一种禽呼肠孤病毒检测传感器中抗体固定的方法与流程

测量装置的制造及其应用技术1.本发明涉及生物技术领域，尤其是一种禽呼肠孤病毒检测传感器，特别涉及到禽呼肠孤病毒检测传感器中增强抗体固定性能的方法。背景技术：2.禽呼肠孤病毒(avian reovirus，arv)是呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属的成员，可感染鸡、火鸡、鸭、鹅及其它野鸟，引起病毒性关节炎、呼吸道疾病、肠道疾病、中枢神经症状和免疫抑制等多种疾病。目前检测arv的主要方法有 elisa、rt-pcr、半套式rt-pcr、核酸探针技术。cn103235123a公开了一种用于检测呼肠孤病毒电化学免疫传感器的工作电极的制备方法，采用了先固定待测样品中目标物质的探针的技术方案，目的是延长探针保存的有效时间，为了保证传感器的灵敏度和特异性，样本的前处理时间比较长，因此牺牲了检测时间上能够快速检测的优势。3.电化学免疫传感器是将电化学分析方法和免疫分析方法相结合的一种新型检测技术，原理是：通过物理化学方法，将能够识别目标物的敏感元件(eg抗体) 固定到工作电极表面上，再与待检的目标物特异性结合，生成的生物化学能被转换成电能，并以电信号形式输出，通过对电信号的检测分析，实现对目标物的检测。当前电化学免疫传感器的研究绝大多数还处于基础实验阶段，“电化学免疫法”中，已获得药监局批准上市销售的有且仅有中山和芯生物技术有限公司注册申请的二类医疗器械：降钙素原检测试剂盒(电化学免疫法)(注册证编号：粤械注准20202401983)，究其原因主要是电化学免疫传感器尚无法满足ivd 临床检测中对灵敏度、稳定性和检测范围的要求。4.纳米材料具有大的比表面积，因此目前已经有大量的研究表明使用纳米材料修饰电极，可以有效提高电极表面的装载能力从而达到扩大检测线性范围、提高检测灵敏度的目的。目前研究工作者们主要关注如何开发各种新型纳米材料，并结合各种信号放大技术不断提高电化学免疫传感器的性能。但是纳米材料在电化学免疫传感器的应用方面仍然缺乏系统的研究，尚不能完全实现对复杂的生物样品的快速、灵敏的检测。5.电化学免疫传感器的线性范围、灵敏度等重要参数是由电极表面的修饰物、抗体的固定方式、电极表面承载能力及信号产生的方式等因素共同决定的，其中更重要的是受到电极修饰材料、电极表面抗体固定方式的影响，尤其是抗体的固定方式应该得到充分的关注，但是目前抗体固定方式对传感器影响的系统的研究还是比较少。6.常见的抗体类型有igg,iga及igm,它们都是y型蛋白。其中igg在免疫传感器被广泛应用，它是一种血清蛋白，分子量约为100kda，由二硫键将两条轻链和两条重链连在一起组成的y型结构，其中含与抗原结合的活性位点的 y型头部由氨基组成，而尾部含有羧基。目前常用于抗体的固定有①利用链酶生物素-亲和素的特异性结合将生物素化的抗体固定在链酶亲和素修饰的电极表面上；②利用羧基甲基化葡聚糖包被电极，然后戊二醛(glu)交联法、1-乙基-3‑ꢀ(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺(edc/nhs)化学法或直接法固定抗体。本发明的目的在于寻找一种优于现有的抗体固定方式的电化学免疫传感器的制备方法，从而提高传感器的线性范围和灵敏度。技术实现要素：7.本发明的目的在于至少部分地克服现有技术的缺陷，提供有利于禽呼肠孤病毒检测传感器中增强抗体固定性能的方法。8.本发明的目的还在于提供一种有利于增强禽呼肠孤病毒检测传感器的线性范围和灵敏度的方法。9.为达到上述目的或目的之一，本发明提供了如下技术方案：10.一种电化学免疫传感器的制备方法，制备得到的传感器用于检测禽呼肠孤病毒，其中，传感器工作电极的制备包括抗体固定前的预处理步骤，并按以下步骤制备：处理电极：包括抛光、水洗、超声清洗、浸泡、用循环伏安进行扫描至稳定后n2吹干；纳米复合物修饰电极：将由贵金属制得的纳米复合物滴加在该电极的表面，4℃下自然晾干，该贵金属为金、铂或金+铂；抗体固定前的预处理：在纳米复合物修饰电极的表面滴加10μl孵育溶液，孵育后用pbs 洗液冲洗至少3次；抗体固定：再滴加禽呼肠孤病毒的单克隆抗体arv/mab，在密闭条件下，4℃下固定反应8h；封闭与检测：抗体固定反应后，依次用 pbs洗液冲洗、bsa溶液封闭、pbs洗液再次冲洗后得到工作电极，直接滴加待测样品，用电化学扫描检测。11.根据本发明的一个优选实施例，所述电化学免疫传感器的制备方法中，电极为玻碳电极，纳米复合物优选为石墨烯-甲壳胺-金铂纳米粒子g-chi-au/pt纳米复合物，该复合物的制备方法包括：石墨烯g：将石墨粉依次高温氧化、超声、硼氢化钠高温还原、洗涤后得到石墨烯g；甲壳胺溶液chi：将甲壳胺溶于醋酸溶液中，25℃磁力搅拌1h混匀，得到甲壳胺溶液chi；其中，该醋酸溶液为冰醋酸和水体积比为1.0％的混合溶液，得到甲壳胺溶液的浓度为0.1wt％；石墨烯-甲壳胺悬浊液g-chi：将石墨烯与上述甲壳胺溶液混匀，超声，得到石墨烯-甲壳胺悬浊液g-chi；其中，超声的功率为250w、连续超声2h，石墨烯 g与甲壳胺溶液chi的投料配比为1mg：1ml；纳米复合物：将四氯金酸溶液与四氯铂酸钾溶液加入上述石墨烯-甲壳胺悬浊液g-chi中，室温搅拌3h，然后 80℃水浴继续反应1h，得到石墨烯-甲壳胺-金铂纳米复合物g-chi-au/pt，即金铂纳米复合物，四氯金酸溶液与四氯铂酸钾溶液的浓度均为10mmol/l、用量均为1ml，石墨烯-甲壳胺悬浊液g-chi的用量均为20ml，其中金au、铂pt、石墨烯g这3者的投料配比为1mmol：1mmol：2g。12.根据本发明的一个优选实施例，所述孵育溶液为半胱胺盐酸盐溶液，该半胱胺盐酸盐溶液的浓度为2mg/ml，孵育为避光条件下反应4h。13.根据本发明的一个优选实施例，所述孵育溶液为戊二醛溶液，该戊二醛溶液的浓度为5％，孵育为室温下孵育3h。14.根据本发明的一个优选实施例，所述孵育溶液为edc/nhs时，先将纳米复合物修饰电极置于naoh溶液中+1.3v恒电位作用40s后，再在其表面滴加孵育溶液；该naoh溶液的浓度为0.5mol/l，该孵育溶液为含有edc和nhs 的mes溶液、且edc的浓度为50mmol/l、nhs的浓度为30mmol/l、mes 溶液的ph值为4.7，孵育为室温下孵育1h。15.根据本发明的一个优选实施例，所述扫描检测是置于电解液中进行，该电解液为含5mm k4fe(cn)6，5mm k3fe(cn)6及0.1m kcl的pbs缓冲液，该 pbs缓冲液的ph值为7.0。16.本发明请求保护一种检测禽呼肠孤病毒的电化学免疫传感器，所述传感器为三电极系统，包括工作电极、辅助电极和参比电极，该工作电极为根据上述电化学免疫传感器的制备方法制得、辅助电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极。17.本发明请求保护一种禽呼肠孤病毒的检测试剂盒，包括检测禽呼肠孤病毒的电化学免疫传感器，该试剂盒检测禽呼肠孤病毒的检测线性范围为0～ 105.82eid50/ml、最低检测限为100.46eid50/ml。18.根据本发明的一个优选实施例，所述试剂盒还包括pbs洗液、电解液、辅助电极和参比电极，该辅助电极为铂丝电极，该参比电极为饱和甘汞电极，该电解液为含5mm k4fe(cn)6，5mm k3fe(cn)6及0.1m kcl的pbs缓冲液，该 pbs缓冲液的ph值为7.0。19.本发明请求保护一种检测呼肠孤病毒的应用方式，包括电化学免疫传感器的制备方法，在制备用于检测呼肠孤病毒中的产品中的应用。20.本发明的有益效果：21.本发明致力于在电化学传感器平台不断地深耕细作，并在cn103235123a 公开内容的基础上，对同一检测对象(呼肠孤病毒)在电化学免疫传感器领域进行完整的、系统的研究，进一步完善了对纳米材料和抗体固定方式的研究，实现对复杂多变的病毒类样品进行快速、灵敏检测的目的，取得了预料不到的技术效果。22.1)本发明制备了金铂纳米复合物，所述石墨烯-甲壳胺-金铂纳米粒子g‑ꢀchi-au/pt纳米复合物为同时含有金、铂的双金属纳米复合物，以石墨烯-甲壳胺作为基底，金、铂离子在溶液中通过螯合作用被chi吸附，加热后被chi原位还原成金属纳米粒子，并结合在g-chi的表面，形成的g-chi-au/pt纳米复合物，一方面可以增加电极表面活性面积，有利于进一步在金铂双金属表面进行结合修饰，固定后形成的免疫复合物稳定性更高、更牢固；另一方面金铂双金属拥有强大的电荷载体移动能力，提高了电极表面的电子传递的能力，导电性相对更好、还有助于增大信号；再一方面金铂双金属的催化性能还有助于提高传感器的灵敏度、拓宽线性范围，使得检测限更低。23.2)本发明不仅优化得到了金铂纳米复合物，还进一步优化了纳米复合物、尤其是金铂双金属纳米复合物的制备方法，主要是将四氯金酸溶液与四氯铂酸钾溶液加入石墨烯-甲壳胺悬浊液g-chi中，其中金铂双金属粒子经过搅拌加热后共价结合在石墨烯-甲壳胺g-chi的表面。该方法属于一种化学制备方法，制备步骤简单，方便，不需要昂贵的仪器设备；相对于粉碎法、气相法、电弧法和辐照等物理方法，本制备方法成本更低、制得的纳米粒子产量更高；相对于晶种生长法、模板法、微乳液法、微波合成法等其它化学方法，制备的石墨烯‑ꢀ甲壳胺-金铂纳米粒子g-chi-au/pt纳米复合物，即金铂纳米复合物热稳定性更好、纳米粒子的粒径分布1.5～5.2nm，分散度较高，易溶于普通溶剂中且不易发生聚沉或分解，因此易于利用其作为电极修饰的复合物溶液固定后，进行下一步有机分子或化合物的修饰或功能化。24.3)本发明进一步将优化得到的金铂纳米复合物与传统电极修饰表征的纳米复合物(单金属的金纳米复合物、铂纳米复合物)进行系统研究，意外的发现相对于传统常用的单金属的纳米复合物，优化结合的双金属金铂纳米复合物的导电性相对更好；系统分析其原因，可能是因为双金属相对于单金属，活性表面更大、电荷载体移动能力更强，因此，有利于提高传感器的灵敏度及电化学催化活性。25.4)本发明利用半胱胺盐酸盐溶液(ch)作为孵育溶液，进行抗体固定前的孵育预处理，之后再进行抗体固定，修饰电极的交流阻抗图显示其ret值相对较大；用bsa封闭后得到的工作电极ge-g-chi-au/ptnp-ch-arv/mab‑ꢀbsa-arv的ret值也是相对最大；通过ch孵育方法成功将更多的蛋白质(如 bsa和抗体等)固定到电极表面上，具体原因可能是：ch孵育方法可以丰富的电极表面的巯基和氨基，为蛋白质(如bsa和抗体等)的结合提供更多的活性位点；进一步ch孵育方法在成功地将较多量的抗体(比如单抗arv/mab) 固定到电极表面上后，相应的该方法固定抗体后经bsa封闭得到的工作电极，也能够结合较多量的的arv病毒粒子。26.5)本发明进一步将优化得到的ch孵育方法与传统的孵育方法 (edc/nhs孵育法、glu孵育法)进行系统的对比研究，系统分析了各方法的优势和原因：①利用edc和nhs的mes溶液(简称edc/nhs)作为孵育溶液，孵育前在碱液(naoh溶液)中进行恒电位作用，edc/nhs孵育后再进行抗体固定，也能固定吸附更多的蛋白质(如bsa和抗体等)，可能是 edc/nhs孵育方法可以丰富的电极表面的羧基和氨基，为蛋白质(如bsa和抗体等)的结合提供更多的活性位点，相对于抗体直接固定方法，固定吸附到电极表面上蛋白质(如bsa和抗体等)的量多一些，但相对于ch孵育方法，固定吸附到电极表面上蛋白质(如bsa和抗体等)的量少些，且制备过程更复杂。进一步地，用edc/nhs方法孵育预处理后固定抗体并经bsa封闭得到的工作电极，结果相对于抗体直接固定方法得到的工作电极，却只能结合较少量的的arv病毒粒子，分析原因可能是：edc/nhs方法孵育预处理是将单抗 arv/mab上fab端的胺基连接到电极表面的羧基上，而单抗arv/mab与 arv病毒粒子的结合位点也在fab端上，因此，edc/nhs方法固定单抗 arv/mab后会在fab端造成一定程度的空间位阻，阻碍了单抗arv/mab与 arv病毒粒子的结合；而抗体直接固定法中，是单抗arv/mab上fc端的羧基连接到修饰电极表面上，或者通过单抗arv/mab侧链上的巯基连接到 au/ptnp的表面上，无论是fc端的羧基还是侧链上的巯基，都距离单抗 arv/mab的fab端上与arv的结合位点较远，空间位阻较小；②利用传统的戊二醛溶液(glu)孵育法预处理后再进行抗体固定，由于glu末端含有2个醛基，相对于直接进行抗体固定，虽然能够一定程度地提供蛋白质(如bsa和抗体等)的活性位点，但由于戊二醛作为一种双官能团交联剂，会发生自连现象，因此固定吸附的蛋白质相对于ch孵育方法较低。27.5)本发明系统地将金、铂的双金属纳米复合物与抗体固定前的预处理方法进行配对结合，得到了一种有利于提高禽呼肠孤病毒检测传感器灵敏度、稳定性和检测范围的优化组合，最终利用金铂纳米复合物修饰表征电极后、用ch 孵育方法进行抗体固定前的预处理，最终优化制备得到的用于检测禽呼肠孤病毒的电化学免疫传感器，检测线性范围为0～105.82eid50/mlarv，最低检测限为 100.46eid50/mlarv，相对于抗体直接固定方法(检测线性范围为 0～104.82eid50/mlarv)，检测线性范围提高了10倍。28.6)本发明优化得到的用于检测禽呼肠孤病毒的电化学免疫传感器，属于电化学免疫传感器中的直接法，结合了免疫分析和电化学检测的优点，采用三电极体系，工作电极上修饰纳米材料后固定捕获抗体形成生物敏感膜，当待测液体中的抗原和固定抗体结合后，作为信号标记物会增大电极表面的电阻，降低电子转移率，电极表面电化学性质的改变用以提供电化学信号，且改变的程度与待测抗原浓度相关，还可以通过电化学检测可以获得待测抗原(如本发明所述的禽呼肠孤病毒)的浓度信息。附图说明29.图1为不同纳米复合物修饰电极的电化学阻抗谱和ret值的柱状图，a为电化学阻抗谱，b为ret值的柱状图，其中，a为ge；b为ge-g-chi-aunp；c 为ge-g-chi-ptnp；d为ge-g-chi-au/ptnp；30.图2为不同预处理后单抗固定的电化学阻抗谱；31.图3为不同预处理后蛋白固定对照组的电化学阻抗谱；32.图4为不同预处理后制备的工作电极的电化学阻抗谱；33.图5为不同预处理后工作电极检测阳性待测液的电化学阻抗谱；34.图6为不同预处理后蛋白固定对照组检测阳性待测液的电化学阻抗谱；35.图7为图2-图6对应电化学阻抗谱对应ret值的柱状图；36.图8为glu孵育方法得到的系列检测电极的电化学阻抗谱和ret值与arv 含量的线性关系图；37.图9为edc/nhs孵育方法得到的系列检测电极的电化学阻抗谱和ret值与arv含量的线性关系图；38.图10为抗体直接固定法得到的系列检测电极的电化学阻抗谱和ret值与 arv含量的线性关系图；39.图11为ch孵育方法得到的系列检测电极的电化学阻抗谱和ret值与 arv含量的线性关系图；40.图12为4组不同预处理后的传感器特异性实验中ret值的柱状图；其中a 代表glu孵育方法，b代表edc/nhs孵育方法，c代表抗体直接固定法，d代表ch孵育方法；41.图13为4组不同预处理后的传感器5批次制备工艺稳定性试验ret值的柱状图；其中a代表glu孵育方法，b代表edc/nhs孵育方法，c代表抗体直接固定法，d代表ch孵育方法；42.图14为同一批次制备的4组不同预处理后的传感器的热稳定性试验ret值的柱状图；其中a代表glu孵育方法，b代表edc/nhs孵育方法，c代表抗体直接固定法，d代表ch孵育方法；横坐标代表4℃分别保存1周、2周、3周与4周。具体实施方式43.下面结合实际应用详细描述本发明的示例性的实施例，在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。44.下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中， haucl4,k2ptcl4及牛血清白蛋白(bovine serum albumin,bsa)购自sigma公司； kmno4、k4fe(cn)6、k3fe(cn)6、h2so4、ch3ch2oh、甲壳胺(chi)、石墨粉(g)，维生素c等均为国产分析纯，实验用水为二次去离子水；抗arv单克隆抗体(arv/mab)由广西兽医研究所制备(参考文献：谢志勤,谢芝勋,刘加波, 庞耀珊,邓显文,谢丽基,范晴,禽呼肠孤病毒s1733株单克隆抗体的制备及夹心 elisa检测方法的建立.中国畜牧兽医.2012,39(11):47-51)。45.下述实施例中所用的仪器有：4000a电化学工作站(princetonapplied research)，使用常规的三电极电化学池进行电化学测量，修饰的金电极作为工作电极，饱和甘汞电极(sce)作为参比电极，铂电极作为辅助电极。免疫传感器包括工作电极、参比电极和辅助电极构成的三电极系统，免疫传感器通过导线与电化学工作站相连。46.下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。47.本发明内容中涉及的待测样品，主要是待测病毒液：禽呼肠孤病毒 (arv)、h3亚型禽流感病毒(aiv h3)、h9亚型禽流感病毒(aiv h9)、新城疫病毒(ndv)、喉气管炎病毒(ltv)、传染性支气管炎病毒(ibv)和传染性法氏囊病毒(ibdv)均由广西兽医研究所生物技术实验室保存，属于微生物领域中的病毒保存液；本发明应用中所涉及的待测样品为离体的无生命的生物样本，仅仅涉及采自于人体或动物体的组织、体液或排泄物等的生物样本，包括已经脱离了有生命的人体或动物体的血液样品(全血/血清/血浆)和体液样品(尿液/粪便/脑脊液/浆膜腔积液/精液/前列腺液/阴道分泌物/胃液/十二指肠引流液及胆汁/痰液)等，不属于有生命的人体或动物体；即本发明所述方法及其应用均不是直接以有生命的人体或动物体为实施对象、也不包括将检测到的生物信息与基准数据进行比较的步骤，以及根据该生物检测信息得出具体诊断结论的步骤；所述检测的直接目的，不是获得疾病的诊断结果或健康状况，而是可以在产业上利用进行生产禽呼肠孤病毒检测的体外检测试剂盒或相关产品，因此，本发明不属于疾病的诊断方法，符合《专利法》对专利保护客体的基本要求。48.本发明提供了一种电化学免疫传感器的制备方法，用于检测禽呼肠孤病毒，所述方法包括如下步骤：(1)处理电极；(2)纳米复合物修饰电极；(3)抗体固定前的预处理；(4)抗体固定；(5)工作电极与检测；本发明所述制备方法中，工作电极的制备增加了抗体固定前的预处理步骤，并且所述纳米复合物为金铂双金属纳米复合物，所述预处理为用半胱胺盐酸盐溶液进行孵育。本发明的经实验证明该传感器检测线性范围为0～105.82eid50/ml、最低检测限为 100.46eid50/ml，相对于抗体直接固定方法，检测线性范围提高了10倍，且敏感度高，特异性良好。49.实施例1、金铂纳米复合物和阳性待检液的制备50.1)石墨烯(g)的制备51.根据hummer方法改进后制备氧化石墨烯，具体实验步骤如下：冰水浴条件下，在烧杯中加入1g石墨粉、2.5g硝酸钾(kno3)、100mlh2so4，搅拌均匀后缓慢加入5g高锰酸钾(kmno4)，随后将烧杯置于35℃水浴反应2h，逐步加入100ml去离子水，温度升至95℃继续反应1h，待观察到混合物由棕褐色变成亮黄色，冷却至室温(25℃)后加入300ml蒸馏水稀释，并加入质量分数为30％的h2o2中和未反应的高锰酸钾，然后先用0.5mol/l的盐酸(hcl)水溶液洗涤，再用水反复离心洗涤5次，真空干燥，得到氧化石墨。52.称取10mg上述制备的氧化石墨置于烧杯中，加入100ml水，超声(250w 持续超声)1h，得到氧化石墨烯(go)。53.再以硼氢化钠(nabh4)作还原剂，95℃的条件下进行还原得到石墨烯(g)，具体如下：磁力搅拌条件下在10ml的0.1mg/ml的氧化石墨烯(go)中逐滴加入 1ml1mg/ml硼氢化钠(nabh4)水溶液，然后升温至95℃反应30min时间，置于室温(25℃)下自然冷却后，用二次去离子水离心洗涤3次，85℃真空干燥24 小时得到石墨烯(g)。54.备注：上述制备的石墨烯可直接用于后期实验，也可以用商业购买的石墨烯直接制备后面的复合物。55.2)甲壳胺溶液(chi)的制备56.将0.3g的甲壳胺(chi)，甲壳胺分子式为:(c6h11no4)n，mv:～1.5×105， viscosity:～100mpa.s)加入到300ml浓度为1.0％(体积百分含量v/v)醋酸溶液 (冰醋酸溶于水中)中，在室温(25℃)条件下磁力搅拌1h，得到0.1wt％(质量百分含量)甲壳胺溶液(chi)。57.3)石墨烯-甲壳胺悬浊液(g-chi)的制备58.将300mg的上述1)得到的石墨烯(g)加入到300ml 0.1wt％(质量百分含量)甲壳胺溶液(chi)中,连续超声(超声功率250w)2h，得到稳定的 1mg/ml的石墨烯-甲壳胺悬浊液(g-chi)。59.4)金铂纳米复合物的制备60.金铂纳米复合物：取1ml 10mmol/l的四氯金酸溶液(haucl4)和1ml10mmol/l的四氯铂酸钾溶液(k2ptcl4)同时加入到上述制备好的20ml石墨烯-甲壳胺悬浊液(g-chi)中，在室温(25℃)条件下搅拌3h，然后水浴加热至80℃继续反应1h，得到石墨烯-甲壳胺-金铂纳米复合物g-chi-au/pt，其中，金au、铂pt、石墨烯g这3者的投料配比为1mmol：1mmol：2g，该石墨烯‑ꢀ甲壳胺-金铂纳米复合物g-chi-au/pt为由2种贵金属为金和铂共同制备的双金属纳米复合物，又简称金铂纳米复合物。61.备注：还可以通过在g-chi(20ml)悬浊液中加入不同体积的haucl4(10 mmol/l)、k2ptcl4(10mmol/l)溶液制备得到不同投料配比的石墨烯-甲壳胺-金铂纳米复合物g-chi-au/pt。62.纳米复合物对照组：分别制备含一种贵金属的金或铂的纳米复合物，制备过程如下：63.①金纳米复合物：取1ml 10mmol/l的四氯金酸溶液(haucl4)加入到制备好的20ml石墨烯-甲壳胺悬浊液(g-chi)中，在室温(25℃)条件下搅拌3 h，然后水浴加热至80℃继续反应1h，得到石墨烯-甲壳胺-金纳米复合物g‑ꢀchi-au，简称金纳米复合物。64.②铂纳米复合物：取1ml 10mmol/l的四氯铂酸钾溶液(k2ptcl4)加入到制备好的20ml石墨烯-甲壳胺悬浊液(g-chi)中，在室温(25℃)条件下搅拌 3h，然后水浴加热至80℃继续反应1h，得到石墨烯-甲壳胺-铂纳米复合物g‑ꢀchi-pt，简称铂纳米复合物。65.5)阳性待检液的制备66.含禽呼肠孤病毒arv的阳性待测液的制备：将禽呼肠孤病毒s1133(购于中国兽药监察所，产品目录号：av2311)用浓度为0.1mol/l的pbs(ph＝7.4) 缓冲溶液稀释至106.82eid50/ml，得到106.82eid50/ml的阳性待测液。67.6)电解液68.电化学阻抗检测所用电解液为含5mm的k4fe(cn)6，5mm的k3fe(cn)6及0.1m的kcl的pbs溶液，所述pbs溶液的ph为7.0。69.实施例2、禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器的制备70.1)处理电极：au/pt-glu-bsa、 ge-g-chi-au/pt-edc/nhs-bsa、ge-g-chi-au/pt-ch-bsa和ge-g-chi‑ꢀau/pt-bsa。83.5)bsa封闭后的工作电极：84.将上述4组禽呼肠孤病毒单抗分别固定后得到的电极分别浸泡在200μl含有1wt％bsa溶液中，于37℃恒温作用1h，以封闭电极表面非特异活性位点；然后用pbs洗液各冲洗3次除去未结合的bsa，分别得到4组封闭后的工作电极ge-g-chi-au/pt-glu-arv/mab-bsa、ge-g-chi-au/pt-edc/nhs‑ꢀarv/mab-bsa、ge-g-chi-au/pt-ch-arv/mab-bsa和ge-g-chi-au/pt‑ꢀarv/mab-bsa。85.6)检测：86.在上述4组单抗固定后bsa封闭后的工作电极表面上，分别滴加8μl待测样品，于37℃恒温作用30min，用pbs洗液分别冲洗3次；最后置于电解液中进行电化学阻抗谱(eis)扫描分析，扫描的频率范围为0.01hz～100khz。87.蛋白固定对照检测组：将4种预处理组后固定bsa的蛋白固定对照组制备的电极，参考上述工作电极的检测方法，直接滴加8μl阳性待测液，37℃孵育 30min后分别做eis检测分析。88.实施例3、禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器的系统分析89.电化学阻抗谱(electrochemical impedance spectroscopy，eis)：早期的电化学文献中称为交流阻抗，可以有效的表征修饰电极表面的电化学信息。半圆将出现在高频区：半圆的直径反应电极表面的电子转移电阻(electron-transferresistance,ret)值，半圆的直径越大，对应电极表面的ret值越大，反之半圆的直径越小，对应电极表面的ret值越小；直线将出现在低频区，用于表征反应电极表面的扩散过程。90.1)不同纳米复合物修饰电极的电化学表征：91.图1中a为未修饰金电极ge和3种不同纳米复合物修饰金电极ge在电解液中的电化学阻抗谱，b为未修饰金电极ge和3种不同纳米复合物修饰金电极ge的ret值的柱状图。a代表未修饰金电极ge，其交流阻抗图中出现一个半圆，而当分别修饰了金纳米复合物g-chi-aunp、铂纳米复合物g-chi-ptnp 和金铂纳米复合物g-chi-au/ptnp后，分别得到3种不同纳米复合物的修饰电极：ge-g-chi-aunp、ge-g-chi-ptnp和ge-g-chi-au/ptnp，依次分别对应于图1中的b、c、d，可见：电化学阻抗谱中a、b、c、d的半圆直径依次减小，金铂纳米复合物g-chi-au/ptnp修饰电极ge-g-chi-au/ptnp的半圆直径最小； ret值的结果是：ge＞ge-g-chi-aunp、ge-g-chi-ptnp＞ge-g-chi-au/ptnp。92.由此可知，虽然3种不同纳米复合物g-chi-aunp、g-chi-ptnp和g-chi‑ꢀau/ptnp均具有很好的导电性，都能够提高了金电极ge表面电子传递的能力，但相对而言，ge-g-chi-au/ptnp的ret值最小，即g-chi-au/ptnp的导电性相对最好。所以本发明筛选出含双金属的金铂纳米复合物修饰电极ge-g-chi‑ꢀau/ptnp为优选的修饰电极。93.2)不同预处理后单抗固定的电化学表征94.图2为不同预处理后单抗固定的电化学阻抗谱。采用4种不同的抗体固定前的预处理步骤后进行禽呼肠孤病毒单抗(arv/mab)的固定，得到4组单抗固定后的电极：ge-g-chi-au/pt-ch-arv/mab、ge-g-chi-au/pt-edc/nhs‑ꢀarv/mab、ge-g-chi-au/pt-arv/mab和ge-g-chi-au/pt-glu-arv/mab，图 2中可见4组单抗固定后的电极的半圆直径依次减小，可见ret值依然是最大，glu孵育预处理后的检测电极ge-g-chi-au/ptnp-glu‑ꢀarv/mab-bsa-arv的ret值依然是最小，分析可能原因是：前期由于glu孵育后自连能够固定单抗arv/mab的数量较少，并且glu作为偶联剂有可能会将单抗arv/mab上fab端的胺基连接到电极表面的氨基上，而单抗 arv/mab与病毒抗原arv的特异性结合位点也位于fab端，因此，glu孵育后制备的工作电极在与病毒抗原arv结合时，由于fab端的结合位点被占用，病毒抗原arv的检测结合存在空间位阻，因此捕获结合病毒粒子较少，多因素叠加作用后glu孵育后的检测电极的ge-g-chi-au/ptnp-glu-arv/mab-bsa‑ꢀarvret值最小。103.但是，前期经过edc/nhs孵育预处理后的工作电极的的ret值是大于抗体直接固定法的，即ge-g-chi-au/pt-edc/nhs-arv/mab-bsa＞ge-g-chi‑ꢀau/pt-arv/mab-bsa，相当于edc/nhs孵育预处理后固定的单抗arv/mab 的量比抗体直接固定法多，但是，与阳性待测液孵育后进行检测，ret值出现了反转，即ge-g-chi-au/ptnp-arv/mab-bsa-arv＞ge-g-chi-au/ptnp‑ꢀedc/nhs-arv/mab-bsa-arv，相当于edc/nhs孵育预处理后的检测电极却未能捕获结合到更多的禽呼肠孤病毒arv抗原粒子。分析可能原因是： edc/nhs孵育方法是将单抗arv/mab上fab端的胺基连接到电极表面的羧基上，与病毒抗原arv的特异性结合位点也位于fab端，因此edc/nhs孵育方法固定单抗arv/mab后会屏蔽一定量后序病毒抗原arv的结合位点，即 edc/nhs孵育方法(同glu孵育方法)会为后序工作电极结合病毒arv抗原带来一定程度的空间位阻，因此，一定程度上会阻碍单抗arv/mab与病毒arv抗原特异性结合的数量；然而，利用抗体直接固定方法直接固定单抗 arv/mab，可能是通过单抗arv/mab上fc端的羧基直接连接到电极表面，或者是通过单抗arv/mab侧链的巯基连接到电极表面的金铂纳米复合物 au/ptnp上，即单抗固定的位点与固定后单抗arv/mab与病毒抗原arv的结合位点相距较远，相对应产生的空间位阻较小，因此能够捕获结合较多量的病毒抗原arv粒子，对应的检测电极的ret值更大，即ge-g-chi-au/ptnp‑ꢀarv/mab-bsa-arv＞ge-g-chi-au/ptnp-edc/nhs-arv/mab-bsa-arv。104.6)不同预处理后蛋白固定对照组检测阳性待测液的电化学表征105.由实施例2中制备的4组bsa蛋白固定对照组，直接与8μl的 106.82eid50/ml的arv阳性待测液于37℃恒温孵育30min后，用pbs洗液分别冲洗3次得到的4组蛋白固定对照检测组电极：ge-g-chi-au/ptnp-ch-bsa‑ꢀarv、ge-g-chi-au/ptnp-edc/nhs-bsa-arv、ge-g-chi-au/ptnp-bsa-arv 和ge-g-chi-au/ptnp-glu-bsa-arv，将这4组蛋白固定对照检测组的电极进行电化学阻抗分析，得到的电化学阻抗谱如图6所示，图6为不同预处理后 bsa蛋白固定对照组检测阳性待检液的电化学阻抗谱，可见这4组检测电极的半圆直径变化与病毒孵育前几乎没有差别，对应的ret值的依然是：ge-g-chi‑ꢀau/pt-ch-bsa＞ge-g-chi-au/pt-edc/nhs-bsa＞ge-g-chi-au/pt-bsa＞ge‑ꢀg-chi-au/pt-glu-bsa，即由于未固定能够与病毒arv抗原特异性结合的单抗 arv/mab，因此，也未能结合捕获病毒arv粒子，ret值基本无变化，证明该传感器特异性好。106.7)4组不同预处理后的5项电化学表征的ret值比较107.由上述1)～6)项分析得到的电化学阻抗谱对应的ret值绘制出柱状对比图，如图7所示。首先，金铂纳米复合物相对于单金属纳米复合物，修饰后电极的ret值最低、导电性最好，为优选的电极修饰复合物。其次，可见未经预处理和蛋白固定的、金铂纳米复合物修饰电极ge-g-chi-au/ptnp的ret值最低，不同预处理后无论是否固定单抗或bsa蛋白，无论是否用bsa封闭、无论是否与阳性待检液孵育，相对于修饰电极ge-g-chi-au/ptnp，经处理后的电极，由于表面不同程度的固定了一定量的蛋白质会降低电极的导电能力，因此ret 值均呈现不同程度的升高。第三，明显可见4组不同预处理后、固定了单抗arv/mab并与阳性待检液孵育孵育的电极的ret值均异常升高，证明该系列传感器能够检测出抗体-抗原间的特异性结合反应，特异性良好。108.实施例4、禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器的性能分析109.1)灵敏性110.由实施例1制备的106.82eid50/ml的arv阳性待测液，分别进行10倍比例的倍比稀释，稀释后系列待检液分别为：111.a为阴性对照、代表arv阳性待测液浓度为0；112.b代表arv阳性待测液浓度为100.82eid50/ml；113.c代表arv阳性待测液浓度为101.82eid50/ml；114.d代表arv阳性待测液浓度为102.82eid50/ml；115.e代表arv阳性待测液浓度为103.82eid50/ml；116.f代表arv阳性待测液浓度为104.82eid50/ml；117.g代表arv阳性待测液浓度为105.82eid50/ml；118.h代表arv阳性待测液浓度为106.82eid50/ml。119.各取10μl上述系列待检液，分别滴加到由实施例2制备的4种不同预处理后的工作电极表面，按照实施例2中所述检测步骤进行，得到相对应的4组系列检测电极的电化学阻抗谱和ret值的线性图。120.图8为glu孵育方法得到的系列检测电极的电化学阻抗谱和ret值与arv 含量的线性关系图，可见glu孵育方法的检测线性范围为0～103.82eid50/ml的病毒arv，最低检测限为100.63eid50/ml的病毒arv。121.图9为edc/nhs孵育方法得到的系列检测电极的电化学阻抗谱和ret值与 arv含量的线性关系图，可见edc/nhs孵育方法的检测线性范围为0～ 103.82eid50/ml的病毒arv，最低检测限为100.48eid50/ml的病毒arv。122.图10为抗体直接固定法得到的系列检测电极的电化学阻抗谱和ret值与 arv含量的线性关系图，可见抗体直接固定法的检测线性范围为0～ 104.82eid50/ml的病毒arv，最低检测限为100.37eid50/ml的病毒arv。123.图11为ch孵育方法得到的系列检测电极的电化学阻抗谱和ret值与arv 含量的线性关系图，可见ch孵育方法的检测线性范围为0～105.82eid50/ml的病毒arv，最低检测限为100.46eid50/ml的病毒arv。124.灵敏性分析：可以看出，由于修饰电极的纳米材料均选用了金铂纳米复合物ge-g-chi-au/ptnp，传感器表面电子转移能力相似，在检测过程中，引起信号变化的原理相同，都是抗原和抗体发生特异性结合，病毒arv粒子作为与单抗arv/mab可特异性结合的抗原，也属于蛋白分子，抗原和抗体结合形成的复合物阻碍了电极表面的电子转移，当抗原的量较少时，4种不同预处理后的传感器表面上的固定的单抗arv/mab均可以提供足够的活性位点与病毒arv 粒子结合，被固定在电极表面抗原数量一致，信号变化也相似，因此4组不同预处理后的传感器的最低检测限差别不大。125.而关于检测线性范围，这4种不同预处理后的传感器中，glu孵育方法和 edc/nhs孵育方法的检测线性范围一致，最高检测线性范围均为 103.82eid50/ml，这可能是因为glu和edc/nhs孵育后都是将单抗arv/mab 的fab端的胺基连接到电极表面上，与抗原arv病毒粒子的特异性结合位点也位于单抗arv/mab的fab端，因此glu和edc/nhs孵育后均存在一定的空间位阻。相对而言，抗体直接固定法最高检测线性范围均为104.82eid50/ml，因为单抗arv/mab是通过侧链的巯基(-sh)或者fc端的羧基(-cooh)连接到电极表面的上，与抗原arv病毒粒子发生特异性结合时受到的空间位阻较小，能提供更多的活性位点与arv结合，因此检测线性范围比glu孵育方法和 edc/nhs孵育方法高10倍。126.最后，ch孵育方法的最高检测线性范围为105.82eid50/ml，比抗体直接固定法高10倍，这是因为ch孵育后，电极表面修饰的ch，可以引入并丰富了电极表面的氨基(-nh2)，随后可以固定更多数量的单抗arv/mab；且ch孵育后固定的单抗arv/mab是通过fc端的羧基(-cooh)连接到电极表面的上，与抗原arv病毒粒子发生特异性结合时受到的空间位阻相对较小，因此叠加作用后检测线性范围进一步得到了提高。127.2)特异性128.待测样品的选择：阳性样本为由实施例1制备的106.82eid50/ml的arv阳性待测液；其他8种常见的病毒类、蛋白类和维生素类对照样本分别为h3亚型禽流感病毒(aiv h3,104.71eid50/ml)、h9亚型禽流感病毒(aiv h9,103.74 eid50/ml)、新城疫病毒(ndv,104.53eid50/ml)、喉气管炎病毒(ltv, 103.86eid50/ml)、传染性支气管炎病毒(ibv,104.36eid50/ml)和传染性法氏囊病毒(ibdv,104.67eid50/ml)，牛血清白蛋白(bsa 1.0μg/ml)和维生素c (vitamin c，1.0μg/ml)，检测结果如图12所示。这4组不同预处理的传感器在检测非arv时ret值和空白对照(blank)对比几乎不发生改变，并且这4组不同预处理的传感器在检测混有ndv(104.53eid50/ml)和bsa(1.0μg/ml)的 arv(102.82eid50/ml)样品的ret值和只含有arv(102.82eid50/ml)样本几乎不发生改变，结果表明这4种传感器只能特异检测arv，特异性良好。129.3)稳定性130.制备工艺稳定性：按照实施例2中的传感器的制备方法，将4组不同预处理的传感器各制备5个批次，得到4组传感器的5个批次系列的产品，分别与 103.82eid50/ml的稀释待检液(灵敏性实验的e)孵育30min后检测电化学阻抗，得到的ret值的柱状图如图13所示，5个批次系列的产品分别用glu孵育方法、 edc/nhs孵育方法、抗体直接固定法和ch孵育方法得到的传感器对应电化学阻抗的ret值，计算相对标准偏差分别为2.04％、2.12％、1.30％和1.92％，即4 组不同预处理的传感器的制备方法生产工艺稳定性良好。131.保存有效期：按照实施例2中的传感器的制备方法制备得到的4组传感器任选同一生产批次的4组传感器置于4℃保存，进行热稳定性试验，每间隔1 星期分别与105.82eid50/ml的稀释待检液(灵敏性实验的g)孵育30min后检测电化学阻抗，得到的ret值的柱状图如图14所示，glu孵育方法、edc/nhs孵育方法、抗体直接固定法和ch孵育方法得到的传感器4℃保存4周后ret值分别为新制备的86.75％、88.89％、89.02％和87.92％，即4组传感器的有效期约为4周，不排除工艺优化和材料优化配置后，有效期还有进一步提升的空间。132.实施例5、禽呼肠孤病毒电化学免疫传感器的应用133.一种禽呼肠孤病毒的检测试剂盒，包括用于检测禽呼肠孤病毒的三电极系统的传感器，三电极系统包括工作电极、辅助电极和参比电极，工作电极由实施例2中制备的4组工作电极，优选的经ch孵育后的工作电极；辅助电极为铂丝电极；参比电极为饱和甘汞电极(sce)。该试剂盒还可以包括阴性对照、阳性对照(由实施例1中制备的阳性待检液)、电解液(由实施例1中制备的电解液)。









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