人抗体可以包括例如在cdr中以及特别是在cdr3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括已经将衍生自另一个哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的cdr序列植入到人框架序列上的抗体。术语“人抗体”不包括在天然存在的、未修饰的活生物体中，在没有修饰或人为干预/操纵的情况下正常存在的天然存在的分子。[0070]如本文所用，表述“抗gitr抗体”包括具有单特异性的单价抗体和单特异性二价抗体，以及包含结合gitr的第一臂和结合第二(靶标)抗原的第二臂的双特异性抗体，其中所述抗gitr臂包含如本文表7中列出的hcvr/lcvr或cdr序列中的任一者。表述“抗gitr抗体”还包括抗体-药物缀合物(adc)，该缀合物包含与药物或毒素(即，细胞毒性剂)缀合的抗gitr抗体或其抗原结合部分。表述“抗gitr抗体”还包括抗体-放射性核素缀合物(adc)，该缀合物包含与放射性核素缀合的抗gitr抗体或其抗原结合部分。[0071]在一些实施方案中，本文提供的抗体可以是重组人抗体。本文中使用的术语“重组人抗体”意图包括通过重组方式制备、表达、建立或分离的所有人抗体，诸如使用转染进宿主细胞中的重组表达载体(在下面进一步描述)表达的抗体，从重组的组合人抗体文库(在下面进一步描述)分离的抗体，从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如，taylor等人(1992)nucl.acids res.20:6287-6295)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他dna序列的任何其他方式制备、表达、建立或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体经历体外诱变(或，使用就人ig序列而言为转基因的动物时，经历体内体细胞诱变)并且因此重组抗体的vh和vl区的氨基酸序列是尽管源自人种系vh和vl序列并且与之相关，但可能在体内人抗体种系库内部不天然存在的序列。[0072]术语“特异性结合”或“特异性结合至”等意指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对较稳定的复合物。特异性结合的特征可在于至少约1x10-8 m或更低的平衡解离常数(，更小的kd指示更紧密的结合)。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域众所周知的，并且包括例如平衡透析、表面等离子共振等。如本文所述，已经通过htx生物传感器上的实时无标记生物层干涉量度分析法鉴定了与gitr特异性结合的抗体。此外，结合至gitr中的一个结构域和一个或多个另外的抗原的多特异性抗体或结合至gitr的两个不同的区域的双特异性抗体仍然被认为是如本文所用的“特异性结合”的抗体。[0073]术语“高亲和力”抗体是指如通过实时无标记生物层干涉量度分析法，例如htx生物传感器，或通过表面等离子共振，例如biacoretm，或通过溶液亲和elisa所测量的，那些对hgitr具有至少10-8m、至少约10-9m、至少约10-10m或至少约10-11m的结合亲和力(表示为kd)的单克隆抗体。[0074]术语“慢解离速率”、“koff”或“kd”意指抗体以1×10-3s-1或更小或1×10-4s-1或更小的速率常数从gitr解离，如通过实时无标记生物层干涉量度分析法，例如htx生物传感器，或通过表面等离子共振，例如biacoretm所确定。[0075]如本文所用，术语“kd”意图指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。[0076]本文提供的抗体可以是分离的抗体。如本文所用，“分离的抗体”意指已经从天然环境的至少一种组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，出于本公开的目的，已经从生物体的至少一种组分中、或者从抗体天然存在或天然产生的组织或细胞中分离或移除的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经经历至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。[0077]如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成性或基因工程化的多肽或糖蛋白。如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”是指保留结合的能力的抗体的一个或多个片段。[0078]如本文所用，术语“抗体”还包括全抗体分子的抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成性或基因工程化的多肽或糖蛋白。可以例如使用任何合适的标准技术(诸如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变结构域和任选地抗体恒定结构域的dna的操作和表达的重组基因工程技术)从全抗体分子衍生出抗体的抗原结合片段。这样的dna是已知的，和/或可以容易地从例如商业来源、dna文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以被合成。可以对dna测序，并化学地或通过使用分子生物学技术进行操作，例如，以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列为合适的构型，或导入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或删除氨基酸等。[0079]抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；(vi)dab片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补性决定区(cdr)诸如cdr3肽)或受限制的fr3-cdr3-fr4肽。如本文所用，其他经工程化的分子(诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、cdr移植抗体、双体、三体、四体、微体、纳米体(例如，单价纳米体、二价纳米体等)、小模块免疫药物(smip)和鲨鱼可变ignar结构域)也被涵盖在表述“抗原结合片段”内。[0080]抗体的抗原结合片段通常包括至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何尺寸或氨基酸组成并且通常将包含与一个或多个框架序列毗邻或符合读框的至少一个cdr。在具有vh结构域与vl结构域缔合的抗原结合片段中，vh和vl结构域可相对于彼此以任何合适的布置定位。例如，可变区可以是二聚体并且含有vh-vh、vh-vl或vl-vl二聚体。可替代地，抗体的抗原结合片段可含有单体vh或vl结构域。[0081]在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。在本公开内容的抗体的抗原结合片段内可以发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)vh-ch1；(ii)vh-ch2；(iii)vh-ch3；(iv)vh-ch1-ch2；(v)vh-ch1-ch2-ch3；(vi)vh-ch2-ch3；(vii)vh-cl；(viii)vl-ch1；(ix)vl-ch2；(x)vl-ch3；(xi)vl-ch1-ch2；(xii)vl-ch1-ch2-ch3；(xiii)vl-ch2-ch3；和(xiv)vl-cl。在可变结构域和恒定结构域的任何构型(包括上面列出的任何示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或者可以通过全长或部分铰链或接头区相连。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，其导致在单个多肽分子中的相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性的或半柔性的连接。此外，本公开的抗体的抗原结合片段可以包含具有上文所列的可变结构域和恒定结构域构型中的任一个的彼此和/或与一个或多个单体vh或vl结构域(例如，通过二硫键)呈非共价缔合的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)。[0082]正如全抗体分子那样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域都能够特异性结合至单独的抗原或相同抗原上的不同表位。使用本领域可用的常规技术，可以使任何多特异性抗体形式，包括本文公开的示例性双特异性抗体形式，适用于本公开的抗体的抗原结合片段的语境中。[0083]人抗体能够以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含大约150-160kda的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不经由链间二硫键连接，并且约75-80kda的分子由共价偶联的轻链和重链(半抗体)构成。即使在亲和纯化之后，这些形式也极难分离。[0084]第二种形式在各种完整igg同种型中的出现频率是由于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人igg4铰链的铰链区中的单个氨基酸取代可以显著减少第二种形式的出现(angal等人(1993)molecular immunology 30:105)至通常使用人igg1铰链观察到的水平。本发明涵盖在铰链、ch2或ch3区中具有一个或多个突变的抗体，这例如在产生中可以是所需的，以提高所需的抗体形式的产率。[0085]对抗体及其抗原结合片段的修饰[0086]本文公开的抗gitr抗体可以包含与本文公开的抗体的序列相比，重链和轻链可变结构域的框架和/或cdr区中的一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失，或者可以是天然或人工修饰的。在某些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)的框架区可以与人类生殖系序列一致，例如与本文所提供的抗体的序列一致，或可以被天然或人工地修饰。给定框架区(或一个或多个框架区)中的一个或多个氨基酸可以被取代，并且取代可以是保守或非保守取代。取代一个或多个cdr残基或省略一个或多个cdr也是可能的。抗体已在科学文献中描述，其中一个或两个cdr可以被分配用于结合。padlan等人(1995faseb j.9:133-139)基于公开的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区，并且得出结论，仅约五分之一到三分之一的cdr残基实际接触抗原。padlan还发现许多抗体，所述抗体中一个或两个cdr没有与抗原接触的氨基酸(另参见vajdos等人2002j mol biol 320:415-428)。因此，本文提供的抗体可在cdr区和/或框架区中被有效修饰，只要经修饰的抗体保持一种或多种期望特征，例如抗体或其抗原结合片段以小于约10-9m的ec50与hgitr结合；和/或展示与缺乏n101或s103修饰的抗体相比截短率降低。[0087]可以相对于来自本文所提供的抗体的cdr序列进行对给定cdr的修饰，并且所述修饰可以包括保守或非保守取代。可以通过分子建模和/或凭经验确定合乎需要的取代。举例来说，一个或多个cdr残基可以被占据另一人类抗体序列中的对应位置的氨基酸或此类序列的共有序列取代。[0088]此外，其抗原结合片段可以是本文公开的抗体，但经过修饰以省略一个或多个cdr和/或一个或多个框架区，只要经修饰的抗体(也称为抗原结合片段)保持与hgitr的结合。[0089]基于先前的研究，通过分子建模和/或凭经验可以从位于chothia cdr外部的kabat cdr区域鉴别出不接触抗原的cdr残基(例如hcdr2中的残基h60-h65通常是不需要的)。可以修饰本文提供的抗体或其抗原结合片段以除去或替换给定的cdr，特别是不接触抗原的cdr。轻链cdr可以用例如通用轻链cdr替代。[0090]本文公开的全人抗gitr单克隆抗体可以包含与对应种系序列相比或与本文公开的序列相比，重链和轻链可变结构域的框架和/或cdr区中的一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，或者通过将氨基酸序列与本文提供的抗体的氨基酸序列，例如表7中提供的抗体序列中的任一者进行比较，可以容易地确定此类修饰或突变。[0091]本公开包括源自本文提供的氨基酸序列中的任一者的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个框架区和/或cdr内的一个或多个氨基酸被修饰，只要经修饰的抗体保持一种或多种期望特征，例如抗体或其抗原结合片段以小于约10-9m的ec50与hgitr结合；和/或展示出体内或体外截短率降低。在获得含有一个或多个框架区和/或cdr的修饰的抗体和抗原结合片段后，可以容易地测试所述抗体和抗原结合片段的一种或多种所需特性，如结合特异性的改善、结合亲和力的增加、拮抗性或激动性生物特性(视具体情况而定)的改善或增强、免疫原性降低等。以这种通用方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本公开内。[0092]本公开包括来源于本文所公开的氨基酸序列中的任一个的抗体和其抗原结合片段，其中一个或多个框架和/或cdr区内的一个或多个氨基酸突变成得到所述抗体的种系序列的对应残基，或另一人类种系序列的对应残基，或对应种系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本领域的普通技术人员从本文所公开的重链和轻链可变区序列开始，可以容易地产生多种抗体和抗原结合片段，其包含一个或多个个别种系突变或其组合。在某些实施方案中，vh和/或vl结构域内的所有框架和/或cdr残基突变回衍生出抗体的原始种系序列中的残基。在其他实施方案中，仅某些残基被突变回原始种系序列，例如，仅存在于fr1的前8个氨基酸内或fr4的后8个氨基酸内的突变残基，或仅存在于cdr1、cdr2或cdr3内的突变残基。在其他实施方案中，框架和/或一个或多个cdr残基中的一个或多个被突变为不同的种系序列(即，与最初衍生出所述抗体的种系序列不同的种系序列)的一个或多个对应残基。此外，本公开的抗体可以含有框架和/或cdr区内的两个或更多个生殖系突变的任何组合，例如，其中某些个别残基突变为特定生殖系序列的对应残基，而不同于原始生殖系序列的某些其他残基得以保持或突变为不同生殖系序列中的相应残基。在获得含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段后，可以容易地测试所述抗体和抗原结合片段的一种或多种所需特性，如结合特异性的改善、结合亲和力的增加、拮抗性或激动性生物特性(视具体情况而定)的改善或增强、免疫原性降低等。以这种通用方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本公开内。[0093]本公开还包括抗gitr抗体，所述抗gitr抗体包含具有一个或多个保守取代的本文公开的hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列中的任一者的变体。例如，本公开包括具有hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列的抗gitr抗体，相对于本文的表7所示的hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列中的任一者，所述hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等等的保守氨基酸取代。[0094]当提及核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本相同”指示当通过适当的核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)最佳对齐时，如通过下文所论述的任何众所周知的序列同一性算法如fasta、blast或gap所测量，至少约95％，并且更优选地至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基存在核苷酸序列同一性。在某些情况下，与参考核酸分子具有大体一致性的核酸分子可以编码与参考核酸分子所编码的多肽具有相同或大体上类似的氨基酸序列的多肽。[0095]如应用于多肽，术语“大体上类似性”或“大体上类似”意指当最佳地比对时，如通过使用默认间隙重量的程序gap或bestfit，共用至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列一致性的两个肽序列。在一些方面，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(r基团)的另一氨基酸残基取代的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代大体上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列的保守取代彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似性程度以校正取代的保守性质。用于进行该调整的手段是本领域的技术人员熟知的。参见例如，pearson(1994)methods mol.biol.24:307-331，该文献以引用的方式并入本文。含有具有相似的化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括：(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链，即半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在以下文献中公开的pam250对数似然矩阵中具有正值的任何变化：gonnet等人(1992)science 256:1443-1445，该文献以引用的方式并入本文。“适度保守”替换是在pam250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。[0096]多肽的序列同一性和/或相似性通常使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用关于指定到包括保守氨基酸取代的各种取代、缺失和其他修饰的相似性度量来匹配相似序列。例如，gcg软件含有诸如gap和bestfit的程序，这些程序可以以默认参数使用，以确定紧密相关的多肽(诸如来自不同物种的生物体的同源多肽)之间，或野生型蛋白及其突变型蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，gcg 6.1版。还可以使用fasta(gcg 6.1版中的程序)使用默认或推荐参数对多肽序列进行比较。fasta(例如，fasta2和fasta3)提供查询与搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(pearson(2000)同上)。序列也可以使用smith-waterman同源搜索算法进行比较，该算法使用仿射空位搜索，空位开放罚分为12，空位延伸罚分为2，blosum矩阵为62。当将本文提供的序列与含有来自不同生物的大量序列的数据库进行对比时，另一种优选的算法是使用默认参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。参见例如altschul.等人.(1990)j.mol.biol.215:403-410和altschul等人(1997)nucleic acids res.25:3389-402，每个文献均以引用的方式并入本文。[0097]包含n101或s103修饰的抗gitr抗体[0098]根据本公开的某些实施方案，提供了在hcvr中具有n101或s103修饰的抗gitr抗体或其抗原结合片段。此类修饰为所公开的抗体提供了在体外和体内稳定性方面的理想特征。[0099]明确排除了本文表1中提供并在美国2017/0355774中公开的抗体，该抗体在hcvr中缺乏n101或s103修饰或突变。[0100]在一些方面，本文提供了在hcvr中具有n101或s103修饰的分离的抗体或其抗原结合片段。具有此类修饰的抗gitr抗体或其抗原结合片段可进一步表现出选自以下的一种或多种特性：[0101](a)在人、猴或小鼠血清中的截短率低于每天0.5％；以及[0102](b)在小鼠中的体内截短率为约0％。[0103]截短率可以通过例如实施例2、实施例5和实施例6中描述的测定法来确定。[0104]在一些情况下，抗gitr抗体或其抗原结合片段可以包含在选自由seq id no:22、28、34和40组成的组的重链可变区(hcvr)氨基酸序列内的三个重链互补决定区(hcdr1、hcdr2和hcdr3)；和在seq id no:10的轻链可变区(lcvr)氨基酸序列内的三个轻链互补决定区(lcdr1、lcdr2和lcdr3)。[0105]在一些方面，抗gitr抗体或其抗原结合片段可以包含选自由seq id no:22、28、34和40组成的组的hcvr氨基酸序列；和seq id no:10的lcvr氨基酸序列。[0106]在一些方面，抗gitr抗体可以包含选自由seq id no:26、32、38和44组成的组的重链氨基酸序列；和seq id no:20的轻链氨基酸序列。[0107]在一些方面，抗gitr抗体或其抗原结合片段可以包含在经n101a、n101f、n101g、n101h、n101i、n101k、n101l、n101m、n101p、n101q、n101r、n101v、n101w或n101y突变进行修饰的seq id no:2的hcvr氨基酸序列内的三个重链cdr；和在seq id no:10的lcvr氨基酸序列内的三个轻链cdr。例如，抗gitr抗体或其抗原结合片段可以包含在经n101d、n101e、n101s或n101t突变进行修饰的seq id no:2的hcvr氨基酸序列内的三个重链cdr；和在seq id no:10的lcvr氨基酸序列内的三个轻链cdr。[0108]在一些方面，抗gitr抗体或其抗原结合片段可以包含在经s103a、s103d、s103e、s103f、s103g、s103h、s103i、s103k、s103l、s103m、s103n、s103p、s103q、s103r、s103t、s103v、s103w或s103y突变进行修饰的seq id no:2的hcvr氨基酸序列内的三个重链cdr；和在seq id no:10的lcvr氨基酸序列内的三个轻链cdr。[0109]明确排除了本文表1中提供且美国2017/0355774中公开的抗体。该抗体在hcvr中缺乏n101或s103修饰或突变。[0110]包含fc变体的抗gitr抗体[0111]根据本公开的某些实施方案，提供了抗gitr抗体，所述抗gitr抗体包含fc结构域，所述fc结构域包含一个或多个突变，所述突变例如与中性ph相比在酸性ph下增强了或减少了抗体与fcrn受体的结合。例如，本公开包括抗gitr抗体，所述抗gitr抗体在fc结构域的ch2或ch3区中包含突变，其中一个或多个突变在酸性环境下(例如，在ph范围为从约5.5至约6.0的胞内体中)增加了fc结构域与fcrn的亲和力。当向动物施用时，此类突变可以导致抗体的血清半衰期增加。这样的fc修饰的非限制性实例包括，例如，在位置250(例如，e或q)；250和428(例如，l或f)；252(例如，l/y/f/w或t)、254(例如，s或t)和256(例如，s/r/q/e/d或t)处的修饰；或在位置428和/或433(例如，h/l/r/s/p/q或k)和/或434(例如，h/f或y)处的修饰；或在位置250和/或428处的修饰；或在位置307或308(例如，308f、v308f)和434处的修饰。在一个实施方案中，修饰包含428l(例如，m428l)和434s(例如，n434s)修饰；428l、259i(例如，v259i)和308f(例如，v308f)修饰；433k(例如，h433k)和434(例如，434y)修饰；252、254和256(例如，252y、254t和256e)修饰；250q和428l修饰(例如，t250q和m428l)；和307和/或308修饰(例如，308f或308p)。[0112]例如，本公开包括抗gitr抗体，所述抗gitr抗体包含fc结构域，所述fc结构域包含一对或多对或者一组或多组选自由以下项组成的组的突变：250q和248l(例如，t250q和m248l)；252y、254t和256e(例如，m252y、s254t和t256e)；428l和434s(例如，m428l和n434s)；以及433k和434f(例如，h433k和n434f)。前述fc结构域突变的所有可能组合和本文公开的抗体可变结构域内的其他突变都涵盖在本公开的范围内。[0113]抗gitr抗体的生物特性[0114]本公开包括以高亲和力结合单体人gitr的抗体及其抗原结合片段。例如，本公开包括以小于约12.0nm的kd结合单体人gitr(例如，hgitr.mmh)的抗gitr抗体，如通过在25℃下的表面等离子共振，例如，使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上类似的测定法所测量。在一些实施方案中，提供了在25℃下以小于约12nm、小于约10nm、小于约5nm或小于约2.0nm的kd结合单体人gitr的抗gitr抗体，如通过表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。本公开还提供了以小于约110nm、小于约90nm、小于约70nm、小于约50nm、小于约25nm或小于约15nm的kd结合单体人gitr的抗gitr抗体，如通过在25℃下的表面等离子共振，使用本文的实施例3中提供的测定法形式所测量，其中抗体是在条件培养中分泌的。[0115]本公开还包括抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗原结合片段以大于约2分钟的解离半衰期(t1/2)结合单体人gitr(例如，hgitr.mmh)，如通过在25℃的表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。根据某些实施方案，提供了抗gitr抗体，所述抗gitr抗体在25℃下以大于约2分钟、大于约4分钟、大于约6分钟、大于约7分钟或更长的t1/2结合单体人gitr，如通过表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。[0116]本公开还包括以高亲和力结合二聚体人gitr(例如，hgitr.mfc)的抗体及其抗原结合片段。例如，本公开包括以小于约1nm的kd结合二聚体人gitr的抗gitr抗体，如通过在25℃下的表面等离子共振，例如，使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上类似的测定法所测量。根据某些实施方案，提供了抗gitr抗体，所述抗gitr抗体在25℃下以小于约1nm、小于约900pm、小于约800pm、小于约700pm、小于约600pm、小于约500pm、小于约400pm、小于约300pm、小于约200pm、小于约100pm的kd结合二聚体人gitr，如通过表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。本公开还包括以小于约5nm、小于约1nm、小于约300pm或小于约100pm的kd结合二聚体人gitr的抗gitr抗体，如通过在25℃下的表面等离子共振，使用本文的实施例3中提供的测定法形式所测量，其中抗体是在条件培养中分泌的。[0117]本公开还包括抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗原结合片段以大于约4分钟的解离半衰期(t1/2)结合二聚体人gitr(例如，hgitr.mfc)，如通过在25℃的表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。根据某些实施方案，提供了抗gitr抗体，所述抗gitr抗体在25℃下以大于约4分钟、大于约9分钟、大于约10分钟、大于约35分钟或大于约70分钟或更长的t1/2结合二聚体人gitr，如通过表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。[0118]本公开还包括结合表达人或猴gitr的jurkat/hcd20靶细胞的抗体及其抗原结合片段。例如，本文提供了以高亲和力与表达人gitr或猴gitr的jurkat/hcd20细胞结合的抗体。例如，本公开包括以小于约4nm的ec50结合表达人gitr的jurkat/hcd20靶细胞的抗gitr抗体，如通过平均荧光强度(mfi)，例如使用本文的实施例7中定义的测定法形式，或基本上类似的测定法所测量。在某些实施方案中，提供了以小于约4nm、小于约3nm、小于约2nm的ec50结合表达人或猴gitr的jurkat/hcd20靶细胞的抗gitr抗体，如通过mfi，例如使用本文的实施例7中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。[0119]本公开还包括结合抗cd3/抗cd28刺激的人和食蟹猴原代t细胞的抗体及其抗原结合片段。cd25和cd69分别是人和食蟹猴原代t细胞激活的替代标志物。例如，本文提供了以高亲和力与抗cd3/抗cd28刺激的人和食蟹猴原代t细胞结合的抗体，使用本文实施例8中定义的测定法形式，或基本类似的测定法。在一些方面，抗gitr抗体或其抗原结合片段可以与pd-1抑制剂诸如西米普利单抗组合。虽然不希望局限于理论，但是在抑制性pd-l1/pd1信号传导的存在下，西米普利单抗可以恢复抗gitr抗体增强抗cd3刺激的t细胞激活的能力。[0120]本公开还包括通过人或食蟹猴fcγr3a(一种介导adcc并主要在nk细胞上表达的fc受体)介导nfat激活的抗体及其抗原结合片段。例如，本文提供了如在adcc报告因子生物测定中评价的通过人或食蟹猴fcγr3a介导nfat激活的抗体。例如，本公开包括在adcc报告因子生物测定中以小于约32pm的ec50通过人或食蟹猴fcγr3a介导nfat激活的抗gitr抗体，如通过发光，例如使用本文实施例9中定义的测定法形式，或基本上类似的测定法所测量。在某些实施方案中，提供了以小于约32pm或小于约16pm的ec50通过人或食蟹猴fcγr3a介导nfat激活的抗gitr抗体，如通过发光，例如使用本文实施例9中定义的测定法形式，或基本上类似的测定法所测量。[0121]本公开的抗体可以通过补体依赖性细胞毒性(cdc)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)起作用。“互补依赖性细胞毒性”(cdc)是指在补体的存在下通过本文提供的抗体裂解表达抗原的细胞。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(adcc)是指其中表达fc受体(fcr)的非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并由此导致靶细胞的裂解的细胞介导的反应。可以使用本领域熟知且可获得的测定来测量cdc和adcc。(参见例如，美国专利号5,500,362和5,821,337，以及clynes等人(1998)proc.natl.acad.sci.(usa)95:652-656)。抗体的恒定区对于抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力很重要。因此，可以根据抗体介导细胞毒性是否需要抗体来选择抗体的同种型。[0122]本公开还包括介导adcc的抗体及其抗原结合片段。例如，本文提供了在人原代nk细胞(效应细胞)的存在下介导针对jurkat/hcd20/hgitr和jurkat/hcd20/mfgitr(靶细胞)的adcc的抗体。例如，本公开包括在人原代nk细胞的存在下以小于约14pm的ec50介导针对jurkat/hcd20/hgitr和jurkat/hcd20/mfgitr的adcc的抗gitr抗体，如通过发光，例如使用本文实施例10中定义的测定法形式，或基本上类似的测定法所测量。在某些实施方案中，在人原代nk细胞的存在下以小于约14pm，或小于约13pm，或小于约12pm，或小于约11pm，或小于约10pm的ec50介导针对jurkat/hcd20/hgitr和jurkat/hcd20/mfgitr的adcc，如通过发光，例如使用本文的实施例10中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。[0123]在另一实例中，本文提供了在人原代nk细胞(效应细胞)的存在下介导针对人原代t细胞(靶细胞)的adcc的抗体。例如，本公开包括在人原代nk细胞的存在下以亚纳摩尔级的ec50介导针对人原代t细胞的adcc的抗gitr抗体，如通过发光，例如使用本文实施例11中定义的测定法形式，或基本上类似的测定法所测量。[0124]本公开还包括介导adcp的抗体及其抗原结合片段。例如，本文提供了在人原代单核细胞来源的吞噬细胞(效应细胞)的存在下介导针对jurkat/hcd20/hgitr和jurkat/hcd20/mfgitr(靶细胞)的浓度依赖性adcp的抗体。例如，本公开包括在人原代单核细胞来源的吞噬细胞的存在下以亚纳摩尔级的ec50介导jurkat/hcd20/hgitr和jurkat/hcd20/mfgitr的浓度依赖性adcp的抗gitr抗体，如通过绿色荧光强度，例如使用本文实施例12中定义的测定法形式，或基本上类似的测定法所测量。[0125]本公开还包括增强抗cd3介导的t细胞增殖的抗体及其抗原结合片段。例如，本文提供了在hek293/fcγr2b辅助细胞的存在下增强由刺激性cd3抗体介导的原代cd4+t细胞增殖的抗体。例如，本公开包括在hek293/fcγr2b辅助细胞的存在下增强由刺激性cd3抗体介导的原代cd4+t细胞增殖的抗gitr抗体，ec50值为亚纳摩尔级并且最大t细胞增殖(以氚衰变的cpm测量)是背景的2.3至3.1倍，例如，使用如本文实施例13中定义的测定法形式，或基本上类似的测定法所测量。[0126]在一些方面，本文提供了在hcvr氨基酸序列中具有n101或s103修饰的分离的抗体或其抗原结合片段。具有此类修饰的抗gitr抗体或其抗原结合片段可进一步表现出选自以下的一种或多种特性：[0127](a)如通过表面等离子共振所测量，在25℃下以小于约12nm的kd结合单体人gitr；[0128](b)在25℃下以大于约2分钟的t1/2结合单体人gitr；[0129](c)如通过表面等离子共振所测量，在25℃下以小于约1nm的kd结合二聚体人gitr；以及[0130](d)在25℃下以大于约5分钟的t1/2结合二聚体人gitr。[0131]在一些方面，本文提供了在hcvr氨基酸序列中具有n101或s103修饰的分离的抗体或其抗原结合片段。具有此类修饰的抗gitr抗体或其抗原结合片段可进一步表现出选自以下的一种或多种特性：[0132](a)以小于约4nm的ec50结合人和食蟹猴细胞表面gitr；[0133](b)以小于约40pm的ec50增强jurkat/nfat-luc/hfcγr3a和/或jurkat/nfat-luc/mffcγr3a效应细胞中fc介导的nfat活性；[0134](c)在人原代nk细胞的存在下以小于约20pm的ec50介导针对人原代t细胞的adcc；[0135](d)相对于不表达gitr的jurkat t细胞，在经工程改造为表达人或食蟹猴gitr的jurkat t细胞中介导至少约5倍的adcp；[0136](e)增强抗cd3介导的原代cd4+t细胞增殖；[0137](f)通过以fcγr依赖性方式优先消耗肿瘤内treg来诱导抗肿瘤免疫；以及[0138](g)以小于约7nm的ic50阻断人单体gitr与人gitr配体的结合。[0139]本发明的抗体可以具有一种或多种前述生物学特征，或它们的任何组合。本文提供的抗体的生物学特征的前述列表并非旨在穷举。通过对包括本文工作实例在内的本公开的回顾，本公开的抗体的其他生物学特征将对本领域普通技术人员来说是显而易见的。[0140]阻断gitr与gitr配体结合的抗体[0141]本公开包括阻断人gitr配体(hgitrl)与人gitr结合的抗体，例如，如在本文实施例14中描述的测定法形式中所确定的。[0142]在一些实施方案中，本文提供的抗体阻断人gitr配体(hgitrl)。在一些实施方案中，抗体或其抗体结合片段阻断人gitr配体，其阻断百分比大于约90％，ic50小于约7.0nm，如实施例14或基本上类似的测定法形式中所述。在一些实施方案中，抗体或其抗体结合片段阻断人gitr配体，其阻断百分比大于约90％、大于约95％或大于约98％，ic50小于约10nm、小于约7.0nm、小于约5.0nm或小于约3.0nm，如实施例14或基本上类似的测定法形式中所述。[0143]表位作图和相关技术[0144]术语“表位”是指与抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点(称为互补位)发生相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有超过一个表位。因此，不同抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同的生物效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链的不同区段的氨基酸在空间上并列而产生。线性表位由多肽链中的邻近氨基酸残基来产生。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖、磷酰基基团或磺酰基基团部分。[0145]本公开的抗体结合的表位可以由gitr蛋白的3个或更多个(例如，3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)氨基酸的单个邻接序列组成。可替代地，表位可以由gitr的多个非邻接氨基酸(或氨基酸序列)组成。在一些实施方案中，表位定位于gitr的gitrl结合结构域上或附近。在其他实施方案中，表位定位于gitr的gitr结合结构域外侧，例如在gitr的表面上当抗体与此类表位结合时，不干扰gitrl与gitr的结合的位置。[0146]本领域普通技术人员已知的各种技术可以用于确定抗体是否在多肽或蛋白质内“与一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括例如常规交叉阻断测定法(诸如antibodies,harlow and lane(cold spring harbor press,cold spring harb.,ny)所述)、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(reineke,2004,methods mol biol 248:443-463)和肽裂解分析。此外，可以采用诸如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(tomer,2000,protein science 9:487-496)。可用于鉴定与抗体相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及对感兴趣的蛋白进行氘标记，然后使抗体与氘标记的蛋白结合。然后，将蛋白质/抗体复合物转移至水中，以允许氢-氘交换在除抗体保护的残基(仍然是氘标记的)之外的所有残基处发生。在抗体解离后，对靶蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，从而揭示氘标记的残基，这些残基对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见例如，ehring(1999)analytical biochemistry 267(2):252-259；engen和smith(2001)anal.chem.73:256a-265a。[0147]本公开还包括结合至与本文所述的特定示例性抗体中的任一者相同的表位的抗gitr抗体(例如，包含本文的表7中列出的氨基酸序列中的任一者的抗体)。同样，本公开还包括与本文所述的特定示例性抗体中的任一者(例如，包含本文的表7中列出的氨基酸序列中的任一者的抗体)竞争与gitr结合的抗gitr抗体。[0148]通过使用本领域已知的和本文示例的常规方法，可以容易地确定抗体是否结合至与参考抗gitr抗体相同的表位，或者与参考抗gitr抗体竞争结合。例如，为了确定试验抗体是否结合至与本文提供的参考抗gitr抗体相同的表位，使参考抗体结合至gitr蛋白。然后，评估试验抗体结合至gitr分子的能力。如果试验抗体在参考抗gitr抗体饱和结合后能够结合至gitr，则可以得出以下结论：试验抗体结合至与参考抗gitr抗体不同的表位。在另一个方面，如果试验抗体在参考抗gitr抗体饱和结合后不能结合至gitr分子，则试验抗体可以结合至与本文提供的参考抗gitr抗体所结合的表位相同的表位。然后可以进行额外的例行实验(例如，肽突变和结合分析)以确认观察到的试验抗体的结合的缺乏是否实际上是由于与参考抗体结合相同的表位或者是否是空间阻断(或另一个现象)导致观察到的结合的缺乏。可以使用elisa、ria、biacore、流式细胞计量术或本领域可获得的任何其他定量或定性抗体结合测定来进行这种实验。根据本公开的某些实施方案，如果例如1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的一种抗体抑制另一种抗体的结合至少50％，但优选地75％、90％或甚至99％，如在竞争性结合测定法中所测量，则两种抗体结合至相同的(或重叠)表位(参见例如，junghans等人,cancer res.1990:50:1495-1502)。可替代地，如果抗原中基本上所有的减少或消除一种抗体结合的氨基酸突变会减少或消除另一种抗体的结合，则认为这两种抗体结合相同的表位。如果只有减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变的子集减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠表位”。[0149]为了确定抗体是否与参考抗gitr抗体竞争结合(或交叉竞争结合)，在两个方向上进行上述结合方法：在第一方向上，使参考抗体在饱和条件下结合至gitr蛋白，然后评估试验抗体与gitr分子的结合。在第二方向上，使试验抗体在饱和条件下结合至gitr分子，然后评估参考抗体与gitr分子的结合。如果在两个方向上只有第一(饱和)抗体能够结合至gitr分子，则可以得出以下结论：试验抗体和参考抗体竞争与gitr结合。如本领域普通技术人员会理解的，与参考抗体竞争结合的抗体可能不一定与参考抗体结合相同的表位，但可能通过结合重叠或相邻的表位在空间上阻断参考抗体的结合。[0150]人抗体的制备[0151]本公开的抗gitr抗体可以是全人抗体。产生单克隆抗体(包括全人单克隆抗体)的方法是本领域已知的。任何此类已知的方法均可用于本公开的背景中，以制备与人gitr特异性结合的人抗体。[0152]使用例如velocimmunetm技术，或用于生成全人单克隆抗体的任何其他类似的已知方法，初始分离出具有人可变区和小鼠恒定区的针对gitr的高亲和力嵌合抗体。如下文实验部分所述，表征和选择抗体的所期望的特征，包括亲和力、配体阻断活性、选择性、表位等。如果需要，用所需的人恒定区(例如野生型或经修饰的igg1或igg4)替换小鼠恒定区，以生成全人抗gitr抗体。虽然所选择的恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和靶特异性特征存在于可变区中。在某些情况下，直接从抗原阳性的b细胞中分离出全人抗gitr抗体。[0153]生物等效物[0154]本公开的抗gitr抗体和抗体片段涵盖具有不同于所述抗体的氨基酸序列但是保留了结合人gitr的能力的蛋白质。当与亲本序列对比时，这样的变体抗体和抗体片段包含氨基酸的一个或多个添加、缺失或取代，但显示出与所述抗体的生物学活性基本上等效的生物学活性。同样，本公开的编码抗gitr抗体的dna序列涵盖这样的序列，所述序列与所公开的序列相比包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或取代，但是编码与本发明的抗gitr抗体或抗体片段基本上生物等效的抗gitr抗体或抗体片段。以上讨论了这样的变体氨基酸和dna序列的例子。[0155]如果例如两种抗原结合蛋白或抗体是当在类似实验条件下以单次剂量或多次剂量施用相同摩尔剂量时，吸收速率和程度不展示显著差异的药物等效物或药物替代物，则将其视为生物等效的。如果一些抗体在吸收程度上相同而在吸收速率上不同，则可被视为等效物或药物替代物，但仍可被认为是生物等效的，因为吸收速率的这种差异是有意的并且反映在说明书中，对于有效体内药物浓度的达到而言不是必需的(例如在长期使用中)，并且对于所研究的特定药物产品而言被认为是医学上无关紧要的。[0156]在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在它们的安全性、纯度和效力方面没有临床上有意义的差异，则它们是生物等效的。[0157]在一个实施方案中，如果与不进行参考产品和生物产品之间的切换的连续疗法相比，患者可以进行此类切换一次或多次，而没有预期的不良反应风险的增加，包括免疫原性的临床上显著的变化、或减少的有效性，则两种抗原结合蛋白是生物等效的。[0158]在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白都通过针对一个或多个使用条件的一种或多种共同作用机制来发挥作用，以达到此类机制是已知的程度，则所述两种抗原结合蛋白是生物等效的。[0159]生物等效性可以通过体内和体外方法来展示。生物等效性度量包括，例如，(a)在人或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量了随时间推移的血液、血浆、血清或其他生物流体中的抗体或其代谢物的浓度；(b)与人体内生物利用率数据相关联并且可以合理地预测人体内生物利用率数据的体外测试；(c)在人或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量了随时间推移的抗体(或其靶标)的适当急性药理作用；以及(d)建立抗体的安全性、功效或生物利用率或生物等效性的良好对照的临床试验。[0160]本发明的抗gitr抗体的生物等效变体可以通过例如对残基或序列进行各种取代或者使生物学活性不需要的末端或内部残基或序列缺失来构建。举例来说，可以缺失不是生物活性必需的半胱氨酸残基或用其他氨基酸替换，以防止在复性时形成不必要的或不正确的分子内二硫桥键。在其他情况下，生物等效抗体可以包括抗gitr抗体变体，所述抗gitr抗体变体包含修饰抗体的糖基化特征的氨基酸改变，例如消除或除去糖基化的突变。[0161]物种选择性和物种交叉反应性[0162]根据某些实施方案，本公开提供了抗gitr抗体，所述抗gitr抗体与人gitr结合但是不与来自其他物种的gitr结合。本发明还包括与人gitr和来自一种或多种非人物种的gitr结合的抗gitr抗体。例如，本文提供的抗gitr抗体可以与人gitr结合并且可以视情况而定与小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、奶牛、马、骆驼、食蟹猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩gitr中的一者或多者结合或不结合。根据本公开的某些示例性实施方案，提供了抗gitr抗体，所述抗gitr抗体特异性结合人gitr和食蟹猴(例如，食蟹猕猴)gitr。本文提供的其他抗gitr抗体结合人gitr，但不结合或仅弱结合食蟹猴gitr。[0163]多特异性抗体[0164]本公开的抗体可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。多特异性抗体可以对一种靶多肽的不同表位具有特异性，或者可以含有对多于一种靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如，tutt等人.,1991,j.immunol.147:60-69；kufer等人.,2004,trends biotechnol.22:238-244。本公开的抗gitr抗体可以连接至另一个功能分子(例如另一个肽或蛋白质)或者与另一个功能分子共表达。例如，抗体或其片段可以功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他分子实体(诸如另一个抗体或抗体片段)，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。[0165]本公开包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂结合人gitr，而免疫球蛋白的另一个臂对第二抗原具有特异性。gitr结合臂可以包含本文的表7中列出的hcvr/lcvr或cdr氨基酸序列中的任一者。在某些实施方案中，gitr结合臂结合人gitr并阻断gitrl与gitr的结合。在其他实施方案中，gitr结合臂结合人gitr，但不阻断gitrl与gitr的结合。在一些实施方案中，gitr结合臂结合人gitr并激活gitr信号传导。在其他实施方案中，gitr结合臂阻断gitrl介导的受体刺激。本公开还包括双特异性抗体，其中抗体的一条臂结合人gitr的第一表位，而所述抗体的另一条臂结合人gitr的第二不同表位。[0166]可以在本公开的上下文中使用的示例性双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(ig)ch3结构域和第二ig ch3结构域，其中第一和第二ig ch3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中与不具有氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异降低双特异性抗体与蛋白a的结合。在一个实施方案中，第一ig ch3结构域结合蛋白a并且第二ig ch3结构域含有降低或消除蛋白a结合的突变，例如h95r修饰(根据imgt外显子编号；根据eu编号的h435r)。第二ch3还可以包含y96f修饰(按照imgt；按照eu的y436f)。在第二ch3内可能发现的其他修饰包括：在igg1抗体的情况下，d16e、l18m、n44s、k52n、v57m和v82i(按照imgt；按照eu的d356e、l358m、n384s、k392n、v397m和v422i)；在igg2抗体的情况下，n44s、k52n和v82i(imgt；按照eu的n384s、k392n和v422i)；以及在igg4抗体的情况下，q15r、n44s、k52n、v57m、r69k、e79q和v82i(按照imgt；按照eu的q355r、n384s、k392n、v397m、r409k、e419q和v422i)。上述双特异性抗体形式的变化被涵盖在本公开内容的范围内。[0167]可以在本公开的语境中使用的其他示例性双特异性形式包括但不限于例如基于scfv的或双体双特异性形式、igg-scfv融合体、双可变结构域(dvd)-ig、四源杂交瘤、钮入孔、共同轻链(例如，具有钮入孔的共同轻链等)、crossmab、crossfab、(seed)体、亮氨酸拉链、duobody、igg1/igg2、双重作用fab(daf)-igg和mab2双特异性形式(关于前述形式的综述，参见例如，klein等人,2012,mabs 4:6,1-11，以及其中引用的参考文献)。还可以使用肽/核酸缀合构建双特异性抗体，例如，其中使用具有正交化学反应性的非天然氨基酸来产生位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，然后将其自组装成具有确定组成、价数和几何形状的多聚体复合物。(参见，例如，kazane等人,j.am.chem.soc.[epub:2012年12月4日])。[0168]治疗制剂和施用[0169]本公开提供了包含本公开的抗gitr抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本文提供的药物组合物用合适的载剂、赋形剂、和提供改善的转移、递送、耐受性等等的其他药剂来配制。众多的适当配制物可以见于所有医药化学家已知的处方集中：remington's pharmaceutical sciences,mack publishing company,宾夕法尼亚州伊斯顿(easton,pa)。这些制剂包括例如粉末剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)囊泡(诸如lipofectintm,life technologies,carlsbad,ca)、dna缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳剂碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶剂和含有碳蜡的半固体混合物。还参见powell等人“compendium of excipients for parenteral formulations”pda(1998)j pharm sci technol 52:238-311。[0170]施用于患者的抗体的剂量可以根据患者的年龄和大小、目标疾病、病症、给药途径等等而变化。优选的剂量通常根据体重或体表面积来计算。在成年患者中，通常以约0.01至约20mg/kg体重、更优选地约0.02至约7、约0.03至约5、或约0.05至约3mg/kg体重的单剂量静脉内施用本公开的抗体可以是有利的。视病症的严重程度而定，可以调整治疗的频率和持续时间。可以凭经验确定抗gitr抗体施用的有效剂量和排程；例如，可以通过定期评估来监测患者进展，并且相应地调整剂量。此外，可以使用本领域熟知的方法进行剂量的物种间按比例缩放(例如mordenti等人,1991,pharmaceut.res.8:1351)。[0171]各种递送系统是已知的，并且可以用于施用本文提供的药物组合物，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞体中(参见例如，wu等人,1987,j.biol.chem.262:4429-4432)。引入的方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述组合物可以通过任何便利的途径，例如通过输注或团注、通过经上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收施用，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性或局部的。[0172]可以用标准针头和注射器皮下地或静脉内地递送本公开内容的药物组合物。此外，对于皮下递送，笔式递送装置易于应用于递送本公开的药物组合物。这种笔式递送装置可以重复使用或是一次性的。可重复使用的笔式递送装置一般利用含有药物组合物的可更换的筒。一旦筒内的所有药物组合物都已施用并且筒变空时，就可以容易地丢弃空筒并且更换为含有药物组合物的新筒。然后可以再使用笔式递送装置。在一次性笔式递送装置中，没有可更换的筒。实际上，一次性笔式递送装置在装置内的储集器中预填充有药物组合物。一旦清空储集器中的药物组合物，就丢弃整个装置。[0173]多种可重复使用的笔式递送装置和自动注射器递送装置应用于皮下递送本公开的药物组合物。实例包括但不限于autopentm(owen mumford,inc.,woodstock,uk)、disetronictm笔(disetronic medical systems,bergdorf,switzerland),humalog mix 75/25tm笔、humalogtm笔、humalin 70/30tm笔(eli lilly and co.,indianapolis,in)、novopentm i、ii和iii(novo nordisk,copenhagen,denmark)、novopen juniortm(novo nordisk,copenhagen,denmark)、bdtm笔(becton dickinson,franklin lakes,nj)、optipentm、optipen protm、optipen starlettm和opticliktm(sanofi-aventis,frankfurt,germany)等等。可用于本公开的药物组合物的皮下递送的一次性笔递送装置的实例包括但不限于solostartm笔(sanofi-aventis)、flexpentm(novo nordisk)、和kwikpentm(eli lilly)、sureclicktm自动注射器(amgen,thousand oaks,ca)、penlettm(haselmeier,stuttgart,germany)、epipen(dey,l.p.)、和humiratm笔(abbott labs,abbott park il)等等。[0174]在某些情形下，药物组合物可以在控制释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见langer,同上；sefton,1987,crc crit.ref.biomed.eng.14:201)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料；参见medical applications of controlled release,langer和wise(编辑),1974,crc pres.,boca raton,florida。在又一个实施方案中，可以将控释系统放置于组合物靶标附近，因此只需要全身剂量的一小部分(参见例如，goodson,1984,载于medical applications of controlled release,同上,第2卷,第115-138页)。其他控释系统在langer,1990,science 249:1527-1533的综述中有所讨论。[0175]可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴液输注等的剂型。这些可注射制剂可以通过众所周知的方法制备。举例来说，可注射制剂可以例如将上文所描述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于常规地用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备。作为用于注射的水性介质，有例如生理盐水、含有葡萄糖和其他辅助剂的等渗溶液等，它们可以与适当的增溶剂(诸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、hco-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等)组合使用。作为油性介质，采用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等组合使用。由此制备的注射剂优选地填充于适当安瓿中。[0176]有利地，将用于上文所描述的口服或不经肠使用的药物组合物制备成适合于符合活性成分剂量的单位剂量的剂型。此类呈单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。所含有的前述抗体的量通常为在单位剂量中每剂型约5至约500mg；尤其是在注射形式中，对于其他剂型，所含有的前述抗体的量为约5至约100mg和约10至约250mg是优选的。[0177]抗体的治疗用途[0178]本公开包括方法，所述方法包括将包含抗gitr抗体(例如，包含本文的表7中列出的hcvr/lcvr或cdr序列中的任一者的抗gitr抗体)的治疗组合物施用于有此需要的受试者。治疗组合物可包含本文公开的抗gitr抗体、其抗原结合片段或adc中的任一者，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。[0179]本文提供的抗体尤其可用于治疗、预防和/或改善与gitr表达或活性相关或由其介导的任何疾病或病症，或者可通过阻断gitr和gitrl之间的相互作用，和/或刺激gitr活性和/或信号传导来治疗的任何疾病或病症。例如，本公开的抗体和抗原结合片段可用于通过例如，gitr激活调节免疫应答，即抗肿瘤应答来治疗免疫和增殖性疾病或病症，例如癌症。[0180]在一些实施方案中，本文所述的抗体不依赖于其配体阻断能力(例如，通过adcc)来消耗表达高水平gitr的细胞。本公开的抗体和抗原结合片段可用于通过增强免疫应答来治疗疾病或病症。本公开包括调节受试者的抗肿瘤免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的抗gitr抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，本公开的抗体或抗原结合片段增强了有益于治疗益处的肿瘤内t效应细胞/t调节性细胞的比率。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段增强了有益于治疗益处的肿瘤内t调节性细胞消耗。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段增加了有益于治疗益处的cd8+t细胞/t调节性细胞的比率。在一些实施方案中，本公开的抗体或抗原结合片段促进t细胞存活。[0181]可用抗体和抗原结合片段治疗的示例性疾病或病症包括免疫和增殖性疾病或病症，例如癌症。本公开的抗体和抗原结合片段可用于治疗在脑和脑膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、雄性和雌性生殖道、肌肉、骨、皮肤和附件、结缔组织、脾、免疫系统、造血细胞和骨髓、肝脏和泌尿道以及特殊感觉器官诸如眼睛中出现的原发性和/或转移性肿瘤。在一些实施方案中，本公开的抗体和抗原结合片段用于治疗实体瘤或血源性肿瘤。在某些实施方案中，本文提供的抗体用于治疗以下的一种或多种：鳞状细胞皮肤癌、皮肤鳞状细胞癌(cscc)、骨髓瘤、肺癌、黑素瘤、头颈部鳞状细胞癌(scchn)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、宫颈癌例如宫颈鳞状细胞癌(宫颈scc)、乳腺癌和肾细胞癌(rcc)、腺癌、结直肠癌(crc)、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、结直肠癌、胃癌(例如，具有met扩增的胃癌)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、睾丸癌、食道癌、子宫癌、子宫内膜癌或肝癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗免疫检查点阻滞(icb)初始癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗icb经历癌。[0182]在一些方面，本公开的抗体用于治疗结直肠癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗头颈部鳞状细胞癌(hnscc或scchn)。在一些方面，本公开的抗体用于治疗皮肤鳞状细胞癌(cscc)。在一些方面，本公开的抗体用于治疗胃癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗非小细胞肺癌(nsclc)。在一些方面，本公开的抗体用于治疗宫颈癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗食道癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗黑素瘤。在一些方面，本公开的抗体用于治疗三阴性乳腺癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗肾细胞癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗乳腺癌。[0183]在某些实施方案中，本文提供的抗体可用于治疗自身免疫性疾病，包括但不限于斑秃、自身免疫性肝炎、乳糜泻、格雷夫斯病(graves’disease)、格林-巴利综合征(guillain-barre syndrome)、桥本氏病(hashimoto’s disease)、溶血性贫血、炎性肠病、炎性肌病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征(syndrome)、全身性红斑狼疮、白癜风、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性血小板减少性紫癜、克罗恩病(crohn’s disease)、i型糖尿病、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性肠胃炎、古德帕斯彻综合征(goodpasture’s syndrome)、重症肌无力、银屑病性关节炎、风湿热、溃疡性结肠炎、脉管炎和韦格纳肉芽肿病(wegener’s granulomatosis)。[0184]在本文所述的治疗方法的背景下，可以将抗gitr抗体作为单药疗法(即，作为唯一的治疗剂)或与一种或多种另外的治疗剂(所述治疗剂的实例在本文别处有所描述)组合施用。[0185]组合疗法和制剂[0186]本文还提供了利用本公开的抗gitr抗体和可以有利地与本公开的抗体或其抗原结合片段组合的任何另外的治疗剂的组合疗法。[0187]本公开包括包含本文所述的抗gitr抗体中的任一者与一种或多种另外的治疗活性组分组合的组合物和治疗制剂，以及包括将此类组合施用于对其有需要的受试者的治疗方法。[0188]本公开的抗体可以与一种或多种用于治疗癌症的抗癌药物或疗法协同组合，包括例如，在某些实施方案中，本文提供的抗体用于治疗以下的一种或多种：鳞状细胞皮肤癌、皮肤鳞状细胞癌(cscc)、骨髓瘤、肺癌、黑素瘤、头颈部鳞状细胞癌(scchn)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、宫颈癌例如宫颈鳞状细胞癌(宫颈scc)、乳腺癌和肾细胞癌(rcc)、腺癌、结直肠癌(crc)、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤、恶性胶质瘤、骨肉瘤、结直肠癌、胃癌(例如，具有met扩增的胃癌)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、睾丸癌、食道癌、子宫癌、子宫内膜癌或肝癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗免疫检查点阻滞(icb)初始癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗icb经历癌。[0189]在一些方面，本公开的抗体用于治疗结直肠癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗头颈部鳞状细胞癌(hnscc或scchn)。在一些方面，本公开的抗体用于治疗皮肤鳞状细胞癌(cscc)。在一些方面，本公开的抗体用于治疗胃癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗非小细胞肺癌(nsclc)。在一些方面，本公开的抗体用于治疗宫颈癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗食道癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗黑素瘤。在一些方面，本公开的抗体用于治疗三阴性乳腺癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗肾细胞癌。在一些方面，本公开的抗体用于治疗乳腺癌。[0190]本文考虑使用本文提供的抗gitr抗体与免疫刺激疗法和/或免疫支持疗法的组合来抑制肿瘤生长，和/或增强癌症患者的存活率。免疫刺激疗法包括直接免疫刺激疗法，通过在受阻抑的免疫细胞上“松开制动踏板”或“踩踏油门”来激活免疫应答，从而增大免疫细胞活性。实例包括靶向其他检查点受体、疫苗接种和佐剂。免疫支持形式可通过促进免疫原性细胞死亡、炎症来增加肿瘤的抗原性或具有促进抗肿瘤免疫应答的其他间接效应。实例包括放射、化学疗法、抗血管生成剂和手术。[0191]本公开包括调节受试者的抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用抗gitr抗体与一种或多种针对激活受体的激动性抗体和一种或多种针对抑制性受体的阻断性抗体的组合，所述阻断性抗体增强t细胞刺激以促进肿瘤破坏。[0192]本公开包括调节受试者的抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的抗gitr抗体或抗原结合片段与一种或多种分离的抗体或其抗原结合片段的组合，所述分离的抗体或其抗原结合片段与第二t细胞激活受体(即，除gitr外)结合。在一些实施方案中，第二t细胞激活受体是cd28、ox40、cd137、cd27或vem。本公开还包括包含本文提供的抗gitr抗体或其抗原结合片段和结合所述第二t细胞激活受体的抗体或抗原结合片段的制剂。[0193]在各种实施方案中，本公开的一种或多种抗体可以与以下组合：pd-l1的抗体、pd-1的抗体(例如，纳武单抗(nivolumab)、西米普利单抗)、lag-3抑制剂、ctla-4抑制剂(例如，伊匹单抗(ipilimumab))、tim3抑制剂、btla抑制剂、tigit抑制剂、cd47抑制剂、另一种t细胞共抑制剂或配体的拮抗剂(例如，cd-28、2b4、ly108、lair1、icos、cd160或vista的抗体)、吲哚胺-2,3-双加氧酶(ido)抑制剂、血管内皮生长因子(vegf)拮抗剂[例如，“vegf-陷阱”，诸如阿柏西普(aflibercept)或如us 7,087,411中所示的其他vegf抑制性融合蛋白，或抗vegf抗体或其抗原结合片段(例如，贝伐单抗(bevacizumab)或兰尼单抗(ranibizumab))或vegf受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))]、ang2抑制剂(例如，奈斯伐单抗(nesvacumab))、转化生长因子β(tgfβ)抑制剂、表皮生长因子受体(egfr)抑制剂(例如，厄洛替尼、西妥昔单抗(cetuximab))、共刺激受体激动剂(例如，糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白的激动剂)、肿瘤特异性抗原(例如，ca9、ca125、黑素瘤相关抗原3(mage3)、癌胚抗原(cea)、波形蛋白、肿瘤-m2-pk、前列腺特异性抗原(psa)、粘蛋白-1、mart-1和ca19-9)的抗体、疫苗(例如，卡介苗、癌症疫苗)、增加抗原呈递的佐剂(例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、双特异性抗体(例如，cd3xcd20双特异性抗体、psmaxcd3双特异性抗体)、细胞毒素、化学治疗剂(例如，达卡巴嗪、替莫唑胺、环磷酰胺、多西他赛、多柔比星、柔红霉素、顺铂、卡铂、吉西他滨、氨甲蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、和长春新碱)、环磷酰胺、放射疗法、il-6r抑制剂(例如，沙利鲁单抗(sarilumab))、il-4r抑制剂(例如，度普利尤单抗(dupilumab))、il-10抑制剂、细胞因子(诸如il-2、il-7、il-21和il-15)、抗体-药物缀合物(adc)(例如，抗cd19-dm4adc和抗ds6-dm4 adc)、抗炎药物(例如，皮质类固醇和非甾体抗炎药)、膳食补充剂(诸如抗氧化剂)或治疗癌症的任何姑息治疗。在某些实施方案中，本公开的抗gitr抗体可以与癌症疫苗组合使用以增大抗肿瘤应答，所述癌症疫苗包括树突细胞疫苗、溶瘤病毒、肿瘤细胞疫苗等。可与本公开的抗gitr抗体组合使用的癌症疫苗的实例包括用于黑素瘤和膀胱癌的mage3疫苗、用于乳腺癌的muc1疫苗、用于脑癌(包括多形性胶质母细胞瘤)的egfrv3(例如，rindopepimut)或alvac-cea(用于cea+癌症)。[0194]在一些实施方案中，本文所述的一种或多种抗gitr抗体与一种或多种抗pd1抗体，包括但不限于美国专利公开号2015/0203579和美国专利号9,987,500中描述的那些组合施用，这些专利中的每一个都通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，抗gitr抗体是来自美国2017/0355774a1的，如本文所述进行修饰的抗体。在一些实施方案中，抗pd1抗体是西米普利单抗、帕博利珠单抗(pembrolizumab)或纳武单抗。[0195]在某些实施方案中，本文提供的抗gitr抗体可在方法中与放射疗法组合施用以产生长期持久的抗肿瘤应答和/或增强癌症患者的存活率。在一些实施方案中，本文提供的抗gitr抗体可以在向癌症患者施用放射疗法之前、同时或之后施用。例如，可以以一个或多个剂量向肿瘤病变施用放射治疗，随后施用一个或多个剂量的本文提供的抗gitr抗体。在一些实施方案中，可以向肿瘤病变局部施用放射疗法，以增强患者肿瘤的局部免疫原性(辅助性放射)和/或杀伤肿瘤细胞(消融性放射)，随后全身施用本文提供的抗gitr抗体。例如，可以向患有脑癌(例如，多形性胶质母细胞瘤)的患者施用颅内放射，与全身施用本文提供的抗gitr抗体组合。在某些实施方案中，本文提供的抗gitr抗体可以与放射疗法和化学治疗剂(例如，替莫唑胺(temozolomide))或vegf拮抗剂(例如，阿柏西普)组合施用。[0196]在某些实施方案中，本文提供的抗gitr抗体可以与一种或多种抗病毒药物组合施用，以治疗由lcmv、hiv、hpv、hbv或hcv引起的慢性病毒感染。抗病毒药物的实例包括但不限于齐多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、利巴韦林(ribavirin)、洛匹那韦(lopinavir)、依法韦仑(efavirenz)、考比斯他(cobicistat)、替诺福韦(tenofovir)、利匹韦林(rilpivirine)以及皮质类固醇。在一些实施方案中，本文提供的抗gitr抗体可以与lag3抑制剂、ctla-4抑制剂或另一种t细胞共抑制剂的任何拮抗剂组合施用，以治疗慢性病毒感染。[0197]在某些实施方案中，本文提供的抗gitr抗体可以与针对免疫细胞上的fc受体的抗体组合，用于治疗自身免疫性疾病。在一个实施方案中，本文提供的抗体或其片段与靶向至自身免疫组织的特异性抗原的抗体或抗原结合蛋白组合施用。在某些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段与靶向至t细胞受体或b细胞受体的抗体或抗原结合蛋白组合施用，所述t细胞受体或b细胞受体包括但不限于fcα(例如，cd89)、fcγ(例如，cd64、cd32、cd16a和cd16b)、cd19等。本文提供的抗体或其片段可以与本领域已知的任何药物或疗法(例如皮质类固醇和其他免疫抑制剂)组合用于治疗自身免疫性疾病或病症，包括但不限于斑秃、自身免疫性肝炎、乳糜泻、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏病、溶血性贫血、炎性肠病、炎性肌病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征、全身性红斑狼疮、白癜风、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性血小板减少性紫癜、克罗恩病、i型糖尿病、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性肠胃炎、古德帕斯彻综合征、重症肌无力、银屑病性关节炎、风湿热、溃疡性结肠炎、脉管炎和韦格纳肉芽肿病。[0198]本公开还包括调节受试者的抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的抗gitr抗体或抗原结合片段与一种或多种分离的抗体或其抗原结合片段的组合，所述分离的抗体或其抗原结合片段与t细胞抑制受体结合。在一些实施方案中，t细胞抑制受体是ctla-4、pd-1、tim-3、btla、vista或lag-3。本公开还包括包含本文提供的抗gitr抗体或其抗原结合片段和结合所述t细胞抑制受体的抗体或抗原结合片段的制剂。在一些方面，例如，在pd1信号传导的存在下，西米普利单抗恢复抗gitr抗体增强抗cd3刺激的t细胞激活的能力。[0199]本公开还包括通过连同放射或化学疗法向受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段或制剂来治疗癌症的方法。[0200]在一些实施方案中，本公开的抗gitr抗体与一种或多种另外的治疗活性组分联合配制和/或组合施用，所述治疗活性成分选自由以下项组成的组：egfr拮抗剂(例如，抗egfr抗体[例如，西妥昔单抗或帕尼单抗]或egfr小分子抑制剂[例如，吉非替尼或厄洛替尼])、另一种egfr家族成员诸如her2/erbb2、erbb3或erbb4的拮抗剂(例如，抗erbb2[例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)或t-dm1]、抗erbb3或抗erbb4抗体或erbb2、erbb3或erbb4活性的小分子抑制剂)、egfrviii的拮抗剂(例如，特异性结合egfrviii的抗体)、cmet拮抗剂(例如，抗cmet抗体)、igf1r拮抗剂(例如，抗igf1r抗体)、b-raf抑制剂(例如，威罗菲尼(vemurafenib)、索拉非尼、gdc-0879、plx-4720)、pdgfr-α抑制剂(例如，抗pdgfr-α抗体)、pdgfr-β抑制剂(例如，抗pdgfr-β抗体或小分子激酶抑制剂，例如甲磺酸伊马替尼或苹果酸舒尼替尼)、pdgf配体抑制剂(例如，抗pdgf-a、pdgf-b、pdgf-c或pdgf-d抗体、适体、sirna等)、vegf拮抗剂(例如，vegf-陷阱诸如阿柏西普，参见例如，us 7,087,411(本文也称为“vegf抑制融合蛋白”)、抗vegf抗体(例如，贝伐单抗)、vegf受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼或帕扎帕尼))、dll4拮抗剂(例如，us2009/0142354中公开的抗dll4抗体，诸如regn421)、ang2拮抗剂(例如，us 2011/0027286中公开的抗ang2抗体，诸如h1h685p)、folh1拮抗剂(例如，抗folh1抗体)、steap1或steap2拮抗剂(例如，抗steap1抗体或抗steap2抗体)、tmprss2拮抗剂(例如，抗tmprss2抗体)、msln拮抗剂(例如，抗msln抗体)、ca9拮抗剂(例如，抗ca9抗体)、uroplakin拮抗剂(例如，抗uroplakin[例如，抗upk3a]抗体)、muc16拮抗剂(例如，抗muc16抗体)、tn抗原拮抗剂(例如，抗tn抗体)、clec12a拮抗剂(例如，抗clec12a抗体)、tnfrsf17拮抗剂(例如，抗tnfrsf17抗体)、lgr5拮抗剂(例如，抗lgr5抗体)、单价cd20拮抗剂(例如，单价抗cd20抗体诸如利妥昔单抗(rituximab))等。可以与本文提供的抗体组合有益地施用的其他药剂包括例如他莫昔芬、芳香酶抑制剂和细胞因子抑制剂，包括小分子细胞因子抑制剂和与细胞因子诸如il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-8、il-9、il-11、il-12、il-13、il-17、il-18或其各自的受体结合的抗体。[0201]本公开包括包含本文所述的抗gitr抗体中的任一者与一种或多种化学治疗剂的组合的组合物和治疗制剂。化学治疗剂的实例包括：烷化剂类，例如，塞替派和环磷酰胺(cytoxantm)；磺酸烷基酯类，例如，白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如，苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基三聚氰胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙烯硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲基三聚氰胺(trimethylomelamine)；氮芥类，例如，苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类，例如，卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如，阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素c(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，例如，甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-fu)；叶酸类似物，例如，二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如，氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如，安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，例如，卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，例如，氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如，亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；贝他布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamnol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；psktm；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”‑三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“ara-c”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如，紫杉醇(taxoltm,bristol-myers squibb oncology,princeton,n.j.)和多西紫杉醇(taxoteretm；aventis antony,france)；苯丁酸氮芥(chloranmbucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如，顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(vp-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素c(mitomycin c)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；视黄酸(retinoic acid)；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在该定义中还包括抗激素剂(其起作用以调节或抑制激素对肿瘤的作用)，诸如抗雌激素类包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、(raloxifene)、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、盐酸雷洛昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(fareston)和抗雄激素类诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。[0202]本文提供的抗gitr抗体也可以与抗病毒剂、抗生素、镇痛剂、皮质类固醇、类固醇、氧气、抗氧化剂、cox抑制剂、保心药、金属螯合剂、ifn-γ和/或nsaid组合施用和/或联合配制。[0203]一种或多种另外的治疗活性组分，例如上文列出的药剂中的任一者或其衍生物，可以在本发明的抗gitr抗体施用之前、同步或者之后立即施用；(出于本公开的目的，此类施用方案被视为抗gitr抗体与另外的治疗活性组分“组合”施用)。本公开包括药物组合物，其中本公开的抗gitr抗体与如本文别处所述的一种或多种另外的治疗活性组分联合配制。[0204]可以在施用本公开的抗gitr抗体之前，向受试者施用另外的治疗活性组分。举例来说，如果第一组分是在施用第二组分之前1周、之前72小时、之前60小时、之前48小时、之前36小时、之前24小时、之前12小时、之前6小时、之前5小时、之前4小时、之前3小时、之前2小时、之前1小时、之前30分钟、之前15分钟、之前10分钟、之前5分钟或之前不到1分钟施用，则可以认为第一组分是在第二组分“之前”施用。在其他实施方案中，可以在本公开的抗gitr抗体施用之后，向受试者施用另外的治疗活性组分。举例来说，如果第一组分是在施用第二组分之后1分钟、之后5分钟、之后10分钟、之后15分钟、之后30分钟、之后1小时、之后2小时、之后3小时、之后4小时、之后5小时、之后6小时、之后12小时、之后24小时、之后36小时、之后48小时、之后60小时、之后72小时施用，则可以认为第一组分是在第二组分“之后”施用。在另外其他实施方案中，在施用本公开的抗gitr抗体同时，可以向受试者施用一种或多种另外的治疗活性组分。出于本公开的目的，“同时”施用包括例如以单一剂型(例如联合配制的)向受试者施用或以单独的剂型在彼此约30分钟或更短时间内向受试者施用抗gitr抗体和另外的治疗活性组分。如果以单独的剂型施用，则每个剂型可以通过相同的途径施用(例如，抗gitr抗体和另外的治疗活性组分都可以静脉内、皮下施用等)；可替代地，每个剂型可以通过不同的途径施用(例如，抗gitr抗体可以静脉内施用，而另外的治疗活性组分可以皮下施用)。在任何情况下，出于本公开的目的，以单一剂型、以相同途径的单独剂型或以不同途径的单独剂型施用所述组分都被认为是“同时施用”。出于本公开的目的，在施用另外的治疗活性组分“之前”、“同时”或“之后”(那些术语如上文所定义)施用抗gitr抗体被视为与另外的治疗活性组分的“组合”施用抗gitr抗体。[0205]本公开包括药物组合物，其中本公开的抗gitr抗体与如本文别处所述的另外的治疗活性组分中的一种或多种使用多种剂量组合联合配制。[0206]在本文提供的抗gitr抗体与vegf拮抗剂(例如，vegf陷阱诸如阿柏西普)组合施用，包括施用包含抗gitr抗体和vegf拮抗剂的联合制剂的示例性实施方案中，单个组分可以使用多种剂量组合施用于受试者和/或联合配制。例如，抗gitr抗体可以以选自由以下项组成的组的量施用于受试者和/或含于联合制剂中：0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg和10.0mg；并且vegf拮抗剂(例如，vegf陷阱诸如阿柏西普)可以以选自由以下项组成的组的量施用于受试者和/或含于联合制剂中：0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg和3.0mg。所述组合/联合制剂可以根据本文别处公开的施用方案中的任一种施用于受试者，包括例如，每周两次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次等。[0207]施用方案[0208]根据本公开的某些实施方案，可以将多剂量的抗gitr抗体(或者包含抗gitr抗体和本文提及的另外的治疗活性剂中的任一者的组合的药物组合物)在限定的时间范围内施用于受试者。根据本文提供的该方面的方法包括将多剂量的本文提供的抗gitr抗体按顺序施用于受试者。如本文所用，“按顺序施用”意指每个剂量的抗gitr抗体在不同的时间点，例如在以预定间隔(例如，小时、日、周或月)分开的不同日施用于受试者。本公开包括这样的方法：所述方法包括将单一初始剂量的抗gitr抗体，然后是一个或多个第二剂量的抗gitr抗体，以及任选地随后是一个或多个第三剂量的抗gitr抗体按顺序施用于患者。[0209]术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指本文提供的抗gitr抗体的施用的时间顺序。因此，"初始剂量"为在治疗方案的开始时施用的剂量(也称为"基础剂量")；"二级剂量"为在初始剂量之后施用的剂量；并且"三级剂量"为在二级剂量之后施用的剂量。初始、第二和第三剂量都可以含有相同量的抗gitr抗体，但是通常在施用频率方面可以彼此不同。然而，在某些实施方案中，在初始、第二和/或第三剂量中含有的抗gitr抗体的量在治疗过程中彼此不同(例如，适当上调或下调)。在某些实施方案中，在治疗方案开始时施用两个或更多个(例如，2、3、4或5个)剂量作为“负荷剂量”，接着以较低频率施用后续剂量(例如，“维持剂量”)。[0210]在本公开的某些示例性实施方案中，每个第二和/或第三剂量在紧接前一剂量之后1至26(例如，1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多)周施用。如本文所用，短语“紧接前一剂量”是指在多次施用的顺序中，抗gitr抗体的剂量在顺序中紧接着的下一剂量施用之前施用于患者，而没有中间剂量。[0211]根据本文提供的这个方面的方法可以包括向患者施用任何数目的第二和/或第三剂量的抗gitr抗体。举例来说，在某些实施方案中，仅向患者施用单次二级剂量。在其他实施方案中，向患者施用两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多次)二级剂量。同样，在某些实施方案中，仅向患者施用单次三级剂量。在其他实施方案中，向患者施用两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多次)第三剂量。施用方案可以在特定受试者的一生中无限期地进行，或者直到此类治疗不再是治疗上需要的或有利的。[0212]在涉及多个第二剂量的实施方案中，每个第二剂量可以与其他第二剂量相同的频率施用。例如，可以在紧接前一剂量之后1至2周或1至2个月向患者施用每个第二剂量。类似地，在涉及多个第三剂量的实施方案中，每个第三剂量可以与其他第三剂量相同的频率施用。例如，可以在紧接前一剂量之后2至12周向患者施用每个第三剂量。在本文提供的某些实施方案中，在治疗方案的过程中，向患者施用的第二和/或第三剂量的频率可以变化。在治疗过程中，医生也可以根据临床检查后个别患者的需要来调整施用频率。[0213]本公开包括施用方案，其中以第一频率(例如，每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次等)向患者施用2至6次负荷剂量，随后以较低的频率向患者施用两次或更多次维持剂量。例如，根据本文提供的这个方面，如果负荷剂量以每月一次的频率施用，则维持剂量可以每六周一次、每两个月一次、每三个月一次等施用于患者。[0214]抗体的诊断用途[0215]本公开的抗gitr抗体也可以用于检测和/或测量样品中的gitr或表达gitr的细胞，例如用于诊断目的。例如，抗gitr抗体或其片段可以用于诊断以gitr的异常表达(例如，过表达、表达不足、表达缺乏等)为特征的病状或疾病。针对gitr的示例性诊断测定法可以包括例如使从患者获得的样品接触本文提供的抗gitr抗体，其中所述抗gitr抗体用可检测标记或报告分子来标记。可替代地，未标记的抗gitr抗体可以与本身被可检测标记的二抗组合用于诊断应用。可检测标记物或报告分子可以是放射性同位素，诸如3h、14c、32p、35s或125i；荧光或化学发光部分诸如萤光素或罗丹明；或酶诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可以用于检测或测量样品中的gitr的具体示例性测定法包括酶联免疫吸附测定法(elisa)、放射免疫测定法(ria)、免疫-pet(例如，89zr、64cu等)和荧光活化细胞分选(facs)。[0216]可以用于根据本公开的gitr诊断测定法的样品包括在正常或病理条件下可从患者获得的任何组织或流体样品，所述样品含有可检测数量的gitr蛋白或其片段。通常，将对从健康患者(例如，未患有与异常gitr水平或活性相关联的疾病或病状的患者)获得的特定样品中的gitr水平进行测量，以初步建立基线或标准gitr水平。然后可以将该gitr的基线水平与在从怀疑患有gitr相关疾病或病状的个体获得的样品中测量的gitr水平进行比较。[0217]实施例[0218]提出以下实施例以给本领域普通技术人员提供如何制备和使用本文提供的方法和组合物的完整公开和描述，且无意限制发明人视作其发明的内容的范围。已努力确保有关所用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑某些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是以摄氏度为单位，且压强是在或接近大气压。[0219]实施例1.抗gitr抗体的生成[0220]通过用包含人gitr的可溶性二聚体胞外结构域的免疫原免疫小鼠(即，包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的dna的经工程化的小鼠)来获得抗gitr抗体。通过gitr特异性免疫测定法来监测抗体免疫应答。如u.s.2007/0280945a1中所述，直接从抗原阳性b细胞分离几种全人抗gitr抗体而不与骨髓瘤细胞融合。[0221]表1列出了所选抗gitr抗体(compab1抗体)的重链和轻链可变区及cdr的氨基酸序列标识符，如先前在u.s.2017/0355774a1中公开的。相应的核酸序列标识符列于表2中。表3提供了compab1抗体的全长重链和轻链序列。[0222]表1：氨基酸序列标识符[0223][0224]表2：核酸序列标识符[0225][0226][0227]表3：全长重链和轻链序列[0228][0229]实施例2.对抗gitr抗体compab1中截短的评估和定量[0230]对compab1抗体的表征观察到一部分在蛋白质表达期间被裂解。进行以下分析以鉴定发生截短的点，并确定经历截短的抗体的量。[0231]通过完整质量分析，使用用uv检测器和在线waters vion ims qtof质谱仪的反相液体色谱法来分析compab1抗体样品，以确定抗体及其变体的分子量。将每个抗体样品进样到waters acquity uplc beh300 c4柱(1.7μm，2.1mm×50mm)，该柱在进样前用99％的流动相a(0.1％甲酸的milli-q水溶液)和1％的流动相b(0.1％甲酸的乙腈溶液)平衡。柱温保持在80℃。使用waters acquity uplc系统，使用0.25ml/min的流速洗脱蛋白质。样品进样后，总流动相梯度在前3分钟保持在1％流动相b，随后在2分钟的过程中流动相b从1％线性增加到20％，在15分钟的过程中流动相b从20％第二次线性增加到35％，然后在5分钟内流动相b从35％第三次线性增加到70％，在接下来的2分钟内流动相b最后增加到90％。使用光电二极管阵列检测器在215nm监测洗脱蛋白质的洗脱曲线，并使用waters vion ims qtof质谱仪测量洗脱蛋白质的质量。[0232]使用该方法，鉴定了全长gitr抗体compab1的截短变体。在uv色谱图中，截短形式的抗体比全长抗体更早洗脱。截短形式的质量与compab1重链cdr3区域中残基n101和p102之间的裂解相对应。基于多批次compab1的uv色谱峰面积，估计截短形式的丰度为总抗体的5％左右。这些裂解的位置通过简化肽作图分析来验证，其中使用胰蛋白酶将compab1消化成以赖氨酸或精氨酸结尾的肽，并通过反相lc分离进行分析，随后在q exactive质谱仪上通过质谱法进行分析。对应于全长抗体的胰蛋白酶肽以及以n101和p102的较短肽(对应于cdr3中的截短位点)基于它们的精确质量和碎片光谱进行鉴定。[0233]体外和体内血清中compab1的截短水平随时间增加：[0234]将compab1在磷酸盐缓冲盐水(pbs)和猴血清中在37℃下孵育长达28天，以研究compab1在体外生理条件下的稳定性。另外，对小鼠给药10mg/kg的compab1，并在第1天和第8天收集血清以研究compab1在体内的稳定性。[0235]使用包被有抗人fc抗体的磁珠从血清样品中纯化compab1。纯化的compab1在酸性条件下从珠粒上洗脱，然后用酶lys-c消化，该酶将全长抗体切割成以赖氨酸结尾的肽。使用反相lc梯度分离样品，并通过q exactive hf质谱仪进行分析。基于它们的精确质量和碎片光谱，在所有样品中鉴定了对应于全长抗体和在n101/p102处截短的抗体的lys-c生成肽。使用对应于完整和截短抗体的质量的提取离子色谱峰面积计算每个样品中的截短百分比。[0236]结果显示，在pbs中孵育导致在28天内compab1截短从10.3％增加到24.5％，在猴血清中孵育导致在28天内相同的compab1截短从7.4％增加到48.7％(图1)。给药小鼠血清中compab1的截短水平8天后从7.7％的起始水平增加到54％(图2)。[0237]实施例3.保持与gitr结合的抗gitr抗体compab1的重链变体的生成[0238]进行筛选以鉴定防止在cdr3中的氨基酸101np102或102ps103截短，同时保持抗gitr功能的compab1重链(hc)变体。表示compab1重链(hc)可变结构域的变体的双链dna片段是订购的并且是由idt(gblock基因片段)合成的，随后将其克隆到含有人igg1重链恒定区的表达载体中。通过用除半胱氨酸以外的所有氨基酸置换compab1 hc的n101或s103，产生了总共36个变体。参见表4。[0239]在cho细胞中瞬时表达每个hc变体和compab1轻链(1-39种系通用轻链)后产生抗体。[0240]表4：compab1重链变体[0241][0242][0243]收集含抗体的上清液并送去通过biacore筛选以测量gitr结合。[0244]通过表面等离子共振测定人抗gitr抗体的结合亲和力和动力学常数。[0245]针对条件培养基中分泌的抗体的biacore实验如下进行。在25℃下使用biacore 2000仪器，以8ul/min的流速在cm5抗人fc偶联表面上捕获抗体80秒。每种抗体大约有1000-2000ru被捕获。100nm hgitr.mmh(可溶性单体hgitr，seq id no:45)或50nm hgitr.mfc(二聚体食蟹猕猴gitr，seq id no:46)在该表面上以50ul/min的流速进样2分钟。测量解离2分钟。通过将双参考传感图拟合到1:1结合模型来计算kd和t1/2。[0246]表5：biacore结合亲和力：chot上清液id no:46)在该表面上以50ul/min的流速进样5分钟。测量解离10分钟。通过将双参考传感图拟合到1:1结合模型来计算kd和t1/2。[0254]与compab1相比，四种纯化的n101变体与单体(hgitr.mmh)和二聚体(hgitr.mfc)gitr的kd和t1/2如表6所示。[0255]表6：cho细胞产生的变体的biacore结合亲和力[0256][0257]实施例4.重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列[0258]表7列出了compab1抗体的抗gitr抗体变体的重链和轻链可变区和cdr的氨基酸序列标识符。相应的核酸序列标识符列于表8中。[0259]表7：氨基酸序列标识符[0260][0261]表8：核酸序列标识符[0262][0263]如本领域的普通技术人员所理解，可以将具有特定fc同种型的抗体转化为具有不同的fc同种型的抗体，但无论如何，可变结构域(包括cdr)(以表7和表8中示出的数字标识符表示)将保持相同，并且预期结合特性相同或基本上相似，无论fc结构域的性质如何。[0264]表9提供了所选抗gitr抗体的示例性全长重链(hc)和轻链(lc)核酸和氨基酸序列标识符。[0265]表9：示例性抗gitr抗体的全长重链和轻链序列的序列标识符[0266][0267]实施例5.对抗gitr抗体compab1的变体中截短的评估和定量[0268]如上所述，鉴定了全长抗gitr抗体compab1的截短变体。截短形式的质量与compab1重链cdr3区域中残基n101和p102之间的裂解相对应。随后产生了在compab1中n101/p102截短位点的n101位置处具有单个氨基酸取代的新抗体变体。对这些新的抗体变体进行分析，以确认它们的同一性并确定新的变体是否显示截短。[0269]采用变性sec(在低温和温和ph下运行)分析变体截短。将compab1和mab1稀释到1mg/ml并且将每种样品各5μg进样到waters acquity uplc beh200 sec柱(1.7μm，4.6mm x 300mm)。在进样前，该柱用100％流动相a(30％乙腈、0.1％甲酸、0.1％三氟乙酸的milli-q水溶液)平衡。柱温已关闭。使用waters acquity uplc系统在100％流动相a下，以0.10ml/min的流速在5分钟内等度洗脱蛋白质。[0270]在不加热柱的情况下，通过变性sec-ms对完整抗体的分析显示，在mab1和mab2中没有截短(表10)。当通过简化肽作图和lc-ms分析变体时，这些结果得以证实(数据未示出)。[0271]表10：在compab1和n101变体中测量的截短百分比。[0272][0273]na：未分析[0274]实施例6：在血清稳定性分析中在compab1的n101d和n101e变体中未观察到截短[0275]将compab1和在与人gitr蛋白结合方面通过biacore确定最有可能是原始候选物的变体候选物mab1(n101d)和mab2(n101e)(参见前一实施例)在37℃下在igg消耗的人血清和小鼠血清以及hepes缓冲液中孵育，以测试它们在生理条件下的稳定性。另外，在小鼠中给药compab1、mab1和mab2(10mg/kg),并且在4小时、1天、2天、4天和8天后收集血清。通过抗fc下拉亲和纯化抗体，并使用lys-c消化。lys-c消化和lc-ms方法仅使用低温进行抗体变性和低柱温以防止n101d变体的人工截短。血清孵育后，compab1分子中的截短水平增加，但在整个时间过程中在mab1或mab2中没有检测到截短(图3和图4)。类似地，在小鼠给药的compab1中检测到可变水平的截短，但在变体mab1或mab2中没有检测到截短。参见表11。[0276]表11：mab1和mab2的体外和体内稳定性[0277][0278]实施例7.抗gitr抗体与细胞表面gitr的结合[0279]使用流式细胞术评价mab1与jurkat/hcd20/hgitr细胞和jurkat/hcd20/mfgitr细胞的结合。jurkat/hcd20细胞用作gitr结合的阴性对照细胞系。将细胞添加到96孔v形底板中(2x105至4x105个细胞/孔)并在fc阻断溶液中孵育，随后在冰上与最终浓度范围为18pm至300nm的一抗(mab1或igg1同种型对照)和5μg/ml的二抗(af647缀合的抗人igg)连续孵育。然后根据制造商的说明，用活/死可固定的绿色死细胞染剂对细胞进行染色。将细胞用bd cytofix固定并通过acroprep advance滤板过滤，之后在intellicyt ique screener plus流式细胞仪上采集。用flowjo软件分析数据。对于ec50(50％活性时的有效浓度)的确定，用graphpad prism在9点应答曲线上使用4参数逻辑斯蒂方程分析测量的几何mfi值。通过取曲线上最高mfi与仅含二抗的孔的mfi之比来确定结合倍数。[0280]mab1显示出与工程改造为表达hgitr或mfgitr的jurkat/hcd20细胞的浓度依赖性结合，其ec50值在纳摩尔范围内；没有检测到与jurkat/hcd20细胞的结合(图5)。igg1同种型对照没有显示出与所测试的3种细胞系中的任何一种的结合。报告了mab1和igg1同种型对照的ec50值(如果适用)、最大mfi(测试的剂量范围内的最高平均mfi)和作为高于背景的最大mfi(仅二抗)计算的结合倍数。结果汇总在表12中。[0281]表12：抗体与工程改造为表达人或食蟹猴gitr的jurkat t细胞的抗体的结合[0282][0283]a最大mfi是在测试的浓度范围内(18pm至300nm)的最高平均mfi值。[0284]b结合倍数作为高于背景的最大mfi(仅二抗)计算。[0285]h，人；mf，食蟹猕猴(食蟹猴)；nd，未确定，因为未观察到浓度依赖性结合[0286]总之，mab1显示出与表达人或猴gitr的jurkat/hcd20靶细胞的浓度依赖性结合，具有相似的效力(ec50)和最大结合倍数。[0287]实施例8：抗gitr抗体与激活的人和食蟹猴原代t细胞的结合[0288]在该实验中，评价了mab1与抗cd3/抗cd28刺激的人和食蟹猴原代t细胞的结合。cd25和cd69分别用作人和食蟹猴原代t细胞激活的替代标志物。[0289]在sepmate管(对于人pbmc)或50ml锥形管(对于食蟹猴pbmc)中通过ficoll-paque plus，使用密度离心，从人或食蟹猴全血(各4个供体)中分离外周血单核细胞(pbmc)并转移到新鲜锥形管中，在红细胞(rbc)裂解缓冲液中孵育。然后将pbmc洗涤并转移到t75培养瓶中，使用用于人或非人灵长类动物的t细胞激活/扩增试剂盒进行t细胞激活和扩增。4天后，使用macsimag分离器从培养物中取出激活珠粒，收集细胞并计数。[0290]使用流式细胞术评价在激活的pbmc中mab1与人或食蟹猴t细胞的结合。将细胞添加到96孔v形底板(3x105个细胞/孔)中并在fc阻断/单核细胞阻断溶液中孵育，随后在冰上与荧光团缀合的抗体(抗cd3、抗cd4、抗cd8和抗cd25[人t细胞的激活标志物]或抗cd69[食蟹猴t细胞的激活标志物])、af647缀合的mab1或af647缀合的igg1同种型对照(最终浓度范围为8pm至200nm)的t细胞表型分析混合物和活/死可固定的蓝色死细胞染剂(根据制造商的说明)孵育。将细胞用bd稳定固定剂固定并通过acroprep advance滤板过滤，之后在bd lsrfortessa x-20流式细胞仪上采集。用flowjo软件分析数据。对于ec50的确定，用graphpad prism在12点应答曲线上使用4参数逻辑斯蒂方程分析测量的几何mfi值。[0291]mab1显示出与激活的人和食蟹猴原代t细胞的浓度依赖性结合。与igg1同种型对照相比，mab1显示出与未激活的人和食蟹猴原代t细胞的最小结合(图6和图7)。表13和表14中汇总了mab1和igg1同种型对照结合的最大mfi值(在测试的最高浓度即200nm处检测的)。[0292]表13：抗gitr抗体与激活的(cd25+)和未激活的(cd25-)人原代t细胞的结合[0293][0294][0295]a最大mfi是在200nm(测试的最高浓度)的非饱和浓度下测定的。[0296]表14：与激活的(cd69+)和未激活的(cd69-)食蟹猴原代t细胞的结合[0297][0298]a最大mfi是在200nm(测试的最高浓度)的非饱和浓度下测定的。[0299]实施例9.在工程化jurkat t细胞中通过fcγr3a激活nfat[0300]开发了adcc报告因子生物测定法(parekh等人，mabs,4(3):310-318,2012)，以评价mab1通过人或食蟹猴fcγr3a(一种介导adcc并主要在nk细胞上表达的fc受体)介导激活t细胞的核因子(nfat)激活的能力。在这些测定法中采用jurkat/nfat-luc/hfcγr3a或jurkat/nfat-luc/mffcγr3a效应细胞和jurkat/hcd20/hgitr或jurkat/hcd20/mfgitr靶细胞。将jurkat/hcd20细胞作为对照靶细胞进行评价。[0301]将mab1或igg1同种型对照(最终浓度范围为916fm至60nm)或抗cd20igg1(最终浓度范围为45.8fm至3nm)一式两份地与效应细胞(2.5x104个细胞/孔)一起在靶细胞(5x104个细胞/孔)的存在下，在jurkat完全培养基(补充有10％胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和292μg/ml l-谷氨酰胺的rpmi)中孵育。不含抗体的孔作为背景信号传导的对照包括在内。板在37℃、5％co2下孵育5小时。然后将板平衡至室温10分钟，随后向孔中添加one-glo荧光素酶底物，保持3分钟。荧光素酶活性作为发光信号被捕获，并使用envision酶标仪以相对光单位(rlu)表示。对于ec50的确定，用graphpad prism在9点应答曲线上使用4参数逻辑斯蒂方程分析rlu值。通过取曲线上最高rlu与不含抗体的孔的rlu之比来确定活性的倍数变化。[0302]结果汇总在表15中。在jurkat/hcd20/hgitr或jurkat/hcd20/mfgitr的存在下，mab1分别介导jurkat/nfat-luc/hfcγr3a和jurkat/nfat-luc/mffcγr3a中nfat信号传导的浓度依赖性增加，其ec50值为亚纳摩尔级(图8)。在jurkat/hcd20和jurkat/hcd20/hgitr或jurkat/hcd20/mfgitr的存在下，阳性测定对照即抗cd20 igg1分别介导jurkat/nfat-luc/hfcγr3a和jurkat/nfat-luc/mffcγr3a中nfat信号传导的浓度依赖性增加，其ec50值为亚纳摩尔级。在靶细胞不存在(即，培养基没有除效应细胞以外的细胞)的情况下，用mab1或抗cd20 igg1，或用igg1同种型对照在任何测试条件下都没有观察到基线nfat激活的增加。[0303]表15：jurkat/nfat-luc/hfcγr3a和jurkat/nfat-luc/mffcγr3a效应细胞中mab1介导的nfat激活的汇总[0304][0305]a最大rlu确定为测试的浓度范围内(对于mab1和igg1同种型对照为916fm至60nm，对于抗cd20 igg1为45.8fm至3nm)的最高平均rlu值。[0306]b活性的倍数变化作为高于背景(无抗体)的最大rlu计算。[0307]h，人；mf，食蟹猕猴(食蟹猴)；nd，未确定，因为未观察到浓度依赖性的荧光素酶活性[0308]实施例10：抗gitr抗体介导针对工程改造为表达人或食蟹猴gitr的jurkat t细胞的adcc[0309]进行adcc测定法以评估mab1诱导针对表达人或食蟹猴gitr的t细胞的adcc的能力。在第一个实验中，靶细胞包括jurkat/hcd20/hgitr细胞或jurkat/hcd20/mfgitr细胞；jurkat/hcd20细胞作为对照靶细胞系包括在内。在第二个实验中，靶细胞包括来自人pbmc(来自相同的3个供体)的经过刺激/扩增的treg(调节性t细胞)和cd8+t细胞。从富含白细胞的全血中分离出的人nk细胞(来自用于用工程化jurkat t细胞进行的测定法的2个供体和来自用于用原代t细胞进行的测定法的2个供体)在adcc测定法中用作效应细胞。igg1同种型对照与mab1并行评价。使用抗cd20 igg1或抗cd3 igg1作为阳性对照以在nk细胞的存在下，分别诱导针对工程化jurkat t细胞和人原代t细胞的adcc。[0310]在人原代nk细胞(效应细胞)的存在下，mab1介导针对jurkat/hcd20/hgitr和jurkat/hcd20/mfgitr(靶细胞)的浓度依赖性adcc；细胞毒性的ec50值在亚纳摩尔范围内。相反，igg1同种型对照在9.5fm至10nm范围的浓度下不介导针对任何靶细胞系的adcc。在不存在抗体处理的情况下添加nk细胞导致针对靶细胞系的低百分比非特异性细胞毒性。[0311]使用阳性对照抗cd20 igg1，评价nk细胞诱导针对相同靶细胞系的adcc的能力。抗cd20 igg1以浓度依赖性方式介导针对jurkat/hcd20、jurkat/hcd20/hgitr和jurkat/hcd20/mfgitr靶细胞的adcc，其细胞毒性的ec50值为亚纳摩尔级。2个人类nk供体的代表性数据示于图9并汇总在表16中。[0312]表16：抗体介导的针对工程化jurkat t细胞的adcc[0313][0314][0315]a最大细胞毒性％确定为测试的浓度范围(9.5fm至10nm)内的最高平均百分比细胞毒性值。h，人；mf，食蟹猕猴(食蟹猴)；nd，未确定，因为未观察到浓度依赖性细胞毒性[0316]实施例11：抗gitr抗体介导针对人原代t细胞的adcc[0317]按照制造商推荐的方案，使用ficoll-paque plus密度梯度培养基和sepmate管，通过密度离心从人全血(3名供体)中分离出pbmc。随后，向分离的pbmc中添加红细胞(rbc)裂解缓冲液，以去除不需要的rbc。然后洗涤pbmc，并根据制造商的说明使用cd8微珠分离cd8+t细胞。使剩余的cd8阴性细胞沉淀并使用cd4+cd25+调节性t细胞分离试剂盒根据制造商的方案分离cd4+cd25+t细胞。[0318]使用流式细胞术确认cd8+和cd4+/cd25+t细胞(即treg)的分离。将cd8+t细胞接种到含有补充了il-2的培养基的t75烧瓶中，使用cd3/cd28dynabead根据制造商的说明进行扩增(1个珠粒:1个细胞)。将treg接种到含有补充了il-2和雷帕霉素(rapamycin)的培养基的t75烧瓶中，使用cd3/cd28macsibead颗粒根据制造商的说明进行扩增(4个珠粒:1个细胞)。培养5天后取出珠粒，并且在用于adcc测定法之前，将细胞在不含il-2或雷帕霉素的培养基中静置24小时。[0319]在细胞毒性测定之前，如实施例8中所述对cd8+t细胞和treg进行染色，并通过流式细胞术评估抗体结合能力(abc)，抗体结合能力定义为在饱和条件下结合到细胞表面的抗体分子的数目。使用quantum simply cellular af647 mesf(可溶性荧光染料分子)珠粒试剂盒根据制造商的说明测定来自miltenyi biotec的gitr抗体的abc。[0320]将靶细胞(5x103个细胞/孔)一式三份地添加到不透明的白色96孔平底板中，随后添加mab1、igg1同种型对照或抗cd20(用于工程化jurkat t细胞)或抗cd3(用于人原代t细胞)igg1(对于工程化jurkat t细胞的最终浓度范围为9.5fm至10nm，对于人原代t细胞的最终浓度范围为169fm至10nm)，然后添加在测定培养基(补充有1％牛血清白蛋白(bsa)、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和292μg/ml l-谷氨酰胺的rpmi)中的人nk细胞(2.5x104个细胞/孔)。将含有除抗体以外的所有组分的对照样品掺入到每个实验中，以确定该测定法的背景信号(即，在nk细胞的存在下靶细胞的非特异性裂解)。为了评估自发裂解，将单独的未处理的靶细胞(靶细胞)和单独的效应细胞(效应细胞)在分开的孔中孵育。[0321]板在37℃、5％co2下孵育3.5小时。然后将板平衡至室温10分钟，随后边振荡边向孔中添加cytotox glo试剂，保持15分钟。使用envision酶标仪测量发光信号作为细胞毒性的读数。[0322]mab1介导针对来自于在人原代nk细胞(效应细胞)的存在下测试的3个供体中的3个的人原代t细胞(靶细胞)的浓度依赖性adcc，其细胞毒性的ec50值在亚纳摩尔范围内。在6个测试条件(2个效应细胞供体×3个靶细胞供体)中，在其中4个条件下，与cd8+t细胞相比，mab1介导的针对treg的细胞毒性显著更大。参见图10和表17。[0323]相反，igg1同种型对照不介导针对任何原代t细胞供体的adcc。在不存在抗体处理的情况下添加nk细胞导致针对原代t细胞的低百分比非特异性细胞毒性。[0324]在使用具有阳性对照抗cd3 igg1的相同nk和t细胞供体的测定法中，还评价了nk细胞诱导adcc的能力。抗cd3 igg1以浓度依赖性方式介导针对原代t细胞的adcc，其细胞毒性的ec50值为亚纳摩尔级。与3个人原代t细胞供体一起测试的2个人原代nk供体的代表性数据示于图10并汇总在表17中。[0325]表17：抗体介导的针对人原代t细胞的adcc[0326][0327]a最大细胞毒性％确定为在测试的浓度范围(169fm至10nm)内的最高平均百分比细胞毒性值。[0328]b mab1与来自供体0400n的cd8+t细胞相比，介导针对treg显著更强的的adcc(p《0.0001)并且与来自供体0200r的treg相比，介导针对cd8+t细胞显著更强的adcc(p《0.0001)。[0329]c抗cd3 igg1与来自供体5100x的treg相比，介导针对cd8+t细胞显著更强的adcc(p《0.0001)。[0330]d mab1与来自所有3个供体的cd8+t细胞相比，介导针对treg显著更强的adcc(p《0.0001)。[0331]通过双因素方差分析(two-way anova)与tukey多重比较事后检验(α＝0.05)，确定每个nk细胞供体在所有试验条件下adcc的统计学显著性。[0332]abc，抗体结合能力(基于通过流式细胞术测量的荧光强度计算的每个细胞结合的抗体)；nd，未确定，因为未观察到浓度依赖性细胞毒性[0333]实施例12：抗gitr抗体介导针对工程改造为表达人或食蟹猴gitr的jurkat t细胞的adcp[0334]进行adcp(抗体依赖性细胞吞噬作用)测定法以评估mab1诱导对表达人或食蟹猴gitr的t细胞的adcp的能力。靶细胞包括jurkat/hcd20/hgitr细胞或jurkat/hcd20/mfgitr细胞；jurkat/hcd20细胞作为对照靶细胞系包括在内。在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)的存在下从cd14+单核细胞分化的吞噬细胞在adcp测定法中用作效应细胞。igg1同种型对照与mab1并行评价。抗cd20 igg1用作阳性对照，用于诱导工程化jurkat t细胞的adcp。[0335]将从lonza获得的冷冻cd14+细胞解冻，重悬于补充有50ng/ml gm-csf的细胞培养基(补充有10％fbs、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和292μg/ml l谷氨酰胺、1％人ab血清、napyr(丙酮酸钠)、hepes、neaa(非必需氨基酸)和0.01mmβ-巯基乙醇的rpmi)，并以5x104个细胞/孔平板接种到透明底、胶原包被的96孔黑色板中，以在13天内分化成吞噬细胞，在第6天和第12天添加新鲜gm-csf(50ng/ml)。[0336]在adcp测定之前将靶细胞和单核细胞来源的吞噬细胞分别与celltrace cfse(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)染料或celltrace远红染料在37℃、5％co2下孵育15分钟进行标记。[0337]将靶细胞(5x105个细胞/孔)一式两份地添加到96孔u形底板中，随后在测定培养基(补充有10％fbs、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和292μg/ml l谷氨酰胺的rpmi)中添加mab1、igg1同种型对照或抗cd20igg1(最终浓度范围为381fm至100nm)，在冰上保持至少15分钟。无抗体的靶细胞作为背景吞噬作用的对照包括在内。然后将含有或不含滴定抗体的靶细胞混合物转移到含有粘附的远红标记吞噬细胞的板上，并将板在37℃、5％co2下孵育1至2小时。[0338]孵育后，从孔中取出含有未附着细胞的培养基，并将孔用pbs冲洗。将3.7％甲醛在pbs中的溶液添加到孔中以固定细胞20分钟。用pbs洗涤孔，并将板储存在4℃直到分析。[0339]通过在opera phoenix高含量筛选系统上使用harmony软件进行荧光成像，以获得在488nm(cfse标记的靶细胞)和647nm(远红标记的吞噬细胞)发射通道中的图像来分析吞噬作用。在columbus软件中进行图像分析，并通过在647nm发射通道中进行图像分割以选择吞噬细胞群体并计算每个吞噬细胞内部的488nm荧光强度(来自cfse标记的靶细胞)作为相对荧光单位(rfu)来量化吞噬作用。对于ec50的确定，分别对于工程化jurkat t细胞或人原代t细胞的测定，用graphpad prism在10点或9点应答曲线上使用4参数逻辑斯蒂方程分析rfu值。通过取曲线上最高rfu与不含抗体的孔的rfu之比来确定活性的倍数变化。[0340]mab1在人原代单核细胞来源的吞噬细胞(效应细胞)的存在下介导jurkat/hcd20/hgitr和jurkat/hcd20/mfgitr(靶细胞)的浓度依赖性adcp。无法计算jurkat/hcd20/hgitr的吞噬作用的ec50值，因为4参数逻辑回归不收敛于单个值；jurkat/hcd20/mfgitr的吞噬作用的ec50值在亚纳摩尔范围内。mab1介导的jurkat/hcd20/hgitr和jurkat/hcd20/mfgitr细胞的吞噬作用的最大水平是可比较的，活性分别是背景(无抗体)的5.92倍和6.98倍。相反，igg1同种型对照不介导任何靶细胞系的adcp。1个人原代单核细胞来源的吞噬细胞供体的数据示于图11并汇总在表18中。[0341]使用阳性对照抗cd20 igg1，评价人原代单核细胞来源的吞噬细胞诱导相同靶细胞系的adcp的能力。抗cd20 igg1以浓度依赖性方式介导jurkat/hcd20、jurkat/hcd20/hgitr和jurkat/hcd20/mfgitr靶细胞的adcp，其吞噬作用的ec50值为亚纳摩尔级。[0342]表18：抗体介导的工程化jurkat t细胞的adcp[0343][0344]a最大rfu确定为在测试的浓度范围内(381fm至100nm)的最高平均rfu值。[0345]b活性的倍数变化作为高于背景(无抗体)的最大rfu计算。[0346]h，人；mf，食蟹猕猴(食蟹猴)；nc，未计算，因为无法为数据集找到唯一的拟合；nd，未确定，因为未观察到浓度依赖性吞噬作用[0347]实施例13：抗gitr抗体对抗cd3介导的原代cd4+t细胞增殖的影响[0348]评价在hek293/fcγr2b辅助细胞的存在下，mab1对由刺激性cd3抗体介导的原代cd4+t细胞增殖的影响。评价了来自6个供体的人原代cd4+t细胞。[0349]将hek293/fcγr2b细胞在37℃、5％co2下在50μg/ml丝裂霉素c中孵育30分钟，并在37℃、5％co2下以1x105个细胞/孔接种到96孔平底组织培养板中过夜。[0350]使用ficoll-paque plus梯度，使用密度梯度离心从来自6名供体的pbmc中分离出cd4+t细胞，然后使用人cd45ro微珠按照制造商的方案消耗记忆t细胞；将初始cd4+t细胞重悬于测定培养基(补充有5％人ab血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和292μg/ml l-谷氨酰胺的rpmi)中。[0351]在测定当天，将平板接种的hek293/fcγr2b细胞与1.2μg/ml okt3在室温下预孵育20分钟，然后添加5x105个初始cd4+t细胞/孔和最终浓度范围为32fm至133nm的mab1或igg1同种型对照。[0352]将板在37℃、5％co2下孵育4天并且向细胞中添加0.5uci氚化胸苷，并将板再孵育16小时。胸苷以及因此氚将以更高的量掺入分裂的细胞中。[0353]孵育后，将细胞收获到96孔unifilter板上并向每个孔中添加35μl闪烁液。使用微孔板闪烁和发光计数器topcount nxt仪器以每分钟计数(cpm)来测量氚掺入。所有连续稀释液都一式两份测试。[0354]使用graphpad prismtm软件在12点剂量应答曲线上根据4参数逻辑斯谛方程确定抗体的ec50值。最大增殖被确定为在测试的浓度范围内检测到的平均最大cpm。通过取曲线上最高cpm与不含抗体的孔的cpm之比来确定活性的倍数变化。[0355]mab1以浓度依赖性方式以亚纳摩尔级的ec50值增强抗cd3介导的t细胞增殖(图12),并且与高于背景的最大t细胞增殖增加2.3-3.1倍相关(以氚衰变的cpm测量)。相反，igg1同种型对照不促进t细胞增殖的浓度依赖性增强。结果汇总在表19中。[0356]表19：抗gitr抗体对抗cd3介导的原代cd4+t细胞增殖的影响[0357][0358]a最大cpm确定为在测试的浓度范围内(32fm至133nm)的最高平均cpm值。[0359]b活性的倍数变化作为高于背景(无抗体)的最大cpm计算。[0360]nc，未计算，因为4参数逻辑回归不收敛于单个值；nd，未确定，因为未观察到浓度依赖性增殖[0361]实施例14：在阻断elisa中抗gitr抗体对gitr与gitr-l结合的影响[0362]重组hgitr与其配体hgitr-l的结合使用基于酶联免疫吸附测定(elisa)的结合测定法来确定。以2μg/ml的浓度稀释于pbs中的重组hgitr-l被动吸附到微量滴定板上，并在4℃下孵育过夜，然后用含0.5％bsa的pbs阻断。然后将一定浓度范围(3.4pm至200nm)的单体重组人gitr胞外域蛋白hgitr.mmh一式两份添加到板中。将板在室温下孵育1小时，然后用含0.05％吐温-20的pbs(pbst)洗涤4次。用辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊抗cmyc抗体以0.33μg/ml检测板结合的hgitr.mmh，并使用比色hrp底物3-3’,5-5’‑四甲基联苯胺(tmb)根据制造商推荐的程序进行可视化。将450nm的吸光度数据(od450)根据重组hgitr.mmh的浓度进行绘图。包括单独的缓冲液样品以确定背景信号；然而，其od450没有绘制在应答曲线中。用graphpad prism软件在11点应答曲线上使用4参数逻辑斯谛方程来分析结合数据，并计算ec50值。ec50值定义为观察到最大结合的50％时hgitr.mmh的浓度。选择接近ec50值的浓度(在线性范围内)作为用于阻断测定法的固定hgitr.mmh浓度。[0363]开发了基于elisa的阻断测定法，以确定mab1阻断重组人gitr(hgitr.mmh)与hgitr-l结合的能力。将固定浓度的重组人hgitr.mmh(1.5nm)与mab1或igg1同种型对照(51pm至3μm)一起预孵育1小时。将预孵育的溶液转移到先前如上所述用gitr-l包被的微量滴定板的双份孔中。将板在室温下孵育1小时，然后用pbst洗涤4次，并且如上所述检测板结合的hgitr.mmh。将od450处的吸光度数据根据抗体浓度进行绘图。用graphpad prism软件在11点应答曲线上使用4参数逻辑斯谛方程来分析结合数据，并计算ic50值。ic50值定义为阻断50％hgitr.mmh与板包被的hgitr-l结合所需的抗体浓度。[0364]mab1或igg1同种型对照对单体重组人gitr胞外域蛋白(hgitr.mmh)与固定化人gitr-l(6his.gcn4.g4sx3.hgitr-l)结合的影响示于图13。表20中汇总了抗体的ic50值和最大抑制百分比。[0365]表20：hgitr.mmh与固定化人gitr-l结合的阻断[0366]抗体ic50(m)最大抑制率％mab16.66e-0998igg1同种型对照nd-6[0367]最大阻断％＝抗体最大浓度时的阻断百分比[0368]nd，未确定，因为未观察到对结合的浓度依赖性抑制[0369]重组hgitr.mmh以浓度依赖性方式结合固定化人gitr-l，ec50值为2.05nm选择接近ec50值的1.5nm浓度(在线性范围内)作为用于阻断测定法的固定重组hgitr.mmh浓度。[0370]mab1以浓度依赖性方式阻断hgitr.mmh与hgitr-l的结合，最大抑制率为98％且ic50值为6.66nm。在测试的任何浓度下，igg1同种型对照都不抑制hgitr.mmh与人gitr-l的结合。[0371]实施例15：抗gitr抗体对cdc的影响[0372]在细胞毒性测定法中评价了在血清补体的存在下，mab1介导针对表达人或食蟹猴gitr的工程化jurkat t细胞的cdc的能力。报告了最大细胞毒性百分比和ec50值。[0373]进行cdc测定法以评估mab1诱导针对表达人或食蟹猴gitr的t细胞的cdc的能力。靶细胞包括jurkat/hcd20/hgitr细胞或jurkat/hcd20/mfgitr细胞；jurkat/hcd20细胞作为对照靶细胞系包括在内。igg1同种型对照与mab1并行评价。抗cd20 igg1用作阳性对照，用于在血清补体因子的存在下诱导针对工程化jurkat t细胞的cdc。[0374]将靶细胞(5x103个细胞/孔)一式三份地添加到不透明的白色96孔平底板中，随后在测定培养基(补充有1％bsa、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和292μg/ml l-谷氨酰胺的rpmi)中添加mab1、igg1同种型对照或抗cd20igg1(最终浓度范围为477fm至500nm)，然后添加血清(最终体积5％)；并行添加单独的测定培养基以评估不存在补体因子的情况下的裂解。将含有除抗体以外的所有组分的缓冲液对照样品掺入每个实验中，以确定该测定法的背景信号(即靶细胞的非特异性裂解)。[0375]板在37℃、5％co2下孵育3.5小时。然后将板平衡至室温30分钟，随后边振荡边向孔中添加cytotox glo试剂，保持15分钟。使用envision酶标仪测量发光信号作为细胞毒性的读数。[0376]如下计算细胞毒性反应：[0377][0378]asbs，自发背景信号[0379]对于ec50的确定，用graphpad prism在12点应答曲线上使用4参数逻辑斯蒂方程分析细胞毒性百分比。[0380]在5％nhs的存在下，在477fm至500nm的浓度范围内，mab1不介导针对jurkat/hcd20、jurkat/hcd20/hgitr或jurkat/hcd20/mfgitr靶细胞的cdc。同样，对于与igg1同种型对照抗体一起孵育的靶细胞，未观察到cdc(图14)。[0381]使用阳性对照即抗cd20 igg1评价该测定法中使用的nhs在相同的靶细胞系中诱导cdc的能力。在nhs的存在下，抗cd20 igg1以浓度依赖的方式介导针对所有3个靶细胞系的cdc。在不存在nhs的情况下，抗cd20igg1不介导针对测试的任何靶细胞系的裂解。[0382]实施例16：抗gitr抗体形成能够结合c1q的免疫复合物的能力[0383]使用单体(hgitr.mmh)或二聚体(hgitr.mfc)形式的重组可溶性gitr胞外域蛋白和microvue cic-c1q eia试剂盒来评价mab1形成能够结合c1q的免疫复合物的能力。作为阳性对照，还评价了热凝集丙种球蛋白(hagg)与c1q的结合。[0384]将30nm的mab1或igg1同种型对照与hgitr.mmh或hgitr.mfc一起以1:1的摩尔比孵育。还评价了仅含30nm mab1、igg1同种型对照、hgitr.mmh或hgitr.mfc的对照。将样品在dpbs中的0.1％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)(ph 7.4)中在37℃下孵育30分钟。每个样品一式三份地进行评价。[0385]为了检查复合物与c1q的结合，将样品稀释50倍到包被有c1q蛋白的elisa板中的试剂盒测定缓冲液中，并在室温下孵育60分钟。将孔洗涤以去除未结合的蛋白质并向每个孔中添加辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊抗人igg(microvue cic-c1q eia试剂盒)，以检测c1q结合的免疫复合物。洗去未结合的hrp缀合物后，通过添加酶底物检测结合的复合物。使用perkin elmer victor x5多标记酶标仪在405nm下读取吸光度。[0386]使用cic-c1q测定标准品hagg基于0、15和38haggμg当量/毫升(μg eq/ml)的吸光度值生成线性参考曲线。每个测试样品的μg eq/ml浓度是参考该标准曲线确定的。还进行了高和低hagg阳性对照。预计高hagg对照会在该测定法中产生11至26μg eq/ml，并且预计低hagg对照会低于4μgeq/ml。试剂盒制造商将小于4μg eq/ml的值定义为对于显著水平的c1q结合的cic是阴性的。[0387]在含有mab1和hgitr.mmh或hgitr.mfc的样品中没有观察到c1q结合(图15)。同样，在含有igg1同种型对照和hgitr.mmh或hgitr.mfc的样品中没有观察到c1q结合。在仅含mab1、igg1同种型对照、hgitr.mmh或hgitr.mfc的样品中没有观察到c1q结合。并行分析高和低hagg阳性对照并且在预期的相应范围内观察到每个样品的c1q结合。[0388]实施例17：抗gitr抗体与西米普利单抗组合对用工程化rbl-2h3细胞刺激的人原代t细胞释放il-2的影响[0389]本实施例检查了mab1对来自2名供体的人原代cd3+t细胞的抗cd3刺激的il-2释放的激动作用。cd3+t细胞是从来自2名供体的pbmc中分离的。对于一名供体，使用ficoll-paque plus梯度，使用密度梯度离心从外周血中分离出pbmc。对于另一名供体，使用来自stem cell technologies公司的easysep直接人pbmc分离试剂盒，按照制造商的方案，从来自健康供体的外周血中分离出pbmc。将分离自两名供体的pbmc单独冷冻在含有10％dmso的fbs中。[0390]对于cd3+t细胞的分离，将冷冻小瓶的pbmc在37℃水浴中解冻并稀释在含有50u/ml全能核酸酶(benzonase nuclease)的刺激培养基(补充有10％fbs、hepes、napyr、neaa和0.01mm bme的x-vivo 15细胞培养基)中。将细胞以1200rpm离心10分钟，重悬于easysep缓冲液中，并使用stemcell technologies easysep t细胞分离试剂盒按照制造商的方案进行分离。[0391]将cd3+t细胞重悬于刺激培养基中并以1x105个细胞/孔的浓度平板接种到96孔圆底板中。将rbl-2h3/αcd3或rbl-2h3/αcd3/hpd-l1细胞在初级刺激培养基中用10μg/ml的丝裂霉素c以10×106个细胞/ml的浓度处理。在37℃、5％co2下孵育1小时后，将经过丝裂霉素c处理的细胞用含有2％fbs的d-pbs洗涤3次并添加到含有最终浓度为5×104个细胞/孔的t细胞的孔中。随后，将最终浓度范围为3pm至200nm的mab1或igg1同种型对照和固定浓度为20nm的西米普利单抗或igg4p同种型对照的抗体组合添加到孔中。10点稀释的最后一个点不含滴定抗体。将板在37℃与5％co2下孵育3天，随后离心以使细胞沉淀。对于il-2释放，使用来自perkinelmer的人il-2试剂盒根据制造商的方案对5μl上清液进行测试。在perkinelmer的多标记酶标仪envision上获取il-2测量值。所有连续稀释液都一式三份测试。[0392]使用graphpad prism软件在10点剂量应答曲线上根据4参数逻辑斯谛方程确定抗体的ec50值。将最大il-2释放量确定为在测试的浓度范围内检测到的平均最大应答。[0393]在rbl-2h3/acd3靶细胞上不存在pd-l1的情况下，mab1以剂量依赖性方式增加il-2释放量，而不依赖于固定浓度的西米普利单抗。两个t细胞供体表现出相似的ec50和最大il-2值，而不依赖于西米普利单抗(图16)。[0394]在rbl-2h3/αcd3细胞上存在pd-l1的情况下，对于两个t细胞供体而言，与缺乏pd-l1的靶细胞相比，基线il-2水平降低。然而，添加固定浓度的西米普利单抗使基线il-2值增加。对于两个t细胞供体而言，mab1不依赖于西米普利单抗，导致il-2的剂量依赖性增加，并且西米普利单抗的添加进一步提高了最大il-2水平(图16)。结果汇总在表21中。[0395]表21：mab1与西米普利单抗组合对来自抗cd3刺激的原代t细胞的il-2释放的影响的汇总[0396][0397]a最大il-2浓度是在测试的抗体浓度范围(76fm至200nm)内记录到的最高平均il-2浓度值。[0398]b西米普利单抗或igg4p同种型对照是在20nm的固定浓度下测试的。[0399]nc，未计算，因为4参数逻辑回归不收敛于单个值；nd，未确定，因为未观察到浓度依赖性il-2释放[0400]概述[0401]上述实施例证明mab1能够与t细胞的细胞表面上表达的人和食蟹猴gitr结合，并且在替代adcc报告因子测定中增强fcγ受体介导的nfat激活。因此，对比cd8+t细胞，mab1诱导工程化t细胞的adcp并介导针对treg的优先adcc。另一方面，mab1不能介导工程化的表达gitr的t细胞的cdc或不能形成能够结合c1q的免疫复合物。mab1还阻断人gitr与人gitr-l的结合。mab1不依赖于西米普利单抗，导致il-2的剂量依赖性增加，并且添加西米普利单抗进一步提高了最大il-2水平。[0402]实施例18：抗gitr抗体消耗肿瘤内的t调节性细胞并增加cd8+t细胞/t调节性细胞的比率[0403]在该实验中，评估了亲本抗gitr抗体compab1及相关变体mab1和mab2在肿瘤内消耗t调节性细胞的能力。用mc38小鼠结肠肿瘤细胞(3.0x105个细胞/小鼠)皮下攻击12周龄的雌性gitr/gitr-l人源化小鼠。在第6天通过腹膜内(i.p.)注射施用compab1、mab1或mab2。第11天对小鼠实施安乐死，并收集肿瘤组织用于facs分析。facs样品通过bd fortessa x20获取并用flowjo软件分析。[0404]数据示于图17中。总的来说，用抗gitr抗体进行单剂量抗体治疗介导了肿瘤内treg细胞的显著减少并增加了cd8+t细胞/t-reg的比率。与n101e变体mab2相比，compab1和n101d变体mab1更持续地消耗treg并增加cd8/treg比率。[0405]实施例19：单独的mab1在gitr/gitr-l人源化小鼠中和mab1与西米普利单抗的组合在携带小鼠结直肠癌肿瘤的gitr/gitr-l/pd-1人源化小鼠中的抗肿瘤功效[0406]第0天，在9至14周龄的雌性gitr/gitr-l/pd-1人源化小鼠的右侧皮下植入mc38结直肠癌细胞(在100μl pbs中的3x 105个细胞)。植入后六天(第6天)，当肿瘤平均为43mm3时，将小鼠随机分成5组并施用第一剂的10mg/kg igg1同种型对照+1mg/kg igg4p同种型对照(n＝7)、10mg/kg igg1同种型对照+1mg/kg西米普利单抗(n＝7)、10mg/kg mab1+1mg/kg西米普利单抗(n＝7)、1mg/kg mab1+1mg/kg西米普利单抗(n＝6)或0.1mg/kg mab1+1mg/kg西米普利单抗(n＝7)。所有小鼠在第13天接受另外的剂次，总共2剂。在第7、12、14和20天给小鼠放血，以监测血清中的抗体浓度。在第5、10、13、17、20、26、28、31、34、38、41、45、48、52、60、68和75天通过测量肿瘤体积来监测肿瘤生长。监测所有小鼠直到第75天，除非由于肿瘤负荷而提前进行安乐死。[0407]与同种型对照抗体(1mg/kg igg4p同种型对照与10mg/kg igg1同种型对照组合)给药的小鼠相比，对于1mg/kg西米普利单抗与0.1、1或10mg/kg mab1组合给药的小鼠观察到肿瘤生长的统计学显著降低(图18)。与西米普利单抗单独(1mg/kg西米普利单抗与10mg/kg igg1同种型对照组合)给药的小鼠相比，对于1mg/kg西米普利单抗与10mg/kg mab1(但不是0.1或1mg/kg mab1)组合给药的小鼠观察到肿瘤生长在数值上更大的减小；然而，差异未达到统计显著性(调整后p＝0.0525)。[0408]多剂1mg/kg单独的西米普利单抗在7只小鼠中的2只中引起肿瘤清除(图19b)。向西米普利单抗中添加mab1的剂次在测试的10mg/kg mab1最高剂量下引起肿瘤清除频率的增加(7只小鼠中的5只；图19c)，但在1mg/kg和0.1mg/kg mab1的较低剂量下不引起肿瘤清除频率的增加(分别为6只小鼠中的2只和7只小鼠中的2只；图19d和图19e)。所有肿瘤清除的小鼠都保持无肿瘤状态，直到研究结束(第75天，最后一剂后大约9周)。正如所预期的，对于同种型对照抗体给药的小鼠没有观察到肿瘤清除(图19a)。[0409]使用综合gehan-breslow-wilcoxon检验，检测到各组间存活率的统计学显著差异(p＝0.0105)；进行另外的gehan-breslow-wilcoxon检验进行组间比较。与同种型对照抗体给药的小鼠(无存活)相比，对于1mg/kg西米普利单抗与1mg/kg或10mg/kg mab1组合给药的小鼠观察到存活率的显著增加(存活率分别为33％和71％)(图20)。此外，与西米普利单抗单独给药的小鼠相比，对于1mg/kg西米普利单抗与10mg/kg mab1(但不是0.1mg/kg或1mg/kg mab1)组合给药的小鼠观察到存活率的显著增加(29％存活率)。[0410]本公开内容在范围上不受本文描述的具体实施方案限制。实际上，除了本文中所描述的那些内容之外，本领域的技术人员根据前述说明和附图将显而易知本文提供的各种修改。此类修改旨在落在所附权利要求书的范围内。









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