核苷酸混合物在用于防治阿尔茨海默症制剂中的应用的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明属于医药保健领域，涉及一种核苷酸产品及其新用途，具体涉及以核 糖核酸为原料经酶法降解生产的核苷酸混合物在制备用于防治阿尔茨海默症制 剂中的应用。背景技术：2.阿尔茨海默症(alzheimer′s disease，ad)，又称老年痴呆症，是以认知和学 习记忆障碍为典型特征的老年常见病。据世界卫生组织统计至2050年，全球受 老年痴呆症影响的人数将从5000万人上升至1.5亿。我国ad的患病率(60岁 以上)约为4.9％，患病人数占全世界病例的1/4。ad的进展可以分为三个阶段： 轻度认知障碍(mild cognitive impairment，mci)、早期阿尔兹海默症(ead)及 晚期阿尔兹海默症(lad)。遗忘性的轻度认知障碍是ad的第一临床阶段，患 者通常出现记忆缺失与减退；ead患者逐渐出现进行性脑退化；lad患者则表 现为严重的记忆力减退、痴呆、行为改变，其日常生活及生命质量严重受到侵害。 ad发病率及死亡率仅次于肿瘤、心脏病及脑卒中，位居第四位，已成为了降低 老年患者生命质量最常见的病症之一。现阶段尚缺乏针对ad的有效防治手段， 现有治疗药物并不能阻止疾病的发展或者逆转神经功能的衰退，且多数存在副作 用。鉴于营养活性成分具有安全、多效、可预防性干预的优势特点，积极寻找筛 选安全、有效能够早期防治ad的候选物，开发辅助改善老年记忆的活性物质， 对提高老年人生活质量，减轻社会负担，具有重大的科学意义、经济和社会效益。3.核苷酸(nucleotide，nts)是机体重要的遗传、能量代谢、信号转导的物质 基础。核苷酸可以来源于人体内源性合成以及通过生物酶解技术等外源性合成。 外源性核苷酸在特定的生理条件下是不可缺少的营养成分。在代谢旺盛的组织器 官或者当机体受到应激、免疫挑战、肝损伤、饥饿以及快速生长的情况下，核苷 酸能被组织吸收利用，节省机体从头合成或者补救合成的消耗，从而可以优化组 织功能。此外，在体外通过酶解方式将核酸降解成为核苷酸后可以省略体内的分 解过程，更加容易被人体消化吸收。目前，nts以其极高的安全性和高效性特点 成为营养研究的热点，并已被广泛用于婴儿配方乳粉/食品，保健食品/特殊医学 用途配方食品中，显示出其在营养干预中的重要作用和广阔前景。但目前对于酶 解技术获得的外源性核苷酸在防治阿尔茨海默症方面的作用研究尚未见报道。技术实现要素：4.本发明的目的在于提供一种分子量较低、吸收快的核苷酸混合物在制备用于 防治阿尔茨海默症制剂中的应用。5.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：6.本发明提供了核苷酸混合物在制备用于防治阿尔茨海默症制剂中的应用，所 述核苷酸混合物为5’‑单磷酸核苷酸混合物。7.进一步地，所述核苷酸混合物由四种或五种5’‑单核苷酸或者其钠盐形式组 成，其中各种核苷酸折合成cmp、amp、ump、gmp、imp酸型的质量比分别 为：cmp 23～78％、amp 6～44％、ump 7～40％、gmp 7～51％、imp为0、或大 于0且不高于2.5％。8.进一步地，所述核苷酸混合物中各核苷酸折合成cmp、amp、ump、gmp、 imp酸型的质量比分别为：cmp 40～78％、amp 6～20％、ump 7～25％、gmp7～20％、imp为0～1％。9.进一步地，所述核苷酸混合物中各核苷酸折合成cmp、amp、ump、gmp、 imp酸型的质量比分别为：cmp 40～45％、amp 15～20％、ump 20～25％、gmp15～20％、imp为0～1％。10.进一步地，所述制剂为粉剂、片剂、软硬胶囊、饮料或口服液。11.进一步地，5’‑单磷酸核苷酸混合物干预对阿尔茨海默症相关的学习记忆能 力及自主活动能力减退等均具有较好的改善作用，可以有效预防与阿尔茨海默病 相关的学习记忆功能障碍。其作用机制与改善乙酰胆碱合成及利用障碍，降低海 马组织中aβ1-42的表达、调节海马内creb通路蛋白表达，改变海马突触结 构及通过菌群-肠-脑轴来调节宿主的脑功能及行为有关，从而对阿尔茨海默症起 到较好的防治作用。12.本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：13.本发明发现了5’‑单磷酸核苷酸混合物可以改善阿尔茨海默症相关的学习记 忆能力减退、有效预防阿尔茨海默病相关的学习记忆功能障碍，对阿尔茨海默症 发生发展具有较好的防治作用，并发现了其在制备防治阿尔茨海默症的药物或功 能性食品中的用途。14.动物实验证实，摄入核苷酸混合物可有效改善阿尔茨海默症相关的学习记忆 能力减退，改善乙酰胆碱合成及利用障碍，降低海马组织中aβ1-42的表达，上调 海马内creb通路和海马突触结构相关蛋白表达，并通过菌群-肠-脑轴来调节宿 主的脑功能及行为。结果表明本发明所述配比的核苷酸混合物是通过多种途径产 生协同效果最终形成对阿尔茨海默症的防治作用，并且实验过程中发现不同配比 的核苷酸混合物技术效果均存在明显差异。附图说明15.图1为nts干预对samp8小鼠morris水迷宫空间学习记忆的影响(n＝12)；16.图2为nts干预对samp8小鼠海马ache、chat活力的影响(n＝10)；17.图3为nts干预对samp8小鼠海马app和aβ1-42表达的影响(n＝3)；18.图4为nts干预对samp8小鼠海马creb通路蛋白表达的影响(n＝3)；19.图5为nts干预对samp8小鼠海马突触结构蛋白表达的影响(n＝3)；20.图6为nts干预对samp8小鼠肠道菌群分布的影响(n＝8)。具体实施方式21.下面结合具体实施方案对本发明作进一步的说明，这些实例应被理解为仅是 举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。22.实施例123.1.本实施例核苷酸混合物是由四种5’‑单核苷酸或者其钠盐的形式按照 cmp 43wt％、amp 17wt％、ump 22wt％、gmp 18wt％比例混合。24.2.具体制备方式如下：25.(1)将四种5’‑单核苷酸或者其钠盐分别进行检测，合格后备用。26.(2)将质检合格的四种5’‑单核苷酸或者其钠盐过60目筛备用。27.(3)按比例计算称取所需的各单核苷酸样品量，全部加入后进行总混，混合 时间不低于40分钟。所得样品常温保存。28.实施例229.本实施例核苷酸混合物是由五种5’‑单核苷酸或者其钠盐的形式按照cmp23.5wt％、amp 44wt％、ump 25wt％、gmp 7wt％、imp 0.5wt％比例混合。制 备方法同实施例1。30.实施例331.本实施例核苷酸混合物是由五种5’‑单核苷酸或者其钠盐的形式按照cmp78wt％、amp 6wt％、ump 8wt％、gmp 7wt％、imp 1wt％比例混合。制备方 法同实施例1。32.实施例433.本实施例核苷酸混合物是由五种5’‑单核苷酸或者其钠盐的形式按照cmp23wt％、amp 17wt％、ump 40wt％、gmp 18wt％、imp 2wt％比例混合。制备 方法同实施例1。34.实施例535.本实施例核苷酸混合物是由五种5’‑单核苷酸或者其钠盐的形式按照cmp24wt％、amp 15.5wt％、ump 7wt％、gmp 51wt％、imp 2.5wt％比例混合。制 备方法同实施例1。36.实施例637.一、材料与方法38.1.样品：上述实施例1-5中所得的核苷酸混合物样品。39.2.实验细胞：本实施例中所使用的细胞均为来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的 pc-12细胞，购自浙江美森细胞科技有限公司。40.3.神经退行性细胞模型的建立：细胞培养于含1％青霉素/链霉素10％胎牛血 清的dmem高糖培养基中，在5％co2培养箱37℃饱和湿度条件下培养。神经 退行性细胞模型的建立如下：细胞生长贴壁后，不同浓度的过氧化氢进行干预， 浓度分别为50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l、800μmol/l，孵育 4h后弃掉含有过氧化氢的培养基，加入正常完全培养基(含1％青霉素/链霉素 10％胎牛血清的dmem高糖培养基)孵育24h，使用cck-8细胞活性试剂盒检 测细胞活性。选择细胞活力约为正常细胞活力的50％的过氧化氢浓度应用于后续 实验，即选择了200μmol/l的过氧化氢浓度进行后续实验。41.4.实验方法：42.本实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文 献所描述的实验方法或条件或者按照试剂盒说明书进行。下述实施例中所用的材 料、试剂、仪器等均可从商业途径得到。实验结果用均数±标准差(x±sd)表 示。运用spss软件对数据进行行方差齐性分析，方差齐采用单因素方差分析 (one-way anova)；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，满足正 态性或者方差齐性要求后进行统计；若变量转换后仍未达到要求，采用非参数检 验进行统计，实验组与对照组两两组间比较采用最小显著差异法(lsd)，以 p＜0.05为差异显著性标准。43.本实施例中所使用的核苷酸混合物以100μm的浓度溶于细胞完全培养基中。44.将细胞培养于6孔细胞培养板，待细胞贴壁生长后将不同孔细胞设置为正常 对照组、模型对照组、核苷酸混合物组(实施例1-5分别依次记作nts混合物1、 nts混合物2、nts混合物3、nts混合物4、nts混合物5)、单一核苷酸对照组 (β-烟酰胺单核苷酸，nmn)。正常对照组将生长状态良好的细胞培养于正常 完全培养基中；模型对照组将生长贴壁后的细胞用含有200μmol/l过氧化氢的完 全培养基培养4h，弃掉含有过氧化氢的培养基后，加入正常完全培养基孵育24h； 5个核苷酸混合组将生长贴壁后的细胞用含有200μmol/l过氧化氢的完全培养基 培养4h，弃掉含有过氧化氢的培养基后，分别加入含有100μmol/l核苷酸混合 物的完全培养基培养24h；单一核苷酸对照组将生长贴壁后的细胞用含有 200μmol/l过氧化氢的完全培养基培养4h，弃掉含有过氧化氢的培养基后，分别 加入含有100μmol/l单一核苷酸的完全培养基培养24h。使用cck-8细胞活性 试剂盒检测细胞活力。45.二、实验结果46.nts对神经退行性变pc-12细胞活力的影响47.与正常对照组比较，模型对照组细胞内细胞活力显著降低(p＜0.05)。与模 型对照组比较，nmn细胞活力有所升高，但明显低于外源nts混合物，且外源 nts混合物中nts混合物1效果最佳(p＜0.05)(表1)。48.表1外源nts对nts对神经退行性变pc-12细胞活力的影响[0049][0050]注：#与正常对照组比较差异有统计学意义，*与模型对照组比较差异有统计学意义， p＜0.05；#：p＜0.01。[0051]实施例7[0052]一、材料与方法[0053]1.样品：上述实施例1中所得的核苷酸混合物样品。[0054]2.模型动物：选用三月龄健康无特定病原体(specific pathogen free，spf) 级雄性快速老化模型鼠samp8和模型对照鼠samr1小鼠，购自北京大学医学 部实验动物中心(实验动物生产许可证号：scxk(京)2016-0010；实验动物使 用许可证号：syxk(京)2016-0041)。实验期间动物行单笼饲养，动物室温度 控制在22±2℃，相对湿度保持为50％～60％，昼：夜明暗交替时间为12h：12h。[0055]samp8小鼠是研究ad引起的学习记忆功能障碍发生机制以及评价益智药 物的良好动物模型，模型较为稳定，被广泛应用到探索ad相关的学习记忆减退 的研究中。因此，本研究选取了3月龄的雄性samp8小鼠作为ad小鼠模型， 在其快速老化发生之前进行nts干预，探索其对ad相关记忆减退的作用及其可 能机制。[0056]3.实验分组与剂量：samp8小鼠适应性喂养一周后，按体重随机分为5组 (n＝20)：无核苷酸组(纯化饲料，nts-free)、普通对照组(基础饲料，normalcontrol)、nts低剂量干预组(0.3g/kg+基础饲料，nts-l)、nts中剂量干预组 (0.6g/kg+基础饲料，nts-m)、nts高剂量干预组(1.2g/kg+基础饲料，nts-h)， 并设立samr1模型对照组(基础饲料，n＝20)。核苷酸混合物按照上述不同剂 量掺入基础饲料中进行干预。自小鼠三月龄起，各组给予对应饲料进行喂养干预，实验期间动物自由饮水与进食。干预至小鼠12月龄时，进行学习记忆相关行为学实验；并留取小鼠海马组织，于液氮中急速冷冻后储存在-80℃冰箱内待用。[0057]4.实验方法[0058]4.1行为学实验[0059]在小鼠12月龄时(即nts干预9个月后)，每组随机选12只进行行为学实验，包括morris水迷宫实验。为减小系统误差、保证实验前后观察的一致性，各行为学实验均由固定人员负责、实验全程减少人员走动、保持安静。每两个行为学实验之间至少间隔3天，以消除干扰。[0060]morris水迷宫实验(morriswatermaze)[0061]实验时将平台随机置于第一象限并固定于水下1～1.5cm，水温保持在21℃±1℃。共历时7天，分为定位航行实验和空间探索实验两部分。[0062]定位航行实验：用于测量小鼠在水迷宫中的学习和记忆能力。实验历时6天。测试开始前，将平台放置于第一象限中央，并固定平台位置不变。每日测试时，小鼠分别从东、西、南、北4个象限面向池壁轻轻放入水中，记录小鼠从入水到找到平台所需的时间(逃避潜伏期，escapelatency)、游泳路程和游泳速度。每次测试间隔5min，4次成绩的平均值作为当日最终成绩进入最后统计。如果动物在60s内未找到平台，则将由实验者将其引导至平台并在平台上停留10s，逃避潜伏期记为60s。[0063]空间探索实验：用于测量小鼠对平台空间位置的记忆保持能力。实验第7天，撤去平台，将小鼠从第三象限的任选一个入水点放入水中，记录小鼠从入水到第一次到达平台所在位置的时间记为逃避潜伏期，记录60s内小鼠在目标象限(定位航行实验中平台所在象限)的停留时间、目标象限游泳路程及准确穿越平台所在位置的次数。[0064]4.2脑胆碱能系统相关酶活力的检测[0065]取小鼠海马组织，采用紫外比色法，根据试剂盒说明书测定各组小鼠海马乙酰胆碱转移酶(cholineacetyltransferase，chat)及乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，ache)活力。[0066]4.3westernblot检测小鼠海马相关蛋白表达水平[0067]取小鼠海马组织，采用westernblot对小鼠海马组织中：淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein，app)、β淀粉样蛋白(β-amyloidprotein，aβ1-42)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(camp-responseelementbindingprotein，creb)、蛋白激酶acβ亚基(p-pkacβ)、脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor，bdnf)、突触后致密蛋白95(postsynapticdensityprotein95，psd95)、ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(calcium/calmodulin-dependentproteinkinaseii，camkii)、蛋白激酶cγ亚单位(proteinkinasecγsubunit，pkcγ)、磷酸化n-甲基-d-天冬氨酸受体1(n-methyl-d-aspartatereceptor1，nmdar1)的表达水平进行测定。[0068]4.4肠道菌群结构及主要功能菌属鉴定[0069]收集小鼠盲肠内容物，对菌群16srrna基因v3区进行扩增和纯化，使用引物对为27f(5’‑id-agagtttgatcctggctcag-3’)和533r(5’‑id-ttaccgcggctgctggcac-3’)。之后进行454焦磷酸测序，测序在roche454gsflx平台上进行。对预处理合格的全部序列使用在线工具进行对比后，导入arb工具，根据序列相似性水平(取97％)划分操作分类单位(operationaltaxonomic unit，otu)，选取丰度最高的序列作为该otu的代表序列，评估测 序量和各个文库的物种多样性、物种丰富度。采用unifrac分析方法对菌群结构 差异进行分析，多样品间进行相似度比对及组间差异显著性分析，筛选出有显著 差异的一组变量操作分类单位，即造成各组动物菌群结构差异的关键影响因子。[0070]5统计学分析[0071]各组数据分别录入excel数据库，使用spss 24.0软件(spss，inc.，chicago， il，usa)对数据进行分析。连续变量数据用均数±标准差表示，采用 单因素方差分析(one-way analysis of variance，anova)对结果进行分析，采 用最小显著性差异法(least-significant difference，lsd)进行组间的统计检验； 变量转换后仍未达到正态或方差齐的数据，采用kruskal-wallis检验。对于记数 资料，采用卡方检验进行不同组之间差异的统计学分析。确定p＜0.05具有统计 学意义。[0072]二、实验结果[0073]1.nts对samp8小鼠空间学习记忆能力的影响[0074]morris水迷宫是一种评价动物学习记忆，尤其是空间学习记忆功能较为客观 而准确的方法。在morris水迷宫定位航行实验中，动物需要通过反复学习、认 识迷宫周围物体的空间位置，寻找记忆里接近迷宫中平台的最佳路线，用最短时 间找到并爬上平台。若动物的空间学习记忆能力下降，其逃避潜伏期和游泳距离 将延长；而空间探索实验用于测量动物学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的 能力。[0075]nts干预对samp8小鼠morris水迷宫空间学习记忆的影响结果如图1所示， nts-free、normal control组小鼠逃避潜伏期显著大于nts-l、nts-m组(p＜0.05)， 同时穿越平台次数、目标象限停留时间及目标象限路程均明显小于nts-l、nts-m 组(p＜0.05orp＜0.01)。结果说明nts-free、normalcontrol组小鼠在12月龄 时空间学习记忆能力显著下降，而nts干预可明显缩短samp8小鼠的逃避潜伏 期，寻找到平台的速度更快，穿越平台所在位置的次数增加，目标象限停留的时 间延长。表明nts能够有效预防samp8小鼠空间学习记忆能力的减退。图1中， a代表与nts-free组相比；b代表与normal control组相比；*代表差异具有显著 性：p＜0.05；#：p＜0.01。[0076]2.nts对samp8小鼠胆碱能系统酶活力的影响[0077]ad患者认知功能衰退程度与海马组织及皮质中胆碱能系统异常有关。ad 患者脑内多表现出chat及ache水平的异常，其诱导了胆碱能神经元缺失及胆 碱能神经纤维的退行性改变的发生发展。乙酰胆碱(acetylcholine，ach)是大 脑学习记忆与认知能力的重要神经传导介质，胆碱能神经递质的减少可直接导致 学习记忆障碍，甚至直接增加罹患老年痴呆症的风险。chat是胆碱能发挥作用 的重要启动酶，其能促进细胞乙酰辅酶a与胆碱合成ach。ache可作用于突 触间隙中的ach使其迅速水解形成乙酸盐及胆碱，是导致机体内ach失活的关 键酶。海马胆碱能系统功能的正常维持可促进记忆相关活动的正常进行，各种行 为学实验的训练过程可引起海马ach水平的升高，并诱发chat的长期水平提 升。[0078]nts干预对samp8小鼠海马ache、chat活力的影响结果如图3所示， ache水平在nts-l组要明显低于nts-free和normalcontrol组(p＜0.05，p＜ 0.01)，在nts-h组明显低于normal control组(p＜0.05)。chat水平在nts-l 组要明显高于nts-free和normalcontrol组(p＜0.05)，在nts-h组明显高于 nts-free组(p＜0.05)。表明nts干预可以通过降低脑组织内ache活性及增加 chat的活性，对乙酰胆碱合成及利用障碍具有防治作用，从而起到保护正常脑 组织胆碱能系统正常运作，预防学习记忆障碍的作用。[0079]3.nts对samp8小鼠海马aβ生成的影响[0080]β淀粉样蛋白(β-amyloid protein，aβ)被公认为是阿尔兹海默症的生物标志 物，老年斑中β淀粉样蛋白沉积为淀粉样蛋白原纤维或非原纤维的无定形聚集体， 由此形成阿尔茨海默病的典型脑特征。aβ在体内由淀粉样前体蛋白app经水解 产生，主要有aβ1-42、aβ1-40和aβ1-43。其中aβ1-42是aβ的主要类型，也是构成 ad病人脑内老年斑的主要成分。[0081]aβ的神经毒性是多种因素导致ad发病的共同通路，能引起一系列的细胞 内生理和生化改变。近年来，对aβ研究的重心从不溶性的淀粉样斑块逐渐转移 到可溶性的寡聚体上。aβ寡聚体是发挥神经毒性，造成ad病人学习记忆下降 的主要原因。在ad的早期阶段，大量的aβ寡聚体诱导一系列的生化改变，导 致神经细胞突触可塑性的降低，学习记忆能力的下降。在海马切片的体外培养和 一些体内实验均发现可溶性aβ寡聚体能够抑制突触ltp的诱导和强化。ad病 人脑部aβ寡聚体的浓度是正常对照大脑的70倍。samp8小鼠在度过生长期 后，伴随着学习记忆的快速减退海马内自发生成过量的可溶性aβ。和ad类似， 正是这些可溶性aβ引起samp8小鼠的学习记忆的减退。同时形态学结果发现 samp8小鼠没有明显的海马神经元的丢失，而海马神经元的凋亡是ad晚期的 典型表现。因此研究认为samp8小鼠是比较好的ad早期aβ相关学习记忆减 退的动物模型。[0082]nts干预对samp8小鼠海马app和aβ1-42表达的影响结果如图3所示， app蛋白表达含量在nts-l组要明显低于nts-free及normalcontrol组(p＜0.05)； aβ1-42蛋白表达含量在nts-l及nts-m组要明显低于nts-free及normalcontrol 组，差异具有显著性(p＜0.05)。表明nts可通过减少脑组织内淀粉样蛋白的沉 积，来干预其潜在的对海马神经元及突触可塑性的侵害作用，具有减缓学习记忆 障碍发展，降低神经退行性疾病发生风险的潜力。图3中，a代表与nts-free组 相比；b代表与normal control组相比；*代表差异具有显著性：p＜0.05；#：p＜0.01。[0083]4.nts对samp8小鼠海马creb通路的影响[0084]ad伴随着海马及周围皮质中转录和表观遗传学的改变，最终会导致相关蛋 白的表达异常，进而抑制长时程增强(ltp)进程，造成突触可塑性的下降，对 机体的学习及记忆能力造成影响。环磷腺苷效应元件结合蛋白(creb)是长期 突触可塑性维持的重要转录因子，其在磷酸化后可被各种酶激活。creb的持续 磷酸化(p-creb)被认为是增强ltp所必需的，在控制神经元功能中起到重要 作用，如参与调控神经元分化及学习与记忆有关基因的转录，辅助细胞增殖与生 存等。pka是creb上游主要的蛋白激酶之一。活化的pka能够直接诱导creb 的磷酸化，或者通过激活erk从而间接的诱导creb的活化。脑源性神经营养 因子(bdnf)是creb调控的重要下游靶因子，是神经生长因子(nervegrowthfactors，ngfs)大家族中非常重要的一员。广泛存在于神经系统，其中以 海马中含量最为丰富。bdnf对学习记忆的影响可能通过以下方式：(1)bdnf 在nmdar-camkii介导下依赖性释放，作用于突触前膜和突触后膜，激活特异 性受体酪氨酸激酶受体b(tyrosine kinase receptor b，trkb)，引发结构和功能 ltp，调节突触可塑性，影响学习与记忆。(2)bdnf能够通过诱导轴突生长 锥结构和功能的变化，促进多种神经元的存活和生长发育，从而促进生长期的脑 部发育，增强学习记忆能力。[0085]nts干预对samp8小鼠海马creb通路蛋白表达的影响如图4所示，小鼠 海马组织p-creb表达水平在nts-l、nts-m、nts-h组明显高于nts-free组， 且在nts-m还要高于normal control及samr1组，差异具有显著性(p＜0.05orp＜0.01)。p-pka β表达水平在nts-l、nts-m组明显高于nts-free、normalcontrol及samr1组(p＜0.05)。bdnf表达水平在nts-l、nts-m、nts-h组 要显著高于nts-free及normal control组(p＜0.05or p＜0.01)。结果表明nts 能够预防samp8小鼠海马内磷酸化的pka、creb及bdnf水平的降低。其机 制可能为nts使pka等蛋白激酶活性增高，转录因子creb的ser133位点磷 酸化水平增高；此外，还可能直接调节海马神经细胞内creb信号途径，发挥 其神经保护作用。可见，nts通过直接调节细胞内蛋白激酶通路，增加ad小鼠 海马内creb的活性，增加bdnf等具有神经保护作用的靶基因的表达，反过 来这些靶基因又能够促进creb的活化，当这种良性循环长期存在，可能会使 nts长期干预小鼠的海马神经突触结构发生变化，突触传递效能增加，进而促进 学习记忆。图4中，a代表与nts-free组相比；b代表与normal control组相比； c、d分别代表与nts-l、nts-m组相比；*代表差异具有显著性：p＜0.05；#： p＜0.01。[0086]5.nts对samp8小鼠海马突触结构蛋白表达的影响[0087]为进一步探索ad和nts对突触形态结构的影响，我们对一些突触相关结构 蛋白表达进行测定。采用western blot方法检测了突触结构相关蛋白psd95、 camkii、nmdar1和pkcγ的表达情况。[0088]在学习与记忆过程中，神经元细胞处于兴奋状态，其中nmdar的激活会 导致细胞内ca2+浓度的增加，进而触发一系列依赖钙的信号级联反应激活。其中， ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camk ii)被认为是诱导ltp形成及相关神经 树突棘结构可塑性的必要条件，其在神经元之间的信号传递、神经电路的发育及 认知功能当中起到了关键作用。ad过程中会发生camkii活性的抑制，进而导 致依赖性nmdar受体功能的下降，破坏突触可塑性并造成神经退行性疾病相 关的认知障碍的出现。nmdar是一种谷氨酸的配基和电压双门控离子通道，在 突触ltp的产生过程中，起着非常重要的作用。nmdar1亚单位是组成nmdar 离子通道的必需配件，是其功能性亚基。有研究者将大鼠ca1区nmdar1亚 基敲除后，该区由nmdar介导的ltp明显消弱，大鼠空间学习记忆的精确性 受到损害。近年来研究证明，pkc与突触可塑性及ltp的形成密切相关，pkc 的激活是ltp产生的重要条件。突触后致密物(postsynaptic density protein，psd) 是位于中枢神经系统突触后膜下由多种蛋白构成的特化区，在电子显微镜下呈密 度增高影，在介导和整合突触信号传递以及学习记忆中发挥重要的作用。psd95 是psd中的一种特殊的胞质内蛋白质，也是psd结构中的主要框架成分。[0089]nts干预对samp8小鼠海马突触结构蛋白表达的影响结果如图5所示，小 鼠海马组织p-camkii表达水平在nts-l组明显要高于nts-free、normalcontrol 及samr1组(p＜0.05orp＜0.01)。pkcγ表达水平在nts-l、nts-h组要明显 高于nts-free、normalcontrol组(p＜0.05)。p-nmdar1表达水平在nts-l、 nts-m组要明显高于nts-free、normalcontrol及samr1组，在nts-h组要明 显高于nts-free组(p＜0.05or p＜0.01)。psd95表达水平在nts-free、 normalcontrol组要低于其它各组，但无明显统计学差异(p＞0.05)。以上研究结 果表明，nts干预可以改善samp8小鼠的脑组织ca2+调节相关酶的表达，且 nts-l组整体改善效果要优于其它各组，从而缓解钙调节异常，调控突触可塑性 相关蛋白表达，进而改善ad相关学习记忆功能障碍。图5中：a代表与nts-free 组相比；b代表与normal control组相比；c、d分别代表与nts-l、nts-m组相 比；*代表差异具有显著性：p＜0.05；#：p＜0.01。[0090]5.nts对samp8小鼠菌群-肠-脑轴的影响[0091]肠道菌群代谢产物及其对宿主神经化学的影响以及病原体感染可能增加阿 尔兹海默症的发病风险。研究人员对比了ad和年轻小鼠在肠道菌群、脑代谢、 脑血管功能、认知行为方面的差异，发现ad小鼠肠道菌群构成发生改变：α多 样性增加、厚壁菌门/拟杆菌门的比例上升；脑代谢产物中与ad相关的多种氨基 酸和脂肪酸含量增加，血脑屏障功能受损，学习记忆能力下降，焦虑现象增加。 在健康人中，肠道革兰氏阴性杆菌产生的脂多糖(的免疫组化信号在脑实质中聚 集成块，而在ad患者中，75％的lps信号聚集在dapi染色的细胞核的周围； 提示在ad患者的脑中大量存在着来源于胃肠道菌群的促炎症信号，随着退行性 疾病，这些毒素分子可能从胃肠道中“漏”进全身循环，最终进入脑。对阿尔兹 海默症患者、轻度认知障碍患者及健康人的粪便菌群多样性及组成进行比较发现， 在轻度认知障碍阶段(阿尔兹海默症的前期)，肠道菌群已发生与疾病阶段相似 的变化。肠道菌群有可能通过菌群-肠-脑轴来调节宿主的脑功能及行为，包括认 知行为的改变，基于菌群-肠-脑轴进行营养干预将成为ad防治的重要途径。针 对nts对小鼠肠道菌群的影响进行了研究，如图6所示，在门水平上，nts-free 组变形菌门、patescibacteria菌门和疣微菌门丰度高于其它各组，拟杆菌门丰度 少于其它各组。nts-l组和nts-m组厚壁菌门含量最高、拟杆菌门含量较少； nmn组厚壁菌门、变形菌门、patescibacteria菌门含量最少，拟杆菌门含量最高。 可见，与nts-free组相比，nts干预可适度降低变形菌门、patesciba菌门和疣 微菌门含量。与nts组相比，nmn组干预可降低厚壁菌门含量，增加拟杆菌门 含量。为了更准确的了解各组间肠道菌群结构的差异，我们在属水平上进行分析， 并结合alpha多样性分析，结果发现nts-free组ace值和chao1值均最小，表 明nts-free组小鼠粪便的细菌丰度较小。而simpson指数与shannon指数均为 nts最大，nts-free最小。因此，nts-free组的小鼠粪便物种多样性最高，而 nts-free则最低，由此表明nts可以增加小鼠肠道菌群的多样性。anova(方 差分析)分析发现，在属水平上，对机体有负面影响的菌属，如梭菌目未培养菌 (uncultured_bacterium_o_clostridiales)、脱硫弧菌科未培养菌 (uncultured_bacterium_f_desulfovibrionaceae)、tyzzerella、劳尔氏菌属 (ralstonia)、ruminiclostridium_5菌属、毛螺菌科(lachnospiraceae_ucg-006)、 毛螺菌科(lachnospiraceae_fcs020_group)、anaerovorax以及拟杆菌属 (bacteroides)均在nts-free中相对丰度最大，表明nts能显著影响小鼠的肠 道菌群，尤其增加了致病菌的丰度水平。以上结果表明，在无核苷酸组中，对机 体有负面影响的菌群相对丰度显著性增加，因此有目的地补充外源核苷酸对调节 肠道菌群，维护机体健康至关重要。通过kegg代谢途径的组成及差异分析发 现，nts的添加能显著影响amino acid metabolism(氨基酸代谢)、carbohydratemetabolism(碳水化合物代谢)、enery metabolism(能量代谢)、membrane transport (膜转运)、metabolism of cofactors and vitamins(辅助因子和维生素代谢)、 nucleotide metabolism(核苷酸代谢)、replication and repair(复制和修复)、signaltransduction(信号转导)、translation(翻译)等代谢通路。nts可能是影响了与 以上代谢相关通路关系密切的菌群的相关丰度，从而达到调节小鼠肠道菌群。综 上，我们可知nts干预则能够增加ad引起的菌群丰度水平的下降，改善菌群结 构(有益菌/有害菌比)，减少对机体有负面影响的菌群相对丰度，其机制可能是 通过影响与代谢相关通路关系密切的菌群的相关丰度，从而达到调节小鼠肠道菌 群的作用，进而可能通过菌群-肠-脑轴来调节宿主的脑功能及行为，包括认知行 为的改变。图6中，a：nts-free组；b：normal control组；c：nts-l组；d： nts-m组；e：nts-h组；f：samr1组。[0092]三、实验结论[0093]本发明采用快速老化samp8小鼠模型，研究了nts预防阿尔茨海默病相 关的记忆减退的作用及其可能机制。研究发现nts干预对小鼠的学习记忆能力 等均具有一定的保护作用，可以有效预防阿尔茨海默病相关的学习记忆功能障碍。 nts发挥作用的机制可能与改善乙酰胆碱合成及利用障碍，降低海马组织中 aβ1-42的表达，调节海马内creb通路和海马突触结构相关蛋白表达，及通过菌 群-肠-脑轴来调节宿主的脑功能及行为有关，从而实现对阿尔茨海默症起到早期 防治的作用。[0094]对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下， 都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或 修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据 本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍 属于本发明技术方案保护的范围内。









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