一种鉴定燕窝基原的LAMP-LFD引物组、试剂盒及其检测方法与用途与流程

有机化合物处理,合成应用技术一种鉴定燕窝基原的lamp-lfd引物组、试剂盒及其检测方法与用途技术领域1.本发明涉及燕窝基原检测技术领域，特别涉及一种鉴定燕窝基原的lamp-lfd引物组、试剂盒及其检测方法与用途。背景技术：2.燕窝是指雨燕目雨燕科的部分雨燕和金丝燕属的几种金丝燕分泌出来的唾液，再混合其他物质所筑成的巢穴。主产于马来西亚、印度尼西亚、泰国和缅甸等东南亚国家及我国的福建和广东沿海地带。燕窝含有丰富的糖类、有机酸、游离氨基酸以及特征物质——唾液酸，具有一定的营养价值。具体到燕窝基原而言，不同燕窝基原的燕窝具有差异，尤其体现于不同基原的燕窝具有其不同的组成占比、形态、口感等，如：唾液酸占比不同。不同燕窝基原的燕窝具有区别特征，因此，对于燕窝基原的鉴定显得必要。对燕窝基原的鉴定不仅有利于燕窝的科学研究，也方便对市场流通的燕窝产品进行鉴定，避免市场流通假冒伪劣产品，对燕窝的整个生产销售环境具有良好的促进效果。3.然而，现有的燕窝基原鉴定方法仍存在诸多不足，无法实现较为准确、快速的燕窝鉴定。如，现有技术中常见的就是采用感官鉴定、理化性质鉴定，虽然该类方法较为简单，但准确性不足、灵敏度低、重现性差。因此，现有技术亟需一种准确度高、灵敏度高、具有重现性的燕窝基原鉴定方法，以弥补现有技术常见鉴定方法所存在的不足。4.环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,lamp)是一种2000年开发出来的快速基因鉴定方法，在链置换dna聚合酶(bst dna polymerase)作用下进行链循环扩增，利用一对外引物和一对内引物与靶基因的6个区域进行配对。对比普通pcr，有更高的特异性。60-65℃是双链dna复性及延伸的中间温度，dna在65℃左右处于动态平衡状态使得链置换dna合成在不停地自我循环。5.lamp扩增分两个阶段，第一阶段为起始阶段，双链dna互补配对延伸时，两条链之间的氢键会断开，变成单链。上游内部引物fip的f2序列首先与模板f2c结合，在链置换型dna聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物f3与模板f3c结合并延伸，置换出完整的fip连接的互补单链。fip上的f1c与此单链上的fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物bip与b3先后启动类似于fip和f3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3'末端的fl区段为起点。以自身为模板，进行dna合成延伸形成茎环状结构，该结构是lamp基因扩增循环的起始结构。第二阶段是扩增循环阶段，以茎环状结构为模板，fip与茎环的f2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的b1区段为起点，以自身为模板。进行dna合成延伸及链置换.形成长短不一的2条新茎环状结构的dna，bip引物上的b2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物dna长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物lf和lb，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度dna的混合物。且产物dna为扩增靶序列的交替反向重复序列。整个过程一般为0.5-1h，可实现靶基因的109～1010扩增，普通pcr基本都是1.5h甚至更长，lamp缩短了不止一半的时间。并且，lamp全程是等温扩增对仪器要求低，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点。然而，lamp也有一些不完善的地方，lamp产物的检测方法主要有3种，琼脂糖凝胶电泳法，自然光及紫外光下观察sybr green i颜色变化，但均需开管检测，容易受到气溶胶的污染而影响实验结果。核酸横向流层析试纸(nucleic acidlateral-flow device,lfd)是建立在免疫层析技术的基础上，将核酸扩增技术和纸层析技术相结合的一种检测手段，与传统的琼脂糖凝胶电泳相比，具有核酸扩增的高灵敏度，又有层析试纸操作简便、价格低廉的优点。除此之外，核酸层析试纸装置价格低廉，全密封性的使用方式还具有防止气溶胶污染的作用。6.本技术意在结合lamp、lfd特点，解决现有技术中在燕窝基原鉴定技术领域常用鉴定方法的不足，提供一种准确、快速、灵敏的鉴定方法及相关引物、试剂等。技术实现要素：7.本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种鉴定燕窝基原的lamp-lfd引物组、试剂盒及其检测方法与用途，通过lamp能够快速扩增待鉴定燕窝dna并实现鉴定，准确度、灵敏度高，具有可重现性，且结合lfd能够避免气溶胶污染，实现简单且更为准确的检测。8.本发明的首要目的在于克服现有形态学鉴定难点，提供一种鉴定燕窝基原的引物组，该引物组应用于lamp扩增和相应的lamp-lfd体系中。9.本发明的目的通过下述技术方案实现：10.一种鉴定燕窝基原的引物组，包括外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip；序列分别为f3：acctcttctcagcaatccca；b3：aagtaggggtggaatggga；fip：gtgtagggcgaagaatcgggttatcggccaaaccctcgta；bip：ccttcctaatcgccggcctcattcctagggggttgttcga。在本发明的一个实施例中，该引物组基于已鉴定燕窝基原的保守序列而设计，应用该引物组能特异性扩增与之相应的燕窝基原燕窝dna，结合lfd的显色，能够有效鉴定样品的燕窝基原。11.优选地，还包括环引物lf、lb；序列分别为：lf：gctgagaagaggttggtaatgac；lb：ctcagtagacaaccccacattaac。通过添加环引物lf、lb能够显著加快反应速度，进一步加快lamp扩增反应，缩短整个鉴定过程所需的时间。12.优选地，lf的5’端标记生物素biotin，lb的5’端标记荧光素fam。通过在lf、lb上分别添加相应的标记生物素、标记荧光素，便于lamp-lfd检测结果的显现，使通过直接观察横向流动层析试纸的显色状况即能获取鉴定结果。13.优选地，上述引物组用于鉴定金丝燕属燕窝。在本发明的一个实施例中，上述引物组是基于已鉴定燕窝基原样品和现有数据库公开的爪哇金丝燕cytb基因保守序列设计的，其至少能用于鉴定燕窝基原是否为金丝燕属。14.本发明的再一目的在于提供一种鉴定燕窝基原的lamp-lfd试剂盒，包含上述的引物组和/或横向流动试纸条。15.优选地，含有上述的引物组，其中lamp反应体系为25μl，包括：16.优选地，lamp-lfd检测条件为：63℃下水浴0.5h，然后室温放置5～10min。本发明人在采用上述引物组进行扩增、鉴定时，对于上述lamp体系而言，lamp扩增的最佳温度为63℃。在63℃下水浴0.5h完成lamp扩增过程，进一步于室温中放置5～10min，lfd则会逐渐显色，以完成检测过程。17.本发明的再一目的在于提供一种鉴定燕窝基原的lamp-lfd检测方法，包括步骤：a1、提取待鉴别燕窝样品dna；a2、设计扩增特异基原dna的lamp引物；a3、基于a1获取的dna、a2获取的lamp引物配置相应的lamp反应体系；a4、将a3配置的lamp反应体系置于核酸检测装置中，所述核酸检测装置中设有核酸层析试纸；所述核酸层析试纸显色状态反映lamp扩增结果，以鉴定待鉴别燕窝样品是否为与lamp引物相应的基原。18.优选地，在本发明的一个实施例中，特异基原为金丝燕属燕窝基原。19.优选地，步骤a2中的lamp引物包括：外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip；序列分别为f3：acctcttctcagcaatccca；b3：aagtaggggtggaatggga；fip：gtgtagggcgaagaatcgggttatcggccaaaccctcgta；bip：ccttcctaatcgccggcctcattcctagggggttgttcga。20.优选地，步骤a2中的lamp引物包括：外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip、环引物lf、环引物lb；序列分别为f3：acctcttctcagcaatccca；b3：aagtaggggtggaatggga；fip：gtgtagggcgaagaatcgggttatcggccaaaccctcgta；bip：ccttcctaatcgccggcctcattcctagggggttgttcga；lf：gctgagaagaggttggtaatgac；lb：ctcagtagacaaccccacattaac。21.优选地，其中lamp反应体系为25μl，包括：22.优选地，步骤a4具体包括步骤：a41、配置lamp反应体系置于核酸检测装置中；a42、温度为63℃条件下水浴0.5h，然后室温放置5-10min；a43、依据试纸显色状态判断lamp扩增结果并鉴定。23.优选地，步骤a43中，使用核酸层析试纸装置的试纸条进行检测，判断核酸层析试纸检测成功与否的标准为：核酸试纸条由上往下第一条线为控制线(c线)，第二条线为检测线(t线)，c线显色则证明装置有效，t线显色则证明检测出lamp扩增片段，样品有目的片段，为阳性；t线未显色则证明未检测出lamp扩增片段，样品无目的片段，为阴性。24.本发明的再一目的在于提供上述引物组在制备鉴定燕窝基原的产品中的用途。25.优选地，产品包括测序平台、试剂、试剂盒。除了采用试剂盒作为检测试剂或为实现燕窝基原鉴定所需的产品外，还可将上述引物组应用与测序平台等产品中，利用其特异性实现相应的鉴定过程。26.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明采用lamp-lfd能够快速扩增待鉴定燕窝样品核酸，提高燕窝检测效率和准确性，有利于燕窝产品溯源，为燕窝产品质控提供有效的检测方法。相较于现有技术中的感官鉴定等方式，本技术采用的lamp-lfd检测不仅具有高灵敏度、高特异性的特点，且能对设备要求低、操作简单，仅需通过试纸即可观察到扩增结果，直观的实现鉴定，简便快捷，适用于投入生产中并得到快速、直接的鉴定。通过本技术提供的引物组、试剂盒及其方法与用途，能够有效的鉴定燕窝生物基原，得以准确把控燕窝产品质量，营造良好市场环境，促进燕窝领域发展和研究。附图说明27.图1显示本发明以不同样品核酸为模板的lamp-lfd检测情况。28.图2显示以不同浓度燕窝核酸质控品为模板的lamp扩增浊度检测情况。29.图3显示以不同浓度燕窝核酸质控品为模板的lamp-lfd检测情况。30.图4显示以不同浓度燕窝核酸质控品为模板的qpcr检测情况。31.图5显示本实施例所采用的的lamp特异性引物序列。具体实施方式32.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。33.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。34.现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。实施例135.不同样品核酸为模板的lamp-lfd检测情况36.取7种不同的经液氮研磨的燕窝样品(样品信息如表1所示)200mg于1.5ml ep管中，按照easypure micro genomic dna kit说明书提取dna，-20℃存放备用；37.将已鉴定生物基原燕窝样品的cytb基因序列，与ncbi数据库中爪哇金丝燕(aerodramusfuciphagus)cytb基因序列，进行比对分析，确定保守特异区段，通过登录日本荣研化学公司的引物在线设计网站(http://primerexplorer.jp/e/)进行燕窝lamp特异性引物的设计以及根据核酸层析装置的试纸特性设计引物的荧光标记，并使用primer 5设计qpcr引物，引物序列如表2所示，详细序列如图5所示，引物均由北京华大生物科技有限公司负责合成。38.对每个样品进行lamp反应体系的配制，并将lamp反应体系配制于含有核酸层析试纸的核酸检测装置中，具体的，25μl lamp反应体系：2×反应缓冲液(rm)12.5μl，酶溶液(em))1μl，10μm外引物f3与b3各1μl，10μm内引物fip与bip各4μl，10μm环引物lb与lf各0.5μl，dna模板1μl，ddh2o 2.5μl。39.按上述25μl lamp反应体系配制完成后，吹打混合均匀后，置于63℃水浴锅中，放置0.5h后，置于室温放置10min后观察核酸层析试纸结果。40.结果见图1所示，其中序号与样品对应关系为：1.my1，2.ved1，3.id1，4.th1，5.myzm1，6.cnh1，7.cnh2，8.猪皮，9.银耳，10.鱼胶；其中id1、my1、ved1、myzm1、th1为属于爪哇金丝燕基原的燕窝，cnh1、cnh2为不属于爪哇金丝燕基原的燕窝。图1中positive、negative、positive、1～10的c线均显色，表明装置有效。而序号6～10中的t线则均不显色，即表明其并非是本实施例1所设计引物对应的燕窝基原，而本实施例中lamp引物则是特异性扩增爪哇金丝燕燕窝核酸。结合6～10均不属于该类生物基原的燕窝，表明本实施例中lamp-lfd能够准确的鉴定燕窝基原。41.表1燕窝样品42.表2lamp引物序列43.注：当使用lamp结合lfd检测方法时，lf-5’端标记生物素biotin，lb-5’端标记荧光素fam。实施例244.灵敏度检测45.采用实施例1所设计的燕窝lamp特异性引物，且恒温水浴锅中lamp反应体系的lf及lb引物为荧光标记引物；对已知拷贝数为4.23×108copies/μl的燕窝核酸质控品以10倍比的梯度进行稀释，进行灵敏度检测，具体的，平行稀释为以下几项实验所需的几份1～9号样品，其中1～9号样品拷贝数范围为4.23×108copies/μl-4.23×100copies/μl，即1～9号样品拷贝数依次为4.23×108、4.23×107、4.23×106、4.23×105、4.23×104、4.23×103、4.23×102、4.23×101、4.23×100copies/μl，在需要lamp扩增的检测过程中，配置lamp反应体系，根据确定的最佳扩增温度63℃进行lamp扩增。具体的，进行有以下灵敏度检测：46.(一)不同浓度燕窝核酸质控品为模板的lamp扩增浊度检测情况47.对一份1～9号样品使用浊度仪进行lamp扩增，测定其浊度，绘制浊度曲线。48.结果如图2所示，扩增曲线随着浓度的降低出现的越晚，且当浓度稀释到4.23×103copies/μl以下时，扩增曲线消失。49.(二)不同浓度燕窝核酸质控品为模板的lamp-lfd检测情况。50.对一份1～9号样品使用恒温水浴锅进行lamp扩增，使用核酸层析试纸装置的试纸条进行检测，判断核酸层析试纸检测成功与否的标准为：核酸试纸条由上往下第一条线为控制线(c线)，第二条线为检测线(t线)，c线显色则证明装置有效，t线显色则证明检测出lamp扩增片段，样品有目的片段，为阳性；t线未显色则证明未检测出lamp扩增片段，样品无目的片段，为阴性。51.结果如图3所示，7～9号样品的lfd检测线亦不显色，即当浓度稀释到4.23×103copies/μl以下时，lfd检测线亦不显色。52.(三)不同浓度燕窝核酸质控品为模板的qpcr检测情况。53.进一步地，还对一份1～9号样品采用实施例1所设计的qpcr引物进行qpcr检测，具体的，将燕窝核酸质控品进行sybrgreen荧光定量分析，其扩增曲线如图4所示，当拷贝数稀释到4.23×101copies/μl时，即图中8号样品，扩增曲线消失。54.由上述灵敏度检测结果可见，本实施例所采用的lamp-lfd快速鉴定方法能够满足4.23×108copies/μl～4.23×103copies/μl范围的扩增，具有很好的灵敏度。本技术提供的lamp-lfd鉴定方法，准确度、灵敏度高，且可再现。实施例355.本实施例提供一种用于燕窝基原鉴定的lamp-lfd试剂盒，包含上述的引物组和横向流动试纸条。56.具体的，引物组含有f3、b3、fip、bip、lb、lf，其中lamp反应体系为25μl，包括：57.lamp-lfd试剂盒使用过程中，lamp扩增体系配置于核酸检测装置中，核酸检测装置中设有横向流动试纸，lamp-lfd检测条件为：63℃下水浴0.5h，然后室温放置5～10min。本发明人在采用上述引物组进行扩增、鉴定时，对于上述lamp体系而言，lamp扩增的最佳温度为63℃。在63℃下水浴0.5h完成lamp扩增过程，进一步于室温中放置5～10min，lfd则会逐渐显色，以完成检测过程。58.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!