抗癌剂组合物的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及抗癌剂组合物。更具体地，本发明涉及包含可逆btk抑制剂和bcl-2抑制剂的组合的抗癌剂组合物。背景技术：2.布鲁顿酪氨酸激酶 (btk)是非受体酪氨酸激酶的tec家族的成员，并且是在除t淋巴细胞和自然杀伤细胞之外的所有造血细胞类型中表达的重要的信号酶。btk是b细胞的存活、分化、增殖、活化等的重要的调控因子，并且在b细胞信号传导中发挥重要作用(非专利文件1和2)。细胞表面上的b细胞受体(bcr)经由存在于其下游的btk而将信号传递至细胞内。因此，b细胞信号通路的异常活化被认为促进b细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病等癌细胞的增殖和存活(非专利文件3)。3.还已知btk在许多其它细胞的信号通路中发挥重要作用，并且被认为参与过敏性疾病、自身免疫性疾病和炎症性疾病 (非专利文件1)。例如，btk在肥大细胞中高亲和力ige受体(fcεri)的信号传导中起着重要作用，并且已知btk缺陷型肥大细胞具有减少的脱粒和减少的促炎细胞因子产生(非专利文件4)。4.在btk缺陷型小鼠的实验中也已经提示btk参与系统性红斑狼疮(sle)(非专利文件5)。此外，btk突变小鼠表现出对胶原诱导的关节炎发作的抗性(非专利文件6)。不可逆btk抑制剂药物依鲁替尼是用于治疗b细胞肿瘤的抗癌剂。近年来，已经揭示btk中的c481s突变在依鲁替尼治疗期间导致依鲁替尼抗性 (非专利文件7)。最近，还报道了同工型p65btk在非血液癌的实体癌中在ras信号的下游表达，并对实体癌如结肠癌细胞中的增殖具有深远的影响(非专利文件8)。5.因此，具有btk抑制活性的化合物被认为可用于治疗涉及btk信号的疾病，例如癌症、b细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病，并且还可用于治疗表达p65btk的实体癌。该化合物还可用于治疗过敏性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病等。同时，需要对在btk中具有突变且对不可逆btk抑制剂如依鲁替尼有抗性的癌症有效的可逆btk抑制剂药物。特别地，已经报道了具有可逆btk抑制作用的氧代异喹啉和三嗪衍生物(参见专利文件1和2)。6.b细胞淋巴瘤2 (bcl-2)是控制细胞死亡的bcl-2家族的成员。bcl-2主要在线粒体膜上起作用，并通过正向和负向调节线粒体外膜通透性而负向调节细胞凋亡。由于bcl-2是通过在滤泡性淋巴瘤中经常观察到的易位发现的分子，并且随后已经报道其在淋巴b细胞肿瘤如弥漫性淋巴瘤(dlbcl)和慢性淋巴细胞白血病(cll)以及多发性骨髓瘤和t细胞肿瘤中被激活，因此抑制bcl-2的分子可用于治疗这些癌症(非专利文件9)。迄今为止已经报道了几种bcl-2抑制剂，并且已知这些bcl-2抑制剂通过选择性结合bcl-2来抑制bcl-2的作用，单独或与其它治疗剂组合诱导强力的细胞凋亡，并且表现出抗肿瘤作用(非专利文件10)。7.如上所述，btk抑制剂已经在临床上用于抗癌治疗，但已经报道了该抑制剂对其无效并且不能总是获得令人满意的治疗效果的患者(非专利文件11)。8.近年来，已经报道了btk抑制剂依鲁替尼和bcl-2抑制剂维奈托克的组合增强血液肿瘤的抗肿瘤效果。因此，btk抑制剂和bcl-2抑制剂的联合治疗有望成为一种新的癌症治疗方法(专利文件3、非专利文件12)。然而，本发明所述的可逆btk抑制剂和bcl-2抑制剂的组合根本没有公开，并且由本发明所述的可逆btk抑制剂和bcl-2抑制剂的组合所实现的抗癌作用从未被报道过。现有技术9.专利文件专利文件1：wo 2018/097234专利文件2：wo 2015/012149专利文件3：wo 2014/168975非专利文件非专利文件1：satterthwaite,a.b.and witte,o.n., immunol.rev., 2000, 175, 120-127非专利文件2：kurosaki,t., curr.opin.immunol., 2000, 12, 276-281非专利文件3：davis,r.e.,et al., nature, 2010, 463, 88-92非专利文件4：ellmeier,w.,et al., febs j., 2011, 278, 1990-2000非专利文件5：halcomb,k.e., mol.immunol., 2008, 46(2), 233-241非专利文件6：jansson,l.and holmdahl,r., clin.exp.immunol., 1993, 94, 459-465非专利文件7：cheng,s., et al., leukemia,2014,1-6非专利文件8：grassili.e.,et al., oncogene, 2016, 35, 4368-4378非专利文件9：czabotar,p.,et al., nature rev. mol.cell biol., 2014, 15, 49-63,非专利文件10：ashkenazi,a.,et al., nature rev. drug discov., 2017, 16, 273-284非专利文件11：wilson w.h.,et al., nat.med., 2015, 21(8), 922-926非专利文件12：kuo hp.,et al., mol.cancer ther., 2017, 16(7), 1246-1256。技术实现要素：10.发明要解决的课题本发明的目的是提供包含抗癌剂的组合物，该抗癌剂通过组合可逆btk抑制剂和bcl-2抑制剂而有效诱导癌细胞的细胞死亡。11.解决课题的手段本发明涉及包含抗癌剂的组合物，该抗癌剂利用可逆btk抑制剂和bcl-2抑制剂的组合。具体地，本发明涉及下述内容：(1) 用于治疗癌症的药物组合物，其包含可逆btk抑制剂和bcl-2抑制剂；(2) (1)所述的药物组合物，其中所述可逆btk抑制剂是式(i)的氧代异喹啉衍生物或其药学上可接受的盐，[化1]其中r1是任选取代的低级烷基，q是选自下列结构(a)、(b)和(c)中的结构；[化2]r2和r3独立地为氢原子、任选取代的低级烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基；(3) (2)所述的药物组合物，其中所述可逆btk抑制剂是其中q为结构(a)、且r1为羟甲基的氧代异喹啉衍生物，(4) (1)所述的药物组合物，其中所述可逆btk抑制剂是以下所示的氧代异喹啉衍生物(ia)或其药学上可接受的盐，[化3]其中r3a是任选取代的四氢吡啶基；(5) (4)所述的药物组合物，其中所述可逆btk抑制剂是具有化合物(i-a)的结构的氧代异喹啉衍生物或其药学上可接受的盐，化合物(i-a)：2-(3-{2-氨基-6-[1-(氧杂环丁烷-3-基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2h)-酮[化4]；(6) (1)所述的药物组合物，其中所述可逆btk抑制剂是以下所示的三嗪衍生物(ii)或其药学上可接受的盐，[化5]其中z1表示任选取代的低级烷基，z2表示氢原子或任选取代的低级烷基，a表示氮原子或c-z3，z3表示氢原子、氰基、任选取代的酰基、任选取代的磺酰基或任选取代的氨基甲酰基，z4表示任选取代的低级烷基、任选取代的环烷基；(7) (6)所述的药物组合物，其中所述可逆btk抑制剂是其中z1为羟甲基的三嗪衍生物或其药学上可接受的盐；(8) (6)所述的药物组合物，其中所述可逆btk抑制剂是具有化合物(ii-a)的结构的三嗪衍生物或其药学上可接受的盐；化合物(ii-a)：2-(3-{4-氨基-6-[(1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基]-1,3,5-三嗪-2-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2h)-酮[化6]；(9) (1)-(8)所述的药物组合物，其中所述bcl-2抑制剂是维奈托克（venetoclax）、那维托克（navitoclax）、奥巴托克（obatoclax）、甲磺酸奥巴托克（obatoclax mesylate）、塞布托克（sabutoclax）、apg-1252、azd-0466、apg-2575、abbv-167、s-65487或s-55746；(10) (9)所述的药物组合物，其中所述bcl-2抑制剂是维奈托克；(11) (9)所述的药物组合物，其中所述bcl-2抑制剂是那维托克；(12) (9)所述的药物组合物，其中所述bcl-2抑制剂是s-55746；(13) (5)所述的药物组合物，其中所述bcl-2抑制剂是维奈托克；(14) (5)所述的药物组合物，其中所述bcl-2抑制剂是那维托克；(15) (5)所述的药物组合物，其中所述bcl-2抑制剂是s-55746；(16) (8)所述的药物组合物，其中所述bcl-2抑制剂是维奈托克；(17) (8)所述的药物组合物，其中所述bcl-2抑制剂是那维托克；(18) (8)所述的药物组合物，其中所述bcl-2抑制剂是s-55746；(19) 化合物(i)和bcl-2抑制剂在制备(1)所述的药物组合物中的用途；和(20) 治疗癌症的方法，其特征在于，使用(1)-(18)所述的任何药物组合。发明内容[0012]与btk抑制剂或bcl-2抑制剂各自单独使用相比，可逆btk抑制剂和bcl-2抑制剂的组合能够以更高的效率导致细胞死亡。特别地，btk抑制剂可以调节癌细胞的异常增殖信号，从而抑制细胞增殖，而bcl-2抑制剂可以通过恢复癌细胞中受抑制的细胞凋亡诱导能力来有效地诱导细胞死亡。因此，可以期待btk抑制剂和bcl-2抑制剂的组合显示出作为抗癌作用的协同效果，并且可用作癌症等的预防或治疗药物(药物组合物)。[0013]附图简述[图1] 图1是显示化合物(i-a)和bcl-2抑制剂(维奈托克)的组合对人dlbcl细胞系(oci-ly10)的相互作用的细胞增殖抑制率的图。[0014][图2] 图2是显示化合物(i-a)和bcl-2抑制剂(维奈托克)的组合对人dlbcl细胞系(oci-ly10)的相互作用的bliss评分的图。[0015][图3] 图3显示化合物(i-a)和bcl-2抑制剂(维奈托克)的组合对人dlbcl细胞系(oci-ly10)的相互作用的等效线图(50%抑制)的图。[0016][图4] 图4是显示化合物(i-a)和bcl-2抑制剂(维奈托克)的组合对人dlbcl细胞系(oci-ly10)的相互作用的fa-ci描点。[0017][图5] 图5是显示化合物(i-a)和bcl-2抑制剂(维奈托克)的组合对btk-c481s-突变体oci-ly10细胞的相互作用的细胞增殖抑制率的图。[0018][图6] 图6是显示化合物(i-a)和bcl-2抑制剂(维奈托克)的组合对btk-c481s-突变体oci-ly10细胞的相互作用的bliss评分的图。[0019][图7] 图7显示化合物(i-a)和bcl-2抑制剂(维奈托克)的组合对btk-c481s-突变体oci-ly10细胞的相互作用的等效线图(50%抑制)的图。[0020][图8] 图8是显示化合物(i-a)和bcl-2抑制剂(维奈托克)的组合对btk-c481s-突变体oci-ly10细胞的相互作用的fa-ci描点。具体实施方式[0021](1) 可逆btk抑制剂可逆btk抑制剂中的一个实施方案是wo2018/097234中记载的下述式(i)所示的氧代异喹啉衍生物或其药学上可接受的盐(专利文件1)；[化7]其中r1是任选取代的低级烷基，q是选自下列结构(a)、(b)和(c)中的结构；[化8]r2和r3独立地为氢原子、任选取代的低级烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基。[0022]在本技术说明书式(i)中，“任选取代的低级烷基”中的低级烷基部分可以是具有1-3个碳原子的直链或支链烷基中的任一者，具体可列举甲基、乙基和异丙基等。[0023]“任选取代的环烷基”中的环烷基部分可以是具有3-6个碳原子的环状烷基的任一者，具体可以列举环丙基、环丁基、环己基等。[0024]“任选取代的芳基”中的芳基部分可以是具有6-14个碳原子的单环或双环芳基的任一者，双环芳基可以是部分氢化的。具体可以列举苯基、萘基、四氢萘基、茚基等。[0025]“任选取代的杂芳基”中的杂芳基部分包括单环芳族杂环基和稠环芳族杂环基，并且包括含有至少选自氮原子、硫原子和氧原子中的一个杂原子的5或6元单环芳族杂环基作为单环芳族杂环基。具体地，可列举吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻吩基、噻唑基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基等，并且稠合芳族杂环基的实例包括其中3至8元环稠合的含有至少选自氮原子、硫原子和氧原子的一个杂原子的稠合双环杂环基。具体可列举四氢异喹啉、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、吲哚基和异喹啉基。[0026]“任选取代的杂环基”中的杂环基部分是含有至少选自氮原子、硫原子和氧原子的一个杂原子的4至6元单环饱和杂环基，并且可以在环内部分地包括不饱和键。具体可列举二氢噻喃基、1,1-二氧代二氢噻喃基和四氢吡啶基，特别优选列举四氢吡啶基。[0027]任选取代的低级烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、和任选取代的杂环基中的术语“任选取代”的取代基在上述基团具有两个以上取代基时可以相同或不同，并且该基团可以在化学上允许的任意位置被一个或两个以上任意种类的取代基取代。[0028]任选取代的低级烷基中的取代基的实例包括例如，卤素原子、c1-c4烷氧基、任选被一个或两个c1-c4烷基取代的氨基、硝基、氰基、羟基、任选被一个或两个c1-c4烷基取代的氨基甲酰基、羧基、甲酰基、乙酰基、甲磺酰基、苯甲酰基、c1-c6酰基氨基、c1-c6酰基氧基等。[0029]作为任选取代的低级烷基，可列举羟甲基。[0030]在任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂环基中，与术语“任选取代”相关的取代基的实例包括卤素原子、氧原子、c1-c4烷基、c1-c4烷氧基、任选被一个或两个c1-c4烷基取代的氨基、硝基、氰基、羟基、任选被一个或两个c1-c4烷基取代的氨基甲酰基、任选被c1-c4烷基取代的磺酰基、羧基、甲酰基、乙酰基、甲磺酰基、苯甲酰基、氧杂环丁烷基、c1-c6酰基氨基、和c1-c6酰基氧基等。[0031]根据取代基的种类，本发明的化合物(i)中可以存在异构体。在本说明书中，异构体可以通过其仅一种形式的化学结构来描述，但是本发明包括可以在结构上形成的所有异构体(几何异构体、光学异构体、互变异构体等)，并且还包括单独的异构体或其混合物。[0032]本发明化合物(i)的药学上可接受的盐的实例包括与盐酸、硫酸、碳酸和磷酸等形成的无机酸盐；与富马酸、马来酸、甲磺酸和对甲苯磺酸等形成的有机酸盐。除了与钠和钾形成的碱金属盐；与镁和钙形成的碱土金属盐；与三乙胺和乙醇胺形成的有机胺盐；以及与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等形成的碱性氨基酸盐之外，本发明还包括铵盐。[0033]本发明的化合物(i)及其药学上可接受的盐，例如，可以通过专利文件1中记载的方法来制造。当定义的基团在以下所示制备方法中的示例性方法的条件下可能受到化学影响，或不适于进行该方法时，可以通过有机合成化学中常用的方法容易地制备它们，例如，应用诸如官能团的保护或脱保护的方法[t.w.greene，protective groups in organic synthesis 3rd edition, john wiley & sons, inc., 1999]。根据需要，也可以改变例如引入取代基的反应步骤的顺序。[0034]在上述化合物(i)中，优选q为结构(a)且r1为羟甲基，更优选化合物(i)是化合物(i-a)：2-(3-{2-氨基-6-[1-(氧杂环丁烷-3-基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基]-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2h)-酮，[化9]另外，化合物(i-a)是专利文件1中实施例23的化合物。[0035]可逆btk抑制剂的另一实施方案是wo2015/012149中描述的式(ii)所示的三嗪衍生物及其药学上可接受的盐(专利文件2)；[化10]其中z1表示任选取代的低级烷基，z2表示氢原子或任选取代的低级烷基，a表示氮原子或c-z3，z3表示氢原子、氰基、任选取代的酰基、任选取代的磺酰基或任选取代的氨基甲酰基，z4表示任选取代的低级烷基、任选取代的环烷基；或其药学上可接受的盐。[0036]在化合物(ii)中，任选取代的低级烷基的低级烷基部分可以是具有1-3个碳原子的直链、支链或环状烷基中的任一者，并且其具体实例包括甲基和异丙基等。[0037]任选取代的环烷基的环烷基部分可以是具有3-6个碳原子的环状烷基，并且其具体实例包括环丙基和环丁基等。[0038]任选取代的酰基的酰基部分可以是与羰基连接的直链状、支链状或环状烷基中的任一种，任选取代的酰基的酰基部分的具体实例包括甲酰基、乙酰基和丙酰基、辛酰基、十二烷酰基、新戊酰基、环丙基羰基和苯甲酰基等。[0039]任选取代的磺酰基的磺酰基部分包括甲基磺酰基、乙基磺酰基等。[0040]任选取代的氨基甲酰基的氨基甲酰基部分包括甲基氨基甲酰基、乙基氨基甲酰基和二甲基氨基甲酰基等。[0041]任选取代的低级烷基、任选取代的环烷基、任选取代的酰基、任选取代的磺酰基或任选取代的氨基甲酰基的取代基在上述基团具有两个以上取代基时可以相同或不同，并且该基团可以在化学上允许的任意位置被一个或两个以上任意种类的取代基取代。取代基的实例包括卤素原子、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的氨基、硝基、氰基、羟基、取代或未取代的烷基氨基、取代或未取代的氨基甲酰基、羧基、甲酰基、乙酰基、甲磺酰基、苯甲酰基、取代或未取代的酰基氨基和取代或未取代的酰基氧基等。[0042]根据取代基的种类，本发明的化合物(ii)中可以存在异构体。在本说明书中，异构体可以通过其仅一种形式的化学结构来描述，但是本发明包括可以在结构上形成的所有异构体(几何异构体、光学异构体、互变异构体等)，并且还包括单独的异构体或其混合物。[0043]本发明化合物(ii)的药学上可接受的盐的实例包括与盐酸、硫酸、碳酸和磷酸形成的无机酸盐；与富马酸、马来酸、甲磺酸和对甲苯磺酸形成的有机酸盐。除了与钠和钾形成的碱金属盐；与镁和钙形成的碱土金属盐；与低级烷基胺和低级醇胺形成的有机胺盐；以及与赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸形成的碱性氨基酸盐之外，本发明还包括铵盐。[0044]本发明的化合物(ii)及其药学上可接受的盐，例如，可以通过专利文件2中记载的方法来制造。当定义的基团在以下所示制备方法中的示例性方法的条件下可能受到化学影响，或不适于进行该方法时，可以通过有机合成化学中常用的方法容易地制备它们，例如，应用诸如官能团的保护或脱保护的方法[t.w.greene，protective groups in organic synthesis 3rd edition, john wiley & sons, inc., 1999]。根据需要，也可以改变例如引入取代基的反应步骤的顺序。[0045]优选化合物(ii)中a为氮原子且z1为羟甲基，更优选化合物(ii)为化合物(ii-a)：2-(3-{4-氨基-6-[(1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基]-1,3,5-三嗪-2-基}-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-8-氟异喹啉-1(2h)-酮[化11]另外，化合物(ii-a)是专利文件2中实施例1的化合物。[0046](2) bcl-2抑制剂本发明中，bcl-2抑制剂是指在细胞内对bcl-2的生理功能具有抑制作用的药剂。bcl-2抑制剂包含低分子量化合物、多肽、蛋白质、核酸(sirna、mirna、适体等)、其它高分子化合物等抑制bcl-2的生理功能的药剂。[0047]bcl-2是控制细胞死亡的bcl-2家族的成员，并负向调节凋亡。bcl-2也在如滤泡性淋巴瘤dlbcl)和cll的淋巴样b细胞肿瘤以及多发性骨髓瘤和t细胞肿瘤中活化。由于bcl-2抑制剂诱导这些癌细胞凋亡以显示抗肿瘤作用，因此除了通过单一药剂实现的那些效果之外，还可通过与其它药剂组合而期待进一步的抗肿瘤效果。[0048]bcl-2抑制剂的实例包括维奈托克、那维托克、奥巴托克、甲磺酸奥巴托克、塞布托克、apg-1252、azd-0466、apg-2575、abbv-167、s-65487和s-55746。[0049](3) 抗癌剂组合物本发明所述的抗癌剂组合物是将可逆btk抑制剂与bcl-2抑制剂适宜组合而得的组合药剂，包含包括该可逆btk抑制剂和bcl-2抑制剂的试剂盒。两种抑制剂可以作为混合物一起或各自分别有效地用于药物，尤其是用于治疗肿瘤。肿瘤的实例包括实体瘤如乳腺癌、结肠直肠癌和肺癌，以及血液癌如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。[0050]本发明所述的抗癌剂组合物可以以适于口服、肠胃外或局部给药的常规药物制剂(药物组合物)的形式制备和使用。[0051]用于口服给药的制剂的实例包括片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等固体制剂，以及糖浆剂等液体制剂。这些制剂可以通过常规方法制备。固体制剂可以通过使用常规的药物载体如乳糖、淀粉如玉米淀粉、结晶纤维素如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钙、滑石和硬脂酸镁来制备。通过将如此制备的颗粒或粉末封入胶囊，可以制备胶囊剂。糖浆可以通过将本发明的化合物或其药学上可接受的盐溶解或悬浮在含有蔗糖、羧甲基纤维素等的水溶液中来制备。[0052]用于肠胃外给药的制剂的实例包括输注如静脉内输注。输注制剂也可通过常规方法制备，并且可适当地掺入等渗剂(例如，甘露醇、氯化钠、葡萄糖、山梨醇、甘油、木糖醇、果糖、麦芽糖、甘露糖)、稳定剂(例如，亚硫酸钠、白蛋白)和防腐剂(例如，苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯)。[0053]本发明中，可逆btk抑制剂和bcl-2抑制剂可以作为混合物制剂或作为分开的制剂同时给药。或者，它们可以以任何顺序依次或以适当的间隔作为分开的制剂给药。[0054]本发明所述的抗癌剂组合物的用法用量可以根据要组合的可逆btk抑制剂和bcl-2抑制剂、以及根据给药方法(口服、肠胃外或局部给药)、组合物所应用的疾病的类型、疾病的严重程度、患者的年龄和体重等而变化。两种抑制剂通常可以以每天1 mg至1,000 mg的范围对成人给药，并且可以通过口服或肠胃外途径以分开的剂量给药一次或两次或三次。[0055]总之，包含作为可逆btk抑制剂的化合物(i-a)与作为bcl-2抑制剂的维奈托克的组合的本发明的抗癌剂组合物可以适宜地用于治疗肿瘤。实施例[0056]试验例1 单一药剂的细胞增殖抑制试验(细胞培养)使用包含20%胎牛血清(ge healthcare)和1%青霉素链霉素(nacalai tesque, inc.)的imdm培养基(iscove's modified dulbecco's medium, thermo fisher scientific inc.)，在5% co2培养箱中培养人淋巴瘤细胞系oci-ly10细胞 (由university health network获得)。[0057]使用包含10%胎牛血清(ge healthcare)和1%青霉素链霉素(nacalai tesque, inc.)的rpmi培养基(roswell park memorial institute medium, thermo fisher scientific inc.)，在5% co2培养箱中培养人淋巴瘤细胞系u2932细胞 (由dsmz获得)。[0058](细胞增殖抑制试验)将oci-ly10或u2932细胞 (20000细胞/well)接种至96孔板(细胞板)中，向其中以终浓度0.009 nm至30000 nm (最终dmso浓度0.3%)加入用培养基稀释的试验化合物，培养96小时后，加入阿尔玛蓝（alamar blue）试剂(thermo fisher scientific inc.)。3小时后，测定激发波长560 nm/荧光波长590 nm的荧光，将无化合物且无细胞的孔设为100%，将无化合物且含细胞的孔设为0%，测定抑制活性ic50值。结果示于表1。[0059][表1]。[0060]实施例1 使用bliss评分的btk抑制剂和bcl-2抑制剂的药剂组合效果的评价bliss评分是用于评价药剂组合中的协同效果的标准之一(borisy et al.proc.natl.acad.sci.usa., 100(13): 7977-7982 (2003); griner et al.proc.natl.acad.sci.usa., 111(6): 2349-54 (2014))。该bliss评分被用于分析btk抑制剂和bcl-2抑制剂在对oci-ly10细胞的增殖抑制方面的组合效果。[0061]以8ꢀ×ꢀ8矩阵(0.6%的最终dmso浓度)的组合向oci-ly10细胞的细胞板中加入btk抑制剂(化合物(i-a)) (0.03 nm至30 nm的7个剂量和dmso对照)和bcl-2抑制剂 (维奈托克) (0.1 nm至90 nm的7个剂量和dmso对照)。培养96小时后，加入阿尔玛蓝试剂，3小时后，测量激发波长560 nm/荧光波长590 nm的荧光。通过将无化合物且无细胞孔设为100%并将无化合物且含细胞孔设为0%来确定细胞增殖抑制率和生存率(100ꢀ‑抑制率%)。[0062](利用bliss评分的评价)各孔的理论bliss独立性(blissin)在认为药剂a和药剂b各自作为单一药剂发挥作用时(即，任一化合物的浓度为0时的细胞增殖率)可以通过下式计算。g是细胞生存率。[0063]blissin = g(a)ꢀ×g(b)各孔的bliss评分可以由理论blissin和细胞增殖率的测量值之间的差异导出。如果bliss评分是正数，则认为存在协同效果。[0064]bliss评分= 100ꢀ×ꢀ(blissinꢀ‑ꢀg)本研究中细胞增殖抑制率的结果示于图1且bliss评分示于图2。[0065]在本研究中，如图1和2所示，btk抑制剂(化合物(i-a))和bcl-2抑制剂(维奈托克)的组合的bliss评分显示正值。因此，实施例1的结果表明btk抑制剂与bcl-2抑制剂的组合具有强协同效果。[0066]实施例2 利用等效线图法评价btk抑制剂(化合物(i-a))与bcl-2抑制剂(维奈托克)的药剂组合效果等效线图法是评价组合使用的两种药剂显示相加、协同或拮抗作用的何种组合效果的一种方法(chou cancer res. 70(2): 440-6 (2010))。该等效线图法被用于分析btk抑制剂和bcl-2抑制剂在对oci-ly10细胞的增殖抑制方面的组合效果。[0067]基于对oci-ly10细胞的细胞增殖抑制试验的结果，使用与作为单一药剂的btk抑制剂或bcl-2抑制剂的ic50值对应的浓度作为标准，制备ic50值ꢀ×ꢀ10000的浓度下的各药剂的dmso溶液。将两种药剂以1:0、1:1、1:5、1:10、10:1、5:1、3:1和0:1的8个比率混合，将如此制备的混合溶液添加至oci-ly10细胞的细胞板中，使得混合溶液的最终浓度为ic50值ꢀ×ꢀ0.001至30 (最终dmso浓度0.3%)。培养96小时后，加入阿尔玛蓝试剂，3小时后，测定激发波长560 nm/荧光波长590 nm的荧光，以确定各混合比的ic50值。[0068]由单一药剂的ic50值和两种药剂的混合比率计算显示50%增殖抑制作用的btk抑制剂和bcl-2抑制剂的浓度。将bcl-2抑制剂的浓度描点于纵轴并将btk抑制剂的浓度描点于横轴，结果示于图3中。[0069](利用等效线图的评价)对于各药剂a和b，将这些药剂作为单一药剂时显示某种作用的剂量设为da和db。当两种药剂的剂量-反应曲线平行时，如果两种药剂的组合获得的作用与单一给药获得的作用相似时的剂量在直线dadb上，则确定该作用是相加的；如果该剂量在直线dadb的左下，则确定该作用是协同的；如果该剂量在直线dadb的右上，则该确定该剂量为拮抗反应。[0070]在本研究中，如图3中所示，在各混合比率下显示50%增殖抑制作用的浓度是在连接各单一药剂的ic50值的直线的左下。因此，实施例2的结果表明本发明所述的btk抑制剂与bcl-2抑制剂的组合具有强协同效果。[0071] 实施例 3 利用中效分析评价btk抑制剂(化合物(i-a))与bcl-2抑制剂(维奈托克)的药剂组合效果中效分析是由chou和talalay提出的理论，其是评价组合使用的两种药剂显示相加、协同或拮抗作用的何种组合效果的一种方法(chou cancer res., 70(2): 440-6 (2010))。当将药剂浓度设为d，将50%抑制浓度(中效剂量)设为dm，将被抑制的细胞的比率设为fa(受影响分数)，将未被抑制的细胞的比率设为fu(未受影响的分数)，并且将m设为系数时，建立下述关系式：d = dm(fa/fu)1/m组合指数ci是组合效果的定量指数。在两种药剂之间效果的作用点彼此不同的情况下，在将组合使用时药剂a的浓度设为(da+b)a，将单独使用实现x%抑制的药剂a的浓度设为(dx)a，将组合使用的药剂b的浓度设为(da+b)b，并且将单独使用实现x%抑制的药剂b的浓度设为(dx)b时，则ci由下式给出：ci = (da+b)a/(dx)a + (da+b)b/(dx)b由以上可知，ci表示为fa的函数。通过在横轴上对fa描点并且在纵轴上对ci描点，得到被称为fa-ci描点的相关图。ci小于1显示协同作用，ci为1显示相加作用，并且ci大于1显示拮抗作用。使用实施例2中等效线图的实验数据对oci-ly10细胞的btk抑制剂和bcl-2抑制剂的fa-ci进行描点(图4)。[0072]如图4中所示，在任意混合比率下，ci小于1，其中fa = 0.5 (50%抑制率)以上，表明btk抑制剂和bcl-2抑制剂的组合具有强协同效果。[0073]实施例 4 在bcl-2抑制剂存在下的btk抑制剂的剂量-反应研究检查了在各种浓度的bcl-2抑制剂的存在下的btk抑制剂的ic50值的变化。[0074]由用作单一药剂的bcl-2抑制剂所获得的结果，对每种癌症细胞系选择三个剂量的bcl-2抑制剂浓度。将btk抑制剂添加至细胞板中，使得btk抑制剂的浓度为0.009 nm至30000 nm(最终dmso浓度0.4%)的范围, 并使用dmso添加组作为对照，以与试验例1相同的方式测定各浓度的bcl-2抑制剂的存在下的ic50值。[0075]各浓度的bcl-2抑制剂存在下的ic50值示于表2至表9中。在本研究中，如表2至表9所示，在淋巴瘤细胞、oci-ly10细胞和u2932细胞中，btk抑制剂的ic50值均依赖于bcl-2抑制剂的浓度而降低。[0076][表2][表3][表4][表5][表6][表7][表8][表9]。[0077]实施例4的结果表明，本发明所述的btk抑制剂和bcl-2抑制剂的组合不仅对特定的癌细胞具有组合效果，而且对其它癌细胞也具有组合效果。[0078]试验例2 单一药剂对btk-c481s-突变体淋巴瘤细胞的细胞增殖抑制效果(btk-c481s-突变体oci-ly10细胞的制作)使用crispr-cas9系统，通过点突变敲入产生btk-c481s-突变体oci-ly10细胞。通过电穿孔法将cas9蛋白(thermo fisher scientific inc.)、利用geneart(tm) precision grna合成试剂盒(thermo fisher scientific inc.)制备的向导rna、以及用于将btk的第481位半胱氨酸残基替换为丝氨酸残基的单链合成寡核苷酸导入oci-ly10细胞。在依鲁替尼的存在下培养所得修饰的oci-ly10细胞，并将生长的细胞用作btk-c481s-突变体oci-ly10细胞。突变的转导通过基因组dna和mrna序列分析来确认。[0079](细胞增殖抑制试验)以与试验例1中相同的方式，测定各抑制剂单一药剂的ic50值。[0080]结果示于表10。[0081][表10]。[0082]实施例 5 使用bliss评分评价btk抑制剂(化合物(i-a))和bcl-2抑制剂(维奈托克)对btk-c481s-突变体淋巴瘤细胞的药剂组合效果以与实施例1中相同的方式计算bliss评分。[0083]本研究中细胞增殖抑制率的结果示于图5且bliss评分示于图6。[0084]在btk-c481-突变体oci-ly10细胞中，如在btk野生型oci-ly10细胞中那样，btk抑制剂和bcl-2抑制剂的组合的bliss评分显示正值，表明本发明所述的btk抑制剂和bcl-2抑制剂的组合具有强协同效果。[0085]实施例6利用等效线图法评价btk抑制剂(化合物(i-a))和bcl-2抑制剂(维奈托克)对btk-c481s-突变体淋巴瘤细胞的药剂组合效果以与实施例2中相同的方式描点出等效线图。[0086]结果示于图7。[0087]在btk-c481-突变体oci-ly10细胞中，如在btk野生型oci-ly10细胞中那样，显示50%增殖抑制作用的各混合比率的浓度在连接单一药剂的ic50值的直线的左下。因此，实施例6的结果表明本发明所述的btk抑制剂和bcl-2抑制剂的组合具有强协同效果。[0088]实施例7利用中效分析评价btk抑制剂化合物(i-a))和bcl-2抑制剂(维奈托克)对btk-c481s-突变体淋巴瘤细胞的药剂组合效果以与实施例3中相同的方式计算ci值。[0089]结果示于图8。[0090]在任意混合比率下，ci小于1，其中fa=0.5(50%抑制率)以上，表明如在btk野生型oci-ly10细胞中那样，本发明所述的btk抑制剂和bcl-2抑制剂的组合在btk-c481-突变体oci-ly10淋巴瘤细胞中具有强协同效果。[0091]实施例8使用btk-c481s-突变体淋巴瘤细胞的bcl-2抑制剂存在下的btk抑制剂的剂量-反应研究将btk-c481s-突变体淋巴瘤细胞用于检查各种浓度的bcl-2抑制剂的存在下的btk抑制剂的ic50值的变化。[0092]由用作单一药剂的bcl-2抑制剂所获得的结果，对btk-c481-突变体oci-ly10细胞选择三个剂量的bcl-2抑制剂浓度。将btk抑制剂添加至细胞板中，使得btk抑制剂的浓度为0.009nm至30000nm(最终dmso浓度0.4%)的范围，并使用dmso添加组作为对照，以与实施例1相同的方式测定各浓度的bcl-2抑制剂的存在下的ic50值。[0093]各浓度的bcl-2抑制剂的存在下的ic50值示于表11至表14。本研究中，如表11至表14所示，在btk-c481-突变体oci-ly10细胞中，btk抑制剂的ic50值依赖于bcl-2抑制剂的浓度而降低。[0094][表11][表12][表13][表14]。[0095]实施例8的结果表明，本发明所述的btk抑制剂和bcl-2抑制剂的组合对btk野生型oci-ly10细胞以及btk-c481-突变体oci-ly10细胞均具有组合效果。[0096]工业适用性本发明提供与btk抑制剂或bcl-2抑制剂各自单独使用时相比，对大范围的癌细胞以更高的效率和更高的选择性和特异性导致细胞死亡的抗癌剂组合物。









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